Echtzeit-Bildgebung von Einzel Engineered RNA-Transkripte in lebenden Zellen Mit Ratiometrische Bimolekulare Beacons

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Biology

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Summary

Ratiometrische bimolekularen Beacons (RBMBs), um die Bild einzigen entwickelt RNA-Transkripte in lebenden Zellen verwendet werden. Hier beschreiben wir die Herstellung und Reinigung von RBMBs, Lieferung RBMBs in Zellen von Mikroporation und fluoreszierende Abbildung einzelner RNA-Transkripte in Echtzeit.

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Song, Y., Zhang, X., Huang, L., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons. J. Vis. Exp. (90), e51544, doi:10.3791/51544 (2014).

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Abstract

Die Erkenntnis, daß sowohl die räumliche und zeitliche Regulierung der Genexpression kann wichtige Auswirkungen auf die Zellfunktion haben zur Entwicklung verschiedener Methoden geführt, einzelne RNA-Transkripte in einzelnen lebenden Zellen sichtbar. Eine vielversprechende Technik, die kürzlich beschrieben wurde, verwendet eine Oligonukleotid-basierten optischen Sonde, ratiometrisch bimolekularen Bake (RBMB), um RNA-Transkripte, die entworfen wurden, um mindestens vier Tandemwiederholungen der RBMB Zielsequenz in der 3'-untranslatierten Region enthalten, zu detektieren. RBMBs sind speziell entwickelt, um ein helles Fluoreszenzsignal bei Hybridisierung an komplementäre RNA emittieren, aber ansonsten bleiben abgeschreckt. Die Verwendung einer synthetischen Sonde bei diesem Ansatz können photo, rot-verschoben und stark emittierenden organischen Farbstoffen für die Bildgebung verwendet werden. Bindung von mehreren RBMBs zu den technisch RNA-Transkripte Ergebnisse in diskreten Fluoreszenzflecken, wenn sie unter einer Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop. Folglich wird die Bewegung der einzelnen RNA-Transkripte können ohne weiteres in Echtzeit, indem sie eine Zeitserie von Fluoreszenzbildern dargestellt werden. Hier beschreiben wir die Herstellung und Reinigung von RBMBs, Lieferung in Zellen durch Mikroporation und Live-Cell-Imaging von einzelnen RNA-Transkripte.

Introduction

Die Expression und Regulation von RNA-Transkripten ist ein komplexer und dynamischer Prozess, der im Wesentlichen zur Steuerung des Zellverhaltens und Schicksal verantwortlich ist. Obwohl die Bedeutung von RNA diktieren Zellfunktion ist seit einiger Zeit bekannt ist, ist es oft schwierig, klare Verbindung zwischen den beiden, da die meisten RNA-Analyse-Tools nicht über die räumliche und zeitliche Auflösung, um wichtige regulatorische Ereignisse wie Transkriptions Platzen zu erfassen, RNA zeichnen Menschenhandel und lokalisierte RNA-Prozessierung. Dies hat zu der Einführung von mehreren Techniken, die einzelnen RNA-Transkripte in lebenden Zellen in Echtzeit visualisiert 1 geführt werden kann. Vielleicht das bekannteste dieser Verfahren verwendet eine GFP-MS2-Fusionsproteins an RNA, die konstruiert wurde, um Tandem-Wiederholungen des MS2-Bindungsstelle in der 3'-UTR-2,3 enthalten Ziel. Indem mehrere GFP-Moleküle in der Nähe, individuelle RNA-Transkripte als helle fluoreszierende Fleckendurch Fluoreszenzmikroskopie. Das GFP-MS2-System beispiellosen Einblick in RNA Verhalten, einschließlich direkte Visualisierung und Messungen der Transkriptions platzen 4,5, Erkennung von einzigartigen Unter zelluläre Lokalisation und Verarbeitung 6-9, und Echtzeit-Bildgebung von RNA-Transport 10 vorgesehen. Doch trotz der enormen Potenzial des GFP-MS2-System, ungebundenen GFP-MS2-Fusionsproteine ​​können eine hohe Hintergrundfluoreszenzsignal, die die Vielseitigkeit und Dynamik dieser Technik begrenzt erstellen. Verschiedene Ansätze wurden entwickelt, um dieses Hintergrundsignal zu begrenzen, einschließlich subzelluläre Kompartimentierung von ungebundenem GFP-MS2 10, Proteinfragments Komplementierung 11 und alternative RNA-Bindeproteinen und Ziele 12. Jedoch sind alle diese Ansätze bleiben empfindlich gegenüber der relativen und gesamten Expression der Ziel-RNA und GFP-MS2-Fusionsprotein.

Als einlternative den GFP-MS2-Systeme haben MBs ebenfalls verwendet, um RNA-Transkripte mit gentechnisch Tandemwiederholungen der komplementären Bindungsstelle in der 3'-UTR 13,14 detektieren. Molecular Beacons sind Haarnadel bildenden Oligonukleotid-Sonden, die an einem Ende mit einem Quencher, und am anderen Ende mit einem fluoreszierenden Reporter markiert sind. Wenn sie nicht an das Ziel gebunden RNA des fluoreszierenden Reporter und Quencher in unmittelbarer Nähe bleiben, was zu einem Nieder fluoreszierenden Zustand. Nach der Hybridisierung werden die fluoreszierenden Reporter und Quencher auseinandergedrückt und die Fluoreszenz wiederhergestellt wird. Ähnlich der GFP-MS2 System die Bindung von mehreren molekularen Beacons auf eine einzige RNA-Transkript ergibt einen hellen fluoreszierenden Flecks, die durch Fluoreszenzmikroskopie identifiziert werden kann; Jedoch wird erwartet, dass die Hintergrundfluoreszenz zu viel niedriger aufgrund des abgeschreckten Konfiguration ungebundenen Molecular Beacons. Leider, trotz der geschickten Aktivierungsmechanismus, der in den m eingebaut istMOLEKULARE Leuchtfeuer-Design, gibt es jetzt immer mehr Hinweise, die Molecular Beacons unhybridisiert nicht in der Haarnadel-Konformation bleiben, wenn in lebende Zellen eingebracht. Daher erzeugen sie ein falsch-positives Signal, dass das Signal-zu-Hintergrund deutlich reduziert. Um diesen Nachteil zu überwinden, haben wir vor kurzem eine neue synthetische Sonde für die Bildgebung RNA in lebenden Zellen, ratiometrische bimolekularen Beacons (RBMBs; 1A) 15,16. RBMBs aus zwei 2'-O-Methyl-Oligonukleotid-Stränge, die eine Hybridstruktur mit Eigenschaften von sowohl kurze Haarnadel-RNA (shRNA) und Molecular Beacons bilden zusammen. Die Schleife und Fluoreszenzaktivierungsmechanismus ist ähnlich zu dem molekularen Leuchtfeuer, während die lange doppelsträngige Domäne mit einem 3'-Überhang UU ist charakteristisch shRNA. Die shRNA Features wurden entwickelt, um Kernexport, die wir steigt auf> 24 h gefunden intrazellulären Lebenszeit, mit minimalen beobachtbaren Verschlechterung zu fahren, undverhindert unspezifischen Öffnung der Schleife. Als Ergebnis RBMBs eine signifikant höhere Signal-zu-Hintergrund als Molecular Beacons.

Es sei darauf hingewiesen, dass RBMBs nicht unter Verwendung von DNA-Oligonukleotiden, da DNA-Sonden auf der Basis nicht die gleichen Kernexportfunktionen als RNA-basierten Sonden besitzen. Strukturell ist das RBMB Schleife in der Regel für 15 bis 21 Basen lang sein, um ein Gleichgewicht zwischen Spezifität und Selektivität bei der RNA-Hybridisierung zu schaffen. Der kurze Schaft, der aus den beiden Selbst komplementären Domänen bildet, wird in der Regel entwickelt, um 4 Basen sein. Wenn ein längerer Schaft ausgewählt wird, wird die Geschwindigkeit der Hybridisierung zwischen der RBMB Schleife und Ziel-RNA deutlich verlangsamt 17,18. Umgekehrt ist die Schmelztemperatur, wenn eine kürzere Schaft-Sequenz ausgewählt ist oft zu gering, um die Stamm-Schleifen-Struktur bei 37 ° C aufrecht zu erhalten, was zu einer hohen Hintergrundsignal. Die Spezifität der RBMB auch rotuced als die Stammlänge verkürzt. Da die Reihenfolge der RBMB Stamm-Schleifen können RBMB Leistung beeinflussen, muss sorgfältig ausgewählt werden, 19. Insbesondere sollte ideal Loop-Sequenzen minimal Sekundärstruktur haben, hybridisieren mit RNA-Sequenzen mit minimalen Sekundärstruktur, Proteinbindungsstellen zu vermeiden, und vermeiden Off-Target-Bindung. Vorhersagen der beiden RBMB und RNA-Sekundärstruktur kann mit einer Software wie mfold 20 erhalten werden. Ergänzende Off-Target-Websites identifiziert mit Hilfe eines Nukleotid-Basic Local Zuordnung Search Tool (BLAST). Jedoch wegen der Unstimmigkeiten in den Modellvorhersagen und der Schwierigkeit bei der Identifizierung von Protein-abwartend Websites, die Spezifität aller RBMBs letztlich experimentell validiert werden.

Falls gewünscht, kann ein ungestillt Referenzfarbstoff, die unempfindlich gegenüber dem Hybridisierungszustand ist auf die RBMB 15 hinzugefügt werden. Die Zugabe eines Referenzfarbstoffs PROVIDE einen Marker für Sonde Lieferung und ratiometrische Bildgebung verwendet werden, wenn genauere Messungen des gesamten zellulären Fluoreszenz erforderlich sind. Die Bezugs Farbstoffen ermöglicht Messungen, um Unterschiede im Hintergrund aufgrund von Zelle zu Zelle Schwankungen in der Abgabe eingestellt werden. Wenn jedoch die Abbildung einzelnen RNA-Transkripte der Referenzfarbstoff ist nicht erforderlich. Bemerkenswert ist, können einige Referenz Farbstoffe mit dem Export von RBMBs aus dem Zellkern stören, was zu einem etwas höheren Hintergrundsignal in den Zellkern.

Wenn sie richtig ausgelegt ist, kann RBMBs für Bild in einzelne RNA-Transkripte in einzelnen lebenden Zellen verwendet werden, wenn die Ziel-RNA wurde entwickelt, um mindestens vier Bindungsstellen RBMB (Abbildung 1B) 16 enthalten. RBMBs wirksam in einer Vielzahl von Zelltypen über Mikroporierung keine Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen 21 zugeführt werden, mit wenig, und quantitative Messungen der Genexpression kanninnerhalb von 30 min gewonnen. Darüber hinaus ist die Methode relativ unempfindlich RBMB Konzentration und Ziel-RNA-Niveaus, da die Fluoreszenz von ungebundenem RBMBs wirksam gequencht. Hier stellen wir eine detaillierte Beschreibung der Methodik herzustellen und zu reinigen RBMBs, sowie ein allgemeines Verfahren für die Lieferung von RBMBs in den Live-Zellen über Mikroporation und die Abbildung der einzelnen RNA-Transkripte in Echtzeit.

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Protocol

In diesem Protokoll wurde ein Oligonukleotid (RBMB1) am 5'-Ende mit einem Farbstoff markiert CF640R Reporter und hat die Sequenz: 5'-mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC MAMAMA mCmAmC mAmAmC mUmCmC mU mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC Mumu-3 '. Selbst komplementären Domänen, die die Bildung der Haarnadelstruktur zu fahren, sind fett gedruckt. Das zweite Oligonukleotid (RBMB2) wurde am 3'-Ende mit einem Iowa Schwarz RQ-Sp Quencher markiert und hat die Sequenz: 5'-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3 '.

1. Herstellung von RBMBs

  1. Ausführen einer schnellen Spin der Röhrchen, die die RBMB1 und RBMB2 Oligonukleotide, um sicherzustellen, das getrocknete Oligonukleotid ist an der Unterseite des Rohres und Resuspension in DNase und RNase-freiem Wasser auf eine Endkonzentration von 100 uM. Zum Beispiel sollte ein 10 nMol Probe von Oligonukleotid in 100 ul Wasser resuspendiert werden.
  2. MeasUre die genaue Konzentration der RBMB1 und RBMB2 Lager Proben durch UV-Vis-Spektroskopie.
    1. Mix 3 ul der RBMB Probe mit 117 ul DPBS (ohne Calcium und Magnesium) in einem Mikrozentrifugenröhrchen.
    2. Blank das Spektralphotometer mit DPBS und messen die Absorption von 200 bis 800 nm auf. Anmerkung: Peakabsorptionen bei 260 nm und 650 nm sichtbar sein.
    3. Berechnen der Stoffkonzentration der RBMB Proben auf der Basis der Absorption bei 260 nm (oder 650 nm für RBMB1) unter Verwendung der Gleichung:
      Auf Konzentration (M) = A 260 * Verdünnungsfaktor / Extinktionskoeffizienten in der A 260 ist die Absorption bei 260 nm und der Verdünnungsfaktor 40.
      Hinweis: Der Extinktionskoeffizient für die RBMB auf dem Datenblatt des Herstellers Oligonukleotid gefunden werden. Der Extinktionskoeffizient bei 650 nm CF640R ist 103.000.
  3. Mix 20 ul 100 uM RBMB1, 30 ul 100 uM RBMB2, 6 ul 10x; Phosphatpuffer (10x Phosphatpuffer: 480 mM K 2 HPO 4, 45 mM KH 2 PO 4, 140 mM NaH 2 PO 4, pH 7,2) und 4 ul DNase und RNase-freiem Wasser. Inkubieren der Mischung bei Raumtemperatur für 30 min. Hinweis: Dies ist in der Regel ausreichend für ca. 50 Studien.
  4. Bereiten Sie eine Flüssigkeits-Chromatographie-Säule mit 75 Grad prep Superdex, alle nicht-hybridisierten Oligonukleotide RBMB2 entfernen. Verwenden Sie einen 8 ml (0,7 x 20 cm) Flüssigchromatographie-Säule mit einem ~ 4 ml Bettvolumen, um das kleine Volumen der gemischten Sonden reinigen.
  5. Waschen und equilibrieren die Superdex mit ~ 50 ml 1X Phosphat-Puffer unter Verwendung einer Spritzenpumpe bei einer Laufstrom bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,6 ml / min. Vor allem der Flüssigkeit in die Bettvolumen, stoppen Sie die Spritzenpumpe, entfernen Sie es, und lassen Sie die restliche Flüssigkeit durch die Säule gehen durch die Schwerkraft.
  6. Laden Sie die RBMB Gemisch (60 ul) auf die Chromatographie-Säule.
    1. Nachdem die Probe vollständig RBMB hatbetrat das Bett, langsam an die Spitze des Bettes weiteren hinzufügen 250 ul 1x Phosphat-Puffer, um sicherzustellen, dass die gesamte Probe vollständig die Spalte eingetragen.
    2. Füllen Sie die Spalte bis zum Rand mit 1x Phosphat-Puffer. Schließen Sie die obere, und starten Sie die Spritzenpumpe - die Spritze sollte gefüllt werden ~ 50 ml 1x PBS und bei einer Flussrate von 0,6 ml / min laufen.
    3. Sobald die RBMB den Boden der Säule nähert - die RBMB Probe kann typischerweise leicht durch die Farbe des Farbstoffs in die Sonde eingebaut visualisiert werden - in Strömungs sammeln die in 2 Tropfen pro Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml). Stoppen Sie das Sammeln der Probe, nachdem der Farbe innerhalb des Mikrozentrifugenröhrchen wird klar.
  7. Kombinieren Sie die Rohre die farbige RBMB Probe, die - in der Regel 5-6 Röhren - und laden Sie zu einer Kreiselfiltervorrichtung (10.000 MW Cutoff). Zentrifugieren Sie die Probe bei 10.000 RCF für 20 Minuten oder bis die gewünschte Lautstärke. Anmerkung: Diese Geschwindigkeiten und Zeiten typischerweiseergeben ein Gesamtvolumen von 30 ul ~.
  8. Messen der genauen Konzentration der gereinigten RBMB Probe durch UV-Vis-Spektroskopie.
    1. Nehmen Sie 3 ul der konzentrierten RBMB Probe und mit 117 ul DPBS in ein Mikrozentrifugenröhrchen mischen.
    2. Blank das Spektralphotometer mit DPBS und messen die Absorption von 200 bis 800 nm auf. Anmerkung: Peakabsorptionen bei 260 nm und 650 nm sichtbar sein.
    3. Berechnen der Stoffkonzentration des hybridisierten RBMB basierend auf der Absorption bei 650 nm, unter Verwendung der Gleichung:
      Auf Konzentration (M) = A 650 * Verdünnungsfaktor / ausgestorben Koeffizient der A 650 ist die Absorption bei 650 nm, ist der Verdünnungsfaktor 40.
      Hinweis: Der Extinktionskoeffizient bei 650 nm für CF640R ist 103.000 und die Extinktionskoeffizienten für Iowa Schwarz RQ ~ 20.000. Die Extinktionskoeffizienten sind additiv und sind nicht empfindlich für die Hybridisierung. Daher hat die Aktie RBMB Probe eine kombinierte Extinktionskoeffizient approximately 123.000 bei 650 nm.
  9. Das Röhrchen entsprechend mit Namen und Konzentration und bei -20 ° C für die zukünftige Verwendung.

2. Herstellung von Poly-D-Lysin beschichteten 8-Well-Kammerdeckgläser

  1. Vorbereiten einer 0,2 mg / ml Lösung von Poly-D-Lysin durch Auflösen von 5 mg Poly-D-Lysin (gefriergetrocknetes Pulver, G-bestrahlten) in 25 ml sterilisiertem Wasser in einer sterilen Umgebung.
  2. Jeweils 200 ul der 0,2 mg / ml Poly-D-Lysin-Lösung in jede Vertiefung eines 8-Well-Kammerdeckgläser in einer sterilen Umgebung.
  3. Inkubieren bei Raumtemperatur für 16-18 Stunden in den Zellkulturhaube.
  4. Saugen Sie den Poly-D-Lysin und mit sterilem destilliertem Wasser waschen das gut 3-mal. Hinweis: Die beschichtete Chamber Slides, können bei 4 ° C gelagert werden.

3. Probe Liefer

Hinweis: Die verwendeten Zellsystem sollte eine integrierte Gen-Konstrukt, das RNA mit mindestens 4-sequentielle binden drückt enthaltening Stellen für die RBMB in der 3'-untranslatierten Region (UTR). Die Target-Sequenzen sollten komplementär zu der Schleife des RBMB sein. Es wird empfohlen, als negative Kontrolle, die gleichen Zelllinie hergestellt werden, um das gleiche Gen-Konstrukt zu exprimieren, aber ohne die Tandem-Repeats. In diesem Protokoll ein Mensch Fibrosarkom-Zelllinie HT1080, wurde ausgeführt, um GFP-RNA mit 96 Tandemwiederholungen des RBMB Zielsequenz in der 3'-UTR auszudrücken. Die Kontrollzelllinie wurde entwickelt, um Wildtyp-GFP-RNA auszudrücken.

  1. Platte Zellen in einer T25-Flasche bei 40-50% Konfluenz einen Tag vor Lieferung Sonde. Kultur die Zellen mit DMEM-Medium mit 1% Penicillin / Streptomycin und 10% fetales Rinderserum (FBS), und bei 37 ° C mit 5% CO 2.
  2. Am nächsten Tag, schalten Sie den Mikroporator und richten Sie die Parameter Mikroporation bis 950 V, 2 Impulse, 25 msec. Anmerkung: Diese Parameter wurden für HT1080-Zellen optimiert, aber sie sind Zelltyp abhängig sein und kann adjusTed für andere Zelltypen wie in der Anleitung des Herstellers beschrieben.
  3. Füllen Sie den Mikroporation Rohr mit 4 ml Elektrolytpuffer und legen Sie es auf der Mikroporation Station.
  4. Nehmen Sie die Lager Probe gereinigt RBMB und abtauen. Verdünnen mehrere Mikroliter bis zu einer Endkonzentration von 12 uM mit 1x Phosphatpuffer. 1 ul für jede Mikroporierung benötigt.
  5. Je 1 ml des Kulturmediums mit FBS, aber ohne Antibiotika in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Hinweis: Diese werden verwendet, um die Zellen nach Mikroporation sofort einzustellen und kann aufgehoben werden, in der Nähe des Mikroporationseinrichtung, vorerst. Der Einschluss von Antibiotika in den Kulturmedien wird die Lebensfähigkeit der Zellen nach Mikroporierung verringern.
  6. Entfernen Sie den Zellkulturmedien von den technisch HT1080-Zellen (60-80% konfluent), waschen Sie die Zellen mit 1 ml Ca2 + und Mg2 + -freie DPBS einmal, und Inkubation mit 1 ml Trypsin für 1-2 min.
  7. Stoppen Sie den trypsinization durch Zugabe von 1 ml DMEM-Medium mit 10% fötalem Rinderserum, Antibiotika und ohne Phenolrot, und übertragen die Zellen in zwei 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
  8. Spin-Down der Zellen in der Mikrozentrifugenröhrchen bei 200 g für 5 min. Entfernen des Überstands, Resuspendieren und verbinden die Zellpellets in einem Endvolumen von 1 ml DPBS.
  9. Nehmen Sie sich 10 ul von der gut gemischten Zellsuspension und zählen Sie die Zellen.
  10. Pipettieren die Zellen nach oben und unten mehrere Male, um sicherzustellen, dass sie gut verteilt sind und übertragen 300.000 Zellen mit DPBS in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und Spin bei 200 xg für 5 min nach unten.
  11. Entfernen Sie den Überstand, man aufpassen, nicht das Zellpellet stören. Das Pellet in 11 ul Resuspensionspuffer und Pipette auf und ab mehrmals, um sicherzustellen, dass die Zellen gut verteilt. Achten Sie darauf, dass keine Luftblasen zu erzeugen. Hinweis: Luftblasen einen Funken während Mikroporation führen und in armen RBMB Lieferung und Zelltod.
  12. 1 ul der verdünnten RBMB (12 uM) und gut mischen durch Pipettieren von oben und unten mehrmals. Wieder darauf, dass keine Luftblasen zu erzeugen.
  13. Saugen Sie 10 ul der RBMB-Zellmischung, mit der Pipette Mikroporation, und legen Sie die Pipette in die Mikroporation Röhre. Den Startknopf drücken, um die Mikroporation starten. Hinweis: Es sollten keine sichtbaren Luftblasen in der Spitze sein.
  14. Wenn der Bildschirm des Mikroporator zeigt Abschluss, entfernen Sie die Pipette aus der Station, vertreiben die 10-ul-Gemisch in die Mikrozentrifugenröhrchen, die zuvor vorbereitet wurde, mit 1 ml Kulturmedium mit FBS, aber ohne Antibiotika. Vorsichtig mischen durch Schwenken der Rohrseite-an-Seite mehrmals.
  15. Dreh die Zellen bei 200 xg für 5 min und waschen Sie die Zellen zwei weitere Male, in 1 ml Phenolrot freien Kulturmedium mit FBS, aber ohne Antibiotika, um alle RBMBs, die nicht in die Zellen geliefert wurden, zu entfernen. Resuspendieren mit 400 ul Phenol rot freien Kulturmedium mit FBS, aber ohneAntibiotika.
  16. Platte die microporated Zellen in das Poly-D-Lysin beschichteten 8-Well-Kammerdeckgläser mit 200 ul pro Vertiefung oder an der gewünschten Konfluenz.
  17. Optional: Wenn es erwünscht ist, die Bild Kern hinzuzufügen Hoechst 33342 zu den Zellen in einer Endkonzentration von 0,01 mg / ml.
  18. Legen Sie die Kammerdeckgläser in eine Zellkulturbrutschrank. Inkubieren Sie die Zellen für 1-2 Stunden vor der Bildgebung, so dass die Zellen ausreichend Zeit, um auf dem Deckglas Oberfläche niederlassen zu haben. Hinweis: Imaging kann, sobald 30 min nach Mikroporierung geführt werden.

4. Image Acquisition

  1. Schalten Sie die Lebendzellstadium oben Inkubation System und äquilibrieren, bis es 37 ° C, 5% CO 2 und 75% Feuchtigkeit erreicht.
  2. Schalten Sie das Mikroskop und Fluoreszenzlichtquelle und öffnen Sie die Metamorph-Software. Anmerkung: ähnliche Software-Pakete für Mikroskopsteuerung und Bildaufnahme können ebenfalls verwendet werden.
  3. Gelten Immersol Öl, um dieZiel.
  4. Übertragen Sie die Kammerdeckgläser mit microporated Zellen zum Live-Zell-Stadium oben Inkubation System. Bebrüten die Bühne oben System, bis die Temperatur und CO 2 Ebenen stabilisiert werden.
  5. Öffnen Sie die Registerkarte Acquire, in Metamorph-Software. Klicken Sie auf die Schaltfläche Live anzeigen, um das Feld zu finden, stellen Sie den Fokus unter weißem Licht und klicken Sie auf den Stop-Button Live.
  6. Unter der Registerkarte Acquire, klicken Sie auf und öffnen Sie den Strom Erwerb Pop-up-Taste, und stellen Sie sich den gewünschten Film Erfassungsparameter. Erwerben 150 Bilder mit dem Cy5 / CF640R Filter und die Bilder auf der Festplatte.

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Representative Results

Kurz nach der Mikroporation von HT1080-Zellen in Anwesenheit von RBMBs, um einzelne RNA-Transkripte, die entwickelt wurden mehrere RBMB Bindungsstellen in ihren 3'-UTR enthalten, erscheinen als helle fluoreszierende Flecken, wenn sie von Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie (Abbildung 2) abgebildet. Während einzelne RNA-Transkripte mit nur vier RBMB Bindungsstellen in Lebendzellen abgebildet werden, die mehrere Bindungsstellen RBMB in der 3'-UTR, desto stärker ist das Fluoreszenzsignal. Außerdem nimmt RBMBs, die jedem Transkript die mehr gebunden werden die RNA sichtbar gemacht, bevor das Signal durch Photobleichen verloren. In diesem Protokoll wurde die RNA entworfen um 96 Tandemwiederholungen des RBMB Zielsequenz in der 3'-UTR enthalten. Die Übernahme von Streaming-Bilder ermöglicht die individuelle RNA-Transkripte in Echtzeit (Movie 1) abgebildet werden. Einzelne RNA-Transkripte können ohne weiteres ersichtlich ist, die innerhalb der Zytoplasma und Kern of die Zellen. Während die meisten der Flecken erscheinen auf der Brownschen oder Unter diffusive Bewegungen unterzogen werden, in seltenen Fällen ein RNA-gerichteten Transport unterzogen wird beobachtet werden (Movie 2). Thesen RNA-Transkripte in der Regel schnell zu bewegen auf einer geraden Bahn (Abbildung 3); jedoch einige RNA nicht folgen Kurvenbahnen oder machen abrupte Richtungswechsel. Diese Bewegungen sind in scharfem Kontrast zu Brownschen Bewegungen, die zufällig in der Natur sind und eine geringe Gesamt Verschiebungen innerhalb der kurzen Zeitrahmen hier erworben (dh <1 min). Die gerichtete RNA-Bewegungen entsprechen den Transport von RNA an Mikrotubuli und Mikrofilamente. Diese Experimente zeigen, dass RBMBs eine vielseitige und robuste Werkzeug für die Abbildung einzelner RNA-Transkripte in lebenden Zellen.

Figur 1
Abbildung1. Schematische Darstellung der RBMBs und die Methodik zur Bild einzelnen RNA-Transkripte in lebenden Zellen. A) RBMBs in Anwesenheit und Abwesenheit von komplementären Ziel-RNA. In Abwesenheit oder Ziel-RNA wird RBMB Fluoreszenz gequencht. In Anwesenheit von Ziel-RNA wird RBMB Fluoreszenz wiederhergestellt. B) Mehr RBMBs binden jedes RNA-Transkript schaffen eine helle Stelle, die Leuchtstoff durch Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen werden kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Repräsentatives Bild HT1080-Zellen, die mit RNA-A) 96 Tandemwiederholungen oder B) 4-Tandem-Repeats der RBMB Bindungsstelledie 3'-UTR, nach dem intrazellulären Transport von RBMBs. Die Anwesenheit von 96-Tandem-Wiederholungen können einzelne RNA-Transkripte als hell fluoreszierende Flecken erscheinen. RNA, die nur 4 Tandemwiederholungen können auch sichtbar gemacht werden, aber die Intensität der fluoreszierenden Flecken sehr dunkel und häufig nur in den Bereichen der extrem niedrigen Hintergrund nachweisbar. Die geringe Anzahl von besonders hellen Flecken entspricht RNA, die sich nicht bewegt. Maßstab:. 10 um Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Fig. 3
Abbildung 3. Montage eines RNA-Transkripts unterziehen gerichteten Transport. Die Flugbahn des Transkripts in der am weitesten links dargestellten Platte. Die Flugbahn wird über eine einzige f überlagertRame der Zeitreihe. Maßstab:. 2,5 um Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Film Film 1. Vertreter der HT1080-Zellen, die RNA mit 96-Tandem-Repeats des RBMB Bindungsstelle in der 3'-UTR-nach dem intrazellulären Transport von RBMBs. Einzelnen RNA-Transkripte als helle fluoreszierende Flecken. Maßstab:. 10 um Klicken Sie hier, um Video anzusehen.

Film Film 2. Vertreter eines RNA-Transkripts unterziehen gerichteten Transport. Maßstab:. 10 um Klicken Sie hier, um Video anzusehen.

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Discussion

Die Fähigkeit, einzelne Bild entwickelt RNA-Transkripte in lebenden Zellen mit einem konventionellen Weitfeldmikroskop erfordert eine helle und photoFluoreszenzSignal mit jedem RNA-Transkript und eine niedrige Leuchtstoff Hintergrund von ungebundenen Fluoreszenzsonden ausgeh zugeordnet werden. In diesem Verfahren wird ein helles Fluoreszenzsignal durch Hybridisierung mehrere (bis zu 96) auf Oligonukleotiden basierende Fluoreszenzsonden, dh RBMBs, auf jedes RNA-Transkript erreicht. Allerdings sind nur vier Bindungsstellen ausreichen 16. Die kollektiven Signale führen zu einem hellen Fleck, der Fluoreszenz-in Echtzeit verfolgt werden können. Das Vorhandensein von Mehrfachsonden können auch für längere Aufnahmezeiten, da ein wesentlicher Anteil der fluoreszierenden Farbstoffe müssen Licht gebleicht, bevor die Sammelsignal verloren werden. Es ist vorgesehen, dass diese Technik einzigartigen Einblick in RNA Biologie liefern und erlauben die Untersuchung einer Vielzahl von RNA-Verhalten von Mess the Reaktion der RNA Handel auf verschiedene äußere Reize, die Beobachtung einzigartige subzelluläre Lokalisation Muster der Ziel-RNA, das Studium, das Schicksal und die Lebensdauer von RNA, und die einen Einblick in RNA Regulierung. Darüber hinaus kann es möglich sein, in RNA-Expression, um Änderungen zu verfolgen (dh Up-und Down-Regulation). Obwohl diese Funktion noch nicht validiert wurde, haben wir bereits gezeigt, dass die RNA-Kopienzahl ziemlich genau bis zu 24 h in lebenden Zellen 22 quantifiziert werden. Hinzu kommt, dass RBMBs anscheinend nicht das Niveau der Genexpression beeinflussen. Zusammen zeigen diese Ergebnisse erste Hinweise, die in der Genexpression in diesem Zeitraum ändert, wurden genau verfolgt wird, auf einer Zelle-für-Zelle-Basis, und das RBMBs nicht zu einer Erhöhung der RNA-Stabilität führen oder verlangsamt RNA-Abbau. Es ist jedoch nicht klar, inwieweit die Genexpression tatsächlich in dieser Zeit verändert, wenn überhaupt.

Im allgemeinen ist eszu erwarten, dass jede Erhöhung der Genexpression würde leicht identifiziert werden; aufgrund der Fülle des ungebundenen RBMB in der Zelle, die kostenlos neu gebildeten Transkripte binden. Doch was ist weniger klar ist, wie RBMBs distanzieren sich ausdrücklich von RNA während der Übersetzung und Abbau und wenn es eine Verzögerung zwischen RNA-Expression / Abbau und der Abbildungs ​​dieser Transkripte. Weitere Studien sind erforderlich, um RBMB Leistung in diesen Szenarien besser zu verstehen.

Mehrere alternative Ansätze, um einzelne RNA-Transkripte Abbilden wurde bereits berichtet. Die frühesten Untersuchungen beteiligt Fluoreszenzmarkierung isolierten RNA-Transkripte und die Wiedereinführung dieser Transkripte in Zellen, die typischerweise durch Mikroinjektion 23,24. Das Signal-zu-Hintergrund dieser Vorgehensweise ist sehr hoch, aufgrund der Fähigkeit, alle nicht gebundenen Fluoreszenzfarbstoffe zu entfernen, aber es gibt Bedenken darüber, ob das beobachtete Verhalten RNA genau darstellt True RNA-Prozessierung. Die häufigste Lösung für diese Unzulänglichkeit wurde Technik Transgenen mit Tandem-Wiederholungen in der 3'-UTR, die von einem fluoreszierenden Reporter gebunden werden können, analog zu der hier vorgestellte Ansatz RBMB beteiligt. Vorherige fluoreszierenden Reporter haben kleine Moleküle, die nur auf die Bindung der RNA-Aptamere, die üblicherweise als Spinat 25 und GFP bezeichnet fluoreszieren enthalten. Spinat ist noch nicht verwendet worden, um einzelne RNA-Transkripte Bildgebung, hat aber für Bild in globalen Ausdruck verwendet. Im Gegensatz dazu verwendet hat, um GFP erfolgreich Bild einzigen RNA-Transkripte wurden. Bei diesem Ansatz wird ein GFP-Reporters zu dem Hüllprotein des Bakteriophagen MS2 (GFP-MS2) fusioniert ist, und bindet an ein Werk RNA-Konstrukts mit Tandemwiederholungen des MS2-Bindungsstelle in der 3'-UTR 2,10. Dieser Ansatz ist sehr ähnlich zu dem hier beschriebenen Ansatz bieten RBMBs mehrere Vorteile. Zum Beispiel ermöglichen RBMBs organische Fluorophore zur Bildgebung verwendet werden, die einen breiteren div bietetersität von Entscheidungen mit überlegenen Photo und überlegene Helligkeit im Vergleich mit fluoreszierenden Proteinen. Ferner gibt es viele kommerziell erhältliche organische Fluorophore, die im hohen bis nahen Infrarot emittieren. Der Vorteil der Wahl Farbstoffe mit rotverschoben Emissionsspektren ergibt sich aus der geringeren zellulären Autofluoreszenz bei diesen Wellenlängen beobachtet. Da hohe Autofluoreszenz kann leicht übertönen keine Fluoreszenzsignale mit RNA-Hybridisierung verbunden ist, bietet die Möglichkeit, drastisch reduzieren Autofluoreszenz wichtige Impulse in Signal-zu-Hintergrund. Ein weiterer wichtiger Vorteil der Verwendung RBMBs ist, dass das Signal von ungebundenen Sonden signifikant gequencht. Zwar wurden verschiedene Ansätze unternommen, um die Hintergrundfluoreszenz des ungebundenen GFP in der GFP-MS2 Ansatz, beispielsweise die Verwendung von Kernlokalisationssignalen zu verringern, die Steuerung GFP-Expressionsniveaus und GFP-Komplementierung 1,10,11,26,27, die Vorhandensein eines tatsächlichen Lösch Moiety im RBMB Design bietet dem Anwender mit viel größeren experimentellen Flexibilität. Zum Beispiel ist die RBMB Ansatz relativ unempfindlich gegenüber sowohl der relativen und Gesamthöhe der RNA-Expression und Sondenkonzentration. In der Tat können die einzelnen Transkripte mit RBMB Konzentrationen, die um eine Größenordnung zu überspannen abgebildet werden. Die kombinierten Vorteile der höhere Photo, heller Signal und Unter Hintergrund machen Echtzeit-RNA Imaging Experimente mit RBMBs weit mehr zugänglich für die Mikroskopie Benutzern mit eingeschränkter Kompetenz.

Vielleicht der bedeutendste Nachteil der Verwendung von exogenen Sonden wie RBMBs, im Gegensatz zu einem Molekül Reporter wie GFP, ist die Notwendigkeit für die intrazelluläre Abgabe. Glücklicherweise ist eine Anzahl von Möglichkeiten gibt, wie zB Mikroinjektion 28. Transfektionsmittel 29, zelldurchdringenden Peptiden 30 und Streptolysin O (SLO) 31. Persönlich haben wir festgestellt, dass Mikroporation istdas benutzerfreundliche und vielseitige Option, was typischerweise zu> 95% Lebensfähigkeit und Liefereffizienz 21. Dies ist wahrscheinlich, weil die Mikroliter-Volumen Elektroporation zeigt eine Verringerung der vielen schädlichen Ereignisse oft mit Elektroporation verbunden sind, einschließlich Wärmeerzeugung, Metallionen-Lösung, pH-Veränderung und Oxidbildung. Wichtig ist, Mikroporation ebenfalls für Hochdurchsatz-Studien, da RBMBs kann in> 100.000 Zellen in einem einzigen Experiment geliefert.

Trotz der vielen Vorteile der Verwendung RBMBs um Bild RNA Lokalisierung und Bewegung in lebenden Zellen eine Reihe von Einschränkungen und Probleme bleiben. Vielleicht ist die größte Herausforderung, die Unfähigkeit, RNA für mehr als ein paar Minuten unter Dauerbelastung zu verfolgen. Dies ist eine Folge sowohl der Photobleichung und die Fähigkeit der RNA, aus der Fokusbildebene zu bewegen. Heller und photo Farbstoffe al helfenleviate beide dieser Nachteile durch die Erhöhung der Anzahl der einzelnen Farbstoff angeregt werden kann und so die diskreten Leuchtstoffplätze in größerer Entfernung von der Brennebene abgebildet werden. Ein vielversprechender Ansatz, um Photo erhöhen beinhaltet die Verwendung von selbstheilende Farbstoffe, die Triplett-Löscher verwenden in der Nähe des organischen Fluorophore, um ihre Lebensdauer zu verlängern 32. Eine weitere Option ist die Verwendung von fluoreszierenden Verstärker konjugierte Polymere, die aus einer großen Anzahl von verbundenen Fluorophoren, die nicht selbst tun Quench bestehen können. Diese Polymere können viele Male heller als einzige organische Fluorophore und dennoch effizient von einem einzigen Löschkomponente 33,34 abgeschreckt werden; Allerdings sind weitere Arbeiten in diesem Bereich noch benötigt. Es sollte angemerkt werden, dass eine intermittierende Bildgebung mit einer Bildrate> 1 Frame pro Sekunde, können nicht auf eine einzelne Bild RNA-Transkript über längere Zeiträume durchgeführt werden, da es schwierig ist, zu gewährleisten, dass ter dieselbe RNA-Transkript aus Rahmen-zu-Rahmen verfolgt. Natürlich ist die quantitative Bewertung der Genexpression auf der Ebene einzelner Zellen immer noch möglich über lange Zeiträume durch die Zählung der einzelnen fluoreszierenden Flecken auf einer Basis pro Zelle 16,35,36. In diesem Fall ist es nicht notwendig, den Überblick über einzelne Transkripte halten. Insgesamt wird angenommen, daß RBMBs sind in der Lage, wichtige Einblicke in RNA-Funktion und ermöglicht die Abbildung von einzelnen Werk RNA-Transkripte mit konventioneller Mikroskopie Ausrüstung und begrenzter Kompetenz.

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Disclosures

Dr. Mark Behlke und Dr. Ling Huang werden von IDT verwendet, die Oligonukleotide zum Verkauf ähnlich wie einige der in der Handschrift beschriebenen Verbindungen bietet. IDT ist jedoch nicht ein börsennotiertes Unternehmen und die sie persönlich nicht besitzen keine Aktien / Aktien in IDT.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation Career Award (0953583) und dem National Institute of Health NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766 unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nuclease-free water Life Technologies AM9932 no DEPC-treated
DPBS Life Technologies 14190-144 No Ca2+ and Mg2+
Cary 100 UV-Vis spectrophotometer Agilent Technologies
Potassium phosphate dibasic Fisher Scientific P290-500
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific P284-500
Sodium phosphate monobasic Fisher Scientific S381-500
Microcentrifuge tubes Eppendorf 22364111 1.5 ml
Chromatography column Kimble Chase Life Science 420400-0720 0.7 x 20 cm
Superdex 75 prep grade GE healthcare 17-1044-01
Syringe pump Braintree Scientific BS-300
Syringe BD 301035 60 ml, Luer-lok tip
Centrifugal filter units Millipore UFC501096 MW 10,000 cutoff
Centrifuge 5418 Eppendorf
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P7280-5MG lyophilized powder, g-irradiated
8-well chambered coverglass Fisher Scientific 155409 Working volume 0.2-0.5 ml
HT1080 ATCC CCL-121 Human Fibrosarcoma cell line
Cell culture flask Corning 430639 25 cm2
DMEM Life Technologies 11965084 High glucose
DMEM without phenol red Life Technologies 21063029 High glucose
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F2442-500ML
Penecillin/streptomycin Life Technologies 15140122
Trypsin Life Technologies 25300054 0.05% Trypsin-EDTA
Neon transfection system Life Technologies MPK5000
Neon transfection system kit Life Technologies MPK1096
Hemacytometer Fisher Scientific 02-671-10
Hoescht 33342 Life Technologies H1399
IX-81 Inverted fluorescence microscope Olympus
SOLA light engine Lumencor
Metamorph Molecular Devices Software controlling microscope
Immersol oil 518F Fisher Scientific 12-624-66B

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References

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