Tandem-Hochdruck-Schnell Einfrieren und Gefriersubstitution von Pflanzengeweben für die Transmissionselektronenmikroskopie

Biology

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Bobik, K., Dunlap, J. R., Burch-Smith, T. M. Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (92), e51844, doi:10.3791/51844 (2014).

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Abstract

Seit den 1940er Jahren Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bietet seit Biologen mit ultra-hochauflösende Bilder von biologischen Materialien. Doch weil der mühsame und zeitraubende Protokolle, die auch verlangen, Erfahrung in der Herstellung von artefaktfreie Proben, TEM ist nicht als eine benutzerfreundliche Technik. Traditionelle Probenvorbereitung für TEM verwendeten chemischen Fixiermittel, um zelluläre Strukturen zu bewahren. Hochdruckgefrier ist Kryofixation von biologischen Proben bei hohen Drücken sehr schnell Kühlraten zu erzeugen, wodurch die Eisbildung, die nachteilig für die Integrität der zellulären Ultrastruktur schränkt. Hochdruck Gefrieren und Gefriersubstitution sind derzeit die Methode der Wahl zur Herstellung der höchsten Qualität Morphologie Harzabschnitte für TEM. Diese Methoden minimieren die Artefakte, die normalerweise mit herkömmlichen Verarbeitungs für TEM von Dünnschnitten verbunden. Nach Kryofixation das gefrorene Wasser in der Probe wird mit Flüssigkeit ersetztorganischen Lösungsmittel bei tiefen Temperaturen, ein Prozess, der Gefriersubstitution. Gefriersubstitution erfolgt typischerweise über mehrere Tage in gewidmet, teure Ausrüstung durchgeführt. Eine Innovation kann das Verfahren in drei Stunden abgeschlossen sein, anstelle der üblichen zwei Tage. Dies wird typischerweise durch mehrere Tage der Probenvorbereitung, die Infiltration und die Einbettung in Epoxyharzen vor dem Schneiden enthält, gefolgt. Hier präsentieren wir ein Protokoll, die hohe Druckgefrieren und Schnellgefrier Substitution, die Pflanzenprobe Fixierung innerhalb weniger Stunden erreicht werden können. Das Protokoll kann leicht für die Zusammenarbeit mit anderen Geweben oder Organismen angepasst werden. Pflanzengewebe sind von besonderer Bedeutung, da die Anwesenheit von belüfteten Räumen und mit Wasser gefüllte Vakuolen, die eisfreien Gefrieren von Wasser zu verhindern. Darüber hinaus ist der Prozess der chemischen Fixierung besonders lange in Pflanzen durch Zellwände behindert das Eindringen von Chemikalien, tief in das Gewebe. Pflanzengewebe sind daher insbesonsondere Herausforderung, aber dieses Protokoll ist zuverlässig und produziert Proben von höchster Qualität.

Introduction

Unser Wissen über die Ultrastruktur der Zelle kommt hauptsächlich aus Elektronen-Mikroskopie, die Details im Bereich von wenigen Nanometern 1 auflösen kann. Obwohl er so mächtig in auflösenden TEM nicht als benutzerfreundlich, da die Probenvorbereitung erfordert zeitaufwändige und mühsame Protokolle und verlangt einige Erfahrung aus dem Praktiker. Traditionelle Fixierung der Proben wurde die Verwendung von Aldehyden und Osmiumtetroxid vor der Weiterverarbeitung, die eine Dehydratation umfaßt, Einbetten in Harz und dann Schneiden an Ultradünnschnitten, die anschließend mit Schwermetallen verschmutzt sind produzieren kombiniert. Es ist jedoch bekannt, dass chemische Fixierung kann Artefakte einschließlich Proteinaggregation und Verlust von Lipiden 1, und Änderungen an Membranen, die letztlich auf mehrere Zellkompartimente 2 herzustellen. Diese Artefakte sind weitgehend auf die langsame Geschwindigkeit der Fixierung und Dehydratisierung bei Raumtemperatur 3, 4, 5 zurückgeführt.

6, 7. HPF nimmt ein Temperatur Probe zu der flüssigen Stickstoff unter hohem Druck (210 MPa oder 2100 bar) in Millisekunden. Wenn richtig gemacht HPF verhindert die Bildung von großen Eiskristallen, die große Schäden an Ultrastruktur der Zelle führen kann. HPF kann verwendet werden, um Proben von 100-200 um Dicke bei typischen Konzentrationen von gelösten Stoffen biologischen 7 fixieren. Es gibt zahlreiche Beiträge über die Physik und Grundsätze HPF, zB 1, 7, 8.

Nach HPF Proben werden bei niedriger Temperatur (-78,5 ° C bis -90 inkubiert und# 176, c) in Gegenwart eines flüssigen organischen Lösungsmittels, das chemische Fixiermittel wie Osmiumtetroxid, in der Regel einige Tage. Bei dieser niedrigen Temperatur wird das Wasser in der Probe durch das organische Lösungsmittel, üblicherweise Aceton oder Methanol 1, 9 ersetzt. Somit wird dieser Prozess aufgerufen Gefriersubstitution (FS). Die Probe wird dann nach und nach erwärmt und während dieser Zeit ist festgelegt, in der Regel mit Osmiumtetroxid und Uranylacetat 9. Vernetzung bei niedrigen Temperaturen hat den Vorteil einer Fixierung Moleküle immobilisiert sind, die 1. FS erzeugt daher Proben im Vergleich zu denen von herkömmlichen chemischen Fixierung bei Raumtemperatur fixiert höchster Qualität, insbesondere in verbesserten ultra Erhaltung Ergebnisse, bessere Erhaltung der Antigenität und reduziert Verlust von ungebundenen zellulären Komponenten 10, 11.

Die meisten FS erfolgt über lange Zeiträume, typischerweise bis zu mehreren Tagen. Dies ist besonders true für Pflanzen Proben 12, 13, 14. Eine aktuelle Protokoll, das von McDonald und Webb entwickelt reduziert die Zeit für die FS von mehreren Tagen auf wenige Stunden 15. In ihren Schnellgefriersubstitution (QFS) Verfahren wird FS über 3 Stunden durchgeführt, während in den super schnell FS (sqfs) Proben werden in 90 Minuten bearbeitet. Die Qualität der Proben durch diese Verfahren hergestellt wird, vergleichbar mit denen von herkömmlichen FS Protokolle ergab. Wir haben die QFS-Protokoll für die Weiterverarbeitung von Pflanzenproben nach HPF angenommen. Dies hat sich nicht nur Zeit, sondern auch Geld sparen, da QFS und sqfs verwenden gemeinsame Laborgeräte statt der kostspielige Handel erhältlichen FS-Maschinen.

Pflanzengeweben sind oft sehr schwierig, für die TEM vorzubereiten. Im Durchschnitt sind Pflanzenzellen größer als entweder bakterielle oder tierische Zellen. Die Anwesenheit von hydrophoben, wachsartigen Kutikula, dicke Zellwände, große mit Wasser gefüllte Vakuolen, die organische Säuren, Hydrolasen und Phenol compounds, dass bis zu 90% des gesamten Zellvolumens einnehmen bis 16, und das Vorhandensein von belüfteten Räumen stark vermindert die Wärmeleitfähigkeit des Systems 17. Ferner wird in dem Fall von Pflanzen, die Probendicke fast immer 20 um übersteigt, die Grenze für die Nutzung der chemischen Fixierung. Bei diesen Stärken, die geringe Wärmeleitfähigkeit von Wasser verhindert, dass ein Gefrierrate mehr als -10.000 ° C / s in der Mitte der Probe. Diese Rate ist erforderlich, um schädliche Eisbildung hexagonalen (Eiskristalle mit einer geringeren Dichte und größer als 10 bis 15 nm) zu vermeiden, 8. Zusammen bilden diese aktuellen Herausforderungen sowohl richtige Einfrieren der Probe und anschließende FS. Dennoch ist Kryofixation die beste Methode für die Festsetzung Pflanzenproben. Hier wird ein Protokoll für die HPF-QFS Pflanzengewebeproben dargestellt. Es konzentriert sich auf das Modell Art Arabidopsis thaliana, hat aber auch mit Nicotiana benthamiana verwendet. Die typischen Ergebnisse zeigen, dass HPF-QFS produziert samples vergleichbarer Qualität zu herkömmlichen HPF-FS in einem Bruchteil der Zeit. Mit der richtigen Einstellung, kann dieses Protokoll auch für andere relativ dicken biologischen Proben verwendet werden.

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Protocol

HINWEIS: Das Verfahren erfordert QFS äußerster Sorgfalt und Vorsicht durch den Benutzer und stellen wir diese Sicherheitsmaßnahmen hier als Vorsichtshinweise und Hinweise, wo anwendbar.

1.Vorbereitung für HPF Run

  1. Vor Beginn der Probenvorbereitung, schalten Sie den Hochdruckgefrier folgenden Anweisungen des Herstellers.
    HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendet HPF Einheit ist ein Wohlwend Compact 02 Einheit (1A), und es dauert etwa ein bis ein-und-ein-halb Stunden von Start-up-Verfahren vor HPF läuft kann beginnen.
    1. Einschalten des Wohlwend Compact 02 Hochdruck-Gefrierschrank.
      1. Gerät einschalten, indem der Hauptschalter von "0" auf "1".
      2. Freidruckluft an die Maschine.
      3. Frei flüssigem Stickstoff an der Maschine.
      4. Drücken Sie die Taste "SYSTEM austrocknen".
      5. Nach 30 Minuten, drücken Sie die "SYSTEM austrocknen "-Taste.
      6. Drücken Sie die "ON / OFF"-Taste, um das Gerät einzuschalten.
      7. Drücken Sie die "Stickstoff"-Taste.
      8. Lassen Sie die Maschine für 20 Minuten abkühlen lassen, auch wenn der "DRIVE IN"-Taste hat bereits beleuchtet.
      9. Der "DRIVE IN"-Taste leuchtet.
      10. Drücken Sie die "Drive in"-Taste.
      11. Drücken Sie die "AUTO"-Taste.
      12. Die Taste leuchtet "SYSTEM READY" auf.
      13. Legen Sie die Temperatur-und Druckfühler in die Druckkammer und verriegeln Sie ihn mit dem Stift.
      14. Drücken Sie die "JET AUTO"-Taste. Dieser Schritt überprüft, dass der Druckanstieg und Temperaturabfall, wie gewünscht sind; Wesentlichen ein Probelauf. Sharp Temperaturstürze und scharfe Druckerhöhungen erwartet werden (Abbildung 1B).
      15. Führen Sie zwei weitere JET-Zyklen.

2. Vorbereitung für Receiving gefrorenen Proben

  1. Füllen Sie eine isolierte Box mit Cryovial Halter mit flüssigem Stickstoff (siehe Sicherheitshinweise), so dass die Halter vollständig bedeckt (Abbildung 1c).
    Hinweis: Verwenden Sie PPE einschließlich Kryo und Schutzbrille beim Umgang mit flüssigem Stickstoff.
  2. Legen Sie die entsprechende Anzahl der Fläschchen, die die FS Medium in der Aluminium-Rohrhalter in den flüssigen Stickstoff (Abbildung 1c). Mit diesem Protokoll bis zu vier Scheiben jeweils eine einzelne Probe, die in einem einzigen Kryoröhrchen platziert werden.
    HINWEIS: Die Fläschchen sollten mit einem scharfen Instrument wie ein Diamantschreiber und sehr weichen Bleistift markiert werden.
    1. Für Fixiermittel bei QFS verwenden 1% OsO 4 und 0,1% Uranylacetat in Aceton 9. Bereiten Sie die Lösung in großen Mengen, verzichten Aliquots von 1,5 ml in Kryoröhrchen und lagern in flüssigem Stickstoff eingefroren.
      Hinweis: Beachten Sie Sicherheitshinweise für den Umgang mit OsO 4 und Uranylacetat.
      HINWEIS: OsO 4 HINWEIS: Die für die Proben für QFS halten Kryoröhrchen sollte eine harte O-Ring, um zu gewährleisten, dass die Rohre bleiben während QFS abgedichtet, um eine Leckage von OsO 4 zu vermeiden.
  3. Bereiten Sie Hefe-Paste durch Mischen Bäckerhefe mit einem ungefähr gleichen Volumen 10% Methanol mit einem Zahnstocher oder andere Instrument, bis die Paste glatt ist. Die Hefe Paste wirkt als ein extrazelluläres Gefrierschutzmittel und wird verwendet, um den Raum um die Probe in dem Probenträger zu füllen. Die Menge der Paste hängt von der Anzahl der Proben; für 10 Proben oder weniger die Paste (1 ml) in einem Mikrozentrifugenröhrchen gemischt.

3. Hochdruck Einfrieren von Proben

  1. Entfernen Sie ein Blatt (oder andere Gewebe) von Interesse aus der Pflanze und legen Sie sie vorsichtig auf ein Stück Dental Wachs oder andere Schnittfläche. Verwenden Sie einen Schlag von 2,0 mm oder gewünschte Größe, um eine Probe aus dem Blatt geschnitten. Behandeln Sie die Probe vorsichtig mit einer Pinzette und arbeiten so schnell wie möglich.
  2. Arbeiten unter einem Binokular, legen Sie die Blattscheibe in der 0,2 mm Seite der Typ-A-Probenträger und bedecken vollständig in Hefe-Paste. Sicherzustellen, dass die Platte vollständig gefüllt wird und die Paste auf einer Höhe mit dem Rand des Halters durch Glätten der Paste mit einem feinen Pinsel (Abbildung 2).
  3. Legen Sie den Träger in den Probenhalter. Decken Sie die Probe mit dem Probenträger Typ B, flache Oberfläche nach unten.
    HINWEIS: Der Probenhalter sollte trocken und bei Raumtemperatur.
  4. Nehmen Probe in Probenhalter, stecken Sie sie in Maschine und initiieren eine Gefrierzyklus durch Drücken der "JET AUTO"-Taste, die in einer oder zwei Sekunden zu vervollständigen sollte.
  5. So schnell wie möglich arbeiten, entfernen Sie den Halter aus dem Gerät und legen Sie die Spitze hält die sample in flüssigen Stickstoff in dem isolierten Kasten auf der Oberseite des HPF Maschine. Tauchen Sie die Spitzen von zwei Pinzetten in den flüssigen Stickstoff, um sie zu kühlen.
    HINWEIS: Nach dem Einfrieren sollten die Träger nur mit flüssigem Stickstoff gekühlten Pinzette gehandhabt werden. Warm (Raumtemperatur) Pinzette sind oft die Ursache des Scheiterns in cryotechniques.
  6. Öffnen Sie ein Kryoröhrchen mit dem FS Medien, und legen Sie den Deckel auf die Seite der Box. Mit Hilfe eines Paares von flüssigem Stickstoff gekühlten Pinzette vorsichtig entfernen Sie die CD aus dem Probenhalter, so dass die Scheibe immer in den flüssigen Stickstoff oder Dampf. Arbeiten in der Flüssigstickstoffdampf, halten Sie das Rohr mit einem FS vorgekühlten Pinzette und mit der anderen, um den Halter in der FS Fläschchen zu platzieren. Schrauben Sie den Deckel des Fläschchens FS wieder an. Nicht jede Falle von flüssigem Stickstoff in der Ampulle.
    HINWEIS: Bei der Übertragung von Proben für QFS Kryoröhrchen, sicherzustellen, dass kein flüssiger Stickstoff in den Fläschchen gefangen. Flüssigem Stickstoff erweitert 700-fach bei Erwärmung und jeder Trapped flüssiger Stickstoff Explosionen während dieser Zeit führen.
  7. Die Schritte 3.1 bis 3.7, bis alle gewünschten Proben werden eingefroren. Mehrere Blattscheiben, die die gleiche Art der Probe kann in der gleichen Ampulle gegeben werden. Beachten Sie, dass der Probenhalter um getrocknete und auf Raumtemperatur zwischen Gefrierpunkt Läufe gebracht werden muss. Um dies schnell zu tun, erhitzen Sie es mit einem Fön, und seine Temperatur durch Berührung zu überwachen.

4. Vorbereitung für die Gefriersubstitution

  1. Vollständig einzutauchen das Aluminium Heizblock in flüssigen Stickstoff für 10 Minuten oder bis das Blasensieden stoppt. Während dies vor sich geht, legen eine Schicht aus Trockeneis (1-2 cm) in den Boden des als FS Kammer (Abbildung 3) verwendet Container. Ein Styropor-Behälter oder Eiskübel für FS verwendet werden, zusammen mit zerkleinerten Trockeneis oder Pellets.
  2. Legen schnell die Kryoröhrchen mit den Proben zusammen mit dem Temperaturfühler in die mittleren Reihen der Heizungsblock. Achten Sie darauf, dass die Deckel auf dieFläschchen fest verschraubt, so dass der FS Medien nicht während FS auslaufen. Beginnt die Aufnahme der Temperatur.
    1. Machen den Temperaturfühler, indem ein Thermoelement in der Spitze eines Kryoröhrchen so daß er den Boden des Rohrs erreicht. Verschließen Sie den Deckel der Röhre mit Harz, so dass keine Flüssigkeit austritt. Das Rohr wird mit 1,5 ml Aceton bei Beginn jedes QFS Lauf.
  3. Mit isolierten Kryo oder große Zange, gießen Sie die gesamte Flüssigkeit Stickstoff aus der Heizungsblock. Achten Sie darauf, gießt die Kryoröhrchen.
    Hinweis: Verwenden Sie PPE einschließlich Kryo und Schutzbrille beim Umgang mit flüssigem Stickstoff.
  4. Legen Sie den Block mit den Fläschchen auf die Schicht aus Trockeneis in der QFS Kammer. Sicherstellen, daß der Block so angeordnet ist, daß die Rohre horizontal liegend, aber mit einer leichten Aufwärtsneigung. Es sollte keine Leckage sein, wenn die richtigen Kryoröhrchen eingesetzt werden.
  5. Pack das QFS Kammer mit Trockeneis, so dass die FS Rohre bedeckt, obwohl es nicht notwendig ist,Decken Sie die Oberseite des Blocks. Den Deckel auf die Kammer.

5. Schnelle FS

HINWEIS: Führen Sie die QFS Lauf in einer Abzugshaube in dem Fall, dass eine Leckage von OsO 4 versehentlich trotz anderer Vorsichtsmaßnahmen auftritt.

  1. Zeigen QFS Kammer auf einer Plattform Rotationsschüttler in einer Abzugshaube und drehen sich mit 125 Umdrehungen pro Minute für 120 min. Während dieser Zeit wird die Temperatur des Blocks schrittweise auf etwa -80 ° C zu erhöhen. Das Rühren gewährleistet das Mischen der Komponenten zur besseren FS.
    HINWEIS: Die Platzierung der Shaker in der Dunstabzugshaube und der Position des Abzugshaube Tür sollte sich während der gesamten Prozedur QFS und für jede QFS laufen, um konsistente Erwärmung der Proben zu gewährleisten.
  2. Entfernen Sie das Trockeneis aus der Kammer und weiter Schütteln für eine Stunde.
    Hinweis: die Temperatur auf etwa -15 ° C bis -20 ° C zu erhöhen.
  3. Entfernen Sie die Proben und Temperaturfühler aus der QFS Kammer und auf denSchüttler bei Raumtemperatur für weitere 10-15 Minuten, bis sie Raumtemperatur erreichen. Stoppen Sie die Aufzeichnung der Temperatur.
  4. Während FS, schalten Sie den HPF-Maschine.
    1. Schließen der Abgriff des Flüssigstickstofftank, während das HPF Maschine wird mit Stickstoff gefüllt.
    2. Drücken Sie die "Stickstoff"-Taste.
    3. Warten Sie, bis das rote "Kolben nach unten" Licht erlischt.
    4. Drücken Sie die "ON / OFF"-Taste.
    5. Drücken Sie die Taste "SYSTEM austrocknen".
    6. Zufuhr von Druckluft zu der Maschine.
    7. Nach mindestens 12 Stunden (auf Trocken jeglicher Feuchtigkeit zu gewährleisten), schalten Sie das Gerät durch Drehen des Hauptschalters von "1" auf "0".

6. Beitrag FS Verarbeitung

  1. Die FS-Medien mit Kunststoff-Pipetten und in die entsprechenden Container für toxische Abfälle sorgfältig zu entfernen.
    HINWEIS: OsO 4 und Uranylacetat sind gefährliche Chemikalienund sollte im Abzug gehandhabt werden, während das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) einschließlich geschlossene Schuhe, Kittel und Handschuhe.
  2. Wasch Proben viermal mit 100% Aceton. Sammeln Sie die ersten zwei Wäschen und legen in der giftigen Abfallbehälter.
  3. Mit einer feinen Pinzette, entfernen Sie die Gewebeproben aus den Halterungen. Halten Proben nass mit Aceton als dies geschehen ist, und arbeiten sehr vorsichtig, um zu brechen Proben zu vermeiden.
    HINWEIS: Es ist nicht ungewöhnlich, und es kann tatsächlich nützlich die Hefe-Paste fallen weg von den Proben, an dieser Stelle haben. Die Hefe-Paste ist in der Regel sehr dunkel braun, während das Blattgewebe ist immer noch grün.
  4. Sammeln Sie die Proben in Kryoröhrchen Aceton enthalten. Fahren Sie mit dem Probenvorbereitung (Infiltration und Einbettung) für die TEM nach den üblichen Protokollen.

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Representative Results

Nachfolgend dargestellten Ergebnisse wurden mit Hilfe eines Wohlwend Compact 02 für HPF (Abbildung 1A) erhalten. Ein großer Vorteil dieses Instruments ist die Leichtigkeit der Verwendung der Probenträger und ihre Halterungen. Bei der Verwendung von anderen Instrumenten, empfiehlt McDonald, dass zwei Benutzer sollten die Durchführung der Probenvorbereitung und HPF, eine Vorbereitung der Proben, während der andere tut das Einfrieren und Transfer zum FS 9 Kryoröhrchen. Doch die Wohlwend Probenträger und Halter sind einfach genug für einen einzelnen Benutzer unabhängig manipulieren (2A, B, E, F und G). Es sollte jedoch erwähnt werden, dass man ein paar Testläufe durchführen, um vor der Arbeit mit wertvollen Proben werden mit dem Instrument vertraut HPF. Ein erfahrener Benutzer sollte in der Lage, mehrere (10 oder mehr) Proben in einer Stunde beheben. Jedoch können die in diesem Protokoll vorgestellten Prinzipien mit einem kommerziell erhältlichen HPF Maschinen eingesetzt werden.

VielleichtDer wichtigste Teil des HPF-QFS Verfahrens ist die Probenvorbereitung für das Laden in den Probenträger (2C). Obwohl dies nicht intuitiv sein, ist es die Stufe in dem Protokoll über die der Forscher hat die beste Kontrolle. Der HPF-Maschine ist robust, und mit der richtigen Verwendung und Wartung sollten die zu erwartenden Änderungen von Druck und Temperatur mit wenig Variation zwischen den Proben zu erzeugen. Wird eine Probe während der Vorbereitung schlecht behandelt dann kein anderer Schritt wird den Schaden verursacht, so erlösen. Pflanzengewebe sind relativ einfach zu manipulieren während dieser Stufe des Verfahrens, da sie nicht in einem Medium kultiviert und die Zellwände geben den Zellen eine gute Festigkeit. Dennoch ist es wichtig, dass die Proben schnell behandelt werden, um ultrastrukturellen Veränderungen, die aus der Entfernung von der Mutterpflanze zu vermeiden und führen zu Stress und Verwundung Antworten zu begrenzen. Die kleinste Probenträger, die eine Probe aufnehmen kann, sollte verwendet werden, um eine effiziente und konsistente HPF zu gewährleisten (BildUre 2C). Schließlich sollte der Probenträger gefüllt, aber nicht überläuft (Figur 2D). Die gefüllten Probenträger wird einfach in das HPF Maschine zum Gefrieren (2 H und I) eingesetzt.

Die ersten Schritte in der QFS-Protokoll kann eine Herausforderung für einen Anfänger sein, so empfiehlt es sich, dass zwei Menschen zusammen arbeiten sollten, bis Benutzer sind zufrieden mit dem Verfahren (3A-E). Es sollte zu jeder Zeit beim Umgang mit flüssigem Stickstoff und die Fixiermittel Osmiumtetroxid und Uranylacetat genommen werden. Eine typische Kurve für Temperaturänderungen während QFS in 2J gezeigt. Die Temperatur steigt schnell von 196 ° C, der Temperatur von flüssigem Stickstoff auf -80 ° C ist. Es ist bei Temperaturen von etwa -78 ° C bis -90 ° C, die Gefriersubstitution wird angenommen, dass 9 auftreten. Eine herausfordernde Schritt in der QFS-Protokoll ist die Entfernung von Trockeneis nach 2 Stunden FS. BeiDieser Schritt, falsche Handhabung der Proben kann eine Spitze in Temperaturen zu erzeugen. Dazu sollte die Heizungsblock schnell aus dem QFS Kammer mit einem cryoglove und das Trockeneis angehoben werden schnell ausgegossen in einen zweiten Behälter.

HPF wurde verwendet, um verschiedene Pflanzengewebe einschließlich Nicotiana benthamiana Blätter und Arabidopsis-Blätter und Embryonen zu beheben. Es ist eine Herausforderung, um Proben aus reifen Blätter zu beheben aufgrund der großen zentralen Vakuolen der meisten Zellen. Jüngere Blätter enthalten kleinere Vakuolen aber die Trichome sind in der Regel recht dicht gepackt. Die Anwesenheit der Trichome kann es schwierig machen, die Proben mit Hefe-Paste packen, aber egal, ist darauf zu achten, dass dies richtig gemacht wird, um die Menge von Luft zwischen der Blattoberfläche und der Paste gefangen zu minimieren. Die eingeschlossene Luft wird während der Wärmeübertragung behindern HPF und reduzieren die Qualität der Fixierung. Dies gilt für jede Probe.

Nach HPF kann und QFS Proben für vi vorbereitet werdenEwing unter der TEM durch Infiltration und Einbettung mit Harz. Dünnschnitte von 65-100 nm kann dann durch Schneiden hergestellt werden. Typische Ergebnisse sind in Abbildung 4 dargestellt. Die gezeigten Bilder sind alle aus Arabidopsis Blattproben. Plasmamembranen sind in der Regel glatt und gegen die Zellwand gedrückt wird, ein Zeichen für eine gute Fixierung (4A, C und E). Andere Organellen wie Chloroplasten (4A, D, F und H) und Thylakoide (4B), Mitochondrien (4D und F), Golgi (4 G), Mikrotubuli (4E) und Ribosomen (insbesondere 4C) sind deutlich sichtbar und die großen zentralen Vakuolen bleiben intakt (4A). Schlechte Behandlung während des HPF-QFS Ergebnisse in Artefakte einschließlich Eis-Kristall-induzierten Schäden (4D) und Plasmolyse (4H). Bleiniederschlag kann auch während der Färbung des § bildens (4F).

Figur 1
Abbildung 1: Das Wohlwend Compact 02 Hochdruck-Gefrierschrank (A) Die für Kryofixation mit dem angeschlossenen Computer Terminal verwendet Wohlwend Compact 02 HPF-Maschine.. Proben werden in der Vorderseite der Maschine (kleiner Kreis) zum Gefrieren eingesetzt. Eine Temperaturkurve auf dem Bildschirm für jeden Durchlauf erzeugt werden, wie vom Benutzer gewünscht. (B) ein typisches Temperatur-Druck-Kurve für ein HPF Lauf. Die gelben und purpurroten Linien die Temperatur und der Druck sind. Beachten Sie die steilen Hänge der beiden Kurven. Der hohe Druck wird für etwa 400 ms gehalten wird. Jedes Intervall auf der x-Achse entspricht 50 ms. Die Daten wurden mit EasyScopeII für DSIM12 Software gesammelt. (C) Die isolierten Kiste und Deckel für die Lagerung o verwendetf gefrorenen Proben unmittelbar nach Einfrieren kann bequem auf dem HPF-Maschine platziert werden. Es wird mit flüssigem Stickstoff gefüllt. Die runden Behälter aus Aluminium halten die Kryoröhrchen.

Figur 2
Abbildung 2: Vorbereiten Gewebeprobe für HPF. (A) Der Probenhalter für die Compact 02 HPF Maschine in seiner geschlossenen Konfiguration. (B) Der Probenhalter geöffnet ist. (C) eine Blattprobe im Bereich von 0,2 mm und einer Art eines Probenträgers. Die andere Seite dieses Trägers ist 0,1 mm tief. (D) Die Blattprobe in Hefe-Paste bedeckt. Beachten Sie, dass der Träger vollständig, aber nicht über. (E) Der Probenträger in den Probenhalter. (F) wird die Probe mit der Typ-B-Träger bedeckt. Dieser Träger hat eine flache Oberfläche und auf der anderen Seite eine gut, dass0,3 mm tief. Hier ist die ebene Oberfläche, um die Probe-Sandwich verwendet. (G) Der Probenhalter ist zum Einsetzen in die Maschine geschlossen und HPF bereit. (H) die Öffnung an der Vorderseite des HPF Instrument in die der Probenhalter wird zum Gefrieren eingesetzt werden . (i) die Temperatur und Druckfühler / Halter in die Maschine eingelegt HPF. (J) Ein typischer Temperaturverlauf für eine QFS Lauf (Daten mit EasyLog Software gesammelt). Temperatur aufgezeichnet wurde jede Sekunde. Die Spitze am Anfang des Laufes ist auf die Elektronik der Sonde verwendet und keine tatsächliche Temperaturmessung nicht reflektieren.

Figur 3
Abbildung 3:. Ausrüstung in QFS verwendet QFS kann in jedem isolierten Behälter, wie eine Styropor-Box oder einem Eimer Eis durchgeführt werden (A) <./ Strong> Eine Schicht aus Trockeneis 1-2 cm tief den Boden der Kammer QFS, hier eine Styroporbox abdeckt. (B) Eine Heizung Block mit 13 mm Löchern zu Haus Proben während QFS verwendet. Der Temperaturfühler mit digitaler Datenlogger ist im Heizblock gelegt. (C) Nach dem Abkühlen der Heizblock in flüssigem Stickstoff werden die Proben in dem Block angeordnet ist, wird der flüssige Stickstoff gegossen, und die gesamte Anordnung ist in der Kammer angeordnet QFS . mit dem Trockeneis (D) Die QFS Kammer ist mit Trockeneis, so dass die Proben bedeckt gefüllt; gibt es kein Nachteil für die gesamte Heizungsblock mit Trockeneis. (E) Die Box ist überdacht und dann auf die Rotationsschüttler in einer Abzugshaube, wo die Proben werden während der Prozedur QFS gerührt bewegt.

Figur 4
Abbildung4:.. Arabidopsis-Blätter durch HPF-QFS vorbereitet Ergebnisse für Proben von HPF-QFS auf einem Zeiss Libra 200 HT FE MC vorbereitet und von TEM abgebildet erhalten (A) Ein Medium hoher Vergrößerung Bild, das einen Chloroplasten (CH) mit Zellwänden und Cytoplasma von benachbarten Zellen. Die Vakuolen (V) enthalten elektronendichten Materials. Maßstab = 0,5 um. (B) eine hohe Vergrößerung Bild eines Chloroplasten. Maßstabsbalken = 100 nm. (C) eine hohe Vergrößerung Bild der Zellwand zwischen benachbarten Zellen. Ein verzweigtes Plasmodesmen sichtbar ist (Pfeil). Beachten Sie die glatte Plasmamembran gegen die Zellwand durch die Vakuole gedrückt. Das Zytoplasma ist dicht mit Ribosomen verpackt. V Vakuole. Die tonoplast ist glatt und kontinuierlich. Maßstab = 200 nm. (D) Ein Bild mit niedriger Vergrößerung, die Bereiche der gute Fixierung in den Chloroplasten (CH) in der Nähe von Regionen von Eis-Schaden (Stern). Maßstab = 0,5 um. (E) eine hohe Vergrößerung Ansicht einer Zelle wall und Mikrotubuli. Maßstab = 100 nm. (F) Bild, das gute Konservierung der Chloroplasten (CH) und Mitochondrien (M). Große schwarze Niederschlag wird von der Färbung Abschnitte mit Blei Citrat. Maßstab = 1 um. (G) Hohe Vergrößerung Ansicht von Golgi (GA). Maßstab = 200 nm. (H) schlecht erhalten Probe zeigt Mangel an Details in den Chloroplasten und Plasmolyse (schwarzer Pfeil). Maßstab = 1 um.

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Discussion

Der Erfolg der hier vorgestellten Protokoll hängt stark von dem Benutzer. Zuerst wird advanced Vorbereitung erforderlich, um sicherzustellen, dass alle notwendigen Materialien leicht verfügbar sind und in ausreichender Menge, um eine gesamte HPF-QFS Lauf abzuschließen. Zweitens muss der Benutzer schnell zu arbeiten, sich von Schritt zu Schritt in einer effizienten Weise, die Handhabung der Proben minimiert und somit Änderungen der nativen Zustand des Gewebes zu minimieren. Sobald Proben werden eingefroren und bevor sie dehydriert sind, ist es unerlässlich, dass sie kalt gehalten werden, so ist darauf zu achten, jede Behandlung, die versehentlich erwärmen kann die Probe, beispielsweise zu vermeiden, die Handhabung mit Handschuhen statt vorgekühlten Pinzette. Geschwindigkeit und Effizienzsteigerung mit Vertrautheit mit dem Protokoll, so sind Trainingsläufe, bevor Sie versuchen, seine Proben von Interesse beheben empfohlen. Drittens muss der Benutzer über die Gefahren der Chemikalien in der FS-Medium als auch die Gefahren bei der Arbeit mit flüssigem Stickstoff und Trockeneis verwendet bleiben. Ein Abzug ist für die Aufstellung der FS Medium und für die QFS Verfahren notwendig. Für alle anderen Schritte, die erforderliche persönliche Schutzausrüstung einschließlich Handschuhe, Kittel, geschlossene Schuhe und Schutzbrille empfohlen.

Die Vorteile der Verwendung Kryofixation anstelle von chemischen Fixiermittel bei Raumtemperatur zur Herstellung von Proben für die TEM, einschließlich Pflanzen ist seit langem bekannt 10. Eine Studie zum Vergleich der Ultrastruktur von Wurzelspitzen von Nicotiana und Arabidopsis durch HPF oder chemische Fixiermittel fixiert gestellt, dass die HPF-FS Verfahren gab weit überlegen Ergebnisse 5. Im Gewebe von HPF-FS hergestellt waren die Plasmamembran und andere zelluläre Membranen glatter, das Plasmalemma war bündig an der Zellwand und im allgemeinen Organellen wie Mikrotubuli waren besser erhalten als bei Proben wurden nach herkömmlichen Verfahren fixiert. Eine weitere Studie von Sojawurzelknöllchen Schluss, dass "chemische Fixierung von gepufferten Glutaraldehydnicht die Ultrastruktur von Sojawurzelknöllchen in einem Staat, der die Korrelation von Struktur und Funktion. erlaubt bewahren "Und zu sagen, dass die einzige Alternative ist, HPF-FS 2 fort. Plasmodesmen sind Membran-gebundene Kanäle, die Pflanzenzellen, um ihre Nachbarn zu verbinden, aber deren Unterbau ist schwierig, auch unter TEM lösen. Kryofixation von HPF oder mit einem Propan-Jet Gefrierschrank, gefolgt von FS wurde über chemische Fixierung in Studien bei der Aufklärung der feinen Details plasmodesmalen Struktur 18 gerichtet gewählt. Trotz dieser frühen Ergebnisse sind TEM-Untersuchungen auf konventionell fixierten Gewebe immer noch die Norm in den Pflanzenwissenschaften. Dies kann durch eine einfache Einhaltung der traditionellen Methoden oder der scheinbar hohen Kosten der HPF-FS Ausrüstung der langen Herstellungszeit für die gegenwärtig verwendeten Protokolle FS gekoppelt sein.

Das Verfahren für die QFS ist eine neue Innovation bei der Beschleunigung der Probenvorbereitung für die TEM-15. QFS istverwendet werden, um ganze C. vorbereiten elegans und N. benthamiana Blätter nach Kryofixation 15. Diese sind relativ dicken Proben von HPF befestigt werden, und die Vorbereitung der Proben von Nicotiana HPF-FS ist traditionell verwendet sehr lange Zeiten FS 12, 13, 14. Aus diesem Protokoll haben wir Blätter von der Modellpflanze Arabidopsis verwendet. Der Grund für die lange FS Zeiten Nicotiana und andere Pflanzenproben ist, dass der Austausch von Lösungsmitteln und Wasser würde wahrscheinlich durch die großen Vakuolen der Zellen verlangsamt werden. Es wird jedoch erwartet, dass eine Entglasung eines gut gefrorene Probe sollte in minimalen Beschädigung der Zellen führen (15 und Quellen. Darin). Wenn Eis Schaden eintritt wird es wahrscheinlich durch das Einfrieren selbst und nicht der QFS verursacht. Noch schneller Protokoll für FS ist berichtet worden 15. Diese super schnell FS (sqfs) nur 90 min für FS. In diesem Protokoll werden die Proben in dem Heizblock bei 100 rpm in Abwesenheit von Trocken i gedrehtce, ohne dabei die sqfs Kammer. Dies ermöglicht die Proben auf -80 ° C zu erreichen rasch. Die Proben werden dann aus dem Heizblock entfernt und auf Raumtemperatur an der Schwinge erreicht. Sqfs wurde erfolgreich verwendet, um Zellen in Kultur gezüchtet und E. dehydratisieren coli-Zellen. Wir haben noch nicht versucht sqfs mit Pflanzenproben aufgrund der Dicke der Pflanzengewebe verwendet werden.

Das Protokoll für cryofixing und dann Dehydratisieren Pflanzenproben durch Tandem-HPF und QFS stellt eine signifikante Verbesserung gegenüber derzeitigen Protokolle. Die Zeit für die Probenvorbereitung vor der Harz-Infiltration wird nun auf einige wenige Stunden anstelle von mehreren Tagen reduziert. Neben der Entwicklung der Methode QFS 15, McDonald hat vor kurzem auch Protokolle für die schnelle Eindringen von Pflanzengewebe mit Harz folgenden sqfs ohne Trockeneis 19 veröffentlicht. Pflanzengewebe werden in der Regel langsam mit Harz durch mehrere lange Inkubationszeiten, einschließlich über Nacht infiltriert. Diese neuen Protocols führen zu noch kürzeren Probenbearbeitungszeiten: 6 Stunden vor dem Einfrieren zu Schneiden. Damit in die Zukunft, sollte die Kombination von HPF-QFS und schnelle Infiltration aktuellen Protokolle für Pflanzen-Probenvorbereitung für TEM ersetzen. Darüber hinaus verwendet das Verfahren QFS gemeinsamen Laborgeräte, die preiswert ist und für verschiedene Zwecke verwendet werden, obwohl eine kommerzielle QFS Kit ist derzeit durch Electron Microscopy Sciences verfügbar (http://www.emsdiasum.com). Entweder Option stellt eine enorme Einsparungen über die Kosten für den Kauf eines dedizierten Gefriersubstitution Einheit, die Kosten können weit über $ 50.000.

Es sei darauf hingewiesen, dass die Anwendungen von Proben hergestellt und HPF FS über Routine TEM-Analyse zu verlängern. Proben in dieser Weise hergestellt, behalten ihre Antigenität und können daher in Antikörper-basierte Ansätze verwendet werden, einschließlich Immunogoldmarkierung 17, 19. Diese Proben können auch für erweiterte dreidimensionale Strukturanalyse verwendet werdenüber 20 Elektronentomographie. HPF-FS Proben können auch bei korrelativen Licht-und EM-21, 22 verwendet werden. So weitere Verbesserungen bei den Verfahren zur Dehydratisierung cryofixing und dann Proben wird sich positiv auf eine Vielzahl von Forschern, die in verschiedenen Systemen sein.

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Acknowledgments

Die Freundlichkeit und Großzügigkeit der Dr. Kent McDonald von der UC Berkeley werden sehr geschätzt. Wir danken einem anonymen Gutachter für sehr hilfreiche Anregungen. Die Burch-Smith-Labor wird von Start-up-Fonds von der Universität von Tennessee unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine Technotrade International, Inc HPF02 With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display  of freezing parameters
Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers Technotrade International, Inc 290
Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A Technotrade International, Inc 241-200
Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B Technotrade International, Inc 242-200
Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20 Chart
Baker's yeast The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production
Tooth picks
Thermocouple data logger EL-USB-TC OMEGA Engineering Inc. OM-EL-USB-TC  Replacement battery purchased separately
Temperature probe Electron Microscopy Sciences 34505
Heater block 12/13 mm
Rotary shaker Fisher Scientific 11-402-10
Leaf punch - Harris Uni-core 2.00 Ted-Pella Inc. 15076
Pink dental wax Electron Microscopy Sciences 72660
Cryogenic vials 2 ml Electron Microscopy Sciences 61802-02
Methanol
Blow dryer
Dry ice
Liquid nitrogen
Acetone
Forceps Several pairs

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References

  1. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and cell biology. 130, 877-889 (2008).
  2. Studer, D., Hennecke, H., Muller, M. High-pressure freezing of soybean nodules leads to an improved preservation of ultrastructure. Planta. 188, 155-163 (1992).
  3. Bowers, B. aM. M. Ch 2. Artifacts in Biological Electron Microscopy. Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. 2, Plenum Press. 13-42 (1988).
  4. Mollenhauer, H. H. Ch 3. Artifacts in Biological Electron Microscopy. Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. Plenum Press. 43-64 (1988).
  5. Kiss, J. Z., Giddings, T. H., Staehelin, L. A., Sack, F. D. Comparison of the ultrastructure of conventionally fixed and high pressure frozen/freeze substituted root tips of Nicotiana and Arabidopsis. Protoplasma. 157, 64-74 (1990).
  6. Moor, H. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. Steinbrecht, R. A., Zierold, K. Springer Verlag. 175-191 (1987).
  7. Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods in cell biology. 88, 151-164 (2008).
  8. Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure freezing for the preservation of biological structure theory and practice. Journal of electron microscopy. 13, 165-174 (1989).
  9. McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods in molecular biology. 117, 77-97 (1999).
  10. Hippe-Sanwald, S. Impact of freeze substitution on biological electron microscopy. Microscopy research and technique. 24, 400-422 (1993).
  11. Kiss, J. Z., McDonald, K. Electron microscopy immunocytochemistry following cryofixation and freeze substitution. Methods in cell biology. 37, 311-341 (1993).
  12. Segui-Simarro, J. M., Austin 2nd, J. R., White, E. A., Staehelin, L. A. Electron tomographic analysis of somatic cell plate formation in meristematic cells of Arabidopsis preserved by high-pressure freezing. The Plant cell. 16, 836-856 (2004).
  13. Kobayashi, K., Otegui, M. S., Krishnakumar, S., Mindrinos, M., Zambryski, P. INCREASED SIZE EXCLUSION LIMIT encodes a putative DEVH box RNA helicase involved in plasmodesmata function during Arabidopsis embryogenesis. The Plant cell. 19, 1885-1897 (2007).
  14. Austin, J. R., 2nd,, Staehelin, L. A. Three-dimensional architecture of grana and stroma thylakoids of higher plants as determined by electron tomography. Plant physiology. 155, 1601-1611 (2011).
  15. McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of microscopy. 243, 227-233 (2011).
  16. Taiz, L. The Plant Vacuole. The Journal of experimental biology. 172-1113 (1992).
  17. Wilson, S. M., Bacic, A. Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nature protocols. 7, 1716-1727 (2012).
  18. Ding, B., Turgeon, R., Parthasarathy, M. V. Substructure of freeze-substituted plasmodesmata. Protoplasma. 169, 28-41 (1992).
  19. McDonald, K. L. Rapid Embedding Methods into Epoxy and LR White Resins for Morphological and Immunological Analysis of Cryofixed Biological Specimens. Microscopy and microanalysis. 20, 152-163 (2014).
  20. McDonald, K. L., Auer, M. High-pressure freezing, cellular tomography, and structural cell biology. BioTechniques. 41, 137, 139-141 (2006).
  21. Spiegelhalter, C., et al. From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy. PloS one. 5, e9014 (2010).
  22. McDonald, K. L. A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues. Journal of microscopy. 235, 273-281 (2009).

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