배아의 마우스 하트을 개발에있는 셀의 레테르를 붙이는 및 사출

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Biology

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Summary

우리는 (E) 9.5 및 이후 단계 배아 일에 마우스 배아 내의 배아 또는 다 능성 세포로부터 유래 된 내인성 및 그래프트 세포의 세포 운명 및 표현형 모두를 모니터하기 위해, 염료를 주입하는 DNA 벡터, 바이러스, 세포를 일련의 방법을 설명 개발.

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Hiriart, E., van Vliet, P., Dirschinger, R. J., Evans, S. M., Puceat, M. Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (86), e51356, doi:10.3791/51356 (2014).

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Abstract

체외 프로토콜 배아 또는 다 능성 줄기 세포 - 파생 상품의 운명을 테스트하는 것은 반드시 자신의 생체 내 가능성을 반영하지 않습니다 논쟁의 결과로되었다. 바람직하게는, 이러한 세포는 확정적 표현형을 획득하기 위해 적절한 배아 환경에 배치되어야한다. 또한, 염료 또는 레트로 바이러스 벡터에 세포를 라벨링 한 후 마우스의 연구를 추적 세포의 혈통은 여전히​​ 저조한 개발 기관과 함께 초기 단계의 마우스 배아에 주로 제한 남아있다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 E9.5 개발 이후 단계에서 마우스 배아에서 심장의 대상 지역에서 다양한 제를 주입하는 표준 및 초음파 매개 미세 주입 프로토콜을 설계. 배아의 체외 이식편 또는 배아는 다음 배양 또는 추가 자궁 내에 개발하기 위해 왼쪽으로 수 있습니다. 이러한 에이전트는 형광 염료, 바이러스, shRNAs, 또는 세포 유래 전구 세포를 줄기 있습니다. 우리의 접근 방식은 쿵푸의 보존을 허용기관의 nction 마이그레이션 및 표시 및 / 또는 주입 된 세포의 운명을 모니터링하면서. 이러한 기술은 다른 장기로 확장 할 수 있으며, 개발 생물학의 주요 생물학적 문제를 해결하는 것은 매우 도움이 될 것입니다.

Introduction

이상 10 년 전 인간 배아 줄기 세포 (HuESCs)는 인간 배반포 1에서 파생되었다. 그 후,이 세포는 인간의 발달 생물학의 충족 문제를 해결 연구의 중요한 분야의 대상이되고있다. HuESCs는 또한 재생 의료에의 희망을 제공하고 있습니다. 최근 몇 년 동안, 인간 유도 만능 줄기 세포 (유도 만능)은 유전 질환 2의 모델을 제공하고, 환자 맞춤형 체세포에서 생성 된. 심장 계통 3를 포함한 다양한 세포 계통,으로 배아 또는 유도 만능 줄기 세포의 분화에 대한 시험 관내 프로토콜에 많은 사람들이보고되고있다. 분화 된 세포는 종종 RNA 및 단백질 발현, 면역 염색, 및 / 또는 기능 시험 관내에서의 분석에 의하여 phenotyped된다. 그러나, 다 능성 줄기 세포 유도체들은​​ 완전히 CEL 취득 여부를 테스트하기 위해 적절한 배아 환경에 배치 될 필요L의 자신의 배아 대응의 운명과 그들이 지역 신호에 대한 응답으로 정품 생체 기능을 요점을 되풀이할지 여부. 조직 공학이 유망하지만, 아직 미발달 티슈 4,5 개발되어 생체 내에서 적절한 모든 알려진 알려지지 단서를 제공하지 않는다.

마우스 배아 등의 배아에있는 염료 또는 레트로 바이러스 벡터와 셀 라벨은 심장 개발 6시 세포 계통의 배아 출처에 중요한 정보를 가져왔다. 예를 들어, 고립 된 마음의 체외 배양 한 다음 생체 마우스 태아의 심장 막 공간에 주입 염료는 심 외막 세포와 그 후손 7 레이블로 사용되었다. 그러나, 염료 및 레트로 바이러스 셀 라벨은 대부분 8 더 쉽게 접근 할 수있다 여전히 제대로 개발 기관, 또는 닭의 배아와 초기 마우스 배아에 적용되었습니다. 예외가 전자의 대상으로 쉽게 뇌입니다mbryos 9,10. 이러한 접근 방식은 아직 구타 배아 마우스의 심장에 적용되지 않았습니다.

염료 또는 바이러스에 직접 라벨을 보완하기 위해보다 고급 단계의 마우스 배아와 성인 마우스의 추적 혈통을 수행하는 셀 라벨 접근 방식은 크레 / 훈제 연어 기술을 이용하여 형질 전환 생쥐의 분석과 결합되어 있습니다. 크레 / 훈제 연어 방법 (11)는 그러나 재조합 효소의 발현을 구동하는 데 사용되는 게놈 규제 지역의 시공간 특이성, 그리고 크레 / 훈제 연어 재조합 (12)의 효율성으로 인해 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 그것은 단지 크레 식을 구동하는 데 사용 규제 지역의 활성화 후 전구체에 레이블을 지정할 수 있습니다 더욱이,이 방법은 완벽하게 세포 운명의 세포 이동 구동 인수의 특정 문제를 해결하지 않습니다. 또한 분명한 윤리적 인 문제에 대해 인간 배아에 적용 할 수 없습니다.

이러한 제한을 감안할 때, 우리는 새로운 P 시리즈를 디자인의 대상 지역에서 같은 형광 염료, 바이러스 등 shRNAs와 DNA 기반의 셀 라벨 벡터로 유전자 발현 조절 자, 또는 E9.5 개발 이후 단계에서 마우스 배아에서 세포와 같은 세포 라벨링 에이전트의 다양한 주입하는 rotocols 마음.

DNA / 세포 주사는 입체 현미경과 48 시간, 또는 48 ~ 72 시간 동안 고립 된 심장이나 배아 이식편 문화까지 생체 배아 문화와 함께 간단한 미세 주입 장치를 사용합니다. 우리는 또한 자궁에 배아의 마음 초음파 매개 미세 주입 프로토콜을보고합니다.이 기술은 배아 (13)의 개발을 모니터링 할 수 있으며 injectates 및 / 또는 표지 세포의 장기 추적 관찰 할 수 있습니다.

우리는 이러한 접근 방식은 장기의 기능을 보존하고 줄기 세포의 잠재력을 시험 관내 시험보다 더 대표적인 환경을 제공하는 것으로 나타났습니다. 또한, 마이그레이션을 수행 할 수있는 기회를 제공한다자신의 운명을 모니터링하는 세포를 표시 및 / 또는 주입. 궁극적으로, 이것은 지역 티슈 패터닝 및 주요 생물학적 과정의 더 나은 이해를 수득한다.

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Protocol

1. 준비

동물 절차

동물 윤리위원회의 승인을 받아야하고 바이러스에 작업에 대한 제도적 지침을 따르 HuESC 및 / 또는 IPSC (해당되는 경우)뿐만 아니라, 마우스 처리, 마우스 배아를 획득, 마우스 수술을 수행. 시간 제한 교배를 들어, 플러그의 날 배아 일 (E) 0.5 / 0.5 일 후 교미 간주됩니다.

  1. 미세 주사 바늘 :
    전 자궁 미세 주입 들어, 1 또는 10 μm의 내부 팁 직경이 각각 DNA 나 세포를 주입하는 날카로운과 원뿔 곡선 (이차 곡선) 끝 모양을 얻을 수있는 피펫 풀러 / beveller를 사용하여 유리 피펫 (1.2 mm 외부 직경 붕규산 모세관)을 당깁니다. 초음파 매개 주사의 경우, 사용 35분의 50 μm의 외경 / ID의 팁 1.14 mm/0.53 mm의 내부 / 외부 직경 (OD / ID)를 가지고 멸균 바늘을 사용자 정의.
  2. 실리콘 가득 배양 접시 :
    사용 설명서에 설명 된 바와 같이, 실리콘을 준비합니다. 기입~ 1cm의 탄성 중합체 층을 깨끗한 유리 60mm 직경 페트리 접시. 공기 방울을 피하십시오.
  3. 상품 :
    절차를 수행하는 동안 사전에 멸균 모든 수술 도구를 유지합니다.
  4. DNA 준비 :
    하나의 튜브에 3 μg의 DNA 12 ㎕의 옵티-MEM을 추가합니다. 다른 튜브에 3 μL의 리포 펙 타민 2000 년 12 ㎕의 옵티-MEM을 추가합니다. RT에서 5 분 동안 품어 두 솔루션을 섞는다. 즉시 사용합니다.
  5. 셀 준비 :
    10 6 세포 현탁액을 준비 / ML DMEM (둘 베코 이글 중간, 높은 포도당과 50 %의 쥐의 혈청). 최종 세포 현탁액의 50 μl의 8 ~ 10 배아 충분하다.
  6. 준비 염료 :
    25 ㎎ / ㎖ DMSO에 녹색 형광 CDCFDA-SE를 사용합니다. -20 ° C에서 20 μL 씩 분주하고 저장을 준비 멸균 생리 식염수 또는 PBS 사용하기 전에 1:100 / 1:200 희석.
  7. 바이러스 준비 :
    ~ 10 10 -10 10 TRA의 역가 상용 제 3 세대 PGK-GFP를 발현하는 렌티 바이러스를 사용단위 / ml의 DMEM을 nsducing. 렌티 바이러스의 준비를 위해, Tiscornia 등 알. (14)는 개인 보호 장비를 착용하고 안전하게 사용과 바이러스 처리를 참조하십시오.

예 생체 내 주입에 대한 E9.5과 E10.5 태아의 2. 컬렉션

  1. 배아 일 9.5 또는 10.5에서 임신 한 쥐를 안락사.
  2. 70 % 에탄올로, 마우스의 흉부 및 복부를 살균.
  3. 복부를 열고 PBS의 RT에서 자궁 경적을 검색하고 M16 매체와 실리콘으로 채워진 페트리 접시에 두 PBS 세척 후 전송하는 복부 정중선 절개를합니다.
  4. 자궁의 혈관 측이 아래쪽이되도록 실리콘 층 곤충 핀 자궁 뿔 핀.
  5. 표면 아래 1mm에 미세 집게와 자궁의 표면과 탈락의 뚜껑을 잘라.
  6. 부드럽게 탈락의 벽을 확산하여 난황에서 배아를 검색 할 수 있습니다.
  7. 37 °에서 배아를 저장; 세포 주입하기 전에 C M16 중간. 주사의 경우, 각 배아는 미리 예열 37 ° C에서 M16 매체로 채워진 실리콘 요리로 전송

입체 현미경 3. DNA 나 세포 주입

  1. 해밀턴 주사기 뒤쪽에서 유리 피펫을 입력하고 끝에서 거품을 제거하기 위해 피펫을 흔들.
  2. 미세 주입 홀더에 피펫을 설정; 50 보압 (DNA) 또는 30 (세포) 고전력 증폭기, 300 (세포)에 150 사출 압력 (DNA) 고전력 증폭기를 설정합니다. 0.2 초 (DNA) 또는 0.5 초 (세포)에 주입 시간을 설정합니다. 이러한 설정은 약간 microinjector과 펫의 종류에 따라 다를 수 있습니다.
  3. 적절한 배아를 건드리지 않고 난황을 통해 실리콘 아래로 배아를 핀. 마음의 영역을보고 그냥이 지역 위의 주머니를 엽니 다.
  4. 세포 주입하는 동안 움직임을 방지하기 위해 배아 주변에 4 개의 핀을 추가합니다.
  5. (수동으로 설정) 미세 조작기를 사용하여, slowl다만 (그림 1) 주입하는 마음의 영역 위의 심낭 위 45 °의 각도로 y 위치 피펫 팁.
  6. 관심 영역에 피펫을 이동하고 주사를 트리거합니다. 가능한 한 빨리 피펫을 가져 가라. 확실히 마음이 제대로 DNA / 세포 주입 후 구타되어 있는지 확인합니다.

4. 배아, 고립 된 마음, 그리고 이식편 문화

  1. 페니실린 / 스트렙토 마이신, 37 ° C에서 미리 예열하고 40 % O 2 산소 보충 25 % M2 매체 75 %의 쥐의 혈청 문화 E9.5의 배아.
  2. , 25 ㎖ 유리관에 2 ㎖의 배양액을 추가 부드럽게 배아를 추가하고, 튜브에 캡을 나사 결합하기 전에 40 % O 2와 옥시. 회전 또는 (30 회전 / 분)을 흔들어 동안 37 ° C에서 36 시간까지 배양한다.
  3. 원하는 시점 (예 : 24 시간)에서 첫 번째 드에 의해, 마음을 건드리지 않고, 미세 집게로 조심스럽게 마음을 해부하다배아를 capitating; 마음은 말초 유출 관을 사용하여 잡아 당겨 소비세 쉽다.
  4. 문화 12 - 웰 플레이트에서 설정 리겔 코팅 인서트 50 % FCS와 DMEM에있는 다른 36 ~ 48 시간 동안 마음입니다. 심장의 문화 (15)의 개선 된 프로토콜에 대한 다이어 & 패터슨 (2013)를 참조하십시오.
  5. 관심 영역의 이식편을 확인합니다. 예를 들어, 콜라겐 1 형 겔 16에 48 시간의 아트 리오 심실 운하 (AVC)와 문화를 해부하다.

심장 I N 자궁 내 5. 초음파 유도 주사

  1. 초음파 기계 및 microinjector의 설정 :
    1. 레일에 40 MHz의 변환기와 미세 주입 설정으로 고해상도 초음파 시스템을 사용합니다.
    2. 주입 당 69 NL에서 microinjector에 주입 볼륨을 설정합니다. microinjector 프로그래밍을위한 제조 업체의 미세 주입 설명서를 참조하십시오.
  2. microi의 준비njection 설치 및 주입 :
    1. microinjector에 유리 마이크로 피펫을 놓습니다. 최대 볼륨까지 흡입에 의해 효율적으로 주입, 첫 번째 코트에게 미네랄 오일과 피펫의 안쪽을 보장합니다. 그 후 바늘 내부에 오일 1 ~ 2 밀리미터를 떠나, 다시 기름을 꺼냅니다.
    2. 최대 볼륨에 도달 할 때까지 injectate 대기음. 이 끝을 무디게하고 주입을 더욱 어렵게 만들 것으로 바늘 끝으로 모든 표면에 닿지 않도록주의하십시오.
    3. 주입 동안 배아를 함유 자궁 뿔을 안정, 중앙 컷 소 슬릿을 가진 얇은 실리콘 막에 의해 덮여 중간에 구멍이 변경됨 페트리 접시 (2.5 cm 직경)를 사용하고, 절개 사이트 위에 올려 놓으 . 접시의 가장자리에서 점토의 3-4 덩어리를 배치하여 마우스 처리 테이블에 페트리 접시를 안정.
  3. 주입 절차 :
    1. 전에 마취하는 (원하는 배아 단계에서) 임신 한 쥐의 복부를 면도SIA는 머리를 제거합니다. 잔여 머리를 제거하고 70 % 에탄올로 소독 화학 제모 제와 복부를 처리합니다.
    2. 얼굴에 마스크를 통해 산소 / 이소 플루 란과 임신 마우스를 마취. 절차의 나머지 기간 동안 1.5 % 다음에 초기 마취, 100 % 산소에 3 ~ 5 %의 이소 플루 란을 사용합니다. 마우스가 충분히 부드럽게 발 및 / 또는 꼬리를 집어 마취되어 있는지 확인합니다.
    3. (37 ° C에서 가열로 설정) 마우스 처리 테이블에 마우스 부정사를 놓고 각막의 탈수를 방지하기 위해 윤활제와 눈을 포함한다.
    4. 전극에 전극 젤을 적용 및 심박수, 호흡 수, 및 ECG를 모니터링 전극에 발을 테이프. 몸의 온도를 모니터링하기 위해 직장 온도계를 배치합니다.
    5. 먼저 마우스를 시각화 및 초음파에 의해 배아를 계산하여 임신인지 확인합니다. 복부 초음파 젤을 적용하고 방광 위의 스캔 헤드를 놓습니다. 일관성을 위해, 우선 방광을 시각화방광의 위치에서 시작하여 왼쪽에있는 배아과 오른쪽 자궁 뿔을 계산합니다. 배아 마음이 정상적으로 박동되어 있는지 확인합니다.
    6. 마우스가 임신 한 경우, 점토와 미래 절개 위의 페트리 접시를 놓습니다. 요리는 직접 접촉되도록 약간 복부에 접시를 누릅니다.
    7. 접시를 제거하고 다시 복부를 소독. 복부 및 복막을 열고, 약 0.75-1 cm 질보다, 1.5 cm 복부 정중선 절개를합니다. 내부 장기에 손상을 피하십시오.
    8. 집게로 왼쪽 또는 오른쪽 자궁 경적을 외면 화하다, 부드럽게 요리의 실리콘 멤브레인을 당겨, 다시 점토의 요리를 안정. 방지 광범위이 자궁 혈관과 여성 및 / 또는 배아의 조기 사망의 출혈을 일으킬 수 있기 때문에, 잡아 당기거나 조작.
    9. 배아 주입 된 적절한 기록 유지를 보장하기 위해 다시 배아를 계산합니다.
    10. U에 초음파 젤을 적용이미지 terine 뿔 마음과 탈수를 방지하기 위해.
    11. 이미지 최초의 배아를 주입 할 수 있습니다. 배아 심장의 정상적인 박동을 확인하고 태아의 꼬리 - 두개골과 좌우 방향의 기록을 유지. 필요한 경우, 올바른 방향을 확인하기 위해 약간 자궁 뿔의 위치를​​ 변경. 이 어려운 증명하는 경우, 다음 배아로 이동합니다.
    12. 약간 (그림 3) 심낭의 외부 배아 위의 45 ° 각도로 바늘의 위치를 미세 주사 바늘로 조심스럽게 자궁에 구멍을. 이 아트 리오 심실 홈 (그림 3)을 향해 가리 키도록 심 외막 세포의 표지를 들어, 이미지 네 개의 챔버보기 마음과 바늘을 위치. 각도를 조정해야하는 경우, 바늘을 빼, 및 재배치. 이 바늘을 깰 수 있으므로, 자궁 안쪽에 바늘의 각도를 조정하지 마십시오. 이러한 사지 또는 태반 등의 조직을 천공하지 마십시오.
    13. 바늘을 이동심낭 벽에 상냥한,하지만 빠른 움직임으로 찔린. 일반적으로, 거기에 약간의 저항이 될 것입니다,하지만 너무 빨리 바늘을 이동하는 바늘 끝은 심장 자체에 구멍을 발생할 수 있습니다. 팁 아트 리오 심실 홈의 심낭 공간에서 생을 마감한다. 심막 출혈의 경우에, 혈액 세포는 흰 눈 형상 패턴으로 표시 될 것이다. 이 경우, 배아를 주입을 중지하고 다른 배아로 이동.
    14. injectate을 주입한다. 하트 개발에 대한 악영향을 방지하기 위해 심막 공간으로 극대 700 NL 주입한다. 심낭의 약간의 시간적인 부종에 의해 적절한 주사를 모니터링합니다.
    15. 주입 후, 밖으로 바늘을 뽑아 injectate 여전히 바늘이 조직의 조각에 의해 막힌되지 않았 음을 확인하기 위해 배출 될 수 있음을 확인.
    16. 이미지 처리 테이블의 위치를​​ 변경하고 다음 배아를 주입. 방지하기 위해 (한 자궁 경적에) 3-4을 최대로하기 위해 주입 된 배아의 수를 유지대향 자궁 경적 제어 배아를 허용하고, 절차가 배아 발달을 방해하지 않았 음을 보장하기 위해 마취를 확장했다.
    17. 배아의 원하는 번호를 주입 한 후, 여분의 초음파 젤을 제거하고 부드럽게 적절한 위치에 복부에 다시​​ 자궁 경적을 배치합니다.
    18. 하나의 복막과 복부 근육 봉합 층, 피부에 대한 봉합의 두 번째 레이어를 사용하여 산모의 복부를 닫습니다.
    19. 진통제의 첫 번째 복용량으로 마우스를 주입한다. 전에 12 시간 간격으로 마취와 세 개의 추가 주사를 끝으로 0.05 ~ 0.1 ㎎ / ㎏ 프레 놀핀 15 분 중 하나 주사를 사용합니다.
    20. 마취를 중단하고 프로 시저의 적절한 복구를 위해 마우스를 모니터링 할 수 있습니다. 주택의 후속 원하는 기간에 대한 개별 케이지에 임신 한 마우스.

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Representative Results

상기 주입 프로토콜을 사용하여, 세포를 표지 및 / 또는 마우스 배아 심장에 주입 될 수있다. 개념의 증거로 몇 가지 예는 주입 프로토콜과 생체 AVC 이식편, 고립 된 심장, 또는 전체 배아 문화 (그림 1) 결합 된 표시됩니다.

도 1은 세포 주입 전의 배아의 제조를 나타낸다. 난황 (그림 1A)의 무결성을 유지하면서 E9.5의 배아의 탈락에서 제거됩니다. 난황은 바로 마음 (그림 1B) 위에 열립니다. 피펫은 (도 1C)에 접근하고 세포가 주입된다. 마음은 그것의 모양 (그림 1D)를 유지하고 구타 남아있다.

이러한 전이 (EMT)를 중간 엽하는 상피 세포로 발달 생물학에서 더 구체적인 생물학적 문제를 해결하기 위해 E9.5 AVC 이식편은 쉬와 함께 주입심 내막 세포의 내피 세포 - 중간 엽 이행 (그림 2A)에 필요한 단백질을 하향 조절 RNA. 제어 배아는 백본 빈 벡터로 주입 하였다. 마찬가지로 Sox9 프로모터의 조절하에 GFP를 발현 빛깔 세포 - 유래 내피 사전 판막 세포는 48 시간 외식 심장 배양 한 후, E10.5에서 AVC에 주사 하였다. 이 세포는 (그림 2B와 2C) 내생 내막 세포 periostin 유사한으로 EMT의 마커를 취득.

이러한 생체 방법은 비교적 간단하지만, 단기 후속 (최대로 48 ~ 72 시간)으로 제한. 초음파 유도 주사 절차는 기술적으로 도전적인 접근 방식을 제공하지만, 자궁 사후에 장기 옵션, 심지어 출생 후와. 염료 또는 특정 심장 지역에서 세포를 라벨에 바이러스 성 벡터의 자궁에 주입도 3A-3에서 볼 수 있습니다 C. 이 방법에서는, 심 외막 세포의 특정 라벨링 형광 염료 (도 3D3E) 또는 바이러스 (도 3F)로 달성 될 수 있고, 방법은 세포 또는 대안 injectates로에 확장 될 수있다.

그림 1
. 마음에 그림 1 세포 주입 A :.. 난황에서 E9.5의 배아 B : 그냥 가슴 위에 난황 개봉 후 심장의 시각화. 아래에 삽입 된 하트의 배율을 표시하고 AV 운하 C 포인트 :.. AVC D 방향으로 피펫의 접근 방식 : 48 시간 배양 (H = 심장) 후 배아를 주입합니다.

그림 2 . 심장 이식편의 내막 세포의 생체 EMT를 방지 E9.5 배아의 AVC에 shRNA를 그림 2 사출은 A :. 제어 백본 벡터 또는 shRNA를가 E9.5의 AVC에 lipotectamine와 함께 주입 마우스 배아; 3 시간 후, AVC는 심 내막 세포의 EMT를 실행하기 위해 밖으로 해부하고 콜라겐 겔에 성장했다. . shRNA를 EMT는 BC에 필요한 단백질을 하향 조절 : Sox9 프로모터의 조절하에 GFP를 표현하기 위하여 설계 빛깔 세포 유래 판막 균체 E10.5 태아의 AVC에 주사 하였다. 마음 2 일 (B)에 배양하고,이어서 고정 방지 periostin 항체 (C)로 염색. 삽입 된 페이지는 AVC 영역의 확대를 보여줍니다.


.. 그림 3 자궁 주입에 A : 실험 장치를 묘사하는 방식. 임신 마우스 누운 위치와 실리콘 막으로 페트리 접시는 절개 사이트 위에 안정화된다. . 1 = microinjector, 2 = 변환기, 실리콘 막 3 = 페트리 접시, 4 = 초음파 젤, 자궁 뿔 (빨간색)와 5 = 마우스, 6 = 재생 드리 점토, 7 = 마우스 처리 테이블 B : 여전히 프레임 이전에 주입 바늘과 배아 심장의 위치를​​ 보여주는 초음파 동영상 (M 모드). 여성 ECG는 바닥 (녹색) 및 오른쪽 (황색)의 마음과 호흡의 비율로 표시됩니다. H = 마음 C :. 주입하는 동안 바늘과 배아 심장의 위치를 보여주는 초음파 영상. 삽입 : 끝이 심낭을 통과했지만, 심근에 접촉하지 않고, 그 때문에 주사식사는 아트 리오 심실 홈의 심낭 공간에 주입 할 수있다. 검은 점선은 아트리움 (A) 및 뇌실 (V)의 경계를 표시 D :. 전체가 심낭 공간에서 염료의 강한 형광을 나타내는 E11.5 마우스 배아의 이미지를 마운트 E :. E11.5의 대표 섹션 형광 염료 (CDCFDA-SE, 녹색) 주사 후 4 시간과 심낭 및 심 외막 세포의 라벨을 표시 배아 마우스 마음. 핵은 DAPI (파란색)으로 표시되어 있습니다. LA = 좌심방, LV = 좌심실, RA = 우심방, RV = 우심실 F :. 삼일 주입 후 GFP를 발현하는 렌티 바이러스 모자이크 심 외막 세포의 라벨을 표시 E14.5 마우스 배아 심장의 대표 섹션. GFP의 특이성을 확인하기 위해, GFP 단백질은 또한 GFP 항체 (빨강)로 염색 하였다. 핵은 DAPI (파란색)으로 표시되어 있습니다.

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Discussion

위에서 설명한 내 심장 생체 주입 프로토콜은 중간 단계 (E9.5 - E11.5) 마우스 배아에서 최소 48 시간 동안 심근 기능을 보존하도록 설계되어 있습니다. 이러한 주입 방법은 DNA 나 세포의 공간적 대상으로 주입 할 수 있습니다. 그림 1-3에 나와있는 몇 가지 예는 생체와 같은 내막 또는 심 외막 세포의 EMT으로 제한된 심장 지역에서 개최 발달 과정의 생체 분자 메커니즘에 윤곽을위한 개념 증명을 제공합니다. 가장 중요한 것은, 이러한 프로토콜은 적절한 배아 환경, 지금까지 충족되지 않은 문제에서 인간의 배아 세포 또는 huESC 유도체 주입 세포의 이동과 운명을 수행 할 수있는 기회를 제공합니다.에서 포화와 (그림 3의 심 외막 세포 등) 생체 표지 또는 염료 또는 바이러스의 희석을 제한하는 것은 단기뿐만 아니라 장기적 B의 셀 (하위) 인구의 혈통 추적 가능크레 / LOX 기술 없이도 아시스 (이들 기술을 조합하면도 유용 할 수있다.)

이러한 프로토콜을 적용하는 동안 몇 가지 중요한 단계가 관찰되었다. 첫째, 배아는 빛에 매우 민감하다. 그것은, 따라서 절차는 배아 당 15 분 이내 재현성과 효율로 수행 될 수 있도록 실체 현미경 주입 프로토콜을 실시하도록 권장한다. 동일 행에서 전체 초음파 중재 주입 절차는 배아의 좋은 생존율을 유지하고 자신의 자궁 현상을 손상하지 않도록 30 분 내에 수행되어야한다. 자궁의 조작은 최소한으로 유지되어야한다. 또한, 임신 쥐에 수술 (1 ~ 2 일전 정상보다) 조산 발생하는 경향이 있음을 주목해야한다. 그러나 신생아는 일반적으로 건강해야하며, 일반적으로 개발합니다. 또한, 자궁 벽, 난황과 배아를 통해 피펫의 침투심낭에 도달하고 마지막으로 심근 섬세한 절차 (단계 5.3.13)입니다 수 있습니다. 이 단계는 신중하고 조심스럽게 수행해야합니다. 최적화를 위해, 그것은 재현성을 결정하고 비 대상 지역에서 주입을 제외 할 몇 가지 단기 염료 주사를 수행하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 우리는 위의 주어진 예는 주입 절차와 관련된 발달 심장 결함을 발견하지 않았습니다. 그러나, 더 자세한는 단계 - 의해 - 단계, 형태 학적 및 기능적 분석은 완전히 관심의 단계에서 정상적인 발달과 기능을 확인하기 위해 수행해야합니다.

이러한 기술의 한계는 주중이다. (ⅰ) 실체 현미경을 주입 마우스 배아의 빛과 온도 감도에 의해 제한됩니다. 이것은 정기적으로 교체하거나 매체를 따뜻하게하고 어두운 방에서 작업을 가능한 한 빨리되기 위해 미세 주입 절차의 연습에 의해 극복 될 수있다. (II)의 EX V배아 또는 외식 IVO의 문화는 장기 추적 관찰을 허용에서 자궁 초음파 유도 주사는 대조적으로, 시간에 제한됩니다. 중요한 염료는 거의 즉시 세포 레이블을하는 경향이 3-4일 주입 후까지 계속 표시됩니다. 그러나, 염료의 농도는 연속적인 세포 분열에 의해 희석 될 것이다. 렌티 바이러스와 세포에 레이블을 지정하면이 문제를 극복 할 수 있습니다. 그러나, 바이러스의 흡수는 몇 시간이 소요 표현은 단기 분석을 방지 24-48 시간 후에 최적입니다. (III) 초음파 매개 주입 장비의 비용에 의해 제한됩니다. 40 MHz의 변환기의 해상도는 중간 및 말기 배아에 충분하지만, 더 이전에 E11.5에 단계에 대한 제한.

요약하면, 우리는 전술 한 심장 주입 프로토콜 중기 마우스 배아에서 사용되어야 함을 제안한다. 생체 기술은 배아의 문화, 고립 된 마음, 또는 이식편와 호환의. 생체 절차는 출생 후 개발을 포함한 장기 추적 관찰 할 수 있습니다. 이 기술은 적절한 환경에서 인간 줄기 세포 파생 상품의 분화 가능성을 테스트 할뿐만 아니라, 이러한 세포의 이동 및 기능의 마음을 형성하는 방향으로 도로의 주요 이벤트입니다 지역 단서, 같은 발달 생물학의 특정 문제를 해결하는 데 크게 도움이됩니다 . 또한, 우리의 방법 등 (10)의 이러한 미래에 가능한 체외 배양 프로토콜 및 / 또는 생체 내에서 발달 단계에 따라 심장 이외의 장기 조사를 위해 사용될 수있다.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

저자는 재단 Leducq (승모판)과 직원은 국립가이 연구에 자금을 지원을 위해 라 공들인 (ANR Specistem을 부여)을 부어 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Setups/Hardware
40 MHz Transducer VisualSonics MS550S
Microinjector VisualSonics
Microinjector Eppendorf 5242
Micromanipulator  Eppendorf 5171
Nitrogen required to pressurize the injector
Rail system VisualSonics
rotator to rotate glass tube with embryos inside the incubator
Standard incubator 5% CO2, 37 °C
stereomicroscope Zeiss Discovery. V8
Vevo 2100 VisualSonics
Microinjection
Borosilicate capillary tubes World Precision Instrument KTW-120-6 1.2-μm external diameter
Pipette puller Sutter Model P87
Microinjection needles Origio-Humagen C060609 OD/ID 1.14 mm/53 mm, with 50/35 μm OD/ID tip
Hamilton syringes 
Petri dishes 10-cm diameter
Mineral oil Sigma M8410
Silicon membrane Visualsonics 4.3 x 4.3 cm
Play-Doh
Isoflurane Vet One
hair removal agent  Nair
Eye lubricant Optixcare 31779
Electrode gel (Signa) Parker
Suture Sofsilk 5-0 S1173
Ultrasound gel Aquasonic
Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride) Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. NDC 12496-0757-1 0.05-0.1 mg/kg in saline
Other
Silicone Elastomer Dow Corning Sylgard 184
Glass petridishes Fine Science Tools 60-mm diameter
Insect pins Fine Science Tools 26002-20
Media and culture reagents
Optimem medium Life Technologies 51985026
M2 medium Sigma M7167
Dulbecco’s Eagle Medium Lonza BE12-640F high glucose and 50% rat serum
M16 medium Sigma M7292
Rat serum Janvier ODI 7158
Pennicilin/streptomycin Life Technologies 15140-12
oxygen 40% Air liquid required to oxygenate the embryo culture medium
Fetal calf serum Fisher RVJ35882
Matrigel BD 356230
Collagen type I BD 354236 to coat culture dishes for explant culture
Culture dishes Dutcher /Orange 131020
Injectates
CDCFDA-SE Invitrogen/Molecular Probes C1165 25 mg/ml DMSO. Store at -20 °C. Dilute 1:100-200 in saline before use.
PGK-GFP-expressing lentivirus  ~8E9 transducing units/ml DMEM
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668019

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References

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