Isolamento dell'RNA da mouse Pancreas: Un Tessuto ricco Ribonucleasi

1Pharmaceutics & Pharmaceutical Chemistry, The Ohio State University
Published 8/02/2014
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Biology

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Summary

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Azevedo-Pouly, A. C., Elgamal, O. A., Schmittgen, T. D. RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue. J. Vis. Exp. (90), e51779, doi:10.3791/51779 (2014).

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Abstract

Introduction

È necessario isolamento di RNA con grande integrità per esperimenti di routine di biologia molecolare come Northern blotting 9, qRT-PCR 1 o gene expression profiling 5. La maggior parte dei metodi contemporanei di isolamento dell'RNA si basano sulle modificazioni dei protocolli tiocianato di guanidina 2, 3. Guanidina tiocianato è un forte proteina denaturante e verrà efficacemente interrompere l'attività di ribonucleasi in molte condizioni. Il metodo popolare di Chomczynski e Sacchi 3 combinato fenolo alla soluzione di guanidina tiocianato lisi, riducendo il tempo di isolamento per circa 4 ore. Molti reagenti di estrazione dell'RNA commercialmente disponibili sono basati sul metodo Chomczynski e Sacchi 3.

Ribonucleasi ricchi tessuti come umano o il mouse pancreas presenta una sfida aggiuntiva per isolare RNA. Pancreas mouse può contenere fino a 75 mg di ribonucleasi 6, alcune delle quali verrà rilasciato During rottura del tessuto pancreatico conseguente autolisi tessuto. Modifiche dei protocolli guanidina tiocianato sono stati utilizzati con successo per isolare l'RNA da pancreas con alta integrità 2, 4, 7, 10. L'infusione di RNA stabilizzante in topo pancreas facilitato isolamento di RNA con elevata integrità 4, 7, 10, tuttavia infusione di Le soluzioni nel pancreas richiede grande abilità, possono richiedere strumenti specializzati come un microscopio da dissezione e interrompere architettura del tessuto durante la procedura può provocare la lisi cellulare. Perfusione tissutale con reagente stabilizzazione dell'RNA potrebbe interferire con altre applicazioni, tra cui l'isolamento delle proteine ​​e la colorazione istologica. Inoltre, questa tecnica non è adatto per isolare l'RNA da pancreas umano. Altri protocolli richiedono la preparazione di soluzioni specifiche dallo sperimentatore 2.

Riportiamo un protocollo per isolare l'RNA con grande integrità di topo pancreas. The protocollo utilizza elementi dei metodi precedentemente pubblicati ed è in gran parte basata su protocolli standard di fenolo / guanidina a base di tiocianato-lisi reagenti. Non richiede la preparazione di soluzioni specializzate né richiede infusione di reagenti nelle pancreas. Passaggi critici per il successo di isolamento di RNA comprendono un elevato fenolo / guanidina-basato lisi reagente rapporto tra tessuto, la rimozione del tessuto non digerito prima fase la separazione e l'inclusione di un inibitore della ribonucleasi alla soluzione RNA risultante. Utilizzando queste e altre modifiche, di solito isolare l'RNA con RIN superiore a 7 da utilizzare per l'analisi di espressione genica di routine.

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Protocol

1. Preparazione

Le seguenti pratiche aderiscono ai criteri impostati da cura degli animali ed uso commissione dell'Istituzione (IACUC).

  1. Si raccomanda di isolare non più di 6 pancreas di topo in un dato giorno. Hanno tutti gli strumenti chirurgici puliti e sterilizzati in autoclave, un set per ogni animale.
  2. Etichettare tutti i tubi microcentrifuga. Quattro 2 ml provette per animali.
  3. Mettere 8 ml di reagente di lisi in 50 ml provette da centrifuga su ghiaccio. Nota: Mentre il kit di purificazione viene fornito con un guanidina tiocianato reagente fenolo che è adatto per l'isolamento pancreas, reagente di lisi viene utilizzato a causa dei grandi volumi che sono necessari per l'isolamento.
  4. Versare circa 10 ml delle seguenti soluzioni in provette da 15 ml per centrifuga per la pulizia di spazzole del omogeneizzatore. Etanolo, 70% (2 tubi), acqua di qualità per HPLC (1 tubo) e acqua di qualità per HPLC contenente circa 200 ml di RNase via o inattivatore ribonucleasi equivalente.
  5. 2. Chirurgia, Pancreas Dissection e omogeneizzazione

    1. Mettere 1-2 ml di isoflurano in un barattolo contenente garza di cotone o tovaglioli di carta. I topi sono posti su una piattaforma che impedisce loro di raggiungere la fonte del isoflurano. Aggiungi isoflurano fresco al vaso prima di anestetizzare ogni mouse.
    2. Posizionare delicatamente il mouse nel barattolo contenente il isoflurano. Tappare il vaso e monitorare gli effetti dell'anestesia ruotando delicatamente il barattolo avanti e indietro. L'animale viene anestetizzato una volta che è in grado di stare nel suo '.
    3. Per la conferma di anestesia, togliere l'animale dal vaso e applicare un pizzico punta ditta. Se il mouse non reagisce al pizzico punta, passare al punto 2.5.
    4. Se il mouse reagisce pizzico punta, quindi ripetere i passaggi 2,2-2,3.
    5. Posizionare l'animale anestetizzato sul banco in posizione prona. Dislocare cervice del mouse ermeticamente ponendo la mano sinistra sul collo del mouse. Noizione la mano destra afferrare la coda del topo e tirare verso l'alto ad un angolo di circa 45 ° per dislocare la cervice rapidamente.
    6. Fissare la carcassa di una superficie (un pezzo livello di polistirolo ricoperto di carta assorbente) da piercing ciascuno dei quattro zampe dell'animale nella superficie piatta usando 25 calibro aghi ipodermici.
    7. Utilizzando strumenti chirurgici sterili, tagliare la parte mediana del mouse aperta e rapidamente rimuovere il pancreas dal mouse. Utilizzare le pinze per tenere il pancreas e tagliarlo dalla milza e intestino tenue con le forbici a molla. Fare attenzione a non allungare il pancreas durante la cancellazione dal mouse. Turbativa del tessuto potrebbe rilasciare ribonucleasi. Nota: Il tempo necessario per rimuovere il pancreas dal mouse è critica. Un esperto dovrebbe essere in grado di sezionare pancreas di circa 1 minuto o meno.
    8. Porre l'intero pancreas in una provetta da 50 ml contenente 8 ml di ghiaccio freddo reagente di lisi. Tappare la provetta e brevemente agitare per immergere il tiSSUE nel reagente e procedere alla fase successiva senza indugio. Il rapporto di reagente di lisi di tessuto è critica. Vedere la sezione Risultati per un confronto dell'integrità dell'RNA isolato utilizzando diversi volumi di reagente di lisi.
    9. Omogeneizzare per 5 sec. È importante premere le lame omogeneizzatore al fondo della provetta da centrifuga per permettere al tessuto di essere tirato nelle lame di omogeneizzazione efficiente.

    3. Rimozione di tessuto non digerito

    Nota: Dopo omogeneizzazione, piccoli frammenti di tessuto rimarranno nel reagente di lisi. E 'più importante per la lisi rapidamente il tessuto lasciando un po' di tessuto non digerito, piuttosto che su di omogeneizzazione e il degrado rischio di RNA.

    1. Trasferimento di 2 ml di reagente di lisi contenente il pancreas lisati di una provetta 2 ml. Raccogliere due tubi microcentrifuga di omogenato per isolamento. Eliminare l'omogeneizzato rimanente o conservare a -80 ° C per gli studi futuri.
    2. Centrifuge a 4 ° C, 12000 × g per 5 min a pellet tessuto non digerito. Questo è un passo fondamentale, come riporto di tessuto non digerito nelle successive soluzioni di RNA probabilmente contaminare il campione con ribonucleasi (punto 5.13).
    3. Trasferire 1 ml del supernatante in una provetta 2 ml. Procedere con l'isolamento subito e memorizzare il tubo replica a -80 ° C per un uso futuro. Posizionare tutte le provette contenenti omogeneizzato sul ghiaccio bagnato mentre si procede alla fase successiva.
    4. Smaltire il restante reagente di lisi in un apposito contenitore di rifiuti chimici.

    4. Pulizia delle Blades Omogeneizzatore

    1. Prima di procedere all'isolamento successivo, pulire le lame omogeneizzatore mettendoli in 10 ml di etanolo al 70%. Attivare l'omogeneizzatore per circa 20 sec per rimuovere eventuali pezzi di tessuto che può essere catturato nelle lame.
    2. Utilizzare una punta di 200 microlitri pipetta per rimuovere eventuali pezzi che rimangono nelle lame omogeneizzatore. Ripetere il punto 4.1 in acqua, generale inattivatore Rnase e il 70% di etanolo. Asciugare l'albero omogeneizzatore con Kim pulito pulire.
    3. Ripetere il punto 2.1 per l'isolamento pancreas dei rimanenti animali, mantenendo RNA isolato da ogni animale separato piuttosto che mettere in comune l'RNA.

    5. Isolamento RNA

    La sezione seguente è identico al protocollo del kit di purificazione. Il vantaggio del kit di purificazione è che sarà isolare l'RNA totale compreso piccoli RNA.

    1. Se si utilizza la soluzione omogeneizzato congelato, scongelare il ghiaccio umido e lasciate riposare a temperatura ambiente per 5 min.
    2. Aggiungere 200 ml di cloroformio, tappare la provetta e agitare vigorosamente a mano per 15 sec. Lasciate che il tubo di riposare a temperatura ambiente per 2-3 min.
    3. Centrifugare per 15 minuti a 12.000 xg, a 4 ° C.
    4. Trasferire lo strato acquoso superiore in una provetta. Aggiungere 1,5 volumi di isopropanolo e mescolare accuratamente pipettando su e giù parecchie volte.
    5. Trasferimento fino a 700 microlitri di campione in una colonna di spin che viene inserito in un tubo di raccolta da 2 ml. Chiudere il coperchio e centrifugare a 8000 xg per 15 secondi a temperatura ambiente.
    6. Gettare il flow-through.
    7. Ripetere i passaggi 5,5-5,6, con il resto del campione.
    8. Aggiungere 700 microlitri Buffer RWT alla colonna di spin. Centrifugare per 15 sec a 8.000 x g. Gettare il flow-through.
    9. Dispensare 500 microlitri Buffer RPE nella colonna di spin. Centrifugare per 15 sec a 8000 xg per lavare la colonna. Gettare il flow-through.
    10. Aggiungere 500 microlitri Buffer RPE alla colonna di spin. Centrifugare per 2 minuti a 8000 xg per asciugare la colonna.
    11. Trasferire la colonna di selezione per una provetta da 1,5 ml. Dispensare 80 microlitri acqua priva di ribonucleasi direttamente sulla membrana colonna di spin. Centrifugare per 1 min a 8000 xg per eluire l'RNA.
    12. Aggiungere inibitore RNasi 1 microlitri di soluzione di RNA. Conservare a -80 ° C o procedere alla 5.13.
    13. Per convalidare l'integrità dell'RNA, prima calcolare il conce RNAntration e 260/280 rapporto utilizzando uno spettrofotometro.
    14. Diluire una porzione della soluzione di RNA a circa 500 ng / ml con acqua per biologia molecolare.
    15. Determinare l'RNA Integrity (cioè, RIN) utilizzando l'analisi di elettroforesi capillare. Circa 5 ml di soluzione di RNA è sufficiente per l'analisi.
    16. Aliquotare la soluzione RNA (vedere Figura 2) e conservare a -80 ° C.

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Representative Results

La resa RNA totale da 1 ml di omogenato lisi è 20-40 mg. OD 260/280 rapporti sono in genere circa il 2,0 e il RIN sono costantemente maggiore di 7.0. Se il RIN è ≤ 6, l'isolamento dovrà essere ripetuta. Occasionalmente, un RIN che è superiore a 8,0 si ottiene.

I due metodi più comunemente usati di eutanasia topi prima della rimozione del pancreas sono CO 2 asfissia o inalazione di isoflurano. Entrambe le tecniche sono seguiti da dislocazione cervicale. Poiché è possibile che il tempo agente e / o procedimento chimico potrebbe influenzare l'integrità dell'RNA, l'RIN di topo RNA pancreatico isolate utilizzando entrambe le tecniche è stata confrontata. I topi sono stati anestetizzati utilizzando CO 2 asfissia o inalazione isoflurano; entrambe le tecniche sono state seguite per dislocazione cervicale. Il tempo di anestetizzare gli animali prima della dislocazione cervicale è stato di circa 1-2 min più per CO 2 asfissia rispetto al isoflUrane. RNA isolato dopo inalazione di isoflurane prodotto un RIN di 7,5 ± 0,31 a fronte di un RIN di 2,2 ± 0,3 (p <10 -4, media ± SD, triplicare isolamenti) per la CO 2 asfissia. Il metodo di eutanasia ha un impatto drammatico sulla integrità RNA e la tecnica di inalazione isoflurano è preferito a CO 2 asfissia.

L'integrità dell'RNA isolato dal pancreas di topo che sono stati omogeneizzati in 2, 4 e 8 ml di reagente di lisi sono stati confrontati. Abbiamo ipotizzato che aumentando il volume di reagente di lisi porterà ad un maggior grado di inattivazione ribonucleasi. Altro che il volume di reagente di lisi, tutte le condizioni erano identici a quelli elencati nel protocollo. C'era una correlazione tra la quantità di reagente di lisi utilizzato nella omogeneizzazione e integrità dell'RNA (Figura 1). Il RIN di RNA isolato usando 2, 4 e 8 ml di reagente di lisi era 4.2, 6.5 e 7.4, rispettivamente (media, triplice copia èolations). Pertanto, 8 ml di reagente di lisi devono essere utilizzati in questo protocollo.

Per alcuni esperimenti, potrebbe essere necessario raccogliere sia RNA e proteine ​​dalla stessa pancreas. Ad esempio, l'RNA può essere utilizzato per qRT-PCR e proteina può essere visualizzata utilizzando immunoistochimica. Se questo è il caso, si raccomanda di tagliare il pancreas a metà dalla testa alla coda. Questo è importante in quanto il pancreas si differenzia anatomicamente dalla testa alla coda. Per dimostrare se le eventuali differenze integrità dell'RNA esiste tra RNA isolato da due metà del pancreas, il seguente esperimento è stato fatto. RNA è stato isolato dalla prima metà del pancreas. Il RIN determinato da questo RNA è stata confrontata con quella di RNA isolato dalla seconda metà del pancreas dopo seduto a temperatura ambiente per circa 30 secondi durante l'iter della metà iniziale. Il RIN per metà iniziale del pancreas era 7.4 ± 0.20 rispetto a un RIN di 6,9 ± 0,55 per la successiva metà. Mentre il taglio pancreas diquesto modo non sembra rilasciare ribonucleasi e digestione di RNA, se il pancreas deve essere sezionato, si raccomanda di utilizzare il primo tempo per l'analisi dell'RNA e la seconda metà di proteine.

Reagente di lisi interrompe struttura delle proteine ​​e quindi riduce l'attività ribonucleasi. A causa della grande quantità di ribonucleasi che è presente nel pancreas, è possibile che alcune ribonucleasi attiva rimane nella omogenato lisi e questo ribonucleasi sarà equilibrare alla fase acquosa. Qualsiasi ribonucleasi che rimane nella ultima soluzione RNA ostacolerà integrità. Per ovviare a questo, abbiamo aggiunto un inibitore di ribonucleasi alla soluzione acquosa di RNA. L'integrità dell'RNA è stato confrontato da una soluzione di RNA contenente l'inibitore della ribonucleasi a uno che non ha fatto. Su uno disgelo congelamento, il RIN per la soluzione di RNA con inibitore era 7,3 ± 0,15 rispetto a 2,9 ± 0,65 (Figura 2, p <0,001, media ± SD, triplicare isolamenti) per l'soluzione che non conteneva inibitore. Un altro problema è la possibilità che i ripetuti di congelamento scongelamento sarà denaturare il ribonucleasi inibitore rendendola inefficace. Per esaminare questa possibilità, una soluzione di RNA contenente l'inibitore della ribonucleasi è stato più volte congelati e scongelati. Le soluzioni di RNA che sono stati congelati e scongelati fino a 5 volte ancora prodotto un RIN di 7 o superiore, mentre quelle soluzioni che sono stati congelati e scongelati 6 volte o superiore prodotto un RIN inferiore a 7 ​​(Figura 2). Si raccomanda di aliquota della soluzione RNA prima del congelamento e limitare il numero di cicli di congelamento e scongelamento.

Per dimostrare l'utilità di questo metodo, abbiamo effettuato qRT-PCR su RNA isolato. La media RIN da isolamenti di RNA triplicato era 7.4 ± 0.20 (media ± SD). Casuale cDNA innescato stato sintetizzato dall'RNA e l'espressione dei tre geni housekeeping è stata misurata mediante qPCR utilizzando tecniche standard. I dati mostrati nella Figura 3 validatesla nostra capacità di usare correttamente il mouse RNA pancreas in una tecnica di biologia molecolare standard.

Figura 1
Figura 1. Alta lisi reagente rapporto tessuto migliora l'integrità dell'RNA. L'integrità dell'RNA isolato da pancreas di topo che è stato omogeneizzato in 2 (A, D), 4 (B, E) o 8 (C, F) ml di reagente di lisi era rispetto. Altro che il volume di reagente di lisi, tutte le condizioni erano identiche a quelle descritte nel protocollo qui. Esiste una correlazione tra la quantità di reagente di lisi utilizzato nell'integrità omogeneizzazione e RNA. (G) media ± DS, isolamenti in triplicato. p <0.05, ** p <0,001. cliccate qui per vedere una versione più grandedi questa figura.

Figura 2
Figura 2. RNA casualmente degrada dopo ripetute congelamento scongelamento. RNA isolato da topo pancreas è stato più volte congelati e scongelati in presenza o assenza di inibitore della ribonucleasi (RNasi I). Media ± SEM, ** p <0,001.

Figura 3
Figura 3. QRT-PCR di RNA topo pancreatico. RNA è stato isolato da tre pancreas di topo usando il protocollo ottimizzato. L'espressione di 18S rRNA, β-2 microglobulina e snoRNA251 stata determinata utilizzando qRT-PCR (media ± SD).

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Discussion

Isolare RNA da tessuti che sono ribonucleasi ricco rappresenta una grande sfida per esperimenti di biologia molecolare. I vari reagenti e kit sono disponibili in commercio che si basano principalmente sul metodo fenolo guanidina tiocianato di estrazione di RNA. Guanidina tiocianato denatura proteine ​​e quindi riduce l'attività di ribonucleasi. Tuttavia, l'ampiezza delle ribonucleasi nel pancreas richiede ulteriori modifiche ai protocolli standard di isolamento dell'RNA. Un protocollo è riportato qui che si basa sul metodo guanidina tiocianato standard, ancora contiene diverse modifiche critici nonché suggerimenti per successo isolamento di RNA da ribonucleasi ricchi tessuti come il pancreas.

Linee guida standard per isolare l'RNA sono da notare. Queste tecniche sono fondamentali per il successo isolamento di RNA, anche da campioni di meno di pancreas-ricco ribonucleasi. Alcuni esempi includono l'utilizzo wa grado di biologia molecolareter, materiali di consumo privi di ribonucleasi e articoli in plastica usa e getta, piuttosto che di vetro. Si raccomanda di cambiare i guanti tra ogni isolamento. Per chi è inesperto con isolamento di RNA, si raccomanda che guadagnano esperienza con isolamento di RNA da campioni ribonucleasi poveri come il fegato o da colture cellulari prima di intraprendere un lavoro che richiede isolare RNA da pancreas. Esistono protocolli eccellenti che offrono una varietà di punti per lavorare con successo con RNA 8.

Diversi fattori importanti per isolare RNA con grande integrità da topo pancreas sono riportati qui. Questi includono il volume di reagente di lisi utilizzato durante l'omogeneizzazione e l'inclusione di un inibitore di ribonucleasi alla soluzione RNA. Il metodo di includere l'inibitore della ribonucleasi funziona bene, ma ripetuti cicli di congelamento e scongelamento finiranno per ridurre il RIN, probabilmente a causa denaturazione l'inibitore della ribonucleasi. Va notato che tutte le soluzioni di RNA used in questo studio ha attraversato un disgelo congelare prima della determinazione RIN. Un altro metodo per ridurre la degradazione upon disgelo congelamento è di conservare la soluzione RNA a -20 ° C in una forma precipitato 2. Questo offre alcuni inconvenienti cioè rimozione dell'etanolo e ri-dissoluzione del pellet prima di utilizzare l'RNA. Rispetto alle fenolo / guanidina tiocianato protocolli reagente 2, vantaggi del protocollo riportati qui è la semplicità di lavorare con il reagente di lisi e il kit di purificazione che non richiedono la preparazione di soluzioni specializzate e tamponi. Dovrebbe anche essere notato che questo protocollo è stato usato con successo per isolare piccoli RNA da topo pancreas.

Ulteriori suggerimenti includono la velocità di pancreas dissezione e il metodo di anestesia prima dell'eutanasia (isoflurano inalazione è preferito a CO 2 asfissia). Diversi tentativi di praticare la chirurgia del pancreas sono raccomandati prima di anticipare alta Quality RNA. L'adattamento di questo protocollo di tessuti ricchi di ribonucleasi come la milza oi polmoni dovrebbero essere facilmente realizzabile.

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Acknowledgements

Ringraziamo Jianhua Ling, Raymond MacDonald, Galvin Swift, Michelle Griffin, Paolo Grippo e Satyanarayana Rachagani per i loro utili commenti, suggerimenti e condivisione delle loro protocolli. Questo lavoro è stato sostenuto da U01CA111294 sovvenzione e un premio di sviluppo dell'idea del programma di ricerca intramurale Ohio State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Power Gen 500  Fisher Scientific 14-261-03  Homogenizer
5424R Eppendorf Refrigerated microcentifuge
Trizol reagent Invitrogen 15596018 Lysis reagent
Student Vannas spring scissors Fisher 91500-09  Use to cut pancreas from attached tissues
Surgical scissors, 6 inch Fisher 08-951-20 Use to cut scin of mouse
Blunt end forceps Fisher 1381239 Use to hold pancreas while dissecting
Isoflurane USP Abbott Labs 4/8/5210 Anesthetic
Rnase out (40 U/µl) Invitrogen 10777-019 Rnase inhbitor
Rnase Away Ambion 10328-011 General Rnase inactivator
HPLC grade water Fisher W5-4 For washing homogenizer blades
Molecular biology grade water Hyclone SH30538.03 Elution of RNA
miRNeasy Mini kit Qiagen 217004 Purification Kit
2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free USA Scientific Plastics 1620-2700
15 ml centrifuge tubes Falcon 352099
70% ethanol Fisher
100% ethanol Fisher
200 µl pipet tips Rainin GPL200F For cleaning homogenizer blades
Chloroform Fisher BP1145-1
Nanodrop Thermo ND-1000 Spectrophotometer
Bioanalyzer Agilent Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity
RNAlater Ambion RNA Stabilization Reagent 
RNeasy spin columns  Qiagen Spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit
Mice Chales River Strain C57BL/6 Their age ranged from 4 to 12 months.  
Mice  Jackson Lab strain 129 Their age ranged from 4 to 12 months.  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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