Обнаружение альтернативного сплайсинга Во эпителиальных-мезенхимальных перехода

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition. J. Vis. Exp. (92), e51845, doi:10.3791/51845 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Эпителиальных мезенхимальных перехода (EMT) является программой развития, что приводит органов морфогенез и ремоделирования ткани во время эмбриогенеза. При аномально активирована, ЕМТ способствует метастазирования опухоли и органов фиброз 1,2. Неотразимых исследования описано важность регуляции транскрипции в процессе ЕМТ, определяется несколькими факторами транскрипции, такими как кручение, улитки, и ZEB, которые подавляют экспрессию слипчивых перехода белка Е-кадгерина, в результате чего потери cobble- камень как эпителиальной морфологии и коэффициента усиления веретеновидным мезенхимальных фенотипа 3-8. Недавние исследования через генома анализа РНК показали, что существует группа сплайсинг генов, узоры, связанный либо с эпителиальными или мезенхимных фенотипов 9,10. Работа с нашей лаборатории функционально связаны альтернативный сплайсинг и EMT. Изучая CD44 молекул адгезии клеточной поверхности, мы показали, что CD44 чередующеесятельный сплайсинга жестко регулируется во время EMT, и что еще более важно, что CD44 сращивания переключения причинно изоформы способствует EMT 11.

Альтернативный сплайсинг представляет собой широко распространенную и консервативный модель регуляции генов, как до 95% генов нескольких экзонов человека являются альтернативного сплайсинга 12-14. По генерировать множество белковых продуктов из одного гена, альтернативный сплайсинг, является важным механизмом для белка разнообразия, добавляя еще один уровень сложности в геноме человека. Таким образом, нарушение регуляции альтернативного сплайсинга может потенциально привести к глубоким биологических эффектов, вызывающих заболевания человека. Действительно, аберрантная альтернативный сплайсинг при заболеваниях были задокументированы более десяти лет 15-25, в том числе последних выводов, что мутации в генах, кодирующих сплайсосома машины обычно встречаются в миелодиспластических синдромах 26-28. Таким образом, разработка надежных методов выявления альтернативного сплайсинга Isoforms имеет большое значение в изучении различных биологических процессов, включая EMT.

Здесь мы предлагаем протокол для обнаружения изменений в альтернативного сплайсинга, используя индуцибельную модель EMT. Способы конструирования ПЦР-праймеров и обнаружения сплайсинга изоформы пригодны не только для изучения альтернативного сплайсинга во ЕМТ, но также и при изучении альтернативного сплайсинга в других биологических процессах. Исследуя альтернативный сплайсинг во EMT необходимо для того, чтобы лучше понять механизмы EMT и метастазирования опухоли, тем самым способствуя развитию эффективных стратегий для лечения рака метастазы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 Сотовый Культура индукции EMT

Примечание: ЕМТ можно индуцировать путем обработки TGF-beta или эктопической экспрессии факторов транскрипции кручение, улитки, или Zeb1 / 2 в эпителиальных клетках. Описанные в данном протоколе является индуцируемый система EMT через выражение слитого белка Twist-ER в увековечены человека эпителиальных клеток молочной железы (HMLE / Twist-ER, подарок доктора J Ян, UCSD) 9,11,29. После 4-гидрокситамоксифен (ТАМ) лечения, слитый белок Twist-ER транслоцируется в ядро ездить транскрипцию и результаты в полном переходе ЕМТ в 12-14 дней 9,11,29. Дополнительные EMT индуцибельные системы, такие как HMLE / Улитка-ER, HMLE / TGF-beta, и MCF10A / TGF-beta, можно найти в наших предыдущих публикациях 11,30.

  1. Поддержание HMLE / Twist-ER клеток в бессывороточной молочной среде роста эпителиальных клеток (MEGM) в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2. Пассаж клетки каждые 2-3 дня, когда они достигают 80% слияния. Инкубируйте клетки с 0,15% трипсина при 37 ° С в течение 5-10 мин, а затем инактивируют трипсин с 5% сыворотки теленка / DMEM. Спин вниз клетки и ресуспендируют их в MEGM. Пластина клеток в новой тканевой культуральной чашке в соотношении 1 к 4.
  2. Растворить TAM в этаноле для получения раствора 200 мкм. Защитите TAM от света и хранить при температуре -20 ° C. Перед использованием недавно добавить TAM в MEGM СМИ в разведении 1: 10 000, чтобы сделать конечную концентрацию 20 нМ ТАМ.
  3. Для индукции EMT, плиты 1.6 х 10 6 HMLE / Twist-ER клеток в 10 см блюдо культуры ткани в двух экземплярах. Культуры клеток с 20 нМ ТАМ содержащих MEGM СМИ.
  4. Пластинчатые 1,6 х 10 6 HMLE / Twist-ER клеток в 10 см блюдо в двух экземплярах и лечения клетки с 0.01% этанола в качестве не-ТАМ-обработанной контроля.
  5. Через два дня после инкубации снимать под световым микроскопом при 10-кратным увеличением, чтобы записать морфологических изменений клеток.
  6. Аспирируйте среды из одного блюда контроля или ТАМ-лечениеклетки. Вымойте клеток с холодным ФСБ и урожая клетки, избавляясь половину тарелки в РНК буфера для лизиса для выделения РНК, а другая половина в RIPA буфере для анализа белков.
  7. Пассаж клетки от управления или ТАМ обработанных блюд, повторно покрытие 1,6 х 10 6 клеток в 10 см блюдо в двух экземплярах. Постоянно лечить клетки с 20 нМ ТАМ или транспортного средства.
  8. Повторяйте шаги с 5 по 7 раз в два дня, пока 14-й день, в это время, ТАМ-обработанные Twist-ER клетки показывают веретенообразную мезенхимальных морфологию, в то время как контрольные клетки обработанных носителем поддержания булыжника, как эпителиальных морфологию.

2 Характеристика EMT

Примечание: завершение EMT обозначается: (1) Сотовые морфологических изменений от булыжной-как эпителиальной морфологии к веретенообразной фибробластов, как внешний вид; (2) Потеря E-кадгерина локализации в межклеточных соединений; и (3) включен экспрессию маркеров ЕМТ, определяется потериэпителиальных маркеров и усиления мезенхимальных маркеров.

Сотовые морфологические изменения захватываются светового микроскопа на 10-кратным увеличением за время курса индукции ЕМТ, приведенным в главе 1 обнаружения Иммуно-флуоресценции Е-кадгерином в сотовых переходов описывается в данном разделе. Экспрессия маркеров ЕМТ обнаружен с помощью иммуноблоттинга. Общие эпителиальные маркеры E-кадгерин, γ-катенин, и occludin, и мезенхимальные маркеры включают фибронектина, N-кадгерин и виментин. Общие процедуры иммуноблотинга описаны в разделе 4.

  1. В 12-й день лечения ТАМ, семян 1 х 10 5 клеток на 12 мм стекла круговой покровного помещенные в лунку 24-луночного планшета.
  2. 48 ч после посева, аспирата средних и мыть клетки с подогретого PBS.
  3. Закрепить клеток с подогретого 4% параформальдегидом в течение 15 мин.
  4. Промывают клетки три раза PBS.
  5. Инкубируйте клетки с 0,2% Triton X-100 в PBS в течение 15мин при комнатной температуре.
  6. Промывают клетки три раза PBS.
  7. Инкубируйте клетки в 5% BSA / PBS в течение 1 часа при комнатной температуре, чтобы блокировать неспецифического связывания.
  8. Инкубируйте клетки с первичным антителом Е-кадгерина в 1:50 разбавление в 1% BSA в / PBS в увлажненной камере O / N при 4 ° С. Примечание: диапазон для разбавления первичных антител, как правило, между 1:50 и 1: 200, а также оптимальное разбавления для каждого антитела должны быть определены экспериментально.
  9. Декантировать первичного антитела и мыть клетки три раза PBS.
  10. Инкубируйте клетки с флуоресцентным-меченого вторичного антитела в разведении 1: 500 в течение 1 ч при комнатной температуре. От этого шага на, защищают клетки от действия света.
  11. Декантировать вторичного антитела и промыть три раза PBS.
  12. Пятно клетки с 0,1-1 г / мл DAPI или Hoechst в течение 10 мин.
  13. Промыть клетки с PBS, в три раза.
  14. Гора покровные с каплей монтажной среды, и тюленей покровные с лаком для ногтей.
  15. Соблюдайте клетки и принятьизображения под 63x флуоресцентным микроскопом.

Окрашивание с дополнительными антителами, могут быть выполнены, чтобы подтвердить фенотип ЕМТ. Например, N-кадгерин и α-актин гладких мышц может быть окрашивали на фенотип мезенхимальных 29,31,32. Реорганизация цитоскелета структуры можно контролировать путем окрашивания клеток с фаллоидином для F-актина 11. Кроме того, анализы для подвижности клеток и сопротивления клеточной смерти могут быть выполнены, чтобы исследовать свойства EMT 11.

3 Обнаружение сращивания изоформ Использование Qrt-ПЦР

  1. Грунтовка Дизайн
    ПРИМЕЧАНИЕ: Грунтовка пары должны быть тщательно разработаны, чтобы усилить определенные сплайсинга изоформ. Пропуск экзонов, наиболее часто наблюдается альтернативы событием сплайсинга, показан здесь в качестве примера, чтобы проиллюстрировать стратегию конструкции праймеров. изображает четыре экзона пре-мРНК, с третьей экзона в качестве переменной экзона. Включение экзона 3 приводит кпроизводство более длительного сплайсинга изоформы, в то время как пропуск экзона 3 генерирует короткий сплайс-изоформы. Грунты должны быть разработаны, чтобы отличить экзона-3-включен изоформы и экзон-3-пропускаются изоформы, и обнаружить общее стенограмму этой мРНК.
    1. Для обнаружения включения экзона, тщательно проектировать прямого праймера в переменной экзона 3, и обратного праймера внутри соседней конститутивной экзона 4, что позволяет специфической амплификации экзона переменной-включен изоформы. Убедитесь, что не проектировать как прямого и обратного праймеров в пределах той же переменной экзона во избежание продукты ПЦР-амплификации с геномной ДНК или пре-мРНК.
    2. Чтобы специально усиливать пропуска экзона события, дизайн один из праймеров, охватывающих стык учредительном экзона 2 и экзона 4, что в противном случае будет разрушена при переменной экзон 3 включен. Дизайн другого праймера внутри учредительном экзона 4 как таковой, ПЦР-продукты создаются только тогда, когда переменная экзон 3 excludред и конститутивный экзона 2 и экзона 4 соединяемые впоследствии между собой.
    3. Чтобы определить общее количество транскриптов гена, конструировать праймеры в течение двух конститутивных экзонов 1 и 2 Таким образом, продукты ПЦР амплифицировали из всех изоформ.
    4. Убедитесь, что температура плавления (Tm) для всех праймеров составляет примерно 55 ° С, длина каждого праймера составляет примерно 18-22 нуклеотидов, а размер продуктов ПЦР составляет от 80 до 150 пар оснований.
  2. Выделение РНК: Извлечение РНК с использованием общего набора для выделения РНК (см таблицу материалов).
    1. Сбор клеток в 350 мкл буфера РНК лизиса.
    2. Добавить 350 мкл 70% этанола, чтобы лизата и тщательно перемешать.
    3. Передача образца на колонку очистки РНК.
    4. Центрифуга на 10000 мкг в течение 1 мин и сброса проточных.
    5. Промыть колонку один раз 500 мкл промывочного буфера РНК I и РНК дважды промывочным буфером II.
    6. Удалите остатки буфер РНК стиркиII из колонки путем центрифугирования при максимальной скорости в течение 2 мин.
    7. Передача столбец в новую пробирку 1,5 мл, добавляют 50 мкл нуклеазы без воды в центре матрицы колонки и элюции РНК центрифугированием при максимальной скорости.
  3. Синтез первой цепи кДНК
    1. Определить концентрацию и качество РНК на измерении поглощения УФ. ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошее качество РНК должны иметь / 280 нм соотношение поглощения 260 нм приблизительно 2,0.
    2. Настройка обратной транскриптазы (RT) реакции, которые содержат 250 нг тотальной РНК, 0,05 мкг случайных праймеров гексамерных, 50 пмоль MgCl 2, 10 пмоль дНТФ, 2 мкл 5 × GoScript буфера и 1 мкл RT фермента в конечном объеме 20 мкл.
    3. Выполнение реакции RT при 42 ° С в течение 1 часа с последующей инкубацией при 70 ° С в течение 5 мин для инактивации фермента RT.
  4. ПЦР в реальном времени
    1. Настройка 20 мкл реакции, которые состоят из 10 мкл SYBR зеленый мастер-микс,0,1-1,0 мкл кДНК-матрицы и 5 пмоль прямого и обратного праймеров.
    2. Запуск ПЦР в реальном времени с 40 циклами из следующих шагов: 95 ° C денатурации в течение 10 сек, 58 ° C отжига в течение 10 секунд и 60 ° C расширением в течение 30 сек. Выполнение ПЦР-реакции, в трех экземплярах.
    3. Проверьте кривые диссоциации и убедитесь, что единственный пик наблюдается для каждого набором праймеров.
    4. Получите количественное цикл (ОВ) значения путем вычисления второй производной значения кривых усиления.
    5. Рассчитать относительную величину (RQ) целевых мРНК в образцах, вызванных, по сравнению с неиндуцированным образца с помощью "Дельта Дельта ™ (ΔΔCq) 'метод, как показано с помощью следующей формулы. Используйте генов домашнего хозяйства, таких как GAPDH или ТБФ, в качестве эталона.

Уравнение 1
Для более точного расчета относительных значений сплайсинга изоформ, тОн использование нескольких опорных генов, должны быть рассмотрены. Результаты могут быть проанализированы с помощью модифицированного метода абсолютное значение количественного описанный Pfaffl соавт 33,34.

4 Экспертиза сращивания изоформ на уровне белка

  1. Сбор клеток в 100 мкл ледяного RIPA буфера.
  2. Установите лизатов на льду в течение примерно 10 мин.
  3. Центрифуга при 14000 х г в течение 10 мин при 4 ° С, и собирать надосадочную жидкость.
  4. Измерьте концентрацию белка по Брэдфорд анализов.
  5. Развести образцы белка в SDS буфере для загрузки и загрузить 20-40 мкг белка в 10% ПААГ с ДСН.
  6. Запустите ПААГ с ДСН при 20 мА в течение 1,5 часа.
  7. Передача белков мембраны ПВДФ в системе передачи влажного при 4 ° С в течение 3 часов при 85 В. Регулировка времени передачи в соответствии с молекулярной массой белков-мишеней.
  8. Блок мембраны в 5% обезжиренном молоке в течение 30 мин до 1 ч при комнатной температуре.
  9. Выдержите мембраны Wiго первичного антитела при 4 ° С CO / N. Диапазон для разбавления первичных антител, как правило, в пределах от 1: 200 до 1: 5000, определить оптимальную для каждого разведения антител в эксперименте. Разбавление антител, используемых в данном протоколе можно найти в "таблице конкретных реагентов и оборудования".
    1. Для обнаружения сплайсинга изоформы, использовать специфические антитела, которые распознают конкретный изоформы. Вместо этого можно использовать антитело, которое распознает эпитоп в конститутивной кодирующей области экзона и обнаружения сплайсинга изоформы одновременно на основе различных белковых их размеров.
    2. В то же время, контролировать EMT с помощью иммуноблоттинга для маркеров ЕМТ. Использование E-кадгерин, γ-катенин, и occludin как эпителиальные маркеры, и фибронектин, N-кадгерин и виментин как мезенхимальных маркеров.
  10. Вымойте мембранные три раза TBS-T (50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 0,05% Твин 20, рН 7,4) в 5-минутного интервала.
  11. Выдержите мембрану с HRP-конъюгированного вторичного муравьяibody в разведении 1: 10 000 в течение 1 часа при комнатной температуре.
  12. Вымойте мембранные три раза TBS-T в 5-минутного интервала.
  13. Визуализация белка с системой обнаружения хемилюминесценции и подвергать мембрану пленке для ауторадиографии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Процедуры, описанные выше, обеспечивают надежный метод для выявления альтернативного сплайсинга во EMT. Представитель результаты CD44 сращивания коммутации изоформы во Twist-индуцированной EMT приведены ниже в качестве примера.

Твист-индуцированной ЕМТ в HMLE / Twist-ER клеток характеризуется переходом от булыжника как эпителиального фенотипа к удлиненной фибробластического фенотипа (Рисунок 2А), отсутствие эпителиальных маркеров E-кадгерина, γ-катенином и occludin и регуляция мезенхимальные маркеры фибронектина, N-кадгерина, и виментина (Рисунок 2B). Кроме того, ЕМТ оценивали по потере локализации Е-кадгерина в межклеточных соединений (фиг.2С).

Включается экспрессия CD44 сплайсинга изоформ во EMT был осмотрен Qrt-ПЦР и иммуноблоттинга. Ген CD44 человек состоит из девяти переменных экзонов. Альтернативный сплайсинг CD44 позволяет клеток в проварианты дуче CD44 (CD44v), которые включают по крайней мере один переменную экзон и CD44 стандарт (CD44s), лишенной всех переменных экзонов. изображает стратегии проектирования грунтовки для обнаружения различных CD44 сплайсинга изоформ. Для обнаружения экзонным-пропускаются CD44s продукции, прямой праймер расположен в учредительном экзоне 5, в то время как обратный праймер растянутый на стыке учредительных экзонов 5 и 6 Для обнаружения CD44v сплайсинга изоформ, содержащей переменную V5 и V6 экзоны, прямого и обратного праймеров предназначены в V5 и V6, соответственно. Грунтовки для обнаружения других CD44 переменных экзонов содержащих изоформ могут быть разработаны с использованием той же стратегии. Кроме того, общее CD44 транскрипт обнаружены с помощью прямого и обратного праймеров, расположенные в конститутивной экзона 2 и экзона 3, соответственно (фиг.3А). Как показано на фигуре 3В, Qrt-ПЦР анализы использования этих наборы праймеров указано значительное уменьшение CD44В мРНК и увеличение CD44s мРНК после 14 дней лечения ТАМ в Твист-ER-выражения HMLE клеток. В отличие от этого, общее транскрипт CD44 оставалась неизменной в течение EMT (Рисунок 3C). В соответствии с результатами Qrt-ПЦР, уровень белка CD44v отказался удивительно, в то время как экспрессия белка CD44s сильно активируется (Рисунок 3D). Таким образом, основная изоформы CD44 был смещен с CD44v в CD44s в процессе ЕМТ.

Рисунок 1
Рис.1 Primer дизайн. Принципиальные схемы, иллюстрирующие расположение праймеров для обнаружения сплайсинга изоформы в модели экзона-пропуск. Серые прямоугольники представляют учредительные экзонов, оранжевые прямоугольники представляют переменные экзонов, и тонкие линии, соединяющие коробки обозначения интронов. Грунтовка места находятся indicatред стрелками: черные стрелки указывают наборы праймеров для обнаружения общее мРНК, оранжевые стрелки показывают наборы праймеров для амплификации экзона-включен изоформы, и синие стрелки показывают наборы праймеров для обнаружения экзонные-пропуск изоформ.

Рисунок 2
Рисунок 2. Индукция EMT. (A) фазового контраста изображения (10X), иллюстрирующая морфологические изменения в HMLE / Twist-ER клеток до (без лечения) и после 14 дней лечения ТАМ. (B) Иммуноблот анализ маркеров ЕМТ в HMLE / Twist-ER клеток до (без лечения) и после 14 дней лечения ТАМ. После обработки ТАМ, эпителиальные маркеры E-кадгерина, γ-катенин, и occludin были подавляется, и мезенхимальных маркеров фибронектина, N-кадгерина, и виментина были активируется. (C) Иммунные изображения флуоресценции (63X) указывает потерю Е-кадгериномлокализация в межклеточных соединений после 14 дней лечения ТАМ. Зеленый окрашивание указывает Е-кадгерина, и DAPI окрашивание (синий) указывает ядра. Шкала бар = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3 Выключатель CD44 сплайсинга изоформ во EMT. () Грунтовка дизайн для обнаружения CD44 сплайсинга изоформ. Серые прямоугольники представляют учредительные экзонов, оранжевые прямоугольники представляют переменные экзонов, и тонкие линии, соединяющие коробки обозначения интронов. Праймеров места указаны стрелками: Черные стрелки показывают, наборы праймеров для обнаружения CD44 общее мРНК, оранжевые стрелки указывают наборы праймеров для амплификации CD44v5-6, и синие стрелки указывают наборы праймеров дляобнаружении CD44s. (B, C) ​​Qrt-ПЦР-анализ уровней CD44 изоформ в процессе с использованием праймеров, которые специфично ЕМТ обнаружения CD44v, содержащий переменные экзонов V5 и V6 (V5 / 6) и CD44s (б) и CD44 мРНК общее (С) . Относительные уровни экспрессии мРНК в день 14 ячеек были нормализованы к соответствующему день 0 ячеек в TAM обработанной и необработанными групп. Столбики ошибок указывают SEM; п = 3 (D) Иммуноблот анализ CD44 изоформ во ТАМ-индуцированного EMT в HMLE / Twist-ER клеток. Уровни Е-кадгерином и N-кадгерина были проверены, чтобы определить статус EMT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Процедура, описанная здесь, включает обнаружение альтернативного сплайсинга в индуцируемого модели ЕМТ. По существу, динамические изменения экспрессии изоформ сплайсинга могут быть захвачены в течение времени ход EMT. Этот метод имеет преимущества перед использованием различных epithelial- или мезенхимальных-представляющих клеточных линий для сравнения альтернативного сплайсинга, потому что различные генетические фоны от связанных с ООН клеточных линий может оказать неправомерное влияние на альтернативный сплайсинг. Однако успешное индукция EMT должны быть тщательно подтверждена с помощью различных маркеров EMT перед любыми выводами об изменениях в альтернативного сплайсинга могут быть сделаны. Кроме того, в дополнение к твист-ER-индуцируемый системы EMT, описанного здесь, и другие системы, такие как EMT, индуцированные улитки ER или TGF-beta рекомендуются для проверки экспериментальных данных 11,30.

Переключение сплайс-изоформ во ЕМТ могут быть обнаружены в обоих РНК и белка уровнях. Соединитель ISOФорма-специфические антитела являются предпочтительными для анализа белков. При изоформы-специфические антитела не доступны, уровни белка из сплайс-изоформ может быть определена на основе их молекулярной массы в SDS-PAGE с помощью иммуноблоттинга. Уровень РНК из каждой изоформы могут быть определены количественно с помощью изоформ-специфических праймеров. Использование Qrt-ПЦР, кратное изменение каждой изоформы может быть чувствительно и точно определены. В частности, когда экспериментальные материалы ограничены, например, анализа экспрессии конкретной изоформы сплайсинга в клинических образцах, анализ Qrt-ПЦР обеспечивает количественную меру, что будет компенсировать отсутствие изоформ-специфических антител для иммуногистохимического анализа.

Способ упоминалось здесь подходит для обнаружения известных изменений сплайс-изоформ в процессе ЕМТ. Кроме того, этот метод может быть расширен для изучения генома альтернативного сплайсинга и для идентификации нового коммутации сращивания изоформы во EMT. Чтобы достичь этого,Использование крупномасштабного техники, такие как РНК-глубокого секвенирования или сплайсинга чувствителен микрочипов платформ, может быть выполнена с использованием РНК, выделенных из индуцируемой модели ЕМТ, описанной выше. Тем не менее, проверка Qrt-ПЦР изменений изоформ требуется после любого масштабного анализа.

В заключение, альтернативный сплайсинг динамически регулируется во время EMT, процесс, который имеет решающее значение для эмбрионального развития и метастазирования опухоли. Принимая во внимание высокую частоту альтернативного сплайсинга в геноме человека, вполне вероятно, что регулирование альтернативного сплайсинга играет важную роль во многих других биологических и патологических процессов, включающих дифференцировки клеток, развитие тканей, и запрограммированной клеточной смерти 35-41. Протокол, описанный в данном документе для обнаружения сплайс-изоформ будут применимы в этих других систем.

Дополнительные экспериментальные методы, такие как шпон репортер минигена анализов, можно бэ использованы для дальнейшего расследования регуляторные механизмы цис-действующие элементы и транс-действующих факторов, которые контролируют альтернативный сплайсинг 30,42,43. Кроме того, функциональная роль конкретного сращивания изоформы во ЕМТ можно исследовать заставить замолчать или эктопически выражая конкретные изоформы и мониторинга индукции EMT в описанном EMT-индуцибельного системы 11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-hydroxytamoxifen Sigma H7904 Make stock solution by dissolving 4-hydroxytamoxifen in ethanol to 200 μM. Keep the solution at -20 °C protected from light.
E.Z.N.A. Total RNA Isolation kit Omega Bio-Tek R6731 Total RNA isolation kit
GoScript Reverse Transcription System Promega A5001 Reagent for qRT-PCR assay
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6002 Reagent for qRT-PCR assay
LightCycler 480 Real-Time PCR System Roche Equipment for qRT-PCR assay
CD44 antibody R&D Systems BBA10 1:1,000 dilution
E-cadherin antibody Cell Signaling Technology 4065 1:2,500 dilution for immunoblotting; 1:50 dilution for immunofluorescence
γ-Catenin antibody Cell Signaling Technology 2309 1:1,000 dilution
Occludin antibody Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-5562 1:500 dilution
Fibronectin antibody BD Transduction Laboratories 610077 1:5,000 dilution
N-cadherin antibody BD Transduction Laboratories 610920 1:2,000 dilution
Vimentin antibody NeoMarkers MS-129-p1 1:500 dilution
GAPDH antibody Millipore Corporation MAB374 1:10,000 dilution
Amasham ECL Western blotting detection reagent GE Health Life Science RPN2209 Chemiluminescence system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 131-142 (2006).
  2. Yang, J., Weinberg, R. A. Epithelial-mesenchymal transition at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev Cell. 14, 818-829 (2008).
  3. Yang, J., et al. a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis. Cell. 117, 927-939 (2004).
  4. Batlle, E., et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nat Cell Biol. 2, 84-89 (2000).
  5. Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nat Cell Biol. 2, 76-83 (2000).
  6. Comijn, J., et al. The two-handed E box binding zinc finger protein SIP1 downregulates E-cadherin and induces invasion. Mol Cell. 7, 1267-1278 (2001).
  7. Bolos, V., et al. The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors. J Cell Sci. 116, 499-511 (2003).
  8. Eger, A., et al. DeltaEF1 is a transcriptional repressor of E-cadherin and regulates epithelial plasticity in breast cancer cells. Oncogene. 24, 2375-2385 (2005).
  9. Shapiro, I. M., et al. An EMT-driven alternative splicing program occurs in human breast cancer and modulates cellular phenotype. PLoS Genet. 7, e1002218 (2011).
  10. Warzecha, C. C., et al. An ESRP-regulated splicing programme is abrogated during the epithelial-mesenchymal transition. EMBO J. 29, 3286-3300 (2010).
  11. Brown, R. L., et al. CD44 splice isoform switching in human and mouse epithelium is essential for epithelial-mesenchymal transition and breast cancer progression. J Clin Invest. 121, 1064-1074 (2011).
  12. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
  13. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
  14. Liu, S., Cheng, C. Alternative RNA splicing and cancer. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4, 547-566 (2013).
  15. Shtivelman, E., Lifshitz, B., Gale, R. P., Roe, B. A., Canaani, E. Alternative splicing of RNAs transcribed from the human abl gene and from the bcr-abl fused gene. Cell. 47, 277-284 (1986).
  16. Krangel, M. S. Secretion of HLA-A and -B antigens via an alternative RNA splicing pathway. J Exp Med. 163, 1173-1190 (1986).
  17. Brickell, P. M., Latchman, D. S., Murphy, D., Willison, K., Rigby, P. W. Activation of a Qa/Tla class I major histocompatibility antigen gene is a general feature of oncogenesis in the mouse. Nature. 306, 756-760 (1983).
  18. Barbaux, S., et al. Donor splice-site mutations in WT1 are responsible for Frasier syndrome. Nat Genet. 17, 467-470 (1997).
  19. Charlet, B. N., et al. Loss of the muscle-specific chloride channel in type 1 myotonic dystrophy due to misregulated alternative splicing. Mol Cell. 10, 45-53 (2002).
  20. Hutton, M., et al. Association of missense and 5'-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17. Nature. 393, 702-705 (1998).
  21. Kohsaka, T., et al. Exon 9 mutations in the WT1 gene, without influencing KTS splice isoforms, are also responsible for Frasier syndrome. Hum Mutat. 14, 466-470 (1999).
  22. Philips, A. V., Timchenko, L. T., Cooper, T. A. Disruption of splicing regulated by a CUG-binding protein in myotonic dystrophy. Science. 280, 737-741 (1998).
  23. Savkur, R. S., Philips, A. V., Cooper, T. A. Aberrant regulation of insulin receptor alternative splicing is associated with insulin resistance in myotonic dystrophy. Nat Genet. 29, 40-47 (2001).
  24. Spillantini, M. G., et al. Mutation in the tau gene in familial multiple system tauopathy with presenile dementia. Proc Natl Acad Sci USA. 95, 7737-7741 (1998).
  25. Wang, J., et al. Myotonic dystrophy evidence for a possible dominant-negative RNA mutation. Hum Mol Genet. 4, 599-606 (1995).
  26. Graubert, T. A., et al. Recurrent mutations in the U2AF1 splicing factor in myelodysplastic syndromes. Nat Genet. 44, 53-57 (2012).
  27. Papaemmanuil, E., et al. Somatic SF3B1 mutation in myelodysplasia with ring sideroblasts. N Engl J Med. 365, 1384-1395 (2011).
  28. Yoshida, K., et al. Frequent pathway mutations of splicing machinery in myelodysplasia. Nature. 478, 64-69 (2011).
  29. Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133, 704-715 (2008).
  30. Reinke, L. M., Xu, Y., Cheng, C. Snail represses the splicing regulator epithelial splicing regulatory protein 1 to promote epithelial-mesenchymal transition. J Biol Chem. 287, 36435-36442 (2012).
  31. Serini, G., Gabbiani, G. Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation. Exp Cell Res. 250, 273-283 (1999).
  32. Zavadil, J., Bottinger, E. P. TGF-beta and epithelial-to-mesenchymal transitions. Oncogene. 24, 5764-5774 (2005).
  33. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, e45 (2001).
  34. Hellemans, J., Mortier, G., De Paepe, A., Speleman, F., Vandesompele, J. qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data. Genome Biol. 8, R19 (2007).
  35. Boutz, P. L., et al. A post-transcriptional regulatory switch in polypyrimidine tract-binding proteins reprograms alternative splicing in developing neurons. Genes Dev. 21, 1636-1652 (2007).
  36. Salomonis, N., et al. Alternative splicing regulates mouse embryonic stem cell pluripotency and differentiation. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 10514-10519 (2010).
  37. Calarco, J. A., et al. Regulation of vertebrate nervous system alternative splicing and development by an SR-related protein. Cell. 138, 898-910 (2009).
  38. Grabowski, P. Alternative splicing takes shape during neuronal development. Curr Opin Genet Dev. 21, 388-394 (2011).
  39. Seol, D. W., Billiar, T. R. A caspase-9 variant missing the catalytic site is an endogenous inhibitor of apoptosis. J Biol Chem. 274, 2072-2076 (1999).
  40. Srinivasula, S. M., et al. Identification of an endogenous dominant-negative short isoform of caspase-9 that can regulate apoptosis. Cancer Res. 59, 999-1002 (1999).
  41. Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. Alternative splicing of Bcl-2-related genes functional consequences and potential therapeutic applications. Cell Mol Life Sci. 61, 2189-2199 (2004).
  42. Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37, 331-340 (2005).
  43. Cheng, C., Sharp, P. A. Regulation of CD44 alternative splicing by SRm160 and its potential role in tumor cell invasion. Mol Cell Biol. 26, 362-370 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics