Tandem congelación de alta presión y la rápida congelación de sustitución de tejidos vegetales para Microscopía Electrónica de Transmisión

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bobik, K., Dunlap, J. R., Burch-Smith, T. M. Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (92), e51844, doi:10.3791/51844 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Dado que el microscopio electrónico de transmisión de 1940 (TEM) ha estado proporcionando los biólogos con imágenes ultra-alta resolución de los materiales biológicos. Sin embargo, debido a los protocolos laboriosos y lentos que también exigen experiencia en la preparación de las muestras libres de artefactos, TEM no se considera una técnica fácil de usar. Preparación de la muestra tradicional para TEM utiliza fijadores químicos para preservar las estructuras celulares. Congelación de alta presión es la criofijación de muestras biológicas bajo altas presiones para producir velocidades de enfriamiento muy rápidas, restringiendo así la formación de hielo, que es perjudicial para la integridad de la ultraestructura celular. Congelación de alta presión y la sustitución de congelación son actualmente los métodos de elección para la producción de la morfología de la más alta calidad en las secciones de resina para TEM. Estos métodos reducen al mínimo los artefactos normalmente asociados con el procesamiento convencional para TEM de secciones delgadas. Después de criofijación el agua congelada en la muestra se sustituye con el líquidodisolvente orgánico a bajas temperaturas, un proceso llamado sustitución de congelación. Sustitución Freeze se lleva a cabo normalmente durante varios días en dedicado, equipos costosos. Una reciente innovación permite que el proceso se completará en tres horas, en lugar de los habituales dos días. Esto es seguido por varios días más de preparación de la muestra que incluye la infiltración y la incrustación en resinas epoxi antes de seccionar. Aquí se presenta un protocolo que combina la congelación de alta presión y la sustitución de congelación rápida que permite la fijación de la muestra planta para llevar a cabo en cuestión de horas. El protocolo puede adaptarse fácilmente para trabajar con otros tejidos u organismos. Los tejidos vegetales son de especial preocupación debido a la presencia de espacios aireados y vacuolas llenas de agua que impiden la congelación sin hielo de agua. Además, el proceso de fijación química es especialmente larga en las plantas debido a las paredes celulares que impiden la penetración de los productos químicos a lo profundo dentro de los tejidos. Los tejidos de plantas son, por lo tanto particcialmente difícil, pero este protocolo es confiable y produce muestras de la más alta calidad.

Introduction

Nuestro conocimiento de la ultraestructura de células proviene principalmente de microscopía electrónica, que puede resolver detalles en el intervalo de unos pocos nanómetros 1. A pesar de ser tan poderoso en la resolución TEM no se considera fácil de usar, como preparación de la muestra requiere mucho tiempo y protocolos laboriosas, y exige cierta experiencia del practicante. Fijación tradicional de las muestras ha combinado el uso de aldehídos y tetróxido de osmio antes del procesamiento adicional que incluye la deshidratación, incrustación de resina y luego en seccionar para producir secciones ultra-delgada que se tiñen con metales pesados. Sin embargo, se sabe que la fijación química puede producir artefactos incluyendo la agregación de proteínas y la pérdida de lípidos 1, y cambios a las membranas que afectan en última instancia varios compartimentos celulares 2. Estos artefactos se atribuyen en gran parte a la lenta tasa de fijación y deshidratación a temperatura ambiente 3, 4, 5.

6, 7. HPF disminuye un la temperatura de la muestra a la de nitrógeno líquido, a muy alta presión (210 MPa o 2.100 bar) en milisegundos. Cuando se hace correctamente HPF previene la formación de grandes cristales de hielo que pueden causar grandes daños a ultraestructura celular. HPF se puede utilizar para fijar muestras de 100-200 micras de espesor en concentraciones típicas de solutos biológicos 7. Hay numerosas opiniones sobre la física y los principios subyacentes HPF, por ejemplo, 1, 7, 8.

Después de HPF, las muestras se incubaron a temperatura baja (-78,5 ° C a -90 y# 176; C) en presencia de disolvente que contiene fijadores químicos líquidos orgánicos como tetróxido de osmio, generalmente para unos pocos días. A esta baja temperatura, el agua en la muestra se sustituye por el disolvente orgánico, típicamente acetona o metanol 1, 9. Por lo tanto, este proceso se denomina sustitución de congelación (FS). La muestra se calentó gradualmente y durante este tiempo se fija, por lo general con tetróxido de osmio y acetato de uranilo 9. La reticulación a bajas temperaturas tiene la ventaja de la fijación de moléculas que están inmovilizadas 1. FS, por tanto, produce muestras de calidad superior en comparación con los fijados por la fijación química convencional a temperatura ambiente, en particular, que resulta en una mejor conservación ultraestructural, mejor conservación de la antigenicidad y la reducción de la pérdida de los componentes celulares no unidas 10, 11.

La mayoría de FS se lleva a cabo durante períodos de tiempo largos, normalmente de hasta varios días. Esto es particularmente true para las plantas muestras 12, 13, 14. Un reciente protocolo desarrollado por McDonald y Webb reduce en gran medida el tiempo de FS desde varios días hasta unas pocas horas 15. En su procedimiento de rápida sustitución de congelación (QFS), FS se lleva a cabo más de 3 horas, mientras que en el FS súper rápidas (SQFS) muestras se procesan en 90 minutos. La calidad de las muestras producidas por estos métodos es comparables a los generados por los protocolos de FS tradicionales. Hemos adoptado el protocolo QFS para el procesamiento posterior de las muestras de plantas después de HPF. Esto ha demostrado ahorrar no sólo tiempo, sino también dinero, como QFS y SQFS utilizan equipos de laboratorio común en lugar de las costosas máquinas FS disponibles comercialmente.

Los tejidos vegetales son a menudo muy difícil de preparar para TEM. En promedio, las células vegetales son más grandes que cualquiera de las células bacterianas o de animales. La presencia de cutícula cerosa hidrófobo, paredes celulares gruesas, grandes vacuolas llenas de agua que contienen ácidos orgánicos, hidrolasas y c fenólicocomuestos que pueden ocupar hasta el 90% del volumen total de células 16, y la presencia de espacios aireados disminuye gravemente la conductividad de calor del sistema 17. Además, en el caso de las plantas, el espesor de la muestra casi siempre supera 20 m, el límite para el uso de la fijación química. En estos espesores, la baja conductividad de calor de agua evita una tasa de congelación más de -10 000 ° C / seg en el centro de la muestra. Se requiere que la tasa para evitar la formación de hielo hexagonal perjudicial (cristales de hielo con una densidad más baja y más grande que de 10 a 15 nm) 8. Juntos, estos presentan desafíos tanto a congelación adecuada de la muestra y FS posteriores. No obstante, criofijación es el mejor método para la fijación de muestras de plantas. Aquí se presenta un protocolo para HPF-QFS de muestras de tejidos vegetales. Se centra en la especie modelo Arabidopsis thaliana, pero también se ha utilizado con Nicotiana benthamiana. Los resultados típicos demuestran que HPF-QFS produce samples de calidad comparable a la tradicional HPF-FS en una fracción del tiempo. Con los ajustes adecuados, este protocolo puede usarse también para otras muestras biológicas relativamente gruesas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOTA: El procedimiento QFS requiere extremo cuidado y precaución por el usuario y le prestamos atencion a estas precauciones de seguridad aquí como precauciones y notas en su caso.

1.Preparación para HPF Run

  1. Antes de comenzar la preparación de muestras, encienda el congelador de alta presión siguiendo las instrucciones del fabricante.
    NOTA: La unidad HPF utilizada en este protocolo es una unidad compacta Wohlwend 02 (Figura 1), y se tarda aproximadamente una a una hora y media de procedimiento de puesta en marcha antes de HPF se ejecuta puede comenzar.
    1. Encender el Wohlwend compacto de alta presión 02 congelador.
      1. Encienda el instrumento girando el interruptor principal de "0" a "1".
      2. Liberar el aire comprimido a la máquina.
      3. Liberación de nitrógeno líquido a la máquina.
      4. Presione el botón "SYSTEM DRY UP".
      5. Después de 30 minutos, pulse el botón "SYSTEBotón de nuevo M DRY UP ".
      6. Presione el botón "ON / OFF" para encender el instrumento.
      7. Pulse el botón "NITROGENO".
      8. Deje que la máquina se enfríe durante 20 minutos, incluso si el "DRIVE IN" botón ya ha iluminado.
      9. El "DRIVE IN" botón se ilumina.
      10. Pulse el "DRIVE IN" botón.
      11. Pulse el botón "AUTO".
      12. Los "SISTEMA LISTO" botón se ilumina.
      13. Coloque la sonda de temperatura y de presión en la cámara de presión y fijarlo con el pasador.
      14. Pulse el botón "AUTO JET". Este paso comprueba que el aumento de presión y el descenso de la temperatura son tan deseada; esencialmente una prueba. Se espera que las fuertes caídas de temperatura y fuertes aumentos de presión (Figura 1B).
      15. Realizar dos ciclos más JET.

2. Preparación para ReceiviLas muestras congeladas ng

  1. Rellena una caja aislada que contiene los titulares criovial con nitrógeno líquido (véase Advertencias de seguridad), por lo que los titulares están cubiertos completamente (Figura 1C).
    NOTA: Use PPE incluyendo cryogloves y gafas al manipular el nitrógeno líquido.
  2. Coloque el número apropiado de viales que contienen el medio FS en los soportes de tubo de aluminio en el nitrógeno líquido (Figura 1C). Con este protocolo hasta cuatro discos que contienen cada uno una sola muestra se puede colocar en una sola criovial.
    NOTA: Los viales deben ser etiquetados con un instrumento afilado como un escriba con punta de diamante y un lápiz muy suave.
    1. Para fijador durante QFS utilizar 1% OSO 4 y 0,1% de acetato de uranilo en acetona 9. Preparar la solución en gran volumen, dispensar alícuotas de 1,5 ml en crioviales y tienda de congelados en nitrógeno líquido.
      NOTA: los avisos de seguridad para el manejo de OsO4 y acetato de uranilo.
      NOTA: OsO4 NOTA: Los crioviales se utiliza para mantener las muestras para QFS debe tener una junta tórica duro para asegurar que los tubos se mantendrán sellados durante QFS para evitar fugas de OsO4.
  3. Prepare la pasta de levadura mezclando la levadura del pan, con un volumen aproximadamente igual de metanol al 10% con un palillo de dientes u otro objeto similar hasta que la pasta esté suave. La pasta de levadura actúa como un crioprotector extracelular y se utiliza para llenar el espacio alrededor de la muestra en el portamuestras. La cantidad de pasta depende del número de muestras; para 10 muestras o menos la pasta (1 ml) se pueden mezclar en un tubo de microcentrífuga.

Congelación 3. de alta presión de las Muestras

  1. Quite una hoja (u otro tejido) de interés por parte de la planta y suavemente colóquelo sobre un trozo de dental de cera u otra superficie de corte. Use un punzón de 2,0 mm o tamaño deseado para cortar una muestra de la hoja. Maneje la muestra suavemente con un par de pinzas y trabajar lo más rápido posible.
  2. Trabajando bajo un microscopio de disección, coloque el disco de hoja en el lado de 0,2 mm del tipo A portador de muestras y cubrir por completo en la pasta de levadura. Asegúrese de que el disco está completamente lleno y la pasta esté al nivel del borde del soporte al suavizar la pasta con un pincel fino (Figura 2).
  3. Coloque el soporte en el soporte de la muestra. Cubra la muestra con la muestra portadora Tipo B, superficie plana hacia abajo.
    NOTA: El soporte de la muestra debe estar seco ya temperatura ambiente.
  4. Toma de muestras en el soporte de muestra; poner en la máquina e iniciar un ciclo de congelación presionando el botón "AUTO JET", que debe completar en un segundo o dos.
  5. Trabajar lo más rápido posible, retire el soporte de la máquina y colocar la punta de la celebración de la sample en nitrógeno líquido en la caja aislada en la parte superior de la máquina HPF. Sumergir las puntas de dos pares de pinzas en el nitrógeno líquido para enfriar ellos.
    NOTA: Después de la congelación, los transportistas sólo deben ser manipulados con pinzas de nitrógeno líquido refrigerado. (Temperatura ambiente) pinzas calientes son a menudo la causa de la falla en cryotechniques.
  6. Abra una criovial que contiene los medios de comunicación FS, y coloque la tapa en el lado de la caja. Con la ayuda de un par de fórceps enfriado con nitrógeno líquido, eliminar suavemente el disco de la portamuestras, asegurándose de que el disco está siempre en el nitrógeno líquido o vapor. Trabajar en el vapor de nitrógeno líquido, sostenga el tubo FS con uno fórceps pre-enfriado y utilizar la otra para colocar el soporte en el vial FS. Tornillo de la tapa del vial FS de nuevo. No cualquier trampa de nitrógeno líquido en el vial.
    NOTA: Cuando se transfieren las muestras a crioviales de QFS, garanticen que ninguna de nitrógeno líquido queda atrapado en los viales. El nitrógeno líquido se expande 700 veces durante el calentamiento y cualquier trapped nitrógeno líquido puede causar explosiones durante este tiempo.
  7. Repita los pasos 3.1 a 3.7 hasta que se congelan todas las muestras deseadas. Discos de hojas múltiples que contienen el mismo tipo de muestra se pueden colocar en el mismo vial. Tenga en cuenta que el soporte de la muestra tiene que ser secado y se llevó a temperatura ambiente, entre carreras de congelación. Para hacer esto de manera rápida, calentarlo con un secador de pelo, y controlar su temperatura por medio del tacto.

4 Preparación para Congelar Sustitución

  1. Inmersa por completo el bloque calentador de aluminio en nitrógeno líquido durante 10 minutos o hasta que deje de ebullición nucleada. Mientras esto sucede, coloque una capa de hielo seco (1-2 cm) en la parte inferior del recipiente utilizado como cámara de FS (Figura 3). Un recipiente de espuma de poliestireno o cubo de hielo se pueden utilizar para FS, junto con pellets de hielo seco o aplastado.
  2. Inserte rápidamente los crioviales que contienen las muestras junto con la sonda de temperatura en las filas centrales del bloque del calentador. Asegúrese de que las tapas de laviales están firmemente atornillados de manera que los medios de comunicación FS no se escape durante la FS. Comience a registrar la temperatura.
    1. Hacer la sonda de temperatura mediante la colocación de un termopar a través de la parte superior de un criovial para que llegue a la parte inferior del tubo. Sellar la tapa del tubo con resina de forma que no haya fugas de líquido fuera. Llenar el tubo con 1,5 ml de acetona al inicio de cada ejecución QFS.
  3. Usando cryogloves aislados o grandes pinzas, derramará todo el nitrógeno líquido desde el bloque del calentador. Tenga cuidado de no derramar los crioviales.
    NOTA: Use PPE incluyendo cryogloves y gafas al manipular el nitrógeno líquido.
  4. Coloque el bloque que contiene los viales sobre la capa de hielo seco en la cámara de QFS. Asegúrese de que el bloque se coloca de manera que los tubos están en posición horizontal pero con una ligera inclinación hacia arriba. No debe haber fugas si se utilizan los crioviales correctos.
  5. Empaque la cámara de QFS con hielo seco de manera que los tubos FS están cubiertos, aunque no es necesariocubrir la parte superior del bloque. Coloque la tapa en la cámara.

5. FS Rápida

NOTA: Realice la carrera QFS en una campana de humos en caso de que cualquier fuga de OsO4 ocurre inadvertidamente a pesar de otras precauciones.

  1. Coloque cámara de QFS en un agitador rotatorio plataforma en una campana de humos y girar a 125 rpm durante 120 min. Durante este tiempo la temperatura del bloque debe aumentar gradualmente a aproximadamente -80 ° C. La agitación se asegura la mezcla de los componentes de mejores FS.
    NOTA: La colocación de la coctelera en la campana de humos y la posición de la puerta campana de humos debe ser la misma durante todo el procedimiento QFS y por cada QFS ejecutar para asegurar el calentamiento consistente de muestras.
  2. Retire el hielo seco de la cámara y continuar agitando durante otra hora.
    NOTA: la temperatura debe aumentar a alrededor de -15 ° C a -20 ° C.
  3. Retire las muestras y la sonda de temperatura de la cámara de QFS y colocarlo en elagitador a temperatura ambiente durante otros 10-15 minutos, hasta que alcancen la temperatura ambiente. Detener la grabación de la temperatura.
  4. Durante FS, apague la máquina de HPF.
    1. Cierre la llave del tanque de nitrógeno líquido, mientras que la máquina de HPF se llena con nitrógeno.
    2. Pulse el botón "NITROGENO".
    3. Espere hasta que los rojos "pistón hacia abajo" se apaga la luz.
    4. Presione el botón "ON / OFF".
    5. Presione el botón "SYSTEM DRY UP".
    6. Corte el suministro de aire comprimido para la máquina.
    7. Después de un mínimo de 12 horas (para asegurar el secado de la humedad), apague la máquina girando el interruptor principal de "1" a "0".

6. Mensaje FS Procesamiento

  1. Retire con cuidado los medios de comunicación FS con pipetas de transferencia de plástico y colocar en el recipiente apropiado para desechos tóxicos.
    NOTA: OsO4 y acetato de uranilo son productos químicos peligrososy debe ser manejado en la campana de extracción, mientras que use el equipo de protección personal (PPE), incluyendo zapatos cerrados, bata de laboratorio y guantes.
  2. Lávese las muestras cuatro veces con acetona al 100%. Recoge los dos primeros lavados y colocarlo en el contenedor de residuos tóxicos.
  3. Con unas pinzas finas, eliminar las muestras de tejido de los titulares. Mantener las muestras mojado con acetona como se hace esto, y trabajar con mucho cuidado para evitar romper las muestras.
    NOTA: No es inusual y que en realidad puede ser útil disponer de la pasta de levadura se alejan de las muestras en este punto. La pasta de levadura es generalmente de color marrón muy oscuro, mientras que el tejido de la hoja aún está verde.
  4. Recoger las muestras en crioviales que contienen acetona. Proceder a la preparación de muestras (infiltración y la incrustación) para TEM de acuerdo a los protocolos habituales.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Los resultados presentados a continuación han sido obtenidos utilizando un Wohlwend compacto 02 para HPF (Figura 1A). Una gran ventaja de este instrumento es la facilidad de uso de los portadores de muestra y sus titulares. Si se utilizan otros instrumentos, McDonald recomienda que dos usuarios deben llevar a cabo la preparación de la muestra y HPF, una preparación de las muestras, mientras que el otro hace la congelación y traslado al FS crioviales 9. Sin embargo, la Wohlwend espécimen transportistas y titular son bastante fáciles para un solo usuario manipular de forma independiente (Figura 2A, B, E, F y G). Cabe señalar sin embargo, que uno debe realizar algunas corridas de prueba para familiarizarse con el instrumento HPF antes de trabajar con muestras valiosas. Un usuario experimentado debería ser capaz de solucionar varios (10 o más) muestras en una hora. Sin embargo, los principios presentados en este protocolo se pueden utilizar con cualquiera de las máquinas HPF disponibles comercialmente.

Quizásla parte más crítica del procedimiento de HPF-QFS es la preparación de la muestra para la carga en el portador de muestras (Figura 2C). Aunque esto puede no ser intuitivo, es el paso en el protocolo a través del cual el investigador tiene el mayor control. La máquina HPF es robusto, y con el uso y mantenimiento adecuado debe producir los cambios esperados en la presión y la temperatura con poca variación entre muestras. Si una muestra es mal manejado durante la preparación y luego hay otro paso redimirá el daño así causado. Los tejidos vegetales son bastante fáciles de manipular durante esta etapa del proceso, ya que no se cultivan en medio y sus paredes células dan las células buena resistencia. No obstante, es importante que las muestras son manejadas rápidamente para evitar cambios ultraestructurales que resultan de la eliminación de la planta madre y para limitar el estrés y las respuestas hirientes. El portador de muestras más pequeño que puede acomodar una muestra debe ser usado para asegurar HPF eficiente y consistente (Fig2C URE). Por último, el portador de muestras debe ser llenado, pero no desbordante (Figura 2D). El portador de muestras de llenado se inserta fácilmente en la máquina para la congelación de HPF (Figura 2 H e I).

Los primeros pasos en el protocolo QFS puede ser un reto para un principiante, por lo que se recomienda que dos personas deben trabajar juntos hasta que los usuarios se sientan cómodos con el procedimiento (Figura 3A-E). Se debe tener cuidado en todo momento al manipular el nitrógeno líquido y el acetato de tetróxido de osmio y fijadores de uranilo. Una curva típica para los cambios de temperatura durante QFS se muestra en la figura 2J. La temperatura aumenta rápidamente desde -196 ° C, la temperatura del nitrógeno líquido, a aproximadamente -80 ° C. Es a temperaturas de alrededor de -78 ° C a -90 ° C que se cree que se produzca la sustitución de congelación 9. Un paso difícil en el protocolo QFS es la eliminación de hielo seco después de 2 horas de FS. Eneste paso, el mal manejo de las muestras puede producir un aumento en las temperaturas. Para ello, el bloque calentador debe levantarse rápidamente fuera de la cámara utilizando una QFS cryoglove y el hielo seco rápidamente se vertió en un recipiente secundario.

HPF se ha utilizado para fijar diversos tejidos de plantas incluyendo hojas de Nicotiana benthamiana y las hojas de Arabidopsis y embriones. Es un reto para fijar las muestras de las hojas maduras debido a las grandes vacuolas centrales de la mayoría de las células. Las hojas más jóvenes contienen vacuolas más pequeñas, pero los tricomas son por lo general bastante densas. La presencia de los tricomas puede hacer que sea difícil para empacar las muestras con pasta de levadura, pero se debe tener cuidado para asegurarse de que esto se hace adecuadamente para reducir al mínimo la cantidad de aire atrapado entre la superficie de la hoja y la pasta. El aire atrapado se impedir la transferencia de calor durante el HPF y reducir la calidad de la fijación. Esto es cierto para cualquier muestra.

Después muestras HPF y QFS se pueden preparar para viewing bajo el TEM mediante la infiltración y la incrustación de resina. Secciones delgadas de 65-100 nm a continuación, pueden ser preparados por el corte. Los resultados típicos se muestran en la Figura 4. Las imágenes mostradas son todas de muestras de hojas de Arabidopsis. Las membranas plasmáticas son típicamente suave y apretado contra la pared de la célula, un signo de buena fijación (Figura 4 A, C y E). Otros orgánulos incluyendo cloroplastos (Figura 4A, D, F y H) y tilacoides (Figura 4B), mitocondrias (Figura 4D y F), Golgi (Figura 4 G), los microtúbulos (Figura 4e) y ribosomas (especialmente la figura 4C) son también vacuolas claramente visibles y el gran centrales permanecen intactos (Figura 4A). Manejo deficiente durante resultados HPF-QFS en artefactos incluyendo daño inducido por cristales de hielo (Figura 4D) y plasmolisis (Figura 4H). Precipitado plomo también se puede formar durante la tinción de la seccións (Figura 4F).

Figura 1
Figura 1: El Wohlwend compacto 02 de alta presión Congelador (A) La máquina HPF Wohlwend compacto 02 utilizado para criofijación con el terminal de ordenador conectado.. Las muestras se insertan en la parte delantera de la máquina (círculo pequeño) para la congelación. Una curva de temperatura se puede generar en la pantalla del ordenador para cada ejecución, según se desee por el usuario. (B) una curva de presión con temperatura típica para un funcionamiento HPF. Las líneas de color amarillo y morado representan la temperatura y la presión, respectivamente. Tenga en cuenta las fuertes pendientes de las dos curvas. La alta presión se mantiene durante aproximadamente 400 mseg. Cada intervalo en el eje x representa 50 mseg. Los datos fueron recogidos con EasyScopeII de software DSIM12. (C) La caja aislada y cubierta utilizados para el almacenamiento of muestras congeladas inmediatamente después de la congelación pueden ser convenientemente colocados en la parte superior de la máquina de HPF. Está lleno de nitrógeno líquido. Los recipientes de aluminio redondos mantienen los crioviales.

Figura 2
Figura 2: Preparación de muestra de tejido para HPF. (A) El soporte de la muestra para la máquina HPF compacto 02 en su configuración cerrada. (B) El soporte de la muestra está abierta. (C) Una muestra de la hoja en el pozo de 0,2 mm de un Un portador de muestras Tipo. La otra cara de este soporte es de 0,1 mm de profundidad. (D) La muestra de hoja cubierta de pasta de levadura. Tenga en cuenta que el portador es completa, pero no desbordante. (E) El portador de muestras en el soporte de la muestra. (F) La muestra se cubre con el portador Tipo B. Este soporte tiene una superficie plana y en el otro lado un pozo quees 0,3 mm de profundidad. Aquí la superficie plana se utiliza para sándwich de la muestra. (G) El soporte de muestra está cerrado y listo para su inserción en la máquina HPF. (H) El orificio en la parte frontal del instrumento HPF en la cual se inserta el soporte de la muestra para la congelación . (I) La sonda de temperatura y presión / soporte insertado en la máquina HPF. (J) Una curva de la temperatura típica para una carrera QFS (datos recogidos con el software EasyLog). La temperatura se registró cada segundo. El pico en el comienzo de la carrera se debe a la electrónica de la sonda utilizada y no refleja una medida de temperatura real.

Figura 3
Figura 3:. Equipos utilizados en QFS QFS se puede llevar a cabo en cualquier recipiente aislado tal como una caja de espuma de poliestireno o un cubo de hielo (A) <./ Strong> Una capa de hielo seco 1-2 cm de profundidad cubre la parte inferior de la cámara de QFS, aquí una caja de espuma de poliestireno. (B) Un bloque calentador con orificios de 13 mm se utiliza para muestras de las casas durante QFS. La sonda de temperatura con registrador de datos digitales se coloca en el bloque calentador. (C) Después de enfriar el bloque del calentador en nitrógeno líquido las muestras se colocan en el bloque, el nitrógeno líquido se vierte hacia fuera, y todo el conjunto se coloca en la cámara de QFS . con el hielo seco (D) La cámara de QFS se llena con hielo seco de manera que las muestras están cubiertos; no hay inconveniente para que cubra todo el bloque del calentador con hielo seco. (E) La caja está cubierta y luego se trasladó a el agitador rotatorio en una campana de extracción donde se agitan las muestras durante todo el procedimiento QFS.

Figura 4
Figura4:.. Arabidopsis hojas preparado por HPF-QFS Resultados obtenidos para muestras preparadas por HPF-QFS y fotografiados por TEM en un Zeiss Libra 200 HT FE MC (A) Una imagen de medio-alto aumento que muestra un cloroplasto (CH) con paredes celulares y citoplasma de las células adyacentes. Las vacuolas (V) contienen material electrón denso. Barra de escala = 0,5 imagen m. (B) Un gran aumento de un cloroplasto. Barra de escala = 100 nm. (C) Una imagen de alta magnificación de la pared celular entre las células adyacentes. Un plasmodesmas ramificado es visible (flecha). Nota la membrana plasmática suave presionado contra la pared de la célula por la vacuola. El citoplasma está densamente poblada por los ribosomas. V es vacuola. El tonoplasto es suave y continuo. Barra de escala = 200 nm. (D) Una imagen de bajo aumento que muestra las zonas de buena fijación en el cloroplasto (CH) cerca de las regiones de daño de hielo (asterisco). Barra de escala = 0,5 m. (E) Una vista de alta magnificación de una célula wall y los microtúbulos. Barra de escala = 100 nm. (F) Imagen que muestra una buena conservación de los cloroplastos (CH) y mitocondrias (M). Grande precipitado negro es manche secciones con citrato de plomo. Barra de escala = 1 m. (G) de visión de alta magnificación de Golgi (GA). Barra de escala = 200 nm. (H) mal conservado ejemplo que muestra la falta de detalles en los cloroplastos y plasmólisis (flecha negro). Barra de escala = 1 m.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

El éxito del protocolo que se presenta aquí depende en gran medida del usuario. En primer lugar, se requiere una preparación avanzada para asegurar que todos los materiales necesarios son fácilmente disponibles y en cantidad suficiente para completar toda una carrera HPF-QFS. En segundo lugar, el usuario debe trabajar con rapidez, moviéndose desde el paso-a-paso de una manera eficiente que minimiza la manipulación de la muestra, minimizando de este modo los cambios en el estado nativo del tejido. Una vez que las muestras se congelan y antes de que se deshidratan es imperativo que se mantengan fríos, por lo que se debe tener cuidado para evitar cualquier manipulación que se puede calentar de forma inadvertida la muestra, por ejemplo, el manejo con una mano enguantada en lugar de fórceps pre-enfriado. Velocidad y aumentar la eficiencia con la familiaridad con el protocolo, por lo que la práctica se ejecuta se recomiendan antes de intentar arreglar las muestras de uno de interés. En tercer lugar, el usuario debe ser consciente de los peligros de los productos químicos utilizados en el medio FS, así como los peligros de trabajar con nitrógeno líquido y hielo seco. Una campana de ventilación es necesario para la preparación del medio de FS y para el procedimiento QFS. Para todos los demás pasos, el equipo de protección personal necesarios incluidos guantes, bata de laboratorio, se recomienda zapatos cerrados y gafas.

Las ventajas de utilizar criofijación lugar de fijadores químicos a temperatura ambiente para la preparación de muestras para TEM, incluyendo plantas, han sido conocidos 10. Un estudio que comparó la ultraestructura de puntas de raíces de Arabidopsis y Nicotiana fijados por HPF o fijadores químicos encontró que el método HPF-FS dio resultados muy superiores 5. En el tejido preparado por HPF-FS el plasmalema y otras membranas celulares eran más suave, el plasmalema era ras contra la pared de la célula, y generalmente orgánulos, incluyendo los microtúbulos se conservan mejor que cuando las muestras fueron fijadas mediante métodos convencionales. Otro estudio de nódulos de las raíces de la soja llegó a la conclusión de que "la fijación química de glutaraldehído tamponadano conserva la ultraestructura de nódulos de las raíces de soja en un estado que permita la correlación de la estructura y función. "Y continúa diciendo que la única alternativa disponible es HPF-FS 2. Plasmodesmos son los canales de membrana que conectan las células vegetales para sus vecinos, pero cuya subestructura es difícil de resolver, incluso en TEM. Criofijación por HPF o con un congelador de chorro de propano seguido de FS fue elegido sobre la fijación química en los estudios dirigidos a dilucidar los detalles finos de la estructura plasmodesmal 18. A pesar de estos hallazgos preliminares, estudios de TEM en tejidos convencionalmente fijos siguen siendo la norma en la botánica. Esto puede ser debido a una simple adhesión a los métodos tradicionales o al coste prohibitivo de equipos aparentemente HPF-FS acoplado al tiempo preparativa largo para los protocolos de FS que se utilizan actualmente.

El procedimiento para QFS es una innovación reciente en la aceleración de la preparación de muestras para TEM 15. QFS ha sidoutilizado para preparar toda C. elegans y N. benthamiana deja después criofijación 15. Estas son muestras relativamente gruesas que ella determine HPF, y la preparación de muestras de Nicotiana por HPF-FS ha utilizado tradicionalmente FS muy largos tiempos de 12, 13, 14. Para este protocolo se han utilizado las hojas de la planta modelo Arabidopsis. La razón de por fs largos para Nicotiana y otras muestras de plantas es que el intercambio de disolventes y agua probablemente se desaceleró por las grandes vacuolas de las células. Sin embargo, se espera que la desvitrificación de una muestra bien congelado debe resultar en un daño mínimo a las células (15 y refs. Mismo). Si se produce el daño de hielo que es muy probablemente causado por la propia congelación y no el QFS. Un protocolo aún más corto para FS ha informado 15. Este súper rápidas FS (SQFS) utiliza sólo 90 min de FS. En este protocolo, las muestras en el bloque calefactor se hacen girar a 100 rpm en ausencia de i secoce sin cubrir la cámara SQFS. Esto permite que las muestras alcancen -80 ° C rápidamente. Las muestras se retiraron entonces del bloque calefactor y se dejó alcanzar la temperatura ambiente en el eje de balancín. SQFS ha sido utilizado con éxito para deshidratar las células cultivadas en cultivo y E. células de E. coli. Aún no hemos intentado utilizar SQFS con muestras de plantas debido al grosor de los tejidos de la planta.

El protocolo para cryofixing y luego deshidratar muestras de plantas por HPF tándem y QFS representa una mejora significativa sobre los protocolos actuales. El tiempo para la preparación de la muestra antes de la infiltración de resina se reduce ahora a unas pocas horas en lugar de varios días. Además de desarrollar el método QFS 15, McDonald también ha publicado recientemente los protocolos para la rápida infiltración de los tejidos vegetales con resina siguientes SQFS sin hielo seco 19. Los tejidos de plantas se infiltraron por lo general lentamente con resina mediante varias incubaciones largas, incluyendo durante la noche. Estos nuevos protocols resultado aún más cortos tiempos de procesamiento de la muestra: 6 horas de la congelación a seccionar. Así, en el futuro, la combinación de HPF-QFS y la infiltración rápida debe sustituir a los protocolos actuales para planta preparación de la muestra para TEM. Además, el procedimiento QFS utiliza equipo de laboratorio común que es barato y se puede utilizar para múltiples propósitos, aunque un Kit comercial QFS está actualmente disponible a través de Ciencias de Microscopía Electrónica (http://www.emsdiasum.com). Cualquiera de estas opciones representa un enorme ahorro sobre el coste de la compra de una unidad de sustitución congelación dedicada que puede costar más de $ 50.000.

Cabe señalar que las aplicaciones de muestras preparadas por HPF y FS se extienden más allá del análisis TEM de rutina. Las muestras preparadas de esta manera retienen su antigenicidad y por lo tanto se pueden utilizar en los enfoques basados ​​en anticuerpos, incluyendo inmunomarcaje 17, 19. Estas muestras también se pueden utilizar para los análisis estructurales tridimensionales avanzadasa través de la tomografía de electrones 20. Muestras HPF-FS se puede utilizar incluso con la luz correlativa y EM 21, 22. Por lo tanto, continuas mejoras en los procedimientos de cryofixing y luego muestras de deshidratación será beneficioso para una amplia variedad de investigadores que trabajan en los diversos sistemas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

La bondad y la generosidad del Dr. Kent McDonald de la Universidad de Berkeley son muy apreciadas. Damos las gracias a un revisor anónimo de sugerencias muy útiles. El laboratorio de Burch-Smith es apoyado por fondos de puesta en marcha de la Universidad de Tennessee.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine Technotrade International, Inc HPF02 With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display  of freezing parameters
Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers Technotrade International, Inc 290
Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A Technotrade International, Inc 241-200
Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B Technotrade International, Inc 242-200
Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20 Chart
Baker's yeast The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production
Tooth picks
Thermocouple data logger EL-USB-TC OMEGA Engineering Inc. OM-EL-USB-TC  Replacement battery purchased separately
Temperature probe Electron Microscopy Sciences 34505
Heater block 12/13 mm
Rotary shaker Fisher Scientific 11-402-10
Leaf punch - Harris Uni-core 2.00 Ted-Pella Inc. 15076
Pink dental wax Electron Microscopy Sciences 72660
Cryogenic vials 2 ml Electron Microscopy Sciences 61802-02
Methanol
Blow dryer
Dry ice
Liquid nitrogen
Acetone
Forceps Several pairs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and cell biology. 130, 877-889 (2008).
  2. Studer, D., Hennecke, H., Muller, M. High-pressure freezing of soybean nodules leads to an improved preservation of ultrastructure. Planta. 188, 155-163 (1992).
  3. Bowers, B. aM. M. Ch 2. Artifacts in Biological Electron Microscopy. Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. 2, Plenum Press. 13-42 (1988).
  4. Mollenhauer, H. H. Ch 3. Artifacts in Biological Electron Microscopy. Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. Plenum Press. 43-64 (1988).
  5. Kiss, J. Z., Giddings, T. H., Staehelin, L. A., Sack, F. D. Comparison of the ultrastructure of conventionally fixed and high pressure frozen/freeze substituted root tips of Nicotiana and Arabidopsis. Protoplasma. 157, 64-74 (1990).
  6. Moor, H. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. Steinbrecht, R. A., Zierold, K. Springer Verlag. 175-191 (1987).
  7. Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods in cell biology. 88, 151-164 (2008).
  8. Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure freezing for the preservation of biological structure theory and practice. Journal of electron microscopy. 13, 165-174 (1989).
  9. McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods in molecular biology. 117, 77-97 (1999).
  10. Hippe-Sanwald, S. Impact of freeze substitution on biological electron microscopy. Microscopy research and technique. 24, 400-422 (1993).
  11. Kiss, J. Z., McDonald, K. Electron microscopy immunocytochemistry following cryofixation and freeze substitution. Methods in cell biology. 37, 311-341 (1993).
  12. Segui-Simarro, J. M., Austin 2nd, J. R., White, E. A., Staehelin, L. A. Electron tomographic analysis of somatic cell plate formation in meristematic cells of Arabidopsis preserved by high-pressure freezing. The Plant cell. 16, 836-856 (2004).
  13. Kobayashi, K., Otegui, M. S., Krishnakumar, S., Mindrinos, M., Zambryski, P. INCREASED SIZE EXCLUSION LIMIT encodes a putative DEVH box RNA helicase involved in plasmodesmata function during Arabidopsis embryogenesis. The Plant cell. 19, 1885-1897 (2007).
  14. Austin, J. R., 2nd,, Staehelin, L. A. Three-dimensional architecture of grana and stroma thylakoids of higher plants as determined by electron tomography. Plant physiology. 155, 1601-1611 (2011).
  15. McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of microscopy. 243, 227-233 (2011).
  16. Taiz, L. The Plant Vacuole. The Journal of experimental biology. 172-1113 (1992).
  17. Wilson, S. M., Bacic, A. Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nature protocols. 7, 1716-1727 (2012).
  18. Ding, B., Turgeon, R., Parthasarathy, M. V. Substructure of freeze-substituted plasmodesmata. Protoplasma. 169, 28-41 (1992).
  19. McDonald, K. L. Rapid Embedding Methods into Epoxy and LR White Resins for Morphological and Immunological Analysis of Cryofixed Biological Specimens. Microscopy and microanalysis. 20, 152-163 (2014).
  20. McDonald, K. L., Auer, M. High-pressure freezing, cellular tomography, and structural cell biology. BioTechniques. 41, 137, 139-141 (2006).
  21. Spiegelhalter, C., et al. From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy. PloS one. 5, e9014 (2010).
  22. McDonald, K. L. A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues. Journal of microscopy. 235, 273-281 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics