RNA-Isolierung aus Maus Pankreas: Eine Ribonuklease-reichen Gewebe

1Pharmaceutics & Pharmaceutical Chemistry, The Ohio State University
Published 8/02/2014
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Biology

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Azevedo-Pouly, A. C., Elgamal, O. A., Schmittgen, T. D. RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue. J. Vis. Exp. (90), e51779, doi:10.3791/51779 (2014).

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Abstract

Introduction

Isolierung von RNA mit hoher Integrität ist für die routinemäßige molekularbiologische Experimente wie Northern Blot 9, qRT-PCR 1 oder Genexpressions 5 erforderlich. Die meisten zeitgenössischen Methoden der RNA-Isolierung werden bei Änderungen der Guanidinthiocyanat Protokolle 2, 3 basiert. Guanidinthiocyanat ist eine starke Proteindenaturierungsmittel und effektiv stören die Aktivität der Ribonuklease unter den meisten Bedingungen. Die beliebte Methode der Chomczynski und Sacchi 3 kombiniert Phenol zu dem Guanidinthiocyanat Lyse-Lösung, die Verminderung der Isolation Zeit, über 4 Stunden. Viele im Handel erhältliche RNA-Extraktion Reagenzien werden von der Chomczynski und Sacchi Methode 3 basierend.

Ribonuklease reichen Geweben wie Mensch oder Maus Bauchspeicheldrüse stellt eine zusätzliche Herausforderung für die Isolierung von RNA. Maus Bauchspeicheldrüse kann bis zu 75 mg Ribonuklease 6 enthalten von denen einige Durin freigegeben werdeng Störung der nachfolgenden Gewebe Autolyse Pankreasgewebe. Modifikationen der Guanidinthiocyanat-Protokolle wurden erfolgreich verwendet, um RNA aus Pankreas mit hoher Integrität 2, 4, 7, 10. Infusion von RNA-Stabilisierung in Maus-Pankreas-Reagens erleichtert Isolierung von RNA mit hoher Integrität 4, 7, 10, jedoch Infusion isolieren Lösungen in der Bauchspeicheldrüse erfordert viel Geschick, können spezialisierte Instrumente wie einem Binokular und stören Gewebearchitektur während des Verfahrens kann in Zell-Lyse führen müssen. Perfusion Gewebes mit RNA-Stabilisierung Reagenz könnte mit anderen Anwendungen, einschließlich der Proteinisolierung und histologischen Färbung stören. Darüber hinaus ist diese Technik nicht geeignet zur Isolierung von RNA aus menschlichen Pankreas. Andere Protokolle erfordern die Herstellung von spezifischen Lösungen durch den Prüfarzt 2.

Wir berichten über ein Protokoll zur RNA mit hoher Integrität von Maus Bauchspeicheldrüse zu isolieren. ThE-Protokoll verwendet Elemente der bisher veröffentlichten Methoden und wird weitgehend von den Standard-Phenol / Guanidinthiocyanat-basierte Lyse-Reagenz-Protokollen. Es erfordert nicht die Herstellung von Speziallösungen noch erfordert es Infusion von Reagenzien in die Bauchspeicheldrüse. Kritische Schritte für eine erfolgreiche RNA-Isolierung sind eine hohe Phenol / Guanidin-basierte Lyse-Reagenz, um Gewebe-Verhältnis, die Entfernung von unverdauten Gewebe vor der Trennung und Aufnahme einer Ribonuklease-Hemmstoff, um die resultierende RNA-Lösung auslaufen. Mit diesen und anderen Modifikationen, die wir in der Regel isolieren RNA mit RIN größer als 7 um Routine Genexpressionsanalyse verwendet werden.

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Protocol

1. Vorbereitung

Die folgenden Praktiken halten sich an die Richtlinien von Animal Care und Verwenden Ausschuss der Institution (IACUC) eingestellt.

  1. Es wird empfohlen, nicht mehr als 6 Maus Pankreas in einem bestimmten Tag zu isolieren. Haben alle chirurgischen Instrumente sauber und autoklaviert, ein Set pro Tier.
  2. Kennzeichnen Sie alle Mikrozentrifugenröhrchen. Vier 2-ml-Röhrchen pro Tier.
  3. Platz 8 ml Lyse-Reagenz in 50 ml Zentrifugenröhrchen auf Eis. Hinweis: Während der Reinigung-Kit kommt mit einem Guanidinthiocyanat Phenol Reagenz, das für Bauchspeicheldrüse Isolation ist, wird Lysereagens wegen der großen Mengen, die notwendig sind pro Isolierung verwendet.
  4. Dispense etwa 10 ml der folgenden Lösungen in 15 ml Zentrifugenröhrchen für die Reinigung der Homogenisator Klingen. Ethanol, 70% (2 Röhren), HPLC-Wasser (1-Rohr) und HPLC-Wasser, das etwa 200 ul RNase Auswärts oder gleichwertig Ribonuklease Inaktivators.
  5. 2. Chirurgie, Bauchspeicheldrüse Dissection und Homogenisierung

    1. Zeigen 1-2 ml Isofluran in ein Gefäß mit Baumwolle Gaze oder Papiertücher. Mäuse werden auf einer Plattform, die sie vor dem Erreichen der Quelle des Isofluran verhindert platziert. Add frischen Isofluran in das Gefäß vor der Anästhesie jede Maus.
    2. Sanft statt mit der Maus in das Glas mit der Isofluran. Verschließen Sie das Glas und die Auswirkungen der Narkose zu überwachen, indem Sie vorsichtig Drehen Sie das Glas hin und her. Das Tier wird anästhesiert, sobald es nicht mehr in seiner eigenen stehen.
    3. Zur Bestätigung der Anästhesie, entfernen Sie das Tier aus dem Glas und tragen Sie eine Firma Zehe Prise. Wenn die Maus nicht auf die Zehen Prise reagieren, gehen Sie zu Schritt 2.5.
    4. Wenn die Maus bis zu den Zehen Prise reagiert, wiederholen Sie die Schritte 2,2 bis 2,3.
    5. Setzen Sie den narkotisierten Tier auf der Werkbank in der Bauchlage. Verrücken der Maus die Zervix durch dicht indem die linke Hand auf der Maus den Gebärmutterhals. Unsten die rechte Hand die Maus am Schwanz und schnell nach oben ziehen ungefähr in einem Winkel von 45 °, um den Muttermund zu verrücken.
    6. Sichern Sie die Karkasse zu einer Oberfläche (eine Stufe Stück Styropor mit Papiertüchern abgedeckt) durch Einstechen in jedem der vier Pfoten des Tieres in die flache Oberfläche mit 25 Gauge Injektionsnadeln.
    7. Mit einer sterilen chirurgischen Instrumenten, schneiden Sie den Mittelteil der Maus öffnen und schnell zu entfernen, die Bauchspeicheldrüse von der Maus. Verwenden Sie die Zange, um die Bauchspeicheldrüse zu halten und schneiden Sie es aus der Milz und Dünndarm mit Feder Schere. Achten Sie darauf, die Bauchspeicheldrüse bei der Entfernung von der Maus zu dehnen. Störung des Gewebes konnte Ribonuklease freizugeben. Hinweis: Die Zeit, die von der Bauchspeicheldrüse der Maus zu entfernen, ist kritisch. Ein Fachmann sollte in der Lage, die Bauchspeicheldrüse in ca. 1 min oder weniger sezieren können.
    8. Legen Sie die gesamte Bauchspeicheldrüse in ein 50-ml-Tube mit 8 ml eiskaltem Lyse-Reagenz. Das Röhrchen und kurz schütteln, um die ti eintauchenusgabe in das Reagenz und fahren Sie mit dem nächsten Schritt ohne Verzögerung. Das Verhältnis von Lysereagenz, um Gewebe ist kritisch. Siehe Abschnitt Ergebnisse zum Vergleich der RNA-Integrität getrennt unter Verwendung unterschiedlicher Mengen von Lysereagenz.
    9. Homogenisieren für 5 Sekunden. Es ist wichtig, die Homogenisator Schaufeln zum Boden des Zentrifugenröhrchens drücken, damit das Gewebe in die Messer für die effiziente Homogenisierung gezogen werden.

    3. Entfernen von Gewebe Unverdaute

    Anmerkung: Nach der Homogenisierung werden kleine Stücke von Gewebe in dem Lysereagenz bleiben. Es ist wichtiger, die so dass einige Gewebe und nicht über Homogenisieren und Risiko Abbau von RNA unverdaut Gewebe schnell aufzulösen.

    1. 2 ml Lyse-Reagenz, das die Lyse der Bauchspeicheldrüse in einem 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Sammeln Sie zwei Mikrozentrifugenröhrchen pro Homogenat Isolation. Entsorgen Sie die verbleibenden Homogenat oder bei -80 ° C für zukünftige Studien.
    2. Centrifuge bei 4 ° C, 12.000 × g für 5 min, um das unverdaute Gewebe zu pelletieren. Dies ist ein kritischer Schritt, da Verschleppung von unverdauten Gewebe in nachfolgenden Lösungen von RNA wahrscheinlich die Probe verunreinigt mit Ribonuclease (Schritt 5.13).
    3. 1 ml des Überstands in ein 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Fahren Sie mit der Isolation sofort und speichern Sie die Wiederholungsrohr bei -80 ° C für die zukünftige Verwendung. Legen Sie alle Röhrchen mit Homogenat auf nassem Eis, während Sie mit dem nächsten Schritt.
    4. Entsorgen Sie die verbleibenden Lyse-Reagenz in eine geeignete chemische Abfallbehälter.

    4. Reinigung der Homogenisator Blades

    1. Bevor Sie mit dem nächsten Isolation, reinigen Sie die Homogenisator Klingen, indem sie in 10 ml 70% Ethanol. Aktivieren Sie den Homogenisator für ca. 20 Sekunden, um alle Stücke von Gewebe, das von den Messern erfasst werden können, zu entfernen.
    2. Verwenden Sie ein 200 ul Pipettenspitze, alle Stücke, die in den Homogenisator Klingen bleiben zu entfernen. Wiederholen Sie Schritt 4.1 in Wasser, allgemeine RNase Inaktivators und 70% Ethanol. Trocknen der Homogenisator Welle mit einem sauberen Kim zu wischen.
    3. Wiederholen Sie Schritt 2.1 für die Bauchspeicheldrüse Isolation der verbleibenden Tiere, halten RNA von jedem Tier trennen, anstatt die Bündelung der RNA isoliert.

    5. RNA-Isolierung

    Der folgende Abschnitt ist identisch mit der Reinigungskits Protokoll. Der Vorteil des Reinigungs-Kits ist, dass sie die Gesamt-RNA auch kleine RNAs zu isolieren.

    1. Wenn Sie gefrorene Homogenisat Lösung, tauen auf nassem Eis und stehen lassen bei RT für 5 min.
    2. In 200 ul Chloroform, Röhrchen verschließen und kräftig mit der Hand für 15 Sekunden. Lassen Sie den Schlauch stehen bei RT für 2-3 min.
    3. Zentrifugieren für 15 min bei 12.000 × g, 4 ° C
    4. Übertragen Sie die obere wässrige Schicht in einem Mikrozentrifugenröhrchen. In 1,5 Volumen Isopropanol und mischen durch Pipettieren von oben und unten mehrmals.
    5. Übertragen Sie bis zu 700 ul der Probe in eine Spin-Säule in ein 2 ml-Sammelröhrchen angeordnet ist. Schließen Sie den Deckel und Zentrifuge bei 8000 g für 15 sec bei RT.
    6. Entsorgen Sie die Durchströmung.
    7. Die Schritte von 5,5 bis 5,6, mit dem Rest der Probe.
    8. Add 700 ul Puffer RWT auf die Spinsäule. Zentrifuge für 15 s bei 8.000 x g. Entsorgen Sie die Durchströmung.
    9. Pipettieren Sie 500 ul Puffer RPE in die Spin-Säule. Zentrifugieren für 15 Sekunden bei 8000 × g, um die Säule zu waschen. Entsorgen Sie die Durchströmung.
    10. Gib 500 ul Puffer RPE auf die Spinsäule. Zentrifugieren für 2 min bei 8.000 × g, um die Säule zu trocknen.
    11. Übertragung der Spin-Säule in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Pipettieren Sie 80 ul Ribonuklease-freies Wasser direkt auf die Spin-Säule Membran. Zentrifugieren für 1 min bei 8.000 × g, um die RNA zu eluieren.
    12. 1 ul RNase-Inhibitor auf die RNA-Lösung. Lagern bei -80 ° C oder fahren Sie mit 5.13.
    13. Um die Unversehrtheit der RNA zu bestätigen, berechnen wir zuerst die RNA concentration und 260/280 Verhältnis mit einem Spektralphotometer.
    14. Verdünnte einen Teil der RNA-Lösung auf etwa 500 ng / &mgr; l mit Molekularbiologie Wasser.
    15. Bestimmen Sie die RNA-Integrität (dh RIN) mit Kapillar-Elektrophorese-Analyse. Etwa 5 &mgr; l RNA-Lösung ist für die Analyse ausreicht.
    16. Aliquot der RNA-Lösung (siehe Abbildung 2) und bei -80 ° C

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Representative Results

Die Gesamt-RNA-Ausbeute aus 1 ml Lyse-Homogenat ist 20-40 ug. OD 260/280 Verhältnisse sind in der Regel rund 2,0 und die RIN sind durchweg größer als 7,0. Wenn das RIN ≤ 6, wird die Isolation müssen wiederholt werden. Gelegentlich wird ein RIN, die höher als 8,0 ist erreicht.

Die beiden am häufigsten verwendeten Methoden der euthanizing Mäuse vor der Entfernung der Bauchspeicheldrüse sind CO 2-Erstickung oder Inhalation von Isofluran. Beide Techniken werden durch zervikale Dislokation gefolgt. Da es möglich ist, dass das chemische Mittel und / oder Verfahren Zeit könnte die Integrität der RNA, die RIN von Maus Bauchspeicheldrüsen RNA isoliert, wobei beide Verfahren wurde im Vergleich zu beeinflussen. Die Mäuse wurden mit CO 2-Erstickung oder Isofluran-Inhalation betäubt; Beide Techniken wurden durch zervikale Dislokation gefolgt. Die Zeit der Betäubung der Tiere vor zervikale Dislokation war etwa 1 bis 2 Minuten länger für CO 2-Erstickung Vergleich zu isoflUrane. RNA isoliert nach Inhalation von Isofluran erzeugt eine RIN von 7,5 ± 0,31 im Vergleich zu einem RIN von 2,2 ± 0,3 (p <10 -4, Mittelwert ± SD, verdreifachen Isolierungen) für CO 2-Erstickung. Die Methode der Sterbehilfe hat einen dramatischen Einfluss auf die RNA-Integrität und die Technik der Isofluran-Inhalation ist bevorzugt, CO 2-Erstickung.

Die Integrität der RNA aus Maus-Pankreas, die in 2, 4 und 8 ml Lyse-Reagenz homogenisiert wurden isoliert wurden verglichen. Wir nahmen an, dass eine Erhöhung des Volumens des Lysereagenz wird zu einem höheren Grad der Ribonuklease Inaktivierung führen. Andere als das Volumen des Lysereagenz, waren alle Bedingungen die gleichen wie in dem Protokoll enthalten sind. Es eine direkte Korrelation zwischen dem Volumen des Lysereagenz in der Homogenisierung und die Integrität der RNA (Abb. 1) verwendet. Die RIN von RNA isoliert mit 2, 4 und 8 ml Lyse-Reagenz war 4,2, 6,5 bzw. 7,4 (Mittelwert, ist dreifacher Ausfertigungolations). Daher 8 ml Lyse-Reagenz sollte in diesem Protokoll verwendet werden.

Für einige Experimente, kann es notwendig sein, sowohl RNA und Protein aus der gleichen Pankreas sammeln. Zum Beispiel kann RNA für qRT-PCR verwendet werden, und Protein kann mittels Immunhistochemie sichtbar gemacht werden. Wenn dies der Fall ist, empfiehlt es sich, die Bauchspeicheldrüse in der Hälfte von Kopf bis Schwanz abgeschnitten. Dies ist wichtig, da die Bauchspeicheldrüse unterscheidet sich anatomisch von Kopf bis Schwanz. Um zu zeigen, ob irgendwelche Unterschiede in der RNA-Integrität zwischen RNA aus jeder Hälfte des Pankreas isoliert vorhanden ist, wurde das folgende Experiment durchgeführt. RNA wurde aus der ersten Hälfte der Bauchspeicheldrüse isoliert. Die RIN aus dieser RNA bestimmt wurde, dass der RNA aus der zweiten Hälfte der Bauchspeicheldrüse isoliert, nachdem es bei der Aufarbeitung der Anfangs Hälfte saß bei RT für ca. 30 Sek. verglichen. Die RIN für die erste Hälfte der Bauchspeicheldrüse betrug 7,4 ± 0,20 im Vergleich zu einem RIN von 6,9 ± 0,55 für die nachfolgende Hälfte. Beim Schneiden in die Bauchspeicheldrüsediese Weise nicht auf Ribonuklease und Verdauung von RNA frei erscheinen, wenn die Bauchspeicheldrüse zu schneidenden, empfiehlt es sich, die erste Hälfte für die RNA-Analyse und die zweite Hälfte für die Protein verwenden.

Lysereagens stört Proteinstruktur und reduziert Ribonukleaseaktivität daher. Aufgrund der großen Menge an Ribonuclease, die in der Bauchspeicheldrüse vorhanden ist, ist es möglich, dass einige aktive Ribonuklease bleibt bei der Lyse und das Homogenat Ribonuklease wird zu der wässrigen Phase zu äquilibrieren. Jede Ribonuklease, die im letzten RNA-Lösung wird bleibt Integrität beeinträchtigen. Um dies zu überwinden, haben wir eine Ribonuklease-Inhibitor zu der wässrigen Lösung von RNA. Die RNA-Integrität wurde von einer RNA-Lösung, die Ribonuklease-Inhibitor, eine, die nicht taten enthalten verglichen. Nach einem Frost-Tau, die RIN für die Lösung der RNA mit Inhibitor betrug 7,3 ± 0,15 im Vergleich zu 2,9 ± 0,65 (Abbildung 2, p <0,001, Mittelwert ± SD, verdreifachen Isolierungen) für denLösung, die nicht-Inhibitor enthielt. Ein weiteres Problem ist die Möglichkeit, dass wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Ribonukleasehemmers macht sie unwirksam zu denaturieren. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, wurde eine Lösung von RNA, die Ribonuklease-Inhibitor wiederholt eingefroren und aufgetaut. Die RNA-Lösungen, die eingefroren und bis zu 5 Mal aufgetaut wurden noch erzeugt eine RIN von 7 oder höher, während die Lösungen, die eingefroren und 6-mal oder mehr aufgetaut wurden produziert eine RIN unter 7 (Fig. 2). Es wird empfohlen, die RNA-Lösung vor dem Einfrieren aliquotiert und die Anzahl der Gefrier-Tau-Zyklen zu beschränken.

Um die Nützlichkeit dieses Verfahrens zu demonstrieren, führten wir qRT-PCR der isolierten RNA. Der Mittelwert aus dreifachen RIN RNA-Isolierungen war 7,4 ± 0,20 (Mittelwert ± SD). Zufällig geprimte cDNA wurde aus RNA synthetisiert, und die Expression von drei Housekeeping-Genen wurde mittels qPCR unter Verwendung von Standardtechniken gemessen. Die in Abbildung 3 gezeigt, validiert Datenunsere Fähigkeit, Maus Bauchspeicheldrüsen RNA erfolgreich zu nutzen in einem molekularbiologischen Standardtechnik.

Figur 1
1. Hoch Lysereagenz Gewebe Verhältnis verbessert die Integrität der RNA. Die Integrität der RNA aus Maus Bauchspeicheldrüsen, die in 2 (A, D) homogenisiert wurde isoliert, 4 (B, E) oder 8 (C, F) ml Lyse-Reagenz war verglichen. Andere als das Volumen des Lysereagenz, waren alle Bedingungen die gleichen wie in der hier beschriebenen Protokoll. Eine direkte Korrelation zwischen dem Volumen des Lysereagenz in der Homogenisierung und die Integrität der RNA verwendet. (G), Mittelwert ± SD, dreifach-Isolationen. p <0,05, ** p <0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Versiondieser Figur.

Figur 2
2. RNA abbaut schließlich nach wiederholtem Einfrieren Auftauen. RNA aus Maus-Pankreas isoliert wurde wiederholt eingefroren und in Gegenwart oder Abwesenheit von Ribonuclease-Inhibitor (RNase I) aufgetaut. Mittelwert ± SEM, ** p <0,001.

Fig. 3
Abbildung 3. QRT-PCR von Maus-Pankreas-RNA. RNA wurde aus drei Maus Bauchspeicheldrüsen mit dem optimierten Protokoll isoliert. Die Expression von 18S rRNA, β-2-Mikroglobulin und snoRNA251 wurde mit qRT-PCR (Mittelwert ± SD) bestimmt.

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Discussion

Isolierung von RNA aus Gewebe, die Ribonuklease reich sind eine große Herausforderung für die Molekularbiologie Experimenten. Verschiedene Reagenzien und Kits sind kommerziell erhältlich, die in erster Linie von dem Phenol Guanidinthiocyanat-Methode der RNA-Extraktion basieren. Guanidinthiocyanat denaturiert Protein und verringert die Aktivität der Ribonuklease damit. Die schiere Größe der Ribonuklease in der Bauchspeicheldrüse benötigt jedoch zusätzliche Modifikationen Standardprotokollen der RNA-Isolierung. Ein Protokoll ist hier, dass auf der Standard-Guanidinthiocyanat Methode wird berichtet, enthält noch einige kritische Änderungen sowie Tipps für die erfolgreiche Isolierung von RNA aus Ribonuklease reichen Geweben wie der Bauchspeicheldrüse.

Standardrichtlinien für die Isolierung von RNA sind zu beachten. Diese Techniken sind entscheidend für die erfolgreiche Isolierung von RNA, auch aus Proben, die weniger Ribonuklease reicher als Bauchspeicheldrüse sind. Einige Beispiele sind mit Molekularbiologie water, Ribonuklease freie Hilfs-und Einweg-Kunststoff-Geschirr statt Glas. Es wird empfohlen, Handschuhe zwischen jedem Isolation ändern. Für jemanden, der unerfahren mit Isolierung von RNA ist, ist es empfehlenswert, dass sie Erfahrung mit Isolierung von RNA aus Ribonuklease-armen Proben wie Leber-oder Zellkulturen vor der Einschiffung auf der Arbeit, die Isolierung von RNA aus Pankreas erfordert zu gewinnen. Ausgezeichnet Protokolle existieren, die eine Vielzahl von Punkten bieten für ein erfolgreiches Arbeiten mit RNA-8.

Mehrere wichtige Faktoren für die Isolierung von RNA mit hoher Integrität von Maus Bauchspeicheldrüse sind hier berichtet. Dazu gehören die Lautstärke der Lyse Reagenz bei der Homogenisierung und die Aufnahme einer Ribonuklease-Hemmstoff, um die RNA-Lösung. Das Verfahren einschließlich der Ribonukleasehemmers gut funktioniert, wird aber wiederholtes Einfrieren und Auftauen schließlich reduzieren die RIN, wahrscheinlich aufgrund Denaturierung der Ribonuklease-Inhibitor. Es sollte beachtet werden, dass alle RNA-Lösungen used in dieser Studie ging durch ein Frost-Tau vor RIN Bestimmung. Ein weiteres Verfahren zur Verringerung des Abbaus bei Frost-Tau ist, die RNA-Lösung bei -20 ° C in einem gefällter Form 2 zu speichern. Dies bietet einige Nachteile, nämlich Entfernen des Ethanols und Wiederauflösen des Pellets vor der Verwendung des RNA. Im Vergleich zu den Phenol / Guanidinthiocyanat Reagenz Protokolle 2 Vorteile der Protokoll gemeldet hier ist die Einfachheit der Arbeit mit Lyse-Reagenz und Reinigung Kit, das nicht Herstellung von Speziallösungen und Puffer erfordern. Es sollte auch angemerkt, dass dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um kleine RNAs, die von der Bauchspeicheldrüse der Maus zu isolieren.

Weitere Tipps sind: die Geschwindigkeit der Bauchspeicheldrüse Dissektion und die Methode der Anästhesie vor der Euthanasie (Isofluran-Inhalation ist bevorzugt, 2 Ersticken CO). Mehrere Versuche bei der Durchführung der Bauchspeicheldrüse werden vor der Operation erwarten hohe Quali empfohlenty-RNA. Anpassung des Protokolls zu Ribonuklease-reichen Geweben wie der Milz oder Lunge sollte leicht erreichbar sein.

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Acknowledgements

Wir danken Jianhua Ling, Raymond MacDonald, Galvin Swift, Michelle Griffin, Paul Grippo und Satyanarayana Rachagani für ihre hilfreichen Kommentare, Anregungen und Austausch ihrer Protokolle. Diese Arbeit wurde durch Gewährung U01CA111294 und einer Idee Development Award von der Ohio State University Interne Research Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Power Gen 500  Fisher Scientific 14-261-03  Homogenizer
5424R Eppendorf Refrigerated microcentifuge
Trizol reagent Invitrogen 15596018 Lysis reagent
Student Vannas spring scissors Fisher 91500-09  Use to cut pancreas from attached tissues
Surgical scissors, 6 inch Fisher 08-951-20 Use to cut scin of mouse
Blunt end forceps Fisher 1381239 Use to hold pancreas while dissecting
Isoflurane USP Abbott Labs 4/8/5210 Anesthetic
Rnase out (40 U/µl) Invitrogen 10777-019 Rnase inhbitor
Rnase Away Ambion 10328-011 General Rnase inactivator
HPLC grade water Fisher W5-4 For washing homogenizer blades
Molecular biology grade water Hyclone SH30538.03 Elution of RNA
miRNeasy Mini kit Qiagen 217004 Purification Kit
2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free USA Scientific Plastics 1620-2700
15 ml centrifuge tubes Falcon 352099
70% ethanol Fisher
100% ethanol Fisher
200 µl pipet tips Rainin GPL200F For cleaning homogenizer blades
Chloroform Fisher BP1145-1
Nanodrop Thermo ND-1000 Spectrophotometer
Bioanalyzer Agilent Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity
RNAlater Ambion RNA Stabilization Reagent 
RNeasy spin columns  Qiagen Spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit
Mice Chales River Strain C57BL/6 Their age ranged from 4 to 12 months.  
Mice  Jackson Lab strain 129 Their age ranged from 4 to 12 months.  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).
  2. Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemistry. 18, 5294-5299 (1979).
  3. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
  4. Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. Simplified and versatile method for isolation of high-quality RNA from pancreas. Biotechniques. 52, 332-334 (2012).
  5. Iyer, V. R., Eisen, M. B., Ross, D. T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J. C., Trent, J. M., Staudt, L. M., Hudson Jr, J., Boguski, M. S., et al. The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum. Science. 283, 83-87 (1999).
  6. Lenstra, J. A., Beintema, J. J. The amino acid sequence of mouse pancreatic ribonuclease. Extremely rapid evolutionary rates of the myomorph rodent ribonucleases. European journal of biochemistry FEBS. 98, 399-408 (1979).
  7. Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40, 617-621 (2006).
  8. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. RNA A Laboratory Manual. Cold Springs Harbor Laboratory Press. Cold Springs Harbor, NY. (2011).
  9. Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4, 37-43 (2009).
  10. Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments JoVE. (2011).

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