उपकला-Mesenchymal संक्रमण के दौरान वैकल्पिक Splicing की जांच

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Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition. J. Vis. Exp. (92), e51845, doi:10.3791/51845 (2014).

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Abstract

Introduction

उपकला-mesenchymal संक्रमण (EMT) embryogenesis दौरान अंग morphogenesis और ऊतक remodeling ड्राइव कि एक विकास कार्यक्रम है. असामान्य रूप से जब सक्रिय, EMT ट्यूमर मेटास्टेसिस और अंग फाइब्रोसिस 1,2 को बढ़ावा देता है. सम्मोहक पढ़ाई एक cobble- के नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप adherens जंक्शन प्रोटीन ई cadherin की अभिव्यक्ति को दबाने जो ऐसे ट्विस्ट, घोंघा, और Zeb के रूप में कई प्रतिलेखन कारक,,, द्वारा परिभाषित, EMT की प्रक्रिया के दौरान ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन के महत्व का वर्णन किया है उपकला आकारिकी और एक धुरी के आकार mesenchymal phenotype 3-8 से लाभ की तरह पत्थर. RNAs के जीनोम चौड़ा विश्लेषण के माध्यम से हाल के अध्ययनों जिसका splicing पैटर्न उपकला या mesenchymal phenotypes 9,10 या तो साथ जुड़े रहे हैं जीनों का एक समूह है कि वहां मौजूद पता चला. हमारी प्रयोगशाला से कार्य कार्यात्मक वैकल्पिक splicing और EMT जुड़े. कोशिका की सतह आसंजन अणु CD44 का अध्ययन करके, हम CD44 altern कि प्रदर्शनative splicing कसकर EMT के दौरान नियंत्रित किया जाता है, और अधिक महत्वपूर्ण बात, कारणतः स्विचन कि CD44 ब्याह isoform 11 EMT के लिए योगदान देता है.

वैकल्पिक रूप से 12-14 spliced ​​रहे मानव बहु एक्सॉन जीनों के 95% अप करने के लिए के रूप में वैकल्पिक splicing, जीन विनियमन की एक व्यापक और संरक्षित मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है. एक जीन से कई प्रोटीन उत्पादों पैदा करके, वैकल्पिक splicing मानव जीनोम को जटिलता का एक और परत जोड़ने, प्रोटीन विविधता के लिए एक आवश्यक तंत्र का गठन किया. जैसे, वैकल्पिक splicing के अनियंत्रण संभावित मानव रोगों के कारण गहरा जैविक प्रभाव को जन्म दे सकता है. दरअसल, रोगों में न्यायपालिका वैकल्पिक splicing spliceosome मशीनरी एन्कोडिंग जीन में उत्परिवर्तन आमतौर myelodysplastic सिंड्रोम 26-28 में पाया जाता है कि हाल के निष्कर्षों सहित, एक दशक से अधिक 15-25 के लिए प्रलेखित किया गया है. इसलिए, वैकल्पिक रूप से spliced ​​मैं का पता लगाने के लिए विश्वसनीय तरीकों को विकसितsoforms EMT सहित विविध जैविक प्रक्रियाओं के अध्ययन में काफी महत्व की है.

यहाँ हम एक inducible EMT मॉडल का उपयोग वैकल्पिक splicing में परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. ब्याह isoforms पीसीआर प्राइमरों डिजाइन और पता लगाने के लिए तरीकों EMT दौरान वैकल्पिक splicing के अध्ययन के लिए, लेकिन यह भी अन्य जैविक प्रक्रियाओं में वैकल्पिक splicing के अध्ययन के लिए न केवल उपयुक्त हैं. EMT दौरान वैकल्पिक splicing जांच बेहतर इस प्रकार के कैंसर मेटास्टेसिस के इलाज के लिए प्रभावी रणनीति के विकास की सुविधा, EMT और ट्यूमर मेटास्टेसिस के तंत्र को समझने के क्रम में आवश्यक है.

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Protocol

EMT प्रेरण के 1 सेल संस्कृति

नोट: EMT TGFβ के उपचार या उपकला कोशिकाओं में प्रतिलेखन कारक ट्विस्ट, घोंघा, या Zeb1 / 2 के अस्थानिक अभिव्यक्ति द्वारा प्रेरित किया जा सकता है. अमर मानव स्तन उपकला कोशिकाओं (HMLE / ट्विस्ट-ईआर, डॉ जे यांग की एक उपहार, UCSD) 9,11,29 में ट्विस्ट-ईआर संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति के माध्यम से एक inducible EMT प्रणाली इस प्रोटोकॉल में है का वर्णन किया. 4-hydroxytamoxifen (टैम) के उपचार पर, संलयन प्रोटीन ट्विस्ट-ईआर 12-14 दिनों 9,11,29 में एक पूर्ण EMT संक्रमण में प्रतिलेखन और परिणाम ड्राइव करने के नाभिक को translocates. ऐसे HMLE / घोंघा ईआर, HMLE / TGFβ, और MCF10A / TGFβ के रूप में अतिरिक्त EMT inducible प्रणाली, हमारे पिछले प्रकाशनों 11,30 में पाया जा सकता है.

  1. 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सीरम मुक्त स्तन उपकला सेल मध्यम विकास (MEGM) में HMLE / ट्विस्ट-ईआर कोशिकाओं को बनाए रखें. पारित होने कोशिकाओं हर 2-3 दिनों वे 80% संगम तक पहुँच जाने. 5% बछड़ा सीरम / DMEM के साथ trypsin निष्क्रिय फिर 5-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.15% trypsin के साथ कोशिकाओं को सेते हैं, और. कोशिकाओं नीचे स्पिन और MEGM में उन्हें resuspend. 1 to 4 के अनुपात में एक नए टिशू कल्चर पकवान में प्लेट कोशिकाओं.
  2. एक 200 माइक्रोन समाधान बनाने के लिए इथेनॉल में टैम भंग. -20 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश और दुकान से टैम को सुरक्षित रखें. 20 एनएम टैम के अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए 10,000 कमजोर पड़ने उपयोग करने से पहले, हौसले से एक 1 पर MEGM मीडिया में टैम जोड़ें.
  3. EMT के शामिल होने के लिए, दो प्रतियों में एक 10 सेमी टिशू कल्चर पकवान में 1.6 x 10 6 HMLE / ट्विस्ट-ईआर कोशिकाओं थाली. 20 एनएम टैम युक्त MEGM मीडिया के साथ संस्कृति कोशिकाओं.
  4. दो प्रतियों में एक 10 सेमी डिश में प्लेट 1.6 x 10 6 HMLE / ट्विस्ट-ईआर कोशिकाओं और एक गैर टैम इलाज नियंत्रण के रूप में 0.01% इथेनॉल के साथ इलाज कोशिकाओं.
  5. दो दिन ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं के morphological परिवर्तन रिकॉर्ड करने के लिए 10x बढ़ाई पर एक प्रकाश खुर्दबीन के नीचे तस्वीरें ले.
  6. नियंत्रण या टीएएम इलाज से एक पकवान से मध्यम Aspirateकोशिकाओं. शाही सेना अलगाव और प्रोटीन विश्लेषण के लिए RIPA बफर में दूसरे आधे के लिए शाही सेना lysis बफर में थाली के आधे समाप्त द्वारा ठंड पीबीएस के साथ कोशिकाओं, और फसल कोशिकाओं को धो लें.
  7. दो प्रतियों में एक 10 सेमी पकवान में फिर से चढ़ाना 1.6 x 10 6 कोशिकाओं द्वारा नियंत्रण या टीएएम इलाज व्यंजन से पारित होने कोशिकाओं. लगातार 20 एनएम टैम या वाहन के साथ कोशिकाओं का इलाज.
  8. दोहराएँ वाहन का इलाज नियंत्रण कोशिकाओं cobblestone तरह उपकला आकारिकी बनाए रखने जबकि जो समय पर, टैम इलाज ट्विस्ट-ईआर कोशिकाओं, एक धुरी के आकार mesenchymal आकारिकी दिखाने के लिए, 14 दिन तक 5 बार हर दूसरे दिन 7 को दोहराएँ.

EMT के 2 विशेषता

नोट: EMT का एक पूरा होने के संकेत है: एक धुरी के आकार तंतुप्रसू उपस्थिति की तरह करने के लिए एक पत्थर की तरह उपकला आकारिकी से (1) सेल morphological परिवर्तन; (2) सेल सेल जंक्शनों पर ई cadherin स्थानीयकरण की हानि; नुकसान से परिभाषित EMT मार्कर की और (3) स्विच अभिव्यक्ति,उपकला मार्करों और mesenchymal मार्करों के लाभ की.

सेल morphological परिवर्तन इस खंड में वर्णित सेल जंक्शनों पर ई cadherin की धारा 1 इम्यूनो प्रतिदीप्ति का पता लगाने में वर्णित, EMT प्रेरण का समय दौरान 10x बढ़ाई पर प्रकाश माइक्रोस्कोप से कब्जा कर रहे हैं. EMT मार्करों की अभिव्यक्ति Immunoblotting ने पता लगाया है. आम उपकला मार्करों ई cadherin, γ-catenin, और occludin हैं, और mesenchymal मार्करों फ़ाइब्रोनेक्टिन, एन cadherin और vimentin शामिल हैं. Immunoblotting के सामान्य प्रक्रियाओं धारा 4 में वर्णित हैं.

  1. टीएएम उपचार, बीज एक 24 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में रखा एक 12 मिमी गिलास परिपत्र coverslip पर 1 x 10 5 कोशिकाओं की सुबह 12 बजे.
  2. पूर्व गर्म पीबीएस के साथ बोने, महाप्राण मध्यम और धोने कोशिकाओं के बाद 48 घंटे.
  3. 15 मिनट के लिए पूर्व गर्म 4% paraformaldehyde के साथ कोशिकाओं को ठीक करें.
  4. पीबीएस के साथ कोशिकाओं तीन बार धोएं.
  5. 15 के लिए पीबीएस में 0.2% ट्राइटन X-100 के साथ कोशिकाओं को सेतेआरटी पर मिनट.
  6. पीबीएस के साथ कोशिकाओं तीन बार धोएं.
  7. गैर विशिष्ट बंधनकारी ब्लॉक करने के लिए आरटी पर 1 घंटे के लिए 5% BSA / पीबीएस में कोशिकाओं को सेते हैं.
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक 1:50 कमजोर पड़ने 1% में बीएसए / एक humidified कक्ष हे में पीबीएस / एन पर प्राथमिक एंटीबॉडी ई cadherin के साथ कोशिकाओं को सेते हैं. नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के लिए सीमा 1:50 और 1 के बीच सामान्य रूप से है: 200, और प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए इष्टतम कमजोर पड़ने प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना चाहिए.
  9. प्राथमिक एंटीबॉडी छानना और पीबीएस के साथ कोशिकाओं तीन बार धोएं.
  10. आरटी पर 1 घंटे के लिए 500 कमजोर पड़ने: एक 1 में फ्लोरोसेंट लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को सेते हैं. पर इस कदम से, प्रकाश से कोशिकाओं की रक्षा.
  11. माध्यमिक एंटीबॉडी छानना और पीबीएस के साथ तीन बार धोएं.
  12. 10 मिनट के लिए 0.1-1 ग्राम / मिलीलीटर DAPI या Hoechst साथ दाग कोशिकाओं.
  13. पीबीएस तीन बार के साथ कोशिकाओं कुल्ला.
  14. माउंट नेल पॉलिश के साथ एक बढ़ते मध्यम के ड्रॉप, और सील coverslips साथ coverslips.
  15. कोशिकाओं का पालन और लेएक 63X फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे छवियाँ.

अतिरिक्त एंटीबॉडी के साथ धुंधला EMT phenotype पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, एन cadherin और α चिकनी पेशी actin एक mesenchymal phenotype 29,31,32 के लिए दाग जा सकता है. Cytoskeletal संरचना के पुनर्गठन एफ actin 11 के लिए phalloidin साथ कोशिकाओं धुंधला द्वारा नजर रखी जा सकती है. इसके अलावा, सेल गतिशीलता और सेल मौत प्रतिरोध के लिए assays EMT 11 की संपत्तियों की जांच करने के लिए किया जा सकता है.

QRT- पीसीआर assays का उपयोग जांच ब्याह isoforms की 3

  1. प्रथम डिजाइन
    नोट: प्राइमर जोड़े ध्यान से अलग ब्याह isoforms बढ़ाना डिजाइन किया जाना चाहिए. लंघन एक्सॉन, सबसे अधिक देखी वैकल्पिक splicing घटना, प्रथम डिजाइन की रणनीति बताने के लिए एक उदाहरण के रूप में यहाँ दिखाया गया है. चित्रा 1 ए एक चर एक्सॉन के रूप में तीसरे एक्सॉन के साथ एक चार एक्सॉन पूर्व mRNA दर्शाया गया है. एक्सॉन का समावेश 3 परिणामों मेंएक्सॉन 3 की लंघन जबकि एक अब ब्याह isoform के उत्पादन, एक छोटी ब्याह isoform उत्पन्न करता है. प्राइमर एक्सॉन-3-शामिल isoform और एक्सॉन-3-छोड़ isoform भेद करने के लिए, और इस mRNA की कुल प्रतिलेख का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया जाना चाहिए.
    1. एक्सॉन शामिल किए जाने का पता लगाने के लिए, ध्यान से चर एक्सॉन-शामिल isoform के विशिष्ट प्रवर्धन के लिए अनुमति देता है, चर एक्सॉन 3, और आसपास के विधान एक्सॉन 4 अंदर एक रिवर्स प्राइमर के अंदर एक आगे प्राइमर डिजाइन. आगे दोनों डिजाइन और जीनोमिक डीएनए या पूर्व mRNA से परिलक्षित पीसीआर उत्पादों से बचने के लिए एक ही चर एक्सॉन के भीतर प्राइमरों रिवर्स करने के लिए सुनिश्चित करें.
    2. विशेष रूप से एक्सॉन लंघन घटनाओं, डिजाइन बढ़ाना चर एक्सॉन 3 शामिल है जब अन्यथा नष्ट हो जाएगा कि विधान एक्सॉन 2 और एक्सॉन 4 के जंक्शन फैले प्राइमरों में से एक. जैसे विधान एक्सॉन 4 अंदर अन्य प्राइमर डिजाइन, पीसीआर उत्पादों चर एक्सॉन 3 exclud है केवल जब उत्पन्न कर रहे हैंएड और एक्सॉन 2 और एक्सॉन 4 बाद में एक साथ शामिल हो गए हैं विधान.
    3. , जीन की कुल टेप का पता लगाने के दो विधान एक्सॉनों 1 और 2 के भीतर प्राइमरों इस प्रकार डिजाइन करने के लिए, पीसीआर उत्पादों सभी isoforms से परिलक्षित कर रहे हैं.
    4. सुनिश्चित करें कि सभी प्राइमरों के लिए पिघलने के तापमान (टीएम) लगभग 55 डिग्री सेल्सियस, प्रत्येक प्राइमर की लंबाई लगभग 18-22 nucleotides है बनाओ, और पीसीआर उत्पादों का आकार 80 और 150 के बीच आधार जोड़े है.
  2. शाही सेना निकासी: (सामग्री की तालिका देखें) कुल शाही सेना अलगाव किट का उपयोग कर शाही सेना निकालें.
    1. 350 μl शाही सेना lysis बफर में कोशिकाओं को इकट्ठा.
    2. Lysate के लिए 70% इथेनॉल के 350 μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से.
    3. शाही सेना शुद्धि स्तंभ के लिए नमूना स्थानांतरण.
    4. 1 मिनट और त्यागने प्रवाह के माध्यम से के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र.
    5. आरएनए धोने बफर द्वितीय के साथ एक बार शाही सेना धोने बफर मैं के 500 μl के साथ और दो बार स्तंभ धो लें.
    6. अवशिष्ट आरएनए धोने बफर निकालें2 मिनट के लिए अधिकतम गति पर centrifugation द्वारा स्तंभ से द्वितीय.
    7. , एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्तंभ स्थानांतरण स्तंभ मैट्रिक्स के केंद्र में 50 μl nuclease मुक्त पानी जोड़ने और अधिकतम गति पर centrifugation द्वारा आरएनए elute.
  3. पहले कतरा सीडीएनए संश्लेषण
    1. यूवी अवशोषण मापन से एकाग्रता और शाही सेना की गुणवत्ता निर्धारित. नोट: अच्छी गुणवत्ता शाही सेना लगभग 2.0 की एक 260 एनएम / 280 एनएम absorbance के अनुपात होना चाहिए.
    2. 20 μl के अंतिम मात्रा में 250 एनजी कुल शाही सेना, 0.05 माइक्रोग्राम यादृच्छिक hexamer प्राइमरों, 50 pmol 2 MgCl, 10 pmol dNTP, 2 μl 5 × GoScript बफर, और 1 μl आरटी एंजाइम होते हैं कि रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (आरटी) प्रतिक्रियाओं सेट करें.
    3. आरटी एंजाइम निष्क्रिय करने के लिए 5 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन द्वारा पीछा 1 घंटा, के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर आरटी प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन करना.
  4. वास्तविक समय पीसीआर
    1. 10 μl SYBR हरी मास्टर मिश्रण से मिलकर बनता है कि 20 μl प्रतिक्रियाओं सेट अप,0.1-1.0 μl सीडीएनए टेम्पलेट, और 5 आगे pmol और प्राइमरों रिवर्स.
    2. निम्न चरणों में से 40 चक्र के साथ वास्तविक समय पीसीआर चलाएँ: 95 डिग्री सेल्सियस विकृतीकरण 10 सेकंड, 10 सेकंड के लिए 58 डिग्री सेल्सियस annealing, और 30 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस विस्तार के लिए. तीन प्रतियों में पीसीआर प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन करना.
    3. हदबंदी घटता जाँच करें और एक एकल शिखर प्रत्येक प्राइमर सेट के लिए मनाया जाता है कि सुनिश्चित करें.
    4. प्रवर्धन घटता के दूसरे व्युत्पन्न मूल्यों की गणना की मात्रा का ठहराव चक्र (सीक्यू) मान प्राप्त.
    5. 'डेल्टा डेल्टा सीक्यू (ΔΔCq)' निम्न सूत्र द्वारा दिखाया के रूप में विधि का उपयोग uninduced नमूने की तुलना में प्रेरित नमूनों में लक्ष्य mRNAs के रिश्तेदार मात्रा (RQ) की गणना. एक संदर्भ के रूप में, इस तरह के GAPDH या TBP के रूप में गृह व्यवस्था जीन, का प्रयोग करें.

समीकरण 1
अधिक सही ब्याह isoforms के रिश्तेदार मूल्यों की गणना करने के लिए, टीउन्होंने विचार किया जाना चाहिए एकाधिक संदर्भ जीन का उपयोग करें. परिणाम PFAFFL एट अल 33,34 द्वारा वर्णित एक संशोधित निरपेक्ष मूल्य मात्रा का ठहराव विधि का उपयोग विश्लेषण किया जा सकता है.

प्रोटीन के स्तर पर ब्याह isoforms के 4 परीक्षा

  1. 100 μl ठंडा RIPA बफर में कोशिकाओं को इकट्ठा.
  2. लगभग 10 मिनट के लिए बर्फ पर lysates सेट करें.
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा.
  4. ब्रैडफोर्ड assays के द्वारा प्रोटीन एकाग्रता उपाय.
  5. एसडीएस लोड हो रहा है बफर में प्रोटीन के नमूने पतला और 10% एसडीएस पृष्ठ जैल में प्रोटीन की 20-40 ग्राम लोड.
  6. 1.5 घंटे के लिए 20 मा एसडीएस पृष्ठ जैल चलाएँ.
  7. 85 वी में 3 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक गीला हस्तांतरण प्रणाली में PVDF झिल्ली पर स्थानांतरण प्रोटीन लक्ष्य प्रोटीन की आणविक वजन के अनुसार हस्तांतरण के समय को समायोजित करें.
  8. 30 मिनट आरटी पर घंटा 1 करने के लिए 5% गैर वसा दूध में ब्लॉक झिल्ली.
  9. झिल्ली वाई सेते4 डिग्री कंपनी / एन पर एक प्राथमिक एंटीबॉडी वें. 200 और 1: 5000, प्रयोगात्मक प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए इष्टतम कमजोर पड़ने का निर्धारण प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के लिए सीमा सामान्य रूप से 1 के बीच है. इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने "विशिष्ट अभिकर्मकों और उपकरणों की तालिका" में पाया जा सकता है.
    1. ब्याह isoforms का पता लगाने के लिए एक विशेष isoform समझते हैं कि विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करें. वैकल्पिक रूप से, विधान एक्सॉन कोडन क्षेत्र में मिलान को पहचानता है कि एक एंटीबॉडी का उपयोग करें और उनके अलग प्रोटीन आकार के आधार पर एक साथ ब्याह isoforms का पता लगाने.
    2. इसी समय, EMT मार्करों के लिए Immunoblotting द्वारा EMT निगरानी. Mesenchymal मार्कर के रूप में प्रयोग करें ई cadherin, γ-catenin, और उपकला मार्कर के रूप में occludin, और फ़ाइब्रोनेक्टिन, एन cadherin और vimentin.
  10. 5 मिनट के अंतराल पर टीबीएस टी (50 मिमी Tris, 150 मिमी NaCl, 0.05% के बीच 20, 7.4 पीएच) के साथ धो झिल्ली तीन बार.
  11. एक एचआरपी संयुग्मित माध्यमिक चींटी के साथ झिल्ली सेतेआरटी पर 1 घंटे के लिए 10,000 कमजोर पड़ने: एक 1 में ibody.
  12. 5 मिनट के अंतराल पर टीबीएस टी के साथ धो झिल्ली तीन बार.
  13. एक chemiluminescence पहचान प्रणाली के साथ प्रोटीन कल्पना और एक autoradiography फिल्म के लिए झिल्ली का पर्दाफाश.

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Representative Results

ऊपर वर्णित प्रक्रियाओं EMT दौरान वैकल्पिक splicing पता लगाने के लिए एक मजबूत विधि प्रदान करते हैं. ट्विस्ट प्रेरित EMT दौरान CD44 ब्याह isoform स्विचिंग के प्रतिनिधि परिणाम एक उदाहरण के रूप में नीचे दिए गए हैं.

HMLE / ट्विस्ट-ईआर कोशिकाओं में ट्विस्ट प्रेरित EMT एक लम्बी तंतुप्रसू फेनोटाइप को उपकला फेनोटाइप तरह एक पक्की सड़क पत्थर से एक संक्रमण (2A चित्रा), उपकला मार्करों ई cadherin, γ-catenin और occludin और के अभाव की विशेषता थी mesenchymal मार्करों फ़ाइब्रोनेक्टिन, एन cadherin, और vimentin (चित्रा 2B) की upregulation. इसके अलावा, EMT सेल सेल जंक्शनों (चित्रा -2) में ई cadherin स्थानीयकरण के नुकसान द्वारा मूल्यांकन किया गया था.

EMT दौरान CD44 ब्याह isoforms का स्विच अभिव्यक्ति QRT पीसीआर और immunoblotting द्वारा जांच की गई थी. मानव CD44 जीन नौ चर एक्सॉनों के शामिल है. CD44 के वैकल्पिक splicing के समर्थक को कोशिकाओं के लिए अनुमति देता हैकम से कम एक चर एक्सॉन, और सभी चर एक्सॉनों से रहित है कि CD44 मानक (CD44s) शामिल है कि घटाने CD44 वेरिएंट (CD44v). चित्रा 3A विभिन्न CD44 ब्याह isoforms का पता लगाने के लिए प्रथम डिजाइन की रणनीति को दर्शाया गया है. रिवर्स प्राइमर V5 और V6 चर युक्त CD44v ब्याह isoforms की जांच के लिए विधान एक्सॉनों 5 और 6 के बीच जंक्शन भर तक फैला है, जबकि एक्सॉन-छोड़ उत्पाद CD44s का पता लगाने के लिए, आगे प्राइमर, विधान एक्सॉन 5 में स्थित है एक्सॉनों, आगे और रिवर्स प्राइमरों क्रमशः, V5 और V6 के भीतर तैयार कर रहे हैं. अन्य CD44 चर एक्सॉन युक्त isoforms का पता लगाने के लिए प्राइमर एक ही रणनीति का उपयोग कर बनाया जा सकता है. साथ ही, कुल CD44 प्रतिलेख आगे का उपयोग और विधान एक्सॉन 2 और एक्सॉन 3, क्रमशः (चित्रा 3 ए) में स्थित प्राइमरों रिवर्स का पता चला है. चित्रा 3B में दिखाया गया है, QRT- पीसीआर इन प्राइमर सेट का उपयोग सीडी में एक महत्वपूर्ण कमी का संकेत दिया विश्लेषण44v mRNA और ट्विस्ट-ईआर व्यक्त HMLE कोशिकाओं में टीएएम उपचार के 14 दिनों के बाद CD44s mRNA में वृद्धि हुई है. इसके विपरीत, CD44 की कुल प्रतिलेख EMT (चित्रा -3 सी) के दौरान अपरिवर्तित रहे. CD44s प्रोटीन की अभिव्यक्ति बहुत (चित्रा 3 डी) upregulated था जबकि QRT- पीसीआर के परिणामों के साथ संगत, CD44v के प्रोटीन के स्तर उल्लेखनीय गिरावट आई है. इसलिए, CD44 के प्रमुख isoform EMT प्रक्रिया के दौरान CD44s को CD44v से स्थानांतरित कर दिया गया था.

चित्रा 1
चित्रा 1 प्राइमर डिजाइन. एक एक्सॉन लंघन मॉडल में splicing isoforms का पता लगाने के लिए प्राइमरों के स्थान illustrating योजनाबद्ध आरेख. ग्रे बॉक्स नारंगी बॉक्स चर एक्सॉनों का प्रतिनिधित्व करते हैं, विधान एक्सॉनों का प्रतिनिधित्व करते हैं, और बक्से को जोड़ने पतली लाइनों introns निरूपित. प्राइमर स्थानों indicat हैंतीर द्वारा एड: काला तीर कुल mRNA का पता लगाने के लिए प्राइमर सेट से संकेत मिलता है, नारंगी तीर एक्सॉन-शामिल isoforms amplifying के लिए प्राइमर सेट से संकेत मिलता है, और नीले तीर एक्सॉन लंघन isoforms का पता लगाने के लिए प्राइमर सेट से संकेत मिलता है.

चित्रा 2
EMT के 2 प्रेरण चित्रा. (ए) चरण विपरीत छवियों (10X) से पहले (इलाज) HMLE / ट्विस्ट-ईआर कोशिकाओं में morphological परिवर्तन illustrating और टीएएम उपचार के 14 दिनों के बाद. (बी) immunoblot पहले HMLE / ट्विस्ट-ईआर कोशिकाओं में EMT मार्कर का विश्लेषण (इलाज) और टीएएम उपचार के 14 दिनों के बाद. टीएएम उपचार, downregulated थे उपकला मार्करों ई cadherin, γ-catenin, और occludin, और mesenchymal मार्करों फ़ाइब्रोनेक्टिन, एन cadherin, और vimentin पर upregulated थे. (सी) इम्यून प्रतिदीप्ति छवियों (63X) ई cadherin के नुकसान का संकेतटीएएम उपचार के 14 दिनों के बाद सेल सेल जंक्शनों पर स्थानीयकरण. ग्रीन धुंधला ई cadherin इंगित करता है, और DAPI धुंधला (नीला) नाभिक को इंगित करता है. स्केल बार = 10 माइक्रोन. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
EMT दौरान CD44 ब्याह isoforms की चित्रा 3 स्विच. (ए) CD44 ब्याह isoforms का पता लगाने के लिए प्रथम डिजाइन. ग्रे बॉक्स नारंगी बॉक्स चर एक्सॉनों का प्रतिनिधित्व करते हैं, विधान एक्सॉनों का प्रतिनिधित्व करते हैं, और बक्से को जोड़ने पतली लाइनों introns निरूपित. प्राइमर स्थानों तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं: काला तीर CD44 कुल mRNA का पता लगाने के लिए प्राइमर सेट से संकेत मिलता है, नारंगी तीर CD44v5-6 amplifying के लिए प्राइमर सेट से संकेत मिलता है, और नीले तीर के लिए प्राइमर सेट का संकेतCD44s का पता लगाने. (बी, सी) विशेष रूप से CD44v चर एक्सॉनों V5 और वी 6 (V5 / 6) और CD44s (बी), और CD44 कुल mRNA युक्त पता लगाने कि EMT प्राइमरों का उपयोग दौरान CD44 isoforms के स्तर के QRT- पीसीआर विश्लेषण (सी) . दिन में mRNA की रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर 14 कोशिकाओं टीएएम में 0 कोशिकाओं इलाज इसी दिन और गैर इलाज समूहों के लिए सामान्यीकृत थे. त्रुटि सलाखों SEM से संकेत मिलता है; n = HMLE / ट्विस्ट-ईआर कोशिकाओं में टीएएम प्रेरित EMT दौरान CD44 isoforms की 3 (डी) immunoblot विश्लेषण. ई cadherin और एन cadherin के स्तर EMT स्थिति की पहचान करने के लिए निगरानी की गई.

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Discussion

यहाँ वर्णित प्रक्रिया एक inducible EMT मॉडल में वैकल्पिक splicing का पता लगाने में सक्षम बनाता है. ब्याह isoform अभिव्यक्ति के इस तरह, गतिशील परिवर्तन EMT के समय पाठ्यक्रम में कब्जा कर लिया जा सकता है. संयुक्त राष्ट्र से संबंधित सेल लाइनों से अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि अनावश्यक रूप से वैकल्पिक splicing को प्रभावित कर सकता है क्योंकि इस विधि वैकल्पिक splicing की तुलना के लिए अलग epithelial- या mesenchymal प्रतिनिधित्व सेल लाइनों के इस्तेमाल को लेकर फायदे हैं. हालांकि, EMT के सफल प्रेरण ध्यान से वैकल्पिक splicing में परिवर्तन पर किसी भी निष्कर्ष से पहले विभिन्न EMT मार्कर तैयार किया जा सकता का उपयोग कर पुष्टि की जानी चाहिए. इसके अलावा, यहां वर्णित ट्विस्ट-ईआर inducible EMT प्रणाली के अलावा, इस तरह के घोंघा ईआर या TGFβ से प्रेरित उन जैसे अन्य EMT सिस्टम प्रयोगात्मक निष्कर्ष 11,30 के सत्यापन के लिए सिफारिश कर रहे हैं.

EMT दौरान ब्याह isoforms की स्विचिंग दोनों शाही सेना और प्रोटीन के स्तर में पता लगाया जा सकता है. ब्याह आईएसओफार्म विशिष्ट एंटीबॉडी प्रोटीन विश्लेषण के लिए पसंद कर रहे हैं. Isoform विशिष्ट एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं होते हैं, तो ब्याह isoforms की प्रोटीन का स्तर immunoblotting द्वारा एसडीएस पृष्ठ पर अपनी आणविक भार के आधार पर निर्धारित किया जा सकता है. प्रत्येक isoform की शाही सेना स्तर isoform विशिष्ट प्राइमरों द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. QRT- पीसीआर assays का उपयोग, प्रत्येक isoform के गुना परिवर्तन संवेदनशीलता और ठीक निर्धारित किया जा सकता. प्रयोगात्मक सामग्री ऐसी नैदानिक ​​नमूनों में एक विशेष ब्याह isoform की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के रूप में, सीमित कर रहे हैं, विशेष रूप से, QRT- पीसीआर विश्लेषण immunohistochemistry के लिए isoform विशिष्ट एंटीबॉडी की कमी के लिए क्षतिपूर्ति करेगा कि एक मात्रात्मक उपाय प्रदान करता है.

यहाँ वर्णित विधि EMT के दौरान जाना जाता ब्याह isoform परिवर्तन का पता लगाने के लिए उपयुक्त है. साथ ही, इस विधि जीनोम चौड़ा वैकल्पिक splicing के अध्ययन के लिए और EMT दौरान उपन्यास ब्याह isoform स्विचिंग की पहचान के लिए विस्तारित किया जा सकता है. इसे पूरा करने केऐसे आरएनए गहरे अनुक्रमण या splicing संवेदनशील माइक्रोएरे प्लेटफॉर्म के रूप में एक बड़े पैमाने पर तकनीक का उपयोग करते हैं, ऊपर वर्णित inducible EMT मॉडल से अलग RNAs का उपयोग किया जा सकता है. फिर भी, isoform परिवर्तन की QRT- पीसीआर सत्यापन किसी भी बड़े पैमाने पर विश्लेषण निम्नलिखित आवश्यक है.

अंत में, वैकल्पिक splicing गतिशील EMT, भ्रूण विकास और ट्यूमर मेटास्टेसिस के लिए महत्वपूर्ण है कि एक प्रक्रिया के दौरान नियंत्रित किया जाता है. मानव जीनोम में वैकल्पिक splicing के उच्च आवृत्ति को देखते हुए, यह वैकल्पिक splicing के नियमन सेल भेदभाव, ऊतक विकास, और प्रोग्राम कोशिका मृत्यु 35-41 सहित कई अन्य जैविक और रोग प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है कि संभावना है. ब्याह isoforms का पता लगाने के लिए यहाँ बताया प्रोटोकॉल के रूप में अच्छी तरह से इन अन्य प्रणालियों के लिए लागू होगी.

ऐसे splicing संवाददाता minigene assays के रूप में अतिरिक्त प्रयोगात्मक तौर तरीकों,, ख कर सकते हैंई आगे सीआईएस से अभिनय तत्वों और वैकल्पिक splicing 30,42,43 कि नियंत्रण पार अभिनय कारकों के नियामक तंत्र की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया. इसके अलावा, EMT के दौरान एक विशेष ब्याह isoform के कार्यात्मक भूमिका मुंह बंद करने या ectopically विशिष्ट isoform व्यक्त और वर्णित EMT-inducible प्रणाली 11 में EMT प्रेरण की निगरानी के द्वारा जांच की जा सकती है.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-hydroxytamoxifen Sigma H7904 Make stock solution by dissolving 4-hydroxytamoxifen in ethanol to 200 μM. Keep the solution at -20 °C protected from light.
E.Z.N.A. Total RNA Isolation kit Omega Bio-Tek R6731 Total RNA isolation kit
GoScript Reverse Transcription System Promega A5001 Reagent for qRT-PCR assay
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6002 Reagent for qRT-PCR assay
LightCycler 480 Real-Time PCR System Roche Equipment for qRT-PCR assay
CD44 antibody R&D Systems BBA10 1:1,000 dilution
E-cadherin antibody Cell Signaling Technology 4065 1:2,500 dilution for immunoblotting; 1:50 dilution for immunofluorescence
γ-Catenin antibody Cell Signaling Technology 2309 1:1,000 dilution
Occludin antibody Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-5562 1:500 dilution
Fibronectin antibody BD Transduction Laboratories 610077 1:5,000 dilution
N-cadherin antibody BD Transduction Laboratories 610920 1:2,000 dilution
Vimentin antibody NeoMarkers MS-129-p1 1:500 dilution
GAPDH antibody Millipore Corporation MAB374 1:10,000 dilution
Amasham ECL Western blotting detection reagent GE Health Life Science RPN2209 Chemiluminescence system

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