בידוד RNA מן העכבר לבלב: רקמות ribonuclease עשיר

1Pharmaceutics & Pharmaceutical Chemistry, The Ohio State University
Published 8/02/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Azevedo-Pouly, A. C., Elgamal, O. A., Schmittgen, T. D. RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue. J. Vis. Exp. (90), e51779, doi:10.3791/51779 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

בידוד של RNA עם יושרה גבוהה נדרש לניסויים בביולוגיה מולקולריים שיגרתי כגון סופג צפוני 9, qRT-PCR 1 או ביטוי פרופיל גנטי 5. רוב השיטות עכשוויות של בידוד RNA מבוססות על שינויים של פרוטוקולי thiocyanate guanidine 2, 3. Thiocyanate guanidine הוא denaturant חלבון חזק ויהיה יעיל לשבש את הפעילות של ribonuclease תחת רוב התנאים. השיטה הפופולרית של Chomczynski וסאקי 3 בשילוב פנול לפתרון תמוגה thiocyanate guanidine, צמצום זמן הבידוד לכ -4 שעות. ריאגנטים מיצוי RNA, זמינים מסחרי רבים מבוססים על Chomczynski וסאקי שיטת 3.

רקמות ribonuclease עשירות כגון לבלב אנושי או עכבר מציגה אתגר נוסף לבידוד RNA. לבלב של עכבר עשוי להכיל עד 75 מ"ג ribonuclease 6 שחלקם ישוחרר דוריןשיבוש גרם של רקמת הלבלב וכתוצאה מכך autolysis רקמות. שינויים של פרוטוקולי thiocyanate guanidine שימשו בהצלחה לבודד RNA מלבלב עם רמה גבוהה של יושרה 2, 4, 7, 10. עירוי של מגיב ייצוב RNA לבידוד בהנחייתם לבלב של עכברים של RNA עם רמה גבוהה של יושרה 4, 7, 10, לעומת זאת עירוי של פתרונות ללבלב דורש מיומנות רבה, עשוי לדרוש מכשירים מיוחדים כגון מיקרוסקופ לנתח ושיבוש ארכיטקטורת רקמה במהלך ההליך עלול לגרום לתמוגה תא. מרוססים רקמות עם מגיב ייצוב RNA עשוי להפריע ליישומים אחרים, כולל בידוד חלבון וצביעה היסטולוגית. יתר על כן, טכניקה זו אינה מתאימה לבידוד RNA מן הלבלב אנושי. פרוטוקולים אחרים דורשים ההכנה של פתרונות ספציפיים על ידי החוקר 2.

אנו מדווחים על פרוטוקול לבודד RNA עם יושרה גבוהה מלבלב עכבר. הפרוטוקול דואר משתמש באלמנטים של שיטות שפורסמו בעבר, והוא מבוסס במידה רבה על הפרוטוקולים סטנדרטי פנול / guanidine מבוסס thiocyanate תמוגה מגיב. היא אינה דורשת ההכנה של פתרונות מיוחדים ואינו דורש עירוי של חומרים כימיים ללבלב. שלבים קריטיים עבור בידוד RNA מוצלח כוללים פנול / מבוסס guanidine מגיב תמוגה גבוהה יחס רקמות, הסרת הרקמה מעוכלת מראש לשלב הפרדה והכללת מעכב ribonuclease לפתרון RNA וכתוצאה מכך. באמצעות אלה ושינויים אחרים, אנחנו בדרך כלל לבודד RNA עם רין יותר מ 7 שישמשו לניתוח ביטוי גנים שבשגרה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה

השיטות הבאות לדבוק במדיניות שנקבעה על ידי הוועדה של המוסד לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC).

  1. מומלץ לבודד לא יותר מ -6 לבלב של עכבר בכל יום נתון. יש את כל מכשירי הניתוח נקיים וautoclaved, סט אחד לכל בעל חיים.
  2. לייבל כל microcentrifuge הצינורות. ארבעה 2 צינורות מיליליטר לכל בעל חיים.
  3. הנח 8 מיליליטר של מגיב תמוגה ב50 צינורות צנטריפוגה מיליליטר על קרח. הערה: בעוד שערכת הטיהור מגיעה עם מגיב פנול thiocyanate guanidine כי הוא מתאים לבידוד לבלב, מגיב תמוגה משמש בשל הכמויות הגדולות הנדרשות לבידוד.
  4. לוותר על 10 מיליליטר מהפתרונים הבאים ל15 צינורות צנטריפוגה מיליליטר לניקוי הלהבים של homogenizer. אתנול, 70% (2 צינורות), מים כיתה HPLC (צינור 1) ומים HPLC כיתה מכילים כ 200 μl של RNase משם או inactivator ribonuclease המקביל.
  5. 2. כירורגיה, Dissection לבלב ולתפעול

    1. הנח 1-2 מיליליטר של isoflurane לתוך צנצנת המכילה מגבות גזה כותנה או נייר. עכברים מונחים על פלטפורמה המונעת מהם להגיע למקור של isoflurane. הוספת isoflurane הטרי לצנצנת לפני הרדמת כל עכבר.
    2. מניח בעדינות את העכבר לתוך הצנצנת המכילה את isoflurane. מכסה את הצנצנת ולנטר את ההשפעות של ההרדמה על ידי בעדינות לסובב את הצנצנת קדימה ואחורה. בעל החיים הוא מורדם פעם אחת זה באינו מסוגל לעמוד ב'משלו.
    3. לאישור של הרדמה, להסיר את החיה מהצנצנת ולהחיל קמצוץ הבוהן משרד. אם העכבר אינו מגיב לקמצוץ הבוהן, המשך לשלב 2.5.
    4. אם העכבר מגיב לקמצוץ הבוהן, ולאחר מכן לחזור על השלבים 2.2-2.3.
    5. מניחים את החיה מורדמת על גבי הספסל במצב המועדים. לנקוע את צוואר הרחם של העכבר על ידי הצבת בחוזקה עם יד שמאל על צוואר הרחם של העכבר. לנוing יד ימין לתפוס את זנבו של העכבר ובמהירות למשוך כלפי מעלה בזווית של כ 45 ° ללנקוע את צוואר הרחם.
    6. לאבטח את הפגר למשטח (חתיכת רמה של קלקר מכוסה במגבות נייר) על ידי פירסינג כל אחת מארבע כפות רגליו של בעל החיים למשטח השטוח באמצעות מחטים תת עורי 25 מד.
    7. שימוש במכשירי ניתוח סטרילי, לחתוך את הבטן של העכבר פתוח ובמהירות להסיר את הלבלב של העכבר. השתמש במלקחיים כדי להחזיק את הלבלב ולחתוך אותו מהטחול והמעי הדק באמצעות מספריים האביב. היזהר לא למתוח את הלבלב במהלך ההסרה מהעכבר. שיבוש של הרקמה יכול לשחרר ribonuclease. הערה: הזמן שנדרש כדי להסיר את הלבלב של העכבר הוא קריטי. אדם מיומן אמור להיות מסוגל לנתח את הלבלב בכ -1 דקות או פחות.
    8. הנח את הלבלב כולו לתוך צינור 50 מיליליטר המכיל 8 מיליליטר של מגיב תמוגה קר כקרח. שווי הצינור ובקצרה לנער לטבול tissue למגיב ולהמשיך לשלב הבא ללא דיחוי. היחס של מגיב תמוגה לרקמה הוא קריטי. ראה סעיף תוצאות עבור השוואה של שלמות RNA מבודדת באמצעות כרכים שונים של מגיב תמוגה.
    9. Homogenize במשך 5 שניות. חשוב ללחוץ על להבי homogenizer לחלק התחתון של צינור צנטריפוגות כדי לאפשר לרקמות להיות מורמות אל תוך הלהבים להומוגניזציה יעילה.

    3. הסרת רקמות מעוכלת

    שים לב: בעקבות הומוגניזציה, פיסות קטנות של רקמה תישאר במגיבה תמוגה. זה יותר חשוב לי lyse הרקמה להשאיר כמה רקמות מעוכלות ולא מעל homogenizing והשפלה סיכון של RNA במהירות.

    1. העברה 2 מיליליטר של מגיב תמוגה מכיל לבלב lysed לצינור microcentrifuge 2 מיליליטר. לאסוף שני צינורות microcentrifuge של homogenate לבידוד. מחק את homogenate שנותר או בחנות ב -80 מעלות צלזיוס למחקרים עתידיים.
    2. סנטrifuge ב 4 ° C, G 12,000 × למשך 5 דקות עד גלולה הרקמות מעוכלת. זהו צעד קריטי כמו שריד של רקמה מעוכלת לפתרונות הבאים של RNA צפוי לזהם את המדגם עם ribonuclease (שלב 5.13).
    3. העברה 1 מיליליטר של supernatant לתוך צינור microcentrifuge 2 מיליליטר. להמשיך בבידוד באופן מיידי ולאחסן את הצינור לשכפל ב -80 ° C לשימוש עתידי. מניחים את כל הצינורות המכילים homogenate על קרח רטוב תוך שתמשיך לשלב הבא.
    4. השלך את מגיב תמוגה נותר לתוך כלי קיבול פסולת כימית מתאים.

    4. ניקוי של להבי Homogenizer

    1. לפני שתמשיך לבידוד הבא, לנקות את להבי homogenizer ידי הצבת אותם ב10 מיליליטר של 70% אתנול. הפעל את homogenizer במשך לכ20 שניות כדי להסיר כל גושים של רקמה שעלולה להיתפס בלהבים.
    2. השתמש קצה 200 pipet μl כדי להסיר כל חתיכות שתישארנה בלהבי homogenizer. חזור על שלב 4.1 במים, inactivator RNase הכללי ו70% אתנול. ייבש את פיר homogenizer עם קים נקייה לנגב.
    3. חזור על שלב 2.1 לבידוד הלבלב של בעלי החיים שנותרו, RNA שמירה מבודד מכל חיה נפרדת ולא איגום RNA.

    5. בידוד RNA

    הסעיף הבא הוא זהה לפרוטוקול ערכת הטיהור. היתרון של ערכת הטיהור הוא שזה יבודד רנ"א הכל כולל RNA הקטן.

    1. אם אתם משתמשים בפתרון homogenate קפוא, להפשיר על קרח רטוב ולתת לעמוד על RT במשך 5 דקות.
    2. הוסף 200 μl של כלורופורם, מכסה את הצינור ולנער במרץ ביד ל15 שניות. בואו הצינור עומד על RT במשך 2-3 דקות.
    3. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 12,000 XG, 4 ° C.
    4. מעביר את השכבה העליונה המימית לתוך צינור microcentrifuge. הוסף 1.5 כרכים של isopropanol ומערבבים היטב על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים.
    5. העבר עד 700 μl של המדגם לעמודת ספין שממוקם בצינור אוסף 2 מיליליטר. סגור את המכסה וצנטריפוגות ב 8,000 XG במשך 15 שניות ב RT.
    6. מחק את הזרימה דרכו.
    7. חזור על שלבים 5.5-5.6, תוך שימוש בשאר המדגם.
    8. הוסף 700 μl הצפת RWT לעמודת הספין. צנטריפוגה במשך 15 שניות ב8,000 x גרם. מחק את הזרימה דרכו.
    9. Pipet 500 μl הצפת הרשתית לעמודת הספין. צנטריפוגה במשך 15 שניות ב8,000 XG לשטוף את העמודה. מחק את הזרימה דרכו.
    10. הוסף 500 μl הצפת הרשתית לעמודת הספין. צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 8,000 XG לייבש את העמודה.
    11. העבר את טור הספין לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. Pipet 80 ללא מים ribonuclease μl ישירות על גבי קרום טור ספין. צנטריפוגה 1 דקות ב8,000 XG לelute RNA.
    12. הוספת מעכב RNase μl 1 לפתרון RNA. אחסן ב-80 ° C או להמשיך ל5.13.
    13. כדי לאמת את השלמות של RNA, לחשב את conce RNA הראשוןיחס ntration ו260/280 באמצעות ספקטרופוטומטר.
    14. לדלל חלק מפתרון RNA כ 500 ng / μl עם מים כיתה ביולוגיה מולקולרית.
    15. לקבוע את Integrity RNA (כלומר, רין) באמצעות ניתוח אלקטרופורזה נימים. כ 5 μl של פתרון RNA הוא מספיק לניתוח.
    16. Aliquot פתרון RNA (ראה איור 2) ולאחסן ב -80 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תשואת רנ"א הכל מ1 מיליליטר של homogenate תמוגה היא 20-40 מיקרוגרם. יחסי 260/280 OD הם בדרך כלל סביב 2.0 ורין הם גדול יותר באופן עקבי מאשר 7.0. אם רין הוא ≤ 6, הבידוד צריך להיות חוזר ונשנה. לפעמים, רין שהוא גבוה יותר מאשר 8.0 מושגת.

שתי שיטות הנפוצות ביותר של הרדמת חסד עכברים לפני ההסרה של הלבלב הן חנק CO 2 או שאיפה של isoflurane. שני טכניקות ואחריו נקע בצוואר הרחם. כיוון שניתן כי זמן הסוכן הכימי ו / או הליך עשוי להשפיע על שלמות RNA, רין של RNA לבלב העכבר מבודד באמצעות שני הטכניקות הושוו. עכברים מורדמים באמצעות חנק CO 2 או שאיפת isoflurane; שני הטכניקות היו במעקב על ידי נקע בצוואר הרחם. הזמן של הרדמת בעלי החיים קודם לנקע בצוואר הרחם היה כ 1 עד 2 דקות יותר לסרבן ומחנק 2 בהשוואה לisoflurane. RNA מבודד בעקבות שאיפה של isoflurane מיוצר רין של 7.5 ± 0.31 לעומת רין של 2.2 ± 0.3 (p <10 -4, ממוצע ± SD, להכין שלוש עותקי בידודים) לCO מחנק 2. השיטה של המתת חסד יש לו השפעה דרמטית על שלמות RNA והטכניקה של שאיפת isoflurane עדיפה ל-CO 2 מחנק.

היושרה של רנ"א מבודד מלבלב של עכבר שהיו הומוגני ב2, 4 ו -8 מיליליטר של מגיב תמוגה הושוו. חוקרים שערנו כי הגדלת הנפח של מגיב תמוגה תביא למידה רבה יותר של איון ribonuclease. מלבד הנפח של מגיב תמוגה, כל התנאים היו זהים לאלה המופיעים בפרוטוקול. לא היה קשר ישיר בין הנפח של מגיב תמוגה משמש בהמגון ושלמות RNA (איור 1). רין של רנ"א מבודד באמצעות 2, 4 ו -8 מיליליטר של מגיב תמוגה היה 4.2, 6.5 ו7.4, בהתאמה (כלומר, בשלושה עותקים הואolations). לכן יש להשתמש 8 מיליליטר של מגיב תמוגה בפרוטוקול זה.

עבור חלק מניסויים, זה עשוי להיות נחוץ כדי לאסוף גם RNA וחלבון מאותו הלבלב. לדוגמא, RNA עשוי לשמש לqRT-PCR וחלבון עשוי להיות דמיינו באמצעות אימונוהיסטוכימיה. אם זה המקרה, מומלץ לחתוך את הלבלב במחצית מהראש ועד זנב. זה חשוב שכן הלבלב שונה מבחינה אנטומית מהראש ועד זנב. כדי להדגים אם כל הבדלים בשלמות RNA קיימים בין רנ"א מבודד או מחצית מהלבלב, הניסוי הבא נעשה. RNA היה מבודד מהמחצית הראשונה של הלבלב. רין נקבע מ-RNA זה הושווה לזה של רנ"א מבודד מהמחצית השנייה של הלבלב לאחר שישב על RT במשך כ 30 שניות במהלך הבדיקות של המחצית הראשונה. רין במחצית הראשונה של לבלב היה 7.4 ± 0.20 לעומת רין של 6.9 ± 0.55 למחצית הבאה. בעת גזירת הלבלב בצורה זו אינה מופיעה לשחרר ribonuclease ועיכול של RNA, אם הלבלב הוא להיות מחולק, מומלץ להשתמש במחצית הראשונה לניתוח RNA והמחצית השנייה לחלבון.

מגיב תמוגה משבש את מבנה חלבון ולכן מפחית את פעילות ribonuclease. בשל הכמות הגדולה של ribonuclease כי קיים בלבלב, זה אפשרי כי כמה ribonuclease פעיל נשאר בhomogenate תמוגה וribonuclease זה לאזן לשלב המימית. כל ribonuclease שנשאר בפתרון RNA האחרון יעכב יושרה. כדי להתגבר על זה, הוספנו מעכב ribonuclease לתמיסה המימית של רנ"א. שלמות RNA הושוותה מפתרון RNA שהכיל מעכב ribonuclease לאחד שלא. עם הפשרת הקפאה אחד, רין לפתרון RNA עם מעכב היה 7.3 ± 0.15 לעומת 2.9 ± 0.65 (איור 2, עמ '<0.001, ממוצע ± SD, להכין שלוש עותקי בידודים) עבורפתרון שלא מכיל מעכב. בעיה נוספת היא האפשרות שחזרה על הפשרת הקפאה לפגל ribonuclease מעכב טיוח זה לא יעיל. כדי לבחון את האפשרות הזו, פתרון של מעכב ribonuclease RNA המכיל הוקפא שוב ושוב ומופשר. פתרונות RNA שהוקפאו והופשרו עד 5 פעמים עדיין מיוצרים רין של 7 ומעלה בזמן שפתרונות אלה שהוקפאו והופשרו 6 פעמים ומעלה מיוצרים רין מתחת 7 (איור 2). מומלץ aliquot פתרון RNA לפני ההקפאה ולהגביל את מספר מחזורי הפשרת הקפאה.

כדי להדגים את התועלת של שיטה זו, ביצענו qRT-PCR על RNA הבודד. ממוצע רין מבידודי RNA שלושה עותקים היה 7.4 ± 0.20 (ממוצע ± סטיית תקן). cDNA דרוך אקראי היה מסונתז מRNA והביטוי של שלושה גנים משק נמדד על ידי qPCR תוך שימוש בטכניקות סטנדרטיות. הנתונים שמוצגים באיור 3 מאמתהיכולת שלנו להשתמש בהצלחה RNA לבלב עכבר בטכניקת ביולוגיה מולקולרית סטנדרטית.

איור 1
איור 1. גבוה מגיב תמוגה יחס רקמות משפר את שלמות RNA. היושרה של רנ"א מבודד מלבלב של עכבר שהיה הומוגני ב2 (A, D), 4 (B, E) או 8 (C, F) מיליליטר של מגיב תמוגה היה בהשוואה. מלבד הנפח של מגיב תמוגה, כל התנאים היו זהים לאלה שבתוארו בפרוטוקול במסמך זה. קשר ישיר קיים בין הנפח של מגיב תמוגה משמש בשלמות המגון ו-RNA. (G) הממוצע ± SD, בידודים שלושה עותקים. p <0.05, 0.001. ** p <אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותרשל נתון זה.

איור 2
איור 2. RNA מדרדרת סופו של דבר על הפשרת הקפאה חוזרת ונשנית. רנ"א מבודד מלבלב העכבר הוקפא שוב ושוב ומופשר בנוכחותו או היעדריו של מעכב ribonuclease (RNase I). ממוצע ± SEM, ** p <0.001.

איור 3
איור 3. QRT-PCR של RNA לבלב העכבר. RNA היה מבודד משלושה לבלב עכבר באמצעות הפרוטוקול האופטימלי. הביטוי של 18S rRNA, β-2 microglobulin וsnoRNA251 נקבע באמצעות qRT-PCR (ממוצע ± סטיית תקן).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בידוד RNA מן הרקמות הribonuclease עשירים מהווה אתגר גדול לניסויים בביולוגיה מולקולריים. ריאגנטים וערכות שונים זמינים באופן מסחרי המבוססים בעיקר על שיטת thiocyanate guanidine פנול של מיצוי RNA. thiocyanate guanidine denatures חלבון ובכך מפחית את הפעילות של ribonuclease. עם זאת, הגודל העצום של ribonuclease בלבלב דורש שינויים נוספים לפרוטוקולים סטנדרטיים של בידוד RNA. פרוטוקול הוא דיווח כאן, המבוסס על שיטת thiocyanate guanidine הסטנדרטי עדיין מכיל כמה שינויים קריטיים כמו גם טיפים לבידוד מוצלח של RNA מרקמות ribonuclease עשירים כגון הלבלב.

הנחיות סטנדרטיות לבידוד RNA יש לציין. טכניקות אלה הן קריטיות לבידוד מוצלח של RNA, גם מדגימות שהם פחות ribonuclease עשיר יותר מלבלב. כמה דוגמאות כוללות באמצעות wa כיתה ביולוגיה מולקולריתter, מתכלה ללא ribonuclease וכלי פלסטיק חד פעמי ולא זכוכית. מומלץ לשנות את הכפפות בין כל בידוד. עבור מישהו שהוא חסר ניסיון עם בידוד RNA, מומלץ שהם לצבור ניסיון עם בידוד RNA מן דגימות ribonuclease העני כגון כבד או מתרביות תאים לפני היציאה לעבודה הדורשת בידוד RNA מן הלבלב. פרוטוקולים מצוינים קיימים שמציעים מגוון רחב של נקודות להצלחה בעבודה עם RNA 8.

מספר גורמים חשובים לבידוד RNA עם יושרה גבוהה מלבלב עכבר מדווחים כאן. אלה כוללים את הנפח של מגיב תמוגה שימוש במהלך המגון והכללת מעכב ribonuclease לפתרון RNA. השיטה כולל מעכב ribonuclease עובדת היטב, מחזורי הפשרת הקפאה זאת חזרו סופו של דבר להפחית את רין, ככל הנראה בשל denaturing מעכב ribonuclease. יצוין, כי כל פתרונות RNA uSED במחקר זה עבר הפשרת הקפאה אחד לפני קביעת רין. שיטה נוספת של הפחתת השפלה על הפשרת הקפאה היא לאחסן את פתרון RNA ב -20 מעלות צלזיוס בצורה זירז 2. זו מציעה כמה טרדות כלומר הסרת אתנול מחדש המסת גלולה לפני השימוש ברנ"א. בהשוואה לפרוטוקולים מגיב thiocyanate פנול / guanidine 2, יתרונות של הפרוטוקול שדווחו כאן הוא הפשטות של עבודה עם מגיב תמוגה וערכת הטיהור שאינו דורשת הכנה של פתרונות ומאגרים מיוחדים. צריך גם לציין כי פרוטוקול זה שמש בהצלחה לבודד RNA קטן מלבלב עכבר.

טיפים נוספים כוללים את המהירות של נתיחת לבלב ואת השיטה של הרדמה לפני המתת חסד (שאיפת isoflurane עדיפה ל-CO 2 מחנק). מספר ניסיונות בתרגול ניתוחי הלבלב מומלצים לפני מצפה quali הגבוהty-RNA. העיבוד של פרוטוקול זה לרקמות ribonuclease עשיר כגון טחול או ריאות צריך להיות בר השגה בקלות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

אנו מודים Jianhua לינג, ריימונד מקדונלד, גאלווין סוויפט, מישל גריפין, פול Grippo וSatyanarayana Rachagani להערות, הצעותיהם מועילות ושיתוף של הפרוטוקולים שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי U01CA111294 מענק ופרס פיתוח רעיון מהביצוע העצמי תכנית המחקר של אוניברסיטת מדינת אוהיו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Power Gen 500  Fisher Scientific 14-261-03  Homogenizer
5424R Eppendorf Refrigerated microcentifuge
Trizol reagent Invitrogen 15596018 Lysis reagent
Student Vannas spring scissors Fisher 91500-09  Use to cut pancreas from attached tissues
Surgical scissors, 6 inch Fisher 08-951-20 Use to cut scin of mouse
Blunt end forceps Fisher 1381239 Use to hold pancreas while dissecting
Isoflurane USP Abbott Labs 4/8/5210 Anesthetic
Rnase out (40 U/µl) Invitrogen 10777-019 Rnase inhbitor
Rnase Away Ambion 10328-011 General Rnase inactivator
HPLC grade water Fisher W5-4 For washing homogenizer blades
Molecular biology grade water Hyclone SH30538.03 Elution of RNA
miRNeasy Mini kit Qiagen 217004 Purification Kit
2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free USA Scientific Plastics 1620-2700
15 ml centrifuge tubes Falcon 352099
70% ethanol Fisher
100% ethanol Fisher
200 µl pipet tips Rainin GPL200F For cleaning homogenizer blades
Chloroform Fisher BP1145-1
Nanodrop Thermo ND-1000 Spectrophotometer
Bioanalyzer Agilent Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity
RNAlater Ambion RNA Stabilization Reagent 
RNeasy spin columns  Qiagen Spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit
Mice Chales River Strain C57BL/6 Their age ranged from 4 to 12 months.  
Mice  Jackson Lab strain 129 Their age ranged from 4 to 12 months.  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).
  2. Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemistry. 18, 5294-5299 (1979).
  3. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
  4. Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. Simplified and versatile method for isolation of high-quality RNA from pancreas. Biotechniques. 52, 332-334 (2012).
  5. Iyer, V. R., Eisen, M. B., Ross, D. T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J. C., Trent, J. M., Staudt, L. M., Hudson Jr, J., Boguski, M. S., et al. The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum. Science. 283, 83-87 (1999).
  6. Lenstra, J. A., Beintema, J. J. The amino acid sequence of mouse pancreatic ribonuclease. Extremely rapid evolutionary rates of the myomorph rodent ribonucleases. European journal of biochemistry FEBS. 98, 399-408 (1979).
  7. Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40, 617-621 (2006).
  8. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. RNA A Laboratory Manual. Cold Springs Harbor Laboratory Press. Cold Springs Harbor, NY. (2011).
  9. Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4, 37-43 (2009).
  10. Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments JoVE. (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats