Påvisning af alternativ splejsning løbet Epithelial-Mesenchymal Transition

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition. J. Vis. Exp. (92), e51845, doi:10.3791/51845 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Epitel-mesenkymale overgang (EMT) er en udviklingsmæssig program, der driver orgel morfogenese og vævsombygning under embryogenese. Når unormalt aktiveret, EMT fremmer tumormetastase og orgel fibrose 1,2. Overbevisende undersøgelser har beskrevet betydningen af ​​transkriptionel regulering under processen med EMT defineret af flere transkriptionsfaktorer, såsom Twist, sneglen, og ZEB, der undertrykker ekspressionen af ​​adherens krydset protein E-cadherin, hvilket resulterer i tab af en cobble- sten ligesom epitelial morfologi og gevinst på en spindel-formet mesenkymale fænotype 3-8. Nylige undersøgelser gennem hele genomet analyse af RNA'er viste, at der findes en gruppe af gener, hvis splejsning mønstre er forbundet med enten epiteliale eller mesenkyme fænotyper 9,10. Arbejde fra vores laboratorium funktionelt forbundet alternativ splejsning og EMT. Ved at studere celleoverfladen adhæsionsmolekyle CD44 vi vist, at CD44 ALTERNtiv splejsning reguleres stramt under EMT, og endnu vigtigere, at CD44 splejsningsisoform skifte kausalt bidrager til EMT 11.

Alternativ splejsning er en udbredt og bevaret model af genregulering, som op til 95% af humane multi-exon gener alternativt splejsede 12-14. Ved at generere flere protein produkter fra et enkelt gen, alternativ splejsning udgør en væsentlig mekanisme for protein mangfoldighed, tilføjer endnu et lag af kompleksitet til det humane genom. Som sådan kunne dysregulering af alternativ splejsning potentielt føre til dybtgående biologiske effekter, der forårsager sygdomme hos mennesker. Faktisk har afvigende alternativ splejsning i sygdomme, er dokumenteret i over et årti 15-25, herunder de seneste resultater, at mutationer i gener, der koder for spliceosome maskiner er almindeligt forekommende i myelodysplastisk syndrom 26-28. Derfor udvikler pålidelige metoder til påvisning af alternativt splejsede Isoforms er af stor betydning i studiet af forskellige biologiske processer, herunder EMT.

Her giver vi en protokol for at konstatere ændringer i alternativ splejsning ved hjælp af en inducerbar EMT-model. Metoderne til at designe PCR-primere og detektion splejsningsisoformer ikke blot er egnede til undersøgelse af alternativ splejsning i EMT, men også til undersøgelse af alternativ splejsning i andre biologiske processer. Undersøgelse af alternativ splejsning i EMT er afgørende for bedre at forstå de mekanismer, EMT og tumormetastase, og dermed fremme udviklingen af ​​effektive strategier til behandling af kræft metastaser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cell Culture af EMT Induktion

Bemærk: EMT kan fremkaldes ved behandling af TGFp eller ektopisk ekspression af transkriptionsfaktorer Twist, sneglen, eller Zeb1 / 2 i epitelceller. Beskrevet i denne protokol er et inducerbart EMT system via ekspression af Twist-ER fusionsprotein i udødeliggjorte humane mammae epithelceller (HMLE / Twist-ER, en gave fra Dr. J Yang, UCSD) 9,11,29. Ved 4-hydroxytamoxifen (TAM) behandling fusionsproteinet Twist-ER translokerer til kernen til at drive transkription, og resulterer i en fuldstændig EMT overgang i 12-14 dage 9,11,29. Yderligere EMT inducerbare systemer, såsom HMLE / Snail-ER, HMLE / TGFp og MCF10A / TGFp, kan findes i vores tidligere udgivelser 11,30.

  1. Oprethold HMLE / Twist-ER celler i serumfrit brystkirtler vækst epitelcelle medium (MEGM) i en 37 ° C inkubator med 5% CO2. Passage cellerne hver 2-3 dage, når de når 80% konfluens. Cellerne inkuberes med 0,15% trypsin ved 37 ° C i 5-10 minutter, og derefter inaktivere trypsin med 5% kalveserum / DMEM. Spin ned celler og resuspender dem i MEGM. Plate celler i en ny vævsdyrkningsskål i et forhold på 1 til 4.
  2. Opløs TAM i ethanol til at foretage en 200 uM opløsning. Beskyt TAM fra lys og opbevares ved -20 ° C. Før brug, frisk tilføje TAM i MEGM medier på 1: 10.000 fortynding at foretage en endelig koncentration på 20 nM TAM.
  3. Til induktion af EMT, plade 1,6 x 10 6 HMLE / Twist-ER celler i en 10 cm vævsdyrkningsskål i to eksemplarer. Kultur celler med 20 Nm TAM-holdige MEGM medier.
  4. Plate 1,6 x 10 6 HMLE / Twist-ER celler i en 10 cm skål i to eksemplarer og behandle cellerne med 0,01% ethanol som et ikke-TAM-behandlet kontrol.
  5. To dage efter inkubering tage billeder under et lysmikroskop ved 10X forstørrelse optage morfologiske ændringer i cellerne.
  6. Aspirer mediet fra en skål af kontrol eller TAM-behandledeceller. Vask cellerne med kold PBS, og høst celler ved ophugning halvdel af pladen i RNA lysebuffer til RNA isolering og den anden halvdel i RIPA buffer til proteinanalyse.
  7. Passage celler fra kontrol eller TAM-behandlede skåle ved at re-plating 1,6 x 10 6 celler i en 10 cm skål i to eksemplarer. Løbende behandling af cellerne med 20 nM TAM eller vehikel.
  8. Gentag trin 5 til 7 en gang hver anden dag indtil dag 14, på hvilket tidspunkt, TAM-behandlede Twist-ER celler viser en spindel-formet mesenkymale morfologi, mens vehikelbehandlede kontrolgruppe celler opretholde brosten-lignende epitelial morfologi.

2. Karakterisering af EMT

Bemærk: En færdiggørelse af EMT er angivet ved: (1) Cell morfologiske ændringer fra en brosten-lignende epitelial morfologi til en spindel-formet fibroblastisk udseende; (2) Tab af E-cadherin lokalisering ved celle-celle kryds; og (3) skiftede udtryk for EMT markører, defineret af tabetaf epitelial markører og forstærkning af mesenchymale markører.

Cell morfologiske ændringer opfanges af lysmikroskop ved 10X forstørrelse i den tid løbet af EMT induktion, beskrevet i afsnit 1. Immuno-fluorescens detektion af E-cadherin ved celle-kryds er beskrevet i dette afsnit. Ekspressionen af ​​EMT markører påvises ved immunoblotting. Fælles epitelial markører er E-cadherin, γ-catenin og occludin og mesenchymale markører omfatter fibronectin N-cadherin og vimentin. Generelle procedurer for immunblotning er beskrevet i afsnit 4.

  1. På dag 12 TAM behandling frø 1 x 10 5 celler på en 12 mm glas cirkulære dækglas placeret i en brønd i en 24-brønds plade.
  2. 48 timer efter podning, aspireres medium og vask celler med forvarmet PBS.
  3. Fix celler med opvarmet 4% paraformaldehyd i 15 min.
  4. Vask cellerne tre gange med PBS.
  5. Cellerne inkuberes med 0,2% Triton X-100 i PBS i 15min ved stuetemperatur.
  6. Vask cellerne tre gange med PBS.
  7. Inkubér cellerne i 5% BSA / PBS i 1 time ved stuetemperatur for at blokere ikke-specifik binding.
  8. Cellerne inkuberes med det primære antistof E-cadherin på en 1:50 fortynding i 1% BSA / PBS i et fugtigt kammer O / N-ved 4 ° C. BEMÆRK: Intervallet for primære antistof fortynding er normalt mellem 1:50 og 1: 200, og den optimale fortynding for hvert antistof skal bestemmes ved forsøg.
  9. Dekanteres det primære antistof og vaske cellerne tre gange med PBS.
  10. Cellerne inkuberes med fluorescensmærket sekundært antistof i en 1: 500 fortynding i 1 time ved stuetemperatur. Fra dette trin på, beskytte celler mod lys.
  11. Dekanteres det sekundære antistof og vaskes tre gange med PBS.
  12. Stain celler med 0,1-1 g / ml DAPI, Hoechst 10 min.
  13. Skyl celler med PBS tre gange.
  14. Mount dækglas med en dråbe montering medium og sæl dækglas med neglelak.
  15. Observere celler og tagebilleder under en 63X fluorescerende mikroskop.

Farvning med yderligere antistoffer kan udføres for at bekræfte EMT fænotype. For eksempel kan N-cadherin og α-glat muskulatur actin farves til mesenchymale fænotype 29,31,32. Reorganisering af cytoskeletale struktur kan overvåges ved farvning af celler med phalloidin for F-actin-11. Derudover kan assays for cellemotilitet og celledød modstand udføres for at undersøge egenskaberne af EMT 11.

3. Påvisning af splejsningsisoformer Brug QRT-PCR assays

  1. Primer design
    BEMÆRK: Primerpar bør nøje designet til at forstærke distinkte splejsningsisoformer. Exon spring, den hyppigst observerede alternativ splejsning omstændigheder er her vist som et eksempel for at illustrere strategi primer design. Figur 1A viser en fire-exon præ-mRNA, med den tredje exon som en variabel exon. Inddragelse af exon 3 resultater ifremstilling af en længere splejsningsisoform, mens spring af exon 3 genererer en kortere splejsningsisoform. Primere er nødt til at være designet til at skelne mellem exon-3-inkluderet isoform og exon-3-sprunget isoform, og at detektere den samlede udskrift af denne mRNA.
    1. Til påvisning af exon integration omhyggeligt design en fremadrettet primer inden den variable exon 3, og en revers primer inden for nærliggende konstitutive exon 4, der giver mulighed for specifik amplifikation af den variable exon inkluderet isoformen. Sørg for ikke at udforme både fremad og revers-primere inden for den samme variabel exon for at undgå PCR-produkter amplificeret fra genomisk DNA eller præ-mRNA.
    2. Til specifikt at forstærke exon skipping begivenheder, design en af ​​de primere, der spænder over krydset af konstitutive exon 2 og exon 4, som ellers ville blive ødelagt, når variabel exon 3 er inkluderet. Design den anden primer inden den konstitutive exon 4. Som sådan er PCR-produkter frembringes kun, når den variable exon 3 er der korrigeresudgave og den konstitutive exon 2 og exon 4 efterfølgende sammen.
    3. For at detektere de samlede transkripter af genet, designe primere inden for to konstitutive exon 1 og 2. Således er PCR-produkter amplificeret fra alle isoformer.
    4. Sørg smeltetemperaturen (Tm) for alle primere er cirka 55 ° C, er længden af ​​hver primer er cirka 18 til 22 nukleotider, og størrelsen af ​​PCR-produkter er mellem 80 og 150 basepar.
  2. RNA-ekstraktion: Uddrag RNA under anvendelse af et totalt RNA isolation kit (se tabel of Materials).
    1. Saml celler i 350 pi RNA-lysisbuffer.
    2. Tilføj 350 pi af 70% ethanol til lysatet og blandes grundigt.
    3. Overfør prøven til RNA-oprensningssøjle.
    4. Centrifugeres ved 10.000 xg i 1 min og udsmid gennemstrømning.
    5. Vask kolonnen en gang med 500 pi RNA vaskebuffer I og to gange med RNA vaskebuffer II.
    6. Fjern resterende RNA-vaskebufferII fra kolonnen ved centrifugering ved maksimal hastighed i 2 min.
    7. Overfør kolonne i et nyt 1,5 ml rør, tilsættes 50 pi nuclease-frit vand i midten af ​​kolonnen matrix og elueres RNA ved centrifugering ved maksimal hastighed.
  3. Syntese af første cDNA
    1. Bestem koncentrationen og kvaliteten af ​​RNA ved UV-absorption måling. BEMÆRK: God kvalitet RNA bør have en 260 nm / 280 nm absorbansforhold på ca 2,0.
    2. Opsætning reverse transkriptase (RT) reaktioner, der indeholder 250 ng total RNA, 0.05 ug tilfældige hexamerprimere, 50 pmol MgCl2, 10 pmol dNTP, 2 pi 5 × GoScript buffer og 1 pi RT-enzym i et slutvolumen på 20 ul.
    3. Udfør RT reaktioner ved 42 ° C i 1 time efterfulgt af inkubation ved 70 ° C i 5 minutter for at inaktivere RT enzymet.
  4. Real-time PCR
    1. Opsæt 20 reaktioner pi, der består af 10 pi SYBR grøn mester mix,0,1-1,0 ul cDNA skabelon, og 5 pmol frem og bak primere.
    2. Kør realtids-PCR med 40 cykler af de følgende trin: 95 ° C denaturering i 10 sekunder, 58 ° C annealing i 10 sekunder og 60 ° C forlængelse i 30 sekunder. Udfør PCR-reaktioner i tre eksemplarer.
    3. Kontroller dissociation kurver og sørg for, at en enkelt top observeres for hver primer sæt.
    4. Opnå kvantificering cyklus (Cq) værdier ved beregningen af ​​den anden afledte værdier af amplifikationsprodukter kurver.
    5. Beregn den relative mængde (RQ) af target mRNA i inducerede prøver sammenlignet med den ikke-inducerede prøve at bruge 'delta delta Cq (ΔΔCq) "metode, som vist ved følgende formel. Brug husholdning gener, såsom GAPDH eller TBP, som reference.

Ligning 1
For mere præcist at beregne relative værdier af splejsningsisoformer, than bruges flere referencepunkter gener bør overvejes. Resultaterne kan analyseres ved anvendelse af en modificeret absolut værdi kvantificering beskrevet af Pfaffl m.fl. 33,34 metode.

4. Undersøgelse af splejsningsisoformer på proteinniveauet

  1. Saml celler i 100 ul iskold RIPA-buffer.
  2. Sæt lysater på is i cirka 10 minutter.
  3. Der centrifugeres ved 14.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C, og indsamle supernatanten.
  4. Mål proteinkoncentration ved Bradford-analyser.
  5. Fortyndet proteinprøver i SDS-påsætningsbuffer og indlæse 20-40 ug af proteiner i 10% SDS-PAGE geler.
  6. Kør SDS-PAGE geler ved 20 mA i 1,5 timer.
  7. Overførsel proteiner til PVDF-membraner i en våd overførselssystem ved 4 ° C i 3 timer ved 85 V. Juster overførsel tid i henhold til molekylvægten af ​​målproteiner.
  8. Blok membranen i 5% fedtfri mælk i 30 minutter til 1 time ved stuetemperatur.
  9. Inkubér membran with et primært antistof ved 4 ° CO / N. Intervallet for primære antistof fortynding er normalt mellem 1: 200 og 1: 5.000, bestemme den optimale fortynding for hvert antistof eksperimentelt. Den fortynding af antistoffer, der anvendes i denne protokol kan findes i "Tabel over specifikke reagenser og udstyr".
    1. For at detektere splejsningsisoformer, anvende specifikke antistoffer, som genkender en bestemt isoformen. Alternativt kan du bruge et antistof, der genkender epitop i den konstitutive exon kodende region og opdage splejsningsisoformer samtidigt er baseret på deres forskellige protein størrelser.
    2. Samtidig overvåge EMT ved immunoblotting til EMT markører. Brug E-cadherin, γ-catenin og occludin som epiteliale markører, og fibronektin, N-cadherin og vimentin som mesenchymale markører.
  10. Vask membran tre gange med TBS-T (50 mM Tris, 150 mM NaCI, 0,05% Tween 20, pH 7,4) i en 5-minutters interval.
  11. Inkuber membranen med et HRP-konjugeret sekundært myreiBody i en 1: 10.000 fortynding i 1 time ved stuetemperatur.
  12. Vask membran tre gange med TBS-T i en 5-minutters interval.
  13. Visualisere protein med en kemiluminescensdetektion, og udsætte membranen for en autoradiografifilm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De ovenfor beskrevne procedurer giver en robust metode til påvisning af alternativ splejsning under EMT. Repræsentative resultater af CD44 splejsningsisoform skift under Twist-induceret EMT er givet nedenfor som et eksempel.

Twist-induceret EMT i HMLE / Twist-ER-celler var karakteriseret ved en overgang fra en brostensbelagte-sten ligesom epitelial fænotype til en langstrakt fibroblastisk fænotype (figur 2A), fraværet af epitelial markører E-cadherin, γ-catenin og occludin og opregulering af mesenchymale markører fibronectin, N-cadherin, og vimentin (figur 2B). Endvidere blev EMT vurderes ved tabet af E-cadherin lokalisering ved celle-celle kryds (figur 2C).

Den skiftede ekspression af CD44 splejsningsisoformer under EMT blev undersøgt ved QRT-PCR og immunblotting. Det humane CD44-gen består af ni variable exoner. Alternativ splejsning af CD44 tillader celler til proproducere CD44 varianter (CD44v), der omfatter mindst én variabel exon, og CD44 standard (CD44s), der er blottet for alle variable exons 3A afbilder strategi primer design til påvisning af forskellige CD44 splejsningsisoformer.. Til påvisning af de exon-sprunget produktgrupper CD44s, er fremadrettede primer placeret i den konstitutive exon 5, mens den reverse primer strækker sig over forbindelsen mellem konstitutive exon 5 og 6. Til påvisning af CD44v splejsningsisoformer indeholdende v5 og v6 variabel exons, frem og tilbage primere er designet i v5 og v6 hhv. Primere til påvisning af andre CD44 variable exon-indeholdende isoformer kan udformes ved hjælp af den samme strategi. Derudover er den samlede CD44 transkript detekteret ved anvendelse af forward og reverse primere placeret i den konstitutive exon 2 og exon 3 (figur 3A). Som vist i figur 3B, analyser QRT-PCR under anvendelse af disse primersæt til et betydeligt fald i CD44V mRNA og stigning i CD44s mRNA efter 14 dages TAM behandling i Twist-ER-udtrykkende HMLE celler. Derimod er den samlede afskrift af CD44 forblev uændret under EMT (figur 3C). I overensstemmelse med resultaterne af QRT-PCR proteinet niveau CD44v faldt bemærkelsesværdigt, hvorimod ekspression af CD44s proteinet i høj grad blev opreguleret (figur 3D). Derfor blev den store isoform af CD44 flyttet fra CD44v til CD44s under EMT-processen.

Figur 1
Figur 1. Primer design. Skematiske diagrammer, som illustrerer placeringen af primere til påvisning splejsende isoformer i en exon-spring model. De grå kasser repræsenterer konstitutive exons, de orange kasser repræsenterer variable exons, og de tynde linjer, der forbinder bokse betegne introns. De primer-steder er indicated med pile: sorte pile angiver primersæt til påvisning af totalt mRNA, appelsin pile angiver primersæt til amplifikation exon-inkluderet isoformer og blå pile angiver primersæt til påvisning af exon-spring isoformer.

Figur 2
Figur 2. Induktion af EMT. (A) fasekontrast billeder (10x) illustrerer morfologiske ændringer i HMLE / Twist-ER-celler før (ubehandlet), og efter 14 dages TAM behandling. (B) Immunoblotanalyse af EMT markører i HMLE / Twist-ER-celler før (ubehandlet) og efter 14 dages TAM behandling. Ved TAM behandling, epitelceller markører E-cadherin, γ-catenin og occludin blev nedreguleret, og mesenchymale markører fibronectin, N-cadherin, og vimentin blev opreguleret. (C) Immunsystemet fluorescensbilleder (63X), der indikerer tab af E-cadherinlokalisering ved celle-celle kryds efter 14 dages TAM behandling. Grøn farvning indikerer E-cadherin, og DAPI-farvning (blå) angiver kerner. Skala bar = 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Skift af CD44 splejsningsisoformer under EMT. (A) Primer design til påvisning af CD44-splejsningsisoformer. De grå kasser repræsenterer konstitutive exons, de orange kasser repræsenterer variable exons, og de tynde linjer, der forbinder bokse betegne introns. De primer-steder er angivet med pile: sorte pile angiver primersæt til påvisning af CD44 totalt mRNA, appelsin pile angiver primersæt til amplificering CD44v5-6 og blå pile angiver primersæt forpåvisning CD44s. (B, C) ​​QRT-PCR-analyse af indholdet af CD44-isoformer under EMT anvendelse af primere, der specifikt detekterer CD44v indeholdende variable exoner V5 og V6 (v5 / 6) og CD44s (B), og CD44 totalt mRNA (C) . Relative ekspressionsniveauer af mRNA i dag 14-celler blev normaliseret til tilsvarende dag 0 celler i TAM behandlede og ikke-behandlede grupper. Error søjler angiver SEM; n = 3. (D) Immunoblotanalyse af CD44-isoformer under TAM-induceret EMT i HMLE / Twist-ER-celler. Niveauer af E-cadherin og N-cadherin blev overvåget for at identificere EMT status.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den her beskrevne procedure giver påvisning af alternativ splejsning i en inducerbar EMT-model. Som sådan, dynamiske ændringer i splejsningsisoform ekspression kan indfanges i hele tidsforløbet af EMT. Denne metode har fordele i forhold til brugen af ​​forskellige epithelial- eller mesenkymale-repræsenterer cellelinjer til sammenligning af alternativ splejsning, fordi forskellige genetiske baggrunde fra un-relaterede cellelinier uretmæssigt kan påvirke alternativ splejsning. Dog skal en vellykket induktion af EMT nøje bekræftes ved anvendelse kan drages forskellige EMT markører før nogen konklusioner om ændringer i alternativ splejsning. Endvidere, ud over Twist-ER-inducerbare EMT her beskrevne system, andre EMT systemer, såsom dem, der fremkaldes af snail-ER eller TGFp anbefales til validering af eksperimentelle resultater 11,30.

Den kobling af splejsningsisoformer under EMT kan påvises i både RNA og protein niveauer. Splice isodanner antistoffer foretrækkes til proteinanalyse. Når isoform-specifikke antistoffer ikke er tilgængelige, kan bestemmes protein niveauer af splejsningsisoformer baseret på deres molekylvægt på SDS-PAGE ved immunblotting. RNA for hver isoform kan kvantificeres ved isoform-specifikke primere. Brug qRT-PCR-analyser, kan fold ændring af hver isoform være følsomt og præcist bestemt. Især når eksperimentelle materialer er begrænset, såsom en analyse af ekspression af et særligt splejsningsisoform i kliniske prøver, QRT-PCR-analyse giver et kvantitativt mål, som vil kompensere for manglende isoform-specifikke antistoffer til immunhistokemi.

Den her nævnte fremgangsmåde er egnet til påvisning af kendte splejsningsisoform forandringer under EMT. Derudover kan denne fremgangsmåde udvides til undersøgelse af hele genomet alternativ splejsning og til identifikation af hidtil ukendte splejsningsisoform skift i EMT. For at opnå dette,brug af en stor-skala teknik, såsom RNA dybt sekventering eller splejsning følsomme microarray platforme, kan udføres under anvendelse af RNA'er isoleret fra den inducerbare EMT modellen beskrevet ovenfor. Ikke desto mindre er QRT-PCR validering af isoform ændringer, der kræves efter enhver storstilet analyse.

Afslutningsvis er alternativ splejsning dynamisk reguleret under EMT, en proces, der er afgørende for fosterudviklingen og tumormetastase. I betragtning af den høje frekvens af alternativ splejsning i det humane genom, er det sandsynligt, at reguleringen af alternativ splejsning spiller en vigtig rolle i mange andre biologiske og patologiske processer, herunder celledifferentiering, væv udvikling og programmeret celledød 35-41. Den heri beskrevne til påvisning af splejsningsisoformer protokol vil være gældende for disse andre systemer.

Yderligere eksperimentelle fremgangsmåder, såsom splejsning reporterminigen assays kan be bruges til yderligere at undersøge de reguleringsmekanismer af cis-virkende elementer og trans-virkende faktorer, der styrer alternativ splejsning 30,42,43. Endvidere kan den funktionelle rolle af en bestemt splejsningsisoform i EMT undersøges ved silencing eller ektopisk udtrykker specifik isoform og overvågning EMT induktion i den beskrevne EMT-inducerbare system, 11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-hydroxytamoxifen Sigma H7904 Make stock solution by dissolving 4-hydroxytamoxifen in ethanol to 200 μM. Keep the solution at -20 °C protected from light.
E.Z.N.A. Total RNA Isolation kit Omega Bio-Tek R6731 Total RNA isolation kit
GoScript Reverse Transcription System Promega A5001 Reagent for qRT-PCR assay
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6002 Reagent for qRT-PCR assay
LightCycler 480 Real-Time PCR System Roche Equipment for qRT-PCR assay
CD44 antibody R&D Systems BBA10 1:1,000 dilution
E-cadherin antibody Cell Signaling Technology 4065 1:2,500 dilution for immunoblotting; 1:50 dilution for immunofluorescence
γ-Catenin antibody Cell Signaling Technology 2309 1:1,000 dilution
Occludin antibody Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-5562 1:500 dilution
Fibronectin antibody BD Transduction Laboratories 610077 1:5,000 dilution
N-cadherin antibody BD Transduction Laboratories 610920 1:2,000 dilution
Vimentin antibody NeoMarkers MS-129-p1 1:500 dilution
GAPDH antibody Millipore Corporation MAB374 1:10,000 dilution
Amasham ECL Western blotting detection reagent GE Health Life Science RPN2209 Chemiluminescence system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 131-142 (2006).
  2. Yang, J., Weinberg, R. A. Epithelial-mesenchymal transition at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev Cell. 14, 818-829 (2008).
  3. Yang, J., et al. a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis. Cell. 117, 927-939 (2004).
  4. Batlle, E., et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nat Cell Biol. 2, 84-89 (2000).
  5. Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nat Cell Biol. 2, 76-83 (2000).
  6. Comijn, J., et al. The two-handed E box binding zinc finger protein SIP1 downregulates E-cadherin and induces invasion. Mol Cell. 7, 1267-1278 (2001).
  7. Bolos, V., et al. The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors. J Cell Sci. 116, 499-511 (2003).
  8. Eger, A., et al. DeltaEF1 is a transcriptional repressor of E-cadherin and regulates epithelial plasticity in breast cancer cells. Oncogene. 24, 2375-2385 (2005).
  9. Shapiro, I. M., et al. An EMT-driven alternative splicing program occurs in human breast cancer and modulates cellular phenotype. PLoS Genet. 7, e1002218 (2011).
  10. Warzecha, C. C., et al. An ESRP-regulated splicing programme is abrogated during the epithelial-mesenchymal transition. EMBO J. 29, 3286-3300 (2010).
  11. Brown, R. L., et al. CD44 splice isoform switching in human and mouse epithelium is essential for epithelial-mesenchymal transition and breast cancer progression. J Clin Invest. 121, 1064-1074 (2011).
  12. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
  13. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
  14. Liu, S., Cheng, C. Alternative RNA splicing and cancer. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4, 547-566 (2013).
  15. Shtivelman, E., Lifshitz, B., Gale, R. P., Roe, B. A., Canaani, E. Alternative splicing of RNAs transcribed from the human abl gene and from the bcr-abl fused gene. Cell. 47, 277-284 (1986).
  16. Krangel, M. S. Secretion of HLA-A and -B antigens via an alternative RNA splicing pathway. J Exp Med. 163, 1173-1190 (1986).
  17. Brickell, P. M., Latchman, D. S., Murphy, D., Willison, K., Rigby, P. W. Activation of a Qa/Tla class I major histocompatibility antigen gene is a general feature of oncogenesis in the mouse. Nature. 306, 756-760 (1983).
  18. Barbaux, S., et al. Donor splice-site mutations in WT1 are responsible for Frasier syndrome. Nat Genet. 17, 467-470 (1997).
  19. Charlet, B. N., et al. Loss of the muscle-specific chloride channel in type 1 myotonic dystrophy due to misregulated alternative splicing. Mol Cell. 10, 45-53 (2002).
  20. Hutton, M., et al. Association of missense and 5'-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17. Nature. 393, 702-705 (1998).
  21. Kohsaka, T., et al. Exon 9 mutations in the WT1 gene, without influencing KTS splice isoforms, are also responsible for Frasier syndrome. Hum Mutat. 14, 466-470 (1999).
  22. Philips, A. V., Timchenko, L. T., Cooper, T. A. Disruption of splicing regulated by a CUG-binding protein in myotonic dystrophy. Science. 280, 737-741 (1998).
  23. Savkur, R. S., Philips, A. V., Cooper, T. A. Aberrant regulation of insulin receptor alternative splicing is associated with insulin resistance in myotonic dystrophy. Nat Genet. 29, 40-47 (2001).
  24. Spillantini, M. G., et al. Mutation in the tau gene in familial multiple system tauopathy with presenile dementia. Proc Natl Acad Sci USA. 95, 7737-7741 (1998).
  25. Wang, J., et al. Myotonic dystrophy evidence for a possible dominant-negative RNA mutation. Hum Mol Genet. 4, 599-606 (1995).
  26. Graubert, T. A., et al. Recurrent mutations in the U2AF1 splicing factor in myelodysplastic syndromes. Nat Genet. 44, 53-57 (2012).
  27. Papaemmanuil, E., et al. Somatic SF3B1 mutation in myelodysplasia with ring sideroblasts. N Engl J Med. 365, 1384-1395 (2011).
  28. Yoshida, K., et al. Frequent pathway mutations of splicing machinery in myelodysplasia. Nature. 478, 64-69 (2011).
  29. Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133, 704-715 (2008).
  30. Reinke, L. M., Xu, Y., Cheng, C. Snail represses the splicing regulator epithelial splicing regulatory protein 1 to promote epithelial-mesenchymal transition. J Biol Chem. 287, 36435-36442 (2012).
  31. Serini, G., Gabbiani, G. Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation. Exp Cell Res. 250, 273-283 (1999).
  32. Zavadil, J., Bottinger, E. P. TGF-beta and epithelial-to-mesenchymal transitions. Oncogene. 24, 5764-5774 (2005).
  33. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, e45 (2001).
  34. Hellemans, J., Mortier, G., De Paepe, A., Speleman, F., Vandesompele, J. qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data. Genome Biol. 8, R19 (2007).
  35. Boutz, P. L., et al. A post-transcriptional regulatory switch in polypyrimidine tract-binding proteins reprograms alternative splicing in developing neurons. Genes Dev. 21, 1636-1652 (2007).
  36. Salomonis, N., et al. Alternative splicing regulates mouse embryonic stem cell pluripotency and differentiation. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 10514-10519 (2010).
  37. Calarco, J. A., et al. Regulation of vertebrate nervous system alternative splicing and development by an SR-related protein. Cell. 138, 898-910 (2009).
  38. Grabowski, P. Alternative splicing takes shape during neuronal development. Curr Opin Genet Dev. 21, 388-394 (2011).
  39. Seol, D. W., Billiar, T. R. A caspase-9 variant missing the catalytic site is an endogenous inhibitor of apoptosis. J Biol Chem. 274, 2072-2076 (1999).
  40. Srinivasula, S. M., et al. Identification of an endogenous dominant-negative short isoform of caspase-9 that can regulate apoptosis. Cancer Res. 59, 999-1002 (1999).
  41. Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. Alternative splicing of Bcl-2-related genes functional consequences and potential therapeutic applications. Cell Mol Life Sci. 61, 2189-2199 (2004).
  42. Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37, 331-340 (2005).
  43. Cheng, C., Sharp, P. A. Regulation of CD44 alternative splicing by SRm160 and its potential role in tumor cell invasion. Mol Cell Biol. 26, 362-370 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics