마우스 췌장에서 RNA 격리 : 리보 뉴 클레아 풍부한 조직

1Pharmaceutics & Pharmaceutical Chemistry, The Ohio State University
Published 8/02/2014
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Biology

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Summary

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Azevedo-Pouly, A. C., Elgamal, O. A., Schmittgen, T. D. RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue. J. Vis. Exp. (90), e51779, doi:10.3791/51779 (2014).

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Abstract

Introduction

높은 무결성 RNA의 분리는 같은 북부 블로 팅 9, QRT-PCR 1 또는 5 프로파일 유전자 발현 같은 일상적인 분자 생물학 실험이 필요합니다. RNA 분리 대부분의 현대적인 방법을 구아니딘 티오 시아 네이트 프로토콜 (2)의 변형에 기초한다 3. 구아니딘 티오 시아 네이트는 강한 단백질 변성제이고 효과적으로 대부분의 조건에서 리보 뉴 클레아 제의 활성을 방해 할 것이다. Chomczynski 및 사키 3의 인기있는 방법은 약 4 시간에 분리 시간을 줄이고, 구아니딘 티오 시아 네이트 용해 용액에 페놀을 배합. 대부분의 시판되는 RNA 추출 시약은 Chomczynski와 사키 방법 3를 기반으로하고 있습니다.

같은 인간이나 마우스의 췌장 등의 리보 뉴 클레아 풍부한 조직은 RNA를 분리하는 추가 문제를 제공합니다. 마우스의 췌장은 그 중 일부는 운영 시간에만 출시 될 예정 리보 뉴 클레아 제 6의 최대 75 밀리그램을 포함 할 수있다G 조직의자가 분해의 결과로 췌장 조직의 파괴. 구아니딘 티오 시아 네이트 프로토콜의 수정은 성공적으로 높은 무결성 2, 4, 7, 10 높은 무결성 4, 7, 10와 RNA의 마우스 췌장 용이 분리로 RNA 안정화 시약. 주입 그러나 주입으로 췌장으로부터 RNA를 분리하는 데 사용되어왔다 췌장에 솔루션은 좋은 기술을 필요로 같은 해부 현미경 및 절차를 수행하는 동안 조직 구조를 방해하는 세포 용해 될 수 있습니다와 같은 전문 장비가 필요할 수 있습니다. RNA 안정화 시약과 조직을 관류하는 단백질 분리 및 조직 학적 염색 등의 다른 응용 프로그램을 방해 할 수 있습니다. 또한,이 기술은 인간의 췌장에서 RNA를 분리에는 적합하지 않다. 다른 프로토콜은 조사 (2)에 의해 특정 솔루션의 준비가 필요합니다.

우리는 마우스의 췌장에서 높은 무결성과 RNA를 분리하는 프로토콜을보고합니다. 일E 프로토콜은 이전에 발행 된 방법의 요소들을 사용하여 주로 표준 페놀 / 구아니딘 티오 시아 네이트 계 용해 시약 프로토콜에 기초한다. 이것은 특수한 용액의 제조를 필요로하지 않으며 이는 췌장에 시약의 주입을 요구한다. 성공적인 RNA 격리를위한 중요한 단계는 조직의 비율, 그 결과 RNA 용액에 분리 리보 뉴 클레아 제 억제제의 포함을 단계적으로 이전에 소화되지 않은 조직의 제거에 높은 페놀 / 구아니딘 계 용해 시약 있습니다. 이들 및 다른 변형을 사용하여, 우리는 일반적으로 12보다 큰 루틴 유전자 발현 해석에 사용하는 RIN으로 RNA를 분리.

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Protocol

1. 준비

다음 사례는 기관의 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 설정된 정책을 준수.

  1. 그것은 특정 일에 더 이상 6 이상 마우스 췌장을 분리하는 것이 좋습니다. 깨끗하고 멸균 모든 수술 도구, 동물 당 하나의 집합이 있습니다.
  2. 모든 마이크로 원심 튜브 레이블을 지정합니다. 동물 당 네 개의 2 ㎖ 튜브.
  3. 얼음에 50 ㎖의 원심 분리기 튜브에 용해 시약 8 ㎖를 놓습니다. 주 : 정제 키트는 췌장의 분리에 적합한 구아니딘 티오 시아 네이트 페놀 시약와 함께 제공하지만, 용해 시약 때문에 격리 당 필요한 큰 볼륨으로 사용됩니다.
  4. 균질의 블레이드 청소를 위해 15 ML의 원심 분리기 튜브에 다음과 같은 솔루션의 약 10 ㎖를 분배. 에탄올, 70 % (2 관), HPLC 등급 물 (1 관)과 약 200의 RNase ㎕의 비움 또는 이에 상응하는 리보 뉴 클레아 제 inactivator를 포함 HPLC 등급 물.
  5. 2. 외과, 췌장의 해부 및 균질화

    1. 면 거즈 나 종이 수건이 들어있는 항아리에 이소 플루 란의 1 ~ 2 ㎖를 놓습니다. 마우스는 이소 플루 란의 근원에 도달 할 수는없는 플랫폼에 배치됩니다. 이전에 각 마우스를 마취에 항아리에 신선한 이소 플루 란을 추가합니다.
    2. 부드럽게 이소 플루 란을 포함하는 항아리에 마우스를 놓습니다. 항아리 뚜껑을 부드럽게 앞뒤로 항아리를 회전하여 마취의 효과를 모니터링 할 수 있습니다. 그것의 자신에 서 할 수 없습니다에 일단 동물은 마취.
    3. 마취의 확인을 위해, 항아리에서 동물을 제거하고 회사 발가락 핀치를 적용합니다. 마우스가 발가락 핀치에 반응하지 않는 경우, 2.5 단계로 진행합니다.
    4. 마우스가 발가락 핀치에 반응하는 경우, 다음 단계 2.3에 2.2를 반복합니다.
    5. 발생하기 쉬운 위치에 벤치 위에 마취 동물을 놓습니다. 단단히 쥐의 자궁 경부의 왼쪽 손을 배치하여 마우스의 자궁 경부 탈구. 우리오른쪽 마우스의 꼬리를 잡고 빨리 자궁 경부 탈구에 약 위쪽으로 45 °의 각도를 끌어 보내고.
    6. 25 게이지 피하 주사 바늘을 사용하여 평평한 표면에 동물의 네 발을 각각 관통하여 표면 (종이 타월로 덮여 스티로폼 수준의 조각)에 시체를 고정합니다.
    7. 오픈 마우스의 중간 부분을 절단하고 신속하게 마우스의 췌장을 제거, 무균 수술 도구를 사용하여. 췌장을 보유하고 봄 가위를 사용하여 비장과 소장에서 잘라 집게를 사용합니다. 마우스에서 제거하는 동안 췌장을 스트레칭하지 않도록주의하십시오. 조직의 혼란은 리보 뉴 클레아 제를 해제 할 수 있습니다. 참고 : 마우스의 췌장을 제거하는 데 걸리는 시간이 중요합니다. 당업자는 약 1 분 이하로 췌장 해부를 할 수 있어야한다.
    8. 차가운 얼음 용해 시약 8 ㎖를 포함하는 50 ML 튜브로 전체 췌장을 놓습니다. 튜브 캡을 간략하게 TI 젖어 흔들시약에 ssue 지체없이 다음 단계로 진행합니다. 조직에 용균 시약의 비율이 중요하다. 용해 시약의 다른 볼륨을 사용하여 격리 RNA 무결성의 비교 결과 섹션을 참조하십시오.
    9. 5 초 동안 균질화한다. 그것은 조직이 효율적 균질화 블레이드로 당겨질 수 있도록 원심 관의 바닥에 균질 블레이드를 눌러야 중요하다.

    소화되지 않은 조직의 3. 제거

    참고 : 균질화에 따라, 조직의 작은 비트는 용해 시약에 남아 있습니다. 그것은 신속하게 균질화와 RNA의 위험 저하에보다는 소화되지 않은 일부 조직을 떠나는 조직을 용해하는 것이 더 중요합니다.

    1. 전송 2 ㎖ 마이크로 원심 튜브에 용해 췌장을 포함하는 세포 용해 시약 2 ㎖. 격리 당 균질의 두 마이크로 원심 튜브를 수집합니다. 미래 연구를위한 -80 ° C에서 나머지 균질 또는 상점을 폐기하십시오.
    2. 센트4 ° C, 소화되지 않은 조직을 펠렛 5 분간 12,000 × g에서 rifuge. 이 가능성이 리보 뉴 클레아 제 (단계 5.13)로 샘플을 오염시킬 것 RNA의 후속 솔루션으로 소화되지 않은 조직의 이월 등의 중요한 단계입니다.
    3. 2 ㎖ 마이크로 원심 분리 튜브에 이송 상등액 1 ㎖. 즉시 격리을 진행하고 향후 사용을 위해 -80 ° C에서 복제 튜브를 저장합니다. 다음 단계를 진행하는 동안 얼음물에 균질를 포함하는 모든 튜브를 놓습니다.
    4. 적절한 화학 폐기물 용기에 남아있는 용해 시약을 폐기하십시오.

    균질 블레이드 4. 청소

    1. 다음 분리를 진행하기 전에, 70 % 에탄올 10ml에 넣어서 균질화 블레이드 청소. 블레이드에 잡힐 수 있습니다 조직의 덩어리를 제거하기 위해 20 초 동안 약의 균질화를 활성화합니다.
    2. 균질 블레이드에 남아있는 조각을 제거하기 위해 200 μL 피펫 팁을 사용합니다. 물, 일반의 RNase inactivator 및 70 % 에탄올의 단계를 반복합니다 4.1. 깨끗한 김 균질 샤프트 닦아 건조.
    3. 나머지 동물의 췌장 분리 단계를 반복 2.1, 오히려 RNA를 풀링보다 각 동물 별도의 분리 유지 RNA.

    5. RNA 격리

    다음 섹션에서는 정제 키트 프로토콜과 동일하다. 정제 키트의 장점은 작은 RNA를 포함하여 전체 RNA를 분리한다는 것이다.

    1. 냉동 균질 솔루션을 사용하는 경우, 5 분 동안 실온에서 스탠드를 얼음물에 해동 및하자.
    2. 클로로포름 200 μl를 추가, 튜브 캡을 15 초 동안 손으로 격렬하게 흔들어. 튜브 2 ~ 3 분 동안 RT에 서 보자.
    3. 12,000 XG, 4 ℃에서 15 분 동안 원심 분리
    4. microcentrifuge 관에 위 수성 레이어를 전송합니다. 이소프로판올 1.5 볼륨을 추가로 pipetting 아래로 여러 번 철저하게 섞는다.
    5. 70까지 이동2 ML 수집 관에 위치 스핀 컬럼에 샘플의 0 μL. 실온에서 15 초 동안 8,000 XG에 원심 분리기 뚜껑을 닫습니다.
    6. 흐름을 통해 폐기하십시오.
    7. 반복 샘플의 나머지 부분을 사용하여, 5.5-5.6 단계를 반복합니다.
    8. 스핀 컬럼에 700 μL 버퍼 RWT를 추가합니다. 8,000 X g에서 15 초 동안 원심 분리기. 흐름을 통해 폐기하십시오.
    9. 스핀 칼럼에 피펫 500 μL 버퍼 RPE. 열을 씻어 8,000 XG에 15 초 동안 원심 분리기. 흐름을 통해 폐기하십시오.
    10. 스핀 컬럼에 500 μL 버퍼 RPE를 추가합니다. 열을 건조하는 8,000 XG에서 2 분 동안 원심 분리기.
    11. 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 스핀 열을 전송합니다. 직접 스핀 컬럼 막 상 피펫 80 μL의 리보 뉴 클레아없는 물. RNA를 용출 8,000 XG에서 1 분 동안 원심 분리기.
    12. RNA 용액 1 μL의 RNA 분해 효소 억제제를 추가합니다. -80 ° C에서 저장 또는 5.13로 진행합니다.
    13. RNA의 무결성을 확인하려면 먼저 RNA의 conce을 계산분광 광도계를 사용하고 ntration 280분의 260 비.
    14. 분자 생물학 수준의 물에 약 500 NG / μL로 RNA 용액의 일부를 희석.
    15. 모세관 전기 영동 분석을 사용하여 RNA 무결성 (즉, RIN)를 확인합니다. RNA 용액을 약 5 μL는 분석에 충분하다.
    16. C. -80 ° RNA 용액 (그림 2 참조) 및 저장소를 나누어지는

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Representative Results

용해 균질 1 ㎖에서 총 RNA의 수율은 20 ~ 40 μg이다. OD 280분의 260 비율은 일반적으로 약 2.0이며, RIN은 7.0 지속적으로 크다. RIN은 6 ≤ 경우 분리가 반복 될 필요가있을 것이다. 때때로, 8.0보다 높은 R​​IN은 달성된다.

종래 췌장의 제거에 마우스를 안락사의이 가장 일반적으로 사용되는 방법은 CO 2 질식 또는 이소 플루 란을 흡입한다. 두 기술은 자궁 경부 전위 다음에 있습니다. 그것은 화학 약품 및 / 또는 절차에 시간이 RNA 무결성, 두 기술을 비교 하​​였다하여 고립 된 마우스의 췌장 RNA의 RIN에 영향을 줄 수있는 가능성이 있기 때문이다. 마우스는 CO 2 질식 또는 이소 플루 란 흡입을 사용하여 마취; 두 기술은 자궁 전위에 의해 미행했다. 이전의 자궁 경부 전위에 동물을 마취의 시간은 isofl에 비해 CO 2 질식 약 1 ~ 2 분 이상했다urane. 이소 플루 란을 흡입하면 다음과 같은 고립 된 RNA는 CO 2 질식 2.2 ± 0.3 RIN (P <10-4, 아이솔레이션을 세중, SD ± 평균)에 비해 7.5 ± 0.31의 RIN를 생산. 안락사의 방법은 RNA 무결성에 큰 영향을 가지고 있으며, 이소 플루 란 흡입의 기술은 2 질식 CO하는 것이 바람직하다.

용균 시약을 2, 4, 8 ㎖ 중에 균질화시켰다 마우스 췌장으로부터 분리 RNA의 무결성을 비교 하​​였다. 우리는 용해 시약의 양을 증가하는 리보 뉴 클레아 제의 불 활성화의 큰 정도 발생할 것으로 가정 하였다. 용균 시약의 부피 이외에, 모든 조건은 프로토콜에 열거 된 것과 동일 하였다. 균질화 및 RNA 무결성 (그림 1)에 사용되는 용해 시약의 양 사이에 직접적인 상관 관계가 있었다. RNA의 RIN은 용해 시약의 2, 4, 8 ㎖를 각각 4.2, 6.5, 7.4, (뜻이고, 세중이를 사용하여 격리olations). 따라서 용균 시약을 13 ㎖의 프로토콜이 사용되어야한다.

일부 실험에서, 동일 췌장에서 RNA와 단백질 모두를 수집 할 필요가있다. 예를 들어, RNA는 QRT-PCR에 사용될 수 있으며, 단백질은 면역 조직 화학을 이용하여 가시화 될 수있다. 이 경우, 그것은 선두로부터 말미 반 췌장 잘라 추천. 췌장은 머리에서 꼬리에 해부학 적으로 차이가 있기 때문에이 점은 중요하다. RNA 무결성에 차이가 췌장의 절반 하나에서 격리 RNA 사이에 존재하는 경우 설명하기 위해 다음과 같은 실험을 수행 하였다. RNA는 췌장의 전반부로부터 단리 하였다. RIN이 RNA로부터 결정은 그것의 초기 절반 인 워크 업 중에 약 30 초 동안 RT에서 토 후 췌장의 후반으로부터 격리 RNA의 것과 비교 하​​였다. 췌장의 초기 절반 RIN는 이후 반 6.9 ± 0.55의 RIN에 비해 7.4 ± 0.20이었다. 췌장을 절단하는 동안이 방법은 췌장 절개해야하는 경우, 그것은 RNA 분석 및 단백질 하반기 상반기를 사용하는 것이 좋습니다, 리보 뉴 클레아 제와 RNA의 소화를 해제 할 나타나지 않습니다.

용해 시약은 단백질 구조를 방해하기 때문에 리보 뉴 클레아 제 활성을 감소시킨다. 인해 췌장에 존재하는 리보 뉴 클레아 제의 다량으로, 일부 리보 뉴 클레아 제 활성이 용해 파쇄 액에 남아 있고이 리보 뉴 클레아 제는 수성 상에 평형 것이라고 할 수있다. 마지막 RNA 용액에 남아있는 리보 뉴 클레아 무결성을 방해합니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 RNA의 수용액에 리보 뉴 클레아 제 억제제를 추가했습니다. RNA 무결성은하지 않았다 하나에 리보 뉴 클레아 제 억제제를 포함 RNA 솔루션에서 비교 하​​였다. 한 동결 해동시, 억제제와 RNA의 솔루션에 대한 RIN은 대한 (그림 2, P <0.001, 아이솔레이션을 세중, SD 평균 ±) 2.9 ± 0.65에 비해 7.3 ± 0.15이었다억제제가 포함되어 있지 않습니다 솔루션입니다. 또 다른 문제는 동결 해동 효과를 렌더링 억제제 리보 뉴 클레아 제를 변성 것이다 반복 가능성이다. 이러한 가능성을 조사하기 위해, RNA 함유 리보 뉴 클레아 제 억제제의 용액을 반복적으로 냉동 및 해동시켰다. 냉동 및 6 배 이상 해동 한 이러한 솔루션은 7 아래 RIN (그림 2)을 생성하는 동안 냉동 5 회까지 해동 된 RNA 솔루션은 여전히 7 이상 RIN를 생산. 이것은 이전에 냉동 RNA 용액을 분취 동결 해동 사이클의 수를 제한 할 것을 권장한다.

이 방법의 유용성을 입증하기 위해, 우리는 분리 된 RNA에 QRT-PCR을 수행 하였다. 세중 RNA 절연 부에서 평균 RIN은 7.4 ± 0.20이었다 (평균 ± SD). 랜덤 프라이머 cDNA를 RNA로부터 합성하고 세 하우스 키핑 유전자의 발현은 표준 기술을 사용 qPCR에 의해 측정 하였다. 도 3에 도시 된 유효화 데이터성공적으로 표준 분자 생물학 기법으로 마우스의 췌장 RNA를 사용하는 능력.

그림 1
조직의 비율을 그림 1. 높은 용해 시약 RNA 무결성을 향상시킵니다. 2 (A, D)에서 균질화 마우스의 췌장에서 분리 된 RNA의 무결성을, 4 (B, E) 또는 용해 시약의 8 (C, F) ML했다 비교. 용해 시약의 볼륨 이외의 모든 조건이 여기에 설명 된 프로토콜의 설명에서와 동일했다. 직접적인 상관 관계는 균질화 및 RNA 무결성에 사용되는 용해 시약의 양 사이에 존재합니다. (G) 평균 ± SD, 세중 아이솔레이션. P <0.05, ** P <0.001. 보려면 여기를 클릭하십시오 더 큰 버전이 그림의.

그림 2
그림 2. RNA는 결국 반복되는 동결 융해에 따라 저하됩니다. 마우스의 췌장에서 분리 된 RNA가 반복적으로 냉동과 리보 뉴 클레아 제 억제제 (RNA 분해 효소 I)의 존재 또는 부재에 해동되었다. ± SEM, ** P <0.001을 의미한다.

그림 3
그림 3. 마우스의 췌장 RNA의 QRT-PCR. RNA가 최적화 된 프로토콜을 사용하여 세 가지 마우스의 췌장에서 분리 하였다. 18S rRNA의, β-2 마이크로 글로불린과 snoRNA251의 발현은 QRT-PCR (평균 ± SD)를 사용하여 측정 하였다.

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Discussion

풍부한 리보 뉴 클레아하는 조직에서 RNA를 분리하는 것은 분자 생물학 실험에 대한 큰 도전을 나타냅니다. 각종 시약 및 키트는 주로 RNA 추출의 페놀 구아니딘 티오 시아 네이트 방법에 시판을 기반으로하는 그. 구아니딘 티오 시아 네이트는 단백질을 변성 따라서 리보 뉴 클레아 제의 활성을 감소시킨다. 그러나 췌장에서 리보 뉴 클레아 제의 깎아 지른듯한 크기는 RNA 분리의 표준 프로토콜을 추가로 수정해야합니다. 프로토콜 표준 구아니딘 티오 시아 네이트 방식의 기반이 여기에보고 아직 췌장 등의 리보 뉴 클레아 풍부한 조직에서 RNA의 성공적인 분리를위한 몇 가지 중요한 변경뿐만 아니라, 팁이 포함되어 있습니다.

RNA 단리를위한 표준 지침에 유의해야한다. 이 기술은 더 적은 리보 뉴 클레아 풍부한 췌장보다 표본에서, RNA의 성공적인 분리에 매우 중요합니다. 몇 가지 예는 분자 생물학 등급 워싱턴을 사용하여 포함터, 리보 뉴 클레아없는 소모품 오히려 유리보다 일회용 플라스틱 제품. 그것은 각각의 분리 사이에 장갑을 변경하는 것이 좋습니다. RNA를 분리 가진 경험이있는 사람의 경우, 그것은 그들이 이전에 췌장에서 RNA를 분리해야합니다 작업에 착수하기로 같은 간으로 리보 뉴 클레아 제 부족한 샘플이나 세포 배양에서 RNA를 분리 경험을 얻을 것이 좋습니다. 우수한 프로토콜은 성공적으로 RNA 8 작업을위한 점의 다양한 제공이 존재한다.

마우스의 췌장에서 높은 무결성과 RNA를 분리하는 몇 가지 중요한 요인은 여기에보고됩니다. 이들은 균질화 동안 사용 용해 시약의 부피와 RNA 용액에 리보 뉴 클레아 제 억제제의 포함이 (가) 있습니다. 리보 뉴 클레아 제 억제제를 포함하는 방법은 잘 작동하지만 반복 동결 해동 사이클은 결국 인해 리보 뉴 클레아 제 억제제 변성에 대한 가능성, RIN을 줄일 수 있습니다. 그것은 주목해야한다 모든 RNA 솔루션 USED이 연구에서 이전의 RIN의 결정에 하나의 동결 해동을 통해 갔다. 동결 해동시 분해를 감소시키는 또 다른 방법은 침전 형태 2에서 -20 ° C에서 RNA 용액을 저장하는 것이다. 이것은 즉 에탄올을 제거하고 이전의 RNA를 사용하여 펠렛을 다시 용해 약간의 불편 함을 제공합니다. 페놀 / 구아니딘 티오 시아 네이트 시약 프로토콜 2에 비해 프로토콜의 장점은 여기에보고 용해 시약 전문 솔루션 및 버퍼의 준비를 필요로하지 않는 정제 키트 작업의 단순성입니다. 또한,이 프로토콜이 성공적으로 마우스의 췌장에서 작은 RNA를 분리를 위해 사용되었다는 것을 주목해야한다.

추가 팁 췌장 절제술의 속도 전에 안락사 (이소 플루 란 흡입이 2 질식 CO하는 것이 바람직하다)에 마취의 방법을 포함한다. 췌장 수술을 연습에서 여러 가지 시도가 높은 quali에를 기대하기 전에 추천타이 RNA. 비장 또는 폐 등의 리보 뉴 클레아 풍부한 조직에이 프로토콜의 적응은 쉽게 달성 할 수 있어야한다.

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Acknowledgements

우리는 그들의 도움이 의견, 제안 및 자신의 프로토콜을 공유 지안 후아 링, 레이몬드 맥도날드, 갤빈 스위프트, 미셸 그리핀, 폴 Grippo 및 Satyanarayana Rachagani 감사합니다. 이 작품은 부여 U01CA111294와 오하이오 주립 대학 교내 연구 프로그램에서 아이디어 개발의 수상에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Power Gen 500  Fisher Scientific 14-261-03  Homogenizer
5424R Eppendorf Refrigerated microcentifuge
Trizol reagent Invitrogen 15596018 Lysis reagent
Student Vannas spring scissors Fisher 91500-09  Use to cut pancreas from attached tissues
Surgical scissors, 6 inch Fisher 08-951-20 Use to cut scin of mouse
Blunt end forceps Fisher 1381239 Use to hold pancreas while dissecting
Isoflurane USP Abbott Labs 4/8/5210 Anesthetic
Rnase out (40 U/µl) Invitrogen 10777-019 Rnase inhbitor
Rnase Away Ambion 10328-011 General Rnase inactivator
HPLC grade water Fisher W5-4 For washing homogenizer blades
Molecular biology grade water Hyclone SH30538.03 Elution of RNA
miRNeasy Mini kit Qiagen 217004 Purification Kit
2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free USA Scientific Plastics 1620-2700
15 ml centrifuge tubes Falcon 352099
70% ethanol Fisher
100% ethanol Fisher
200 µl pipet tips Rainin GPL200F For cleaning homogenizer blades
Chloroform Fisher BP1145-1
Nanodrop Thermo ND-1000 Spectrophotometer
Bioanalyzer Agilent Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity
RNAlater Ambion RNA Stabilization Reagent 
RNeasy spin columns  Qiagen Spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit
Mice Chales River Strain C57BL/6 Their age ranged from 4 to 12 months.  
Mice  Jackson Lab strain 129 Their age ranged from 4 to 12 months.  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).
  2. Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemistry. 18, 5294-5299 (1979).
  3. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
  4. Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. Simplified and versatile method for isolation of high-quality RNA from pancreas. Biotechniques. 52, 332-334 (2012).
  5. Iyer, V. R., Eisen, M. B., Ross, D. T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J. C., Trent, J. M., Staudt, L. M., Hudson Jr, J., Boguski, M. S., et al. The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum. Science. 283, 83-87 (1999).
  6. Lenstra, J. A., Beintema, J. J. The amino acid sequence of mouse pancreatic ribonuclease. Extremely rapid evolutionary rates of the myomorph rodent ribonucleases. European journal of biochemistry FEBS. 98, 399-408 (1979).
  7. Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40, 617-621 (2006).
  8. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. RNA A Laboratory Manual. Cold Springs Harbor Laboratory Press. Cold Springs Harbor, NY. (2011).
  9. Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4, 37-43 (2009).
  10. Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments JoVE. (2011).

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