Upptäckt av alternativ splits Under Epithelial-Mesenkymala Transition

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition. J. Vis. Exp. (92), e51845, doi:10.3791/51845 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Det epitel-mesenkymala övergång (EMT) är ett utvecklingsprogram som driver organ morfogenes och vävnadsombildning under embryogenes. När onormalt aktiverad, EMT främjar tumörmetastaser och organfibros 1,2. Övertygande studier har beskrivit betydelsen av transkriptionell reglering under processen för EMT, som definieras av flera transkriptionsfaktorer, såsom Twist, Snail, och ZEB, som undertrycker expressionen av adherens proteinet E-cadherin, vilket resulterar i förlust av en cobble- sten som epitelial morfologi och förstärkning av en spolformad mesenkymala fenotyp 3-8. Nyligen genomförda studier genom genomet hela analysen av RNA visade att det finns en grupp av gener vars skarvning mönster är förknippade med antingen epiteliala eller mesenkymala fenotyper 9,10. Arbeta från vårt labb funktionellt anslutna alternativ splitsning och EMT. Genom att studera cellytan adhesionsmolekylen CD44, visade vi att CD44 alterntivt skarvning är hårt reglerad under EMT, och ännu viktigare, att CD44 skarv isoform byta kausalt bidrar till EMT 11.

Alternativ splitsning är en utbredd och bevarad modell av genreglering som upp till 95% av humana multi exon gener alternativt splitsad 12-14. Genom att generera flera proteinprodukter från en enda gen, alternativ splitsning utgör en väsentlig mekanism för protein mångfald, lägga ytterligare ett lager av komplexitet till det mänskliga genomet. Som sådan kunde dysreglering av alternativ splitsning potentiellt leda till djupgående biologiska effekter som orsakar mänskliga sjukdomar. I själva verket har avvikande alternativ splitsning vid sjukdomar har dokumenterats i över ett decennium 15-25, inklusive bedömningar nyligen att mutationer i gener som kodar för spliceosome maskiner är vanliga i myelodysplastiskt syndrom 26-28. Därför utvecklar tillförlitliga metoder för att upptäcka alternativt splitsad isoforms är av stor betydelse i studiet av olika biologiska processer inklusive EMT.

Här ger vi ett protokoll för att upptäcka förändringar i alternativ splitsning med hjälp av ett inducerbart EMT modell. Metoderna för att designa PCR-primrar och detektera splits isoformer är lämpliga inte bara för studier av alternativ splitsning under EMT, men också för studier av alternativ splitsning i andra biologiska processer. Undersöka alternativ splitsning under EMT är absolut nödvändigt för att bättre förstå mekanismerna för EMT och tumörmetastaser och därmed underlätta utvecklingen av effektiva strategier för behandling av cancermetastaser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 cellodling av EMT Induktion

Anm: EMT kan induceras genom behandling av TGFp eller ektopiskt uttryck av transkriptionsfaktorer Twist, snigel, eller Zeb1 / 2 i epitelceller. Beskrivs i detta protokoll är ett inducerbart EMT system via uttryck av Twist-ER-fusionsprotein i odödliggjorda humana bröstepitelceller (HMLE / Twist-ER, en gåva av Dr J Yang, UCSD) 9,11,29. Vid 4-hydroxitamoxifen (TAM) behandling, translokerar fusionsproteinet Twist-ER till cellkärnan för att driva transkription och resulterar i en fullständig EMT övergång i 12-14 dagar 9,11,29. Ytterligare EMT inducerbara system såsom HMLE / Snigel-ER, HMLE / TGFp och MCF10A / TGPP, hittar du i våra tidigare publikationer 11,30.

  1. Bibehåll HMLE / Twist-ER-celler i serumfritt mammary epithelial celltillväxt-medium (MEGM) i en 37 ° C inkubator med 5% CO2. Passage cellerna var 2-3 dagar när de når 80% sammanflödet. Inkubera cellerna med 0,15% trypsin vid 37 ° C under 5-10 min, och därefter inaktivera trypsin med 5% kalvserum / DMEM. Spinn ner celler och slamma dem i MEGM. Plate celler i en ny vävnadsodlingsskål i ett förhållande av 1-4.
  2. Lös TAM i etanol för att göra en 200 iM lösning. Skydda TAM från ljus och förvaras vid -20 ° C. Före användning, nyligen till TAM in MEGM media med en 1: 10,000 späd att göra en slutlig koncentration på 20 nM TAM.
  3. För induktion av EMT, plåt 1,6 x 10 6 HMLE / Twist-ER-celler i en 10 cm vävnadsodlingsskål i två exemplar. Kultur celler med 20 nM TAM-innehållande MEGM media.
  4. Plate 1,6 x 10 6 HMLE / Twist-ER-celler i en 10 cm skål i duplikat och behandla cellerna med 0,01% etanol som en icke-TAM-behandlad kontroll.
  5. Två dagar efter inkubationen, ta bilder under ett ljusmikroskop vid 10X förstoring för att spela in morfologiska förändringar av celler.
  6. Sug mediet från en maträtt av kontroll eller TAM-behandladeceller. Tvätta cellerna med kall PBS och skörda celler genom skrotning hälften av plattan i RNA lyseringsbuffert för RNA-isolering och den andra hälften i RIPA buffert för proteinanalys.
  7. Passage celler från kontroll eller TAM-behandlade rätter från re-plating 1.6 x 10 6 celler i en 10 cm skål i två exemplar. Kontinuerligt behandla cellerna med 20 nM TAM eller fordon.
  8. Upprepa steg 5 till 7 en gång varannan dag fram till dag 14, då, TAM-behandlade Twist-ER celler visar en spolformad mesenkymala morfologi, medan fordonsbehandlade kontrollceller upprätthålla kullersten liknande epitelial morfologi.

2. Karakterisering av EMT

Obs: En avslutad EMT indikeras av: (1) Cell morfologiska förändringar från en gatsten liknande epitelial morfologi till en spolformad fibroblastiska liknande utseende; (2) Förlust av E-cadherin lokalisering vid cell-cell junctions; och (3) kopplas uttryck för EMT markörer, som definieras av förlustenav epiteliala markörer och förstärkning av mesenkymala markörer.

Cell morfologiska förändringar fångas av ljusmikroskop vid 10x förstoring under tidsförloppet för EMT induktion, som beskrivs i avsnitt 1 Immuno-fluorescens detektion av E-cadherin vid cell korsningar beskrivs i det här avsnittet. Uttrycket av EMT markörer detekteras genom immunoblotting. Vanliga epitelceller markörer är E-cadherin, γ-catenin och occludin och mesenkymala markörer inkluderar fibronektin, N-cadherin och vimentin. Allmänna förfaranden för immunoblotting beskrivs i avsnitt 4.

  1. Vid dag 12 i TAM behandling, utsädes 1 x 10 5 celler på en 12 mm glas cirkulär täck placeras i en brunn på en 24-brunnar.
  2. 48 timmar efter sådd, aspirera medium och tvätta celler med förvärmda PBS.
  3. Fix celler med förvärmda 4% paraformaldehyd under 15 min.
  4. Tvätta cellerna tre gånger med PBS.
  5. Inkubera cellerna med 0,2% Triton X-100 i PBS under 15min vid RT.
  6. Tvätta cellerna tre gånger med PBS.
  7. Inkubera cellerna i 5% BSA / PBS under 1 h vid RT för att blockera icke-specifik bindning.
  8. Inkubera cellerna med den primära antikroppen E-cadherin vid en 1:50 utspädning i 1% BSA / PBS i en fuktad kammare O / N vid 4 ° C. OBS: Intervallet för primär antikropp späd är normalt mellan 01:50 och 1: 200, och den optimala utspädningen för varje antikropp bör bestämmas experimentellt.
  9. Dekantera den primära antikroppen och tvätta cellerna tre gånger med PBS.
  10. Inkubera cellerna med fluorescensmärkt sekundär antikropp i en 1: 500 spädning under 1 h vid RT. Från detta steg på, skyddar cellerna från ljus.
  11. Häll av sekundär antikropp och tvätta tre gånger med PBS.
  12. Stain-celler med 0,1 till 1 g / ml DAPI eller Hoechst för 10 min.
  13. Skölj celler med PBS tre gånger.
  14. Montera täckglas med en droppe monteringsmedium och tätningstäck med nagellack.
  15. Beakta celler och tabilder under en 63X fluorescensmikroskop.

Färgning med ytterligare antikroppar kan utföras för att bekräfta EMT fenotyp. Exempelvis kan N-cadherin och α-glattmuskelaktin färgas för en mesenkymal fenotyp 29,31,32. Omorganisation av cytoskelett strukturen kan övervakas genom att färga cellerna med falloidin för F-aktin 11. Dessutom kan analyser för cellmotilitet och celldödsmotståndet utföras för att undersöka egenskaperna för EMT 11.

3. Detektion av skarv Isoformer Använda QRT-PCR-analyser

  1. Primer Design
    OBS: Primerpar bör noggrant utformade för att förstärka olika skarv isoformer. Exon hoppa, den vanligaste observerade alternativ splits händelse, visas här som ett exempel för att illustrera strategi primer design. Figur 1A visar en fyra-exon pre-mRNA, med den tredje exon som en variabel exon. Införande av exon 3 gerproduktion av en längre splits isoformen, medan hoppa av exon 3 genererar en kortare splits isoformen. Primers måste utformas för att särskilja exon-3-inkluderat isoformen och exon-3-hoppade isoform, och för att upptäcka den totala avskrift av detta mRNA.
    1. För detektering av exon integration, noggrant utforma en primer framåt inuti den variabla exonen 3, och en omvänd primer innanför den närliggande konstitutiv exon 4, vilket möjliggör för den specifika amplifieringen av den variabla exonen-inkluderade isoformen. Se till att inte utforma både framåt och bakåt primrar inom samma variabel exon i syfte att undvika PCR-produkter som amplifierats från genom-DNA eller pre-mRNA.
    2. För att specifikt amplifiera exon hoppa evenemang, design en av de primers som spänner över korsningen av konstitutiva exon 2 och exon 4 som annars skulle förstöras när variabel exon 3 ingår. Utforma den andra primern inuti den konstitutiva exon 4. Som sådana är PCR-produkter genereras endast när den variabla exonen 3 är exklusutgåva och den konstitutiva exon 2 och exon 4 därefter hopfogas.
    3. För att detektera den totala transkript av genen, designa primers inom två konstitutiva exoner 1 och 2 är sålunda PCR-produkter amplifierades från alla isoformer.
    4. Se till smälttemperaturen (Tm) för alla primrar är ungefär 55 ° C, varvid längden av varje primer är ca 18 till 22 nukleotider, och storleken av PCR-produkter är mellan 80 och 150 baspar.
  2. RNA-extraktion: Utdrag RNA med hjälp av en total RNA isolering kit (se tabell för material).
    1. Samla celler i 350 pl RNA lyseringsbuffert.
    2. Lägg 350 l av 70% etanol till lysatet och blanda väl.
    3. Överför provet till kolonnen RNA rening.
    4. Centrifugera vid 10.000 xg under 1 min och kasse genomströmning.
    5. Tvätta kolonnen en gång med 500 | il av RNA-tvättbuffert I och två gånger med RNA-tvättbuffert II.
    6. Ta bort kvarvarande RNA tvättbuffertII från kolonnen genom centrifugering vid maximal hastighet i 2 min.
    7. Överför kolonnen in i ett nytt 1,5 ml rör, tillsätt 50 pl nukleasfritt vatten vid centrum av kolonnmatrisen och eluera RNA genom centrifugering vid maximal hastighet.
  3. Syntes av första strängen cDNA
    1. Bestäm koncentrationen och kvalitet av RNA genom UV-absorption mätning. OBS: Bra kvalitet RNA bör ha en 260 nm / 280 nm absorbansförhållandet på cirka 2,0.
    2. Konfigurera omvänt transkriptas (RT) reaktioner som innehåller 250 ng total-RNA, 0,05 pg slumpmässig hexamer-primers, 50 pmol MgCl2, 10 pmol dNTP, 2 | il 5 × GoScript buffert och ett pl RT-enzym i en slutlig volym av 20 | il.
    3. Utför RT reaktioner vid 42 ° C i 1 timme, följt av inkubation vid 70 ° C i 5 minuter för att inaktivera RT enzymet.
  4. Realtids-PCR
    1. Ställ in 20 il reaktioner som består av 10 pl SYBR gröna Master Mix,0,1-1,0 l cDNA mall och 5 pmol framåt och bakåt primers.
    2. Kör realtids-PCR med 40 cykler av följande steg: 95 ° C denaturering i 10 sek, 58 ° C glödgning i 10 sek och 60 ° C förlängning för 30 sek. Utför PCR-reaktioner i tre exemplar.
    3. Kontrollera dissociation kurvor och se till att en enda topp observeras för varje primer set.
    4. Skaffa kvantifiering cykel (Cq) värden genom att beräkna den andra derivat värden på förstärkningskurvor.
    5. Beräkna den relativa kvantiteten (RQ) av mål-mRNA i inducerade prover jämfört med den icke-inducerade prov med användning av den "Delta Delta Cq (ΔΔCq)" metod, såsom visas med följande formel. Använd housekeeping-gener, t.ex. GAPDH eller TBP, som en referens.

Ekvation 1
För att mer exakt beräkna relativa värden av skarv isoformer, tHan använder flera referensgener bör övervägas. Resultaten kan analyseras med användning av en modifierad absolut värde kvantifiering metoden beskriven av Pfaffl m.fl. 33,34.

4 Undersökning av Splice Isoformer på proteinnivå

  1. Samla cellerna i 100 | il iskall RIPA-buffert.
  2. Ställ lysat på is i ungefär 10 minuter.
  3. Centrifugera vid 14.000 xg under 10 minuter vid 4 ° C, och samla upp supernatanten.
  4. Mät proteinkoncentrationen genom Bradford-analyser.
  5. Späd proteinprover i SDS-laddningsbuffert och lasta 20-40 pg av proteiner i 10% SDS-PAGE-geler.
  6. Kör SDS-PAGE-geler vid 20 mA under 1,5 timmar.
  7. Överföring proteiner till PVDF-membran i ett system våt överföring vid 4 ° C under 3 h vid 85 V. Justera överföringstiden i enlighet med den molekylvikt av målproteiner.
  8. Block membran i 5% fettfri mjölk under 30 min till 1 h vid RT.
  9. Inkubera membran with en primär antikropp vid 4 ° CO / N. Intervallet för primär antikropp späd är normalt mellan 1: 200 och 1: 5000, fastställa den optimala utspädningen för varje antikropp experimentellt. Utspädningen av antikroppar som används i detta protokoll finns i "Tabell över specifika reagenser och utrustning".
    1. För att upptäcka skarv isoformer, använder specifika antikroppar som känner igen en viss isoform. Alternativt kan du använda en antikropp som känner igen epitop på konstitutiva exon kodande regionen och upptäcka skarv isoformer samtidigt utifrån sina olika proteinstorlekar.
    2. Samtidigt, övervaka EMT genom immun för EMT markörer. Använd E-cadherin, γ-catenin och occludin som epiteliala markörer, och fibronektin, N-cadherin och vimentin som mesenkymala markörer.
  10. Tvätta membran tre gånger med TBS-T (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) vid en 5-minuters intervall.
  11. Inkubera membran med en HRP-konjugerad sekundär myraibody i en 1: 10.000 utspädning för 1 h vid RT.
  12. Tvätta membran tre gånger med TBS-T på en 5-minuters intervall.
  13. Visualisera protein med en kemiluminescens detektionssystem och utsätta membranet för en autoradiografifilm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De förfaranden som beskrivs ovan ger en robust metod för att upptäcka alternativ splitsning under EMT. Representativa resultat av CD44 splice isoformen omkoppling under Twist-inducerad EMT ges nedan som exempel.

Twist-inducerad EMT i HMLE / Twist-ER-celler kännetecknades av en övergång från en kullersten-sten som epitelial fenotyp till en långsträckt fibroblastrespons fenotyp (Figur 2A), avsaknaden av epiteliala markörer E-cadherin, γ-catenin och occludin och uppreglering av mesenkymala markörer fibronektin, N-cadherin, och vimentin (Figur 2B). Vidare EMT bedöms av förlusten av E-cadherin lokalisering vid cell-cell junctions (figur 2C).

Den bytte uttryck av CD44 skarv isoformer under EMT undersöktes genom QRT-PCR och immunoblotting. Den humana CD44-gen består av nio variabla exoner. Alternativ splitsning av CD44 möjliggör celler till produce CD44 varianter (CD44v) som innehåller minst en variabel exon och CD44 standard (CD44s) som saknar alla rörliga exoner. Figur 3A visar strategin för primer design för detektion av olika CD44 skarv isoformer. För detektering av exon-hoppade produkt CD44s, är den framåtriktade primern belägen i den konstitutiva exon 5, medan den omvända primern sträcker sig över förbindningen mellan konstitutiva exonerna 5 och 6 För detektion av CD44v splits isoformer innehållande V5 och V6 variabel exoner, framåt och bakåt grundfärger är utformade i v5 och v6, respektive. Primers för detektering av andra CD44 variabel exon-innehållande isoformer kan utformas med hjälp av samma strategi. Dessutom är den totala CD44 avskriften detekteras med hjälp av framåt och bakåt primers belägna i den konstitutiva exon 2 och exon 3, respektive (figur 3A). Såsom visas i figur 3B, analyser QRT-PCR med användning av dessa primeruppsättningar indikerade en signifikant minskning i CD44V-mRNA och ökad CD44s mRNA efter 14 dagars TAM behandling i Twist-ER-uttryck HMLE celler. Däremot förblev den totala utskrift av CD44 oförändrad under EMT (figur 3C). I överensstämmelse med resultaten av QRT-PCR, proteinnivån av CD44v minskat anmärkningsvärt, medan expression av CD44s proteinet kraftigt uppreglerad (Figur 3D). Därför var den stora isoformen av CD44 förskjutits från CD44v till CD44s under EMT processen.

Figur 1
Figur 1 Primer design. Schematiska diagram som illustrerar placeringen av primers för detektering skarva isoformer i ett exon-hoppa modell. De grå rutorna representerar konstitutiva exoner, den orange rutorna representerar rörliga exoner, och de tunna linjer som förbinder rutorna betecknar introner. Primern platser är indicated med pilar: svarta pilar anger primeruppsättningar för detektering av total mRNA, orange pilar indikerar primeruppsättningar för förstärkning exon-inkluderat isoformer, och blå pilar anger primeruppsättningar för detektering av exon-hoppa isoformer.

Figur 2
Figur 2 Induktion av EMT. (A) Fas kontrastbilder (10X) illustrerar morfologiska förändringar i HMLE / Twist-ER-celler före (obehandlat) och efter 14 dagars TAM behandling. (B) Immunoblotanalys av EMT markörer i HMLE / Twist-ER-celler före (obehandlat) och efter 14 dagars TAM behandling. Vid TAM behandling, epiteliala markörer E-cadherin, γ-catenin och occludin var nedregleras och mesenkymala markörer fibronektin, N-cadherin och vimentin var uppregleras. (C) Immun fluorescens bilder (63X) som indikerar förlust av E-cadherinlokalisering vid cell-cell junctions efter 14 dagars TAM behandling. Grön färgning visar E-cadherin och DAPI färgning (blå) indikerar kärnor. Skala bar = 10 mikrometer. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3 Slå av CD44 skarv isoformer under EMT. (A) Primer design för detektion av CD44 skarv isoformer. De grå rutorna representerar konstitutiva exoner, den orange rutorna representerar rörliga exoner, och de tunna linjer som förbinder rutorna betecknar introner. De primer platser anges med pilar: svarta pilar anger primeruppsättningar för detektering av CD44 totala mRNA, orange pilar indikerar primeruppsättningar för förstärkning CD44v5-6 och blå pilar indikerar primeruppsättningar fördetektering CD44s. (B, C) ​​QRT-PCR-analys av halter av CD44-isoformer under EMT med användning av primrar som specifikt detekterar CD44v innehållande variabla exoner V5 och V6 (v5 / 6) och CD44s (B), och CD44 total mRNA (C) . Relativa uttrycksnivåer av mRNA i Dag 14 celler normaliserades till motsvarande dag 0 celler i TAM behandlade och icke-behandlade grupper. Felstaplar visar SEM; n = 3 (D) Immunoblotanalys av CD44-isoformer under TAM-inducerad EMT i HMLE / Twist-ER-celler. Nivåer av E-cadherin och N-cadherin övervakades att identifiera EMT status.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det förfarande som beskrivs här möjliggör detektion av alternativ splitsning i ett inducerbart EMT modell. Som sådan, dynamiska förändringar av skarv isoform uttryck kan fångas under hela tidsförloppet för EMT. Denna metod har fördelar jämfört med användning av olika epithelial- eller mesenkymala-representerande cellinjer för jämförelse av alternativ splitsning, eftersom olika genetisk bakgrund från un relaterade cellinjer kunde otillbörligt påverka alternativ splitsning. Dock måste den framgångsrika induktion av EMT bekräftas noggrant med hjälp av olika EMT markörer före några slutsatser om förändringar i alternativ splitsning kan dras. Dessutom förutom Twist-ER-inducerbart EMT-system som beskrivs här är andra EMT system såsom de som induceras av Snail-ER eller TGF rekommenderas för validering av experimentella fynd 11,30.

Omkopplingen av skarv isoformer under EMT kan detekteras i både RNA och proteinnivåer. Splice isoformulärspecifika antikroppar är föredragna för proteinanalys. När isoform-specifika antikroppar inte finns tillgängliga, kan proteinnivåer skarv isoformer bestämmas utifrån deras molekylvikt på SDS-PAGE med immunoblotting. Den RNA-nivån för varje isoform kan kvantifieras genom isoformen specifika primrar. Använda QRT-PCR-analyser, kan vecket förändringen av varje isoform vara känsligt och exakt fastställas. I synnerhet när experimentella material är begränsade, till exempel analysera uttryck för en viss skarv isoform i kliniska prover, ger QRT-PCR-analys ett kvantitativt mått som skulle kompensera för bristen på isoformen specifika antikroppar för immunohistokemi.

Metoden som nämns här är lämplig för detektering av kända skarv isoforma förändringar under EMT. Dessutom kan denna metod utökas för att studera genomet hela alternativ splitsning och för att identifiera nya skarv isoform växling under EMT. För att åstadkomma detta,användning av en storskalig teknik, såsom RNA djupSekvense eller splits känslig microarray plattformar, kan utföras med användning av RNA som isolerats från den inducerbara EMT ovan beskrivna modellen. Ändå är QRT-PCR validering av isoforma förändringar som krävs efter varje större analys.

Sammanfattningsvis är alternativ splitsning dynamiskt regleras under EMT, en process som är avgörande för embryonal utveckling och tumörmetastaser. Med tanke på den höga frekvensen av alternativ splitsning i det mänskliga genomet, är det troligt att regleringen av alternativ splitsning spelar en viktig roll i många andra biologiska och patologiska processer inklusive celldifferentiering, vävnadsutveckling och programmerad celldöd 35-41. Protokollet beskrivs här för detektion av skarv isoformer kommer att gälla för dessa andra system också.

Ytterligare experimentella metoder, såsom skarv reporter minigen analyser, kan be används för att ytterligare undersöka regler hos cis-verkande element och transverkande faktorer som styr alternativ splits 30,42,43. Dessutom kan den funktionella rollen av en viss skarv isoform under EMT undersökas genom att tysta eller ectopically uttrycker den specifika isoformen och övervakning EMT induktion i den beskrivna EMT-inducerbart systemet 11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-hydroxytamoxifen Sigma H7904 Make stock solution by dissolving 4-hydroxytamoxifen in ethanol to 200 μM. Keep the solution at -20 °C protected from light.
E.Z.N.A. Total RNA Isolation kit Omega Bio-Tek R6731 Total RNA isolation kit
GoScript Reverse Transcription System Promega A5001 Reagent for qRT-PCR assay
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6002 Reagent for qRT-PCR assay
LightCycler 480 Real-Time PCR System Roche Equipment for qRT-PCR assay
CD44 antibody R&D Systems BBA10 1:1,000 dilution
E-cadherin antibody Cell Signaling Technology 4065 1:2,500 dilution for immunoblotting; 1:50 dilution for immunofluorescence
γ-Catenin antibody Cell Signaling Technology 2309 1:1,000 dilution
Occludin antibody Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-5562 1:500 dilution
Fibronectin antibody BD Transduction Laboratories 610077 1:5,000 dilution
N-cadherin antibody BD Transduction Laboratories 610920 1:2,000 dilution
Vimentin antibody NeoMarkers MS-129-p1 1:500 dilution
GAPDH antibody Millipore Corporation MAB374 1:10,000 dilution
Amasham ECL Western blotting detection reagent GE Health Life Science RPN2209 Chemiluminescence system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 131-142 (2006).
  2. Yang, J., Weinberg, R. A. Epithelial-mesenchymal transition at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev Cell. 14, 818-829 (2008).
  3. Yang, J., et al. a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis. Cell. 117, 927-939 (2004).
  4. Batlle, E., et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nat Cell Biol. 2, 84-89 (2000).
  5. Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nat Cell Biol. 2, 76-83 (2000).
  6. Comijn, J., et al. The two-handed E box binding zinc finger protein SIP1 downregulates E-cadherin and induces invasion. Mol Cell. 7, 1267-1278 (2001).
  7. Bolos, V., et al. The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors. J Cell Sci. 116, 499-511 (2003).
  8. Eger, A., et al. DeltaEF1 is a transcriptional repressor of E-cadherin and regulates epithelial plasticity in breast cancer cells. Oncogene. 24, 2375-2385 (2005).
  9. Shapiro, I. M., et al. An EMT-driven alternative splicing program occurs in human breast cancer and modulates cellular phenotype. PLoS Genet. 7, e1002218 (2011).
  10. Warzecha, C. C., et al. An ESRP-regulated splicing programme is abrogated during the epithelial-mesenchymal transition. EMBO J. 29, 3286-3300 (2010).
  11. Brown, R. L., et al. CD44 splice isoform switching in human and mouse epithelium is essential for epithelial-mesenchymal transition and breast cancer progression. J Clin Invest. 121, 1064-1074 (2011).
  12. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
  13. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
  14. Liu, S., Cheng, C. Alternative RNA splicing and cancer. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4, 547-566 (2013).
  15. Shtivelman, E., Lifshitz, B., Gale, R. P., Roe, B. A., Canaani, E. Alternative splicing of RNAs transcribed from the human abl gene and from the bcr-abl fused gene. Cell. 47, 277-284 (1986).
  16. Krangel, M. S. Secretion of HLA-A and -B antigens via an alternative RNA splicing pathway. J Exp Med. 163, 1173-1190 (1986).
  17. Brickell, P. M., Latchman, D. S., Murphy, D., Willison, K., Rigby, P. W. Activation of a Qa/Tla class I major histocompatibility antigen gene is a general feature of oncogenesis in the mouse. Nature. 306, 756-760 (1983).
  18. Barbaux, S., et al. Donor splice-site mutations in WT1 are responsible for Frasier syndrome. Nat Genet. 17, 467-470 (1997).
  19. Charlet, B. N., et al. Loss of the muscle-specific chloride channel in type 1 myotonic dystrophy due to misregulated alternative splicing. Mol Cell. 10, 45-53 (2002).
  20. Hutton, M., et al. Association of missense and 5'-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17. Nature. 393, 702-705 (1998).
  21. Kohsaka, T., et al. Exon 9 mutations in the WT1 gene, without influencing KTS splice isoforms, are also responsible for Frasier syndrome. Hum Mutat. 14, 466-470 (1999).
  22. Philips, A. V., Timchenko, L. T., Cooper, T. A. Disruption of splicing regulated by a CUG-binding protein in myotonic dystrophy. Science. 280, 737-741 (1998).
  23. Savkur, R. S., Philips, A. V., Cooper, T. A. Aberrant regulation of insulin receptor alternative splicing is associated with insulin resistance in myotonic dystrophy. Nat Genet. 29, 40-47 (2001).
  24. Spillantini, M. G., et al. Mutation in the tau gene in familial multiple system tauopathy with presenile dementia. Proc Natl Acad Sci USA. 95, 7737-7741 (1998).
  25. Wang, J., et al. Myotonic dystrophy evidence for a possible dominant-negative RNA mutation. Hum Mol Genet. 4, 599-606 (1995).
  26. Graubert, T. A., et al. Recurrent mutations in the U2AF1 splicing factor in myelodysplastic syndromes. Nat Genet. 44, 53-57 (2012).
  27. Papaemmanuil, E., et al. Somatic SF3B1 mutation in myelodysplasia with ring sideroblasts. N Engl J Med. 365, 1384-1395 (2011).
  28. Yoshida, K., et al. Frequent pathway mutations of splicing machinery in myelodysplasia. Nature. 478, 64-69 (2011).
  29. Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133, 704-715 (2008).
  30. Reinke, L. M., Xu, Y., Cheng, C. Snail represses the splicing regulator epithelial splicing regulatory protein 1 to promote epithelial-mesenchymal transition. J Biol Chem. 287, 36435-36442 (2012).
  31. Serini, G., Gabbiani, G. Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation. Exp Cell Res. 250, 273-283 (1999).
  32. Zavadil, J., Bottinger, E. P. TGF-beta and epithelial-to-mesenchymal transitions. Oncogene. 24, 5764-5774 (2005).
  33. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, e45 (2001).
  34. Hellemans, J., Mortier, G., De Paepe, A., Speleman, F., Vandesompele, J. qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data. Genome Biol. 8, R19 (2007).
  35. Boutz, P. L., et al. A post-transcriptional regulatory switch in polypyrimidine tract-binding proteins reprograms alternative splicing in developing neurons. Genes Dev. 21, 1636-1652 (2007).
  36. Salomonis, N., et al. Alternative splicing regulates mouse embryonic stem cell pluripotency and differentiation. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 10514-10519 (2010).
  37. Calarco, J. A., et al. Regulation of vertebrate nervous system alternative splicing and development by an SR-related protein. Cell. 138, 898-910 (2009).
  38. Grabowski, P. Alternative splicing takes shape during neuronal development. Curr Opin Genet Dev. 21, 388-394 (2011).
  39. Seol, D. W., Billiar, T. R. A caspase-9 variant missing the catalytic site is an endogenous inhibitor of apoptosis. J Biol Chem. 274, 2072-2076 (1999).
  40. Srinivasula, S. M., et al. Identification of an endogenous dominant-negative short isoform of caspase-9 that can regulate apoptosis. Cancer Res. 59, 999-1002 (1999).
  41. Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. Alternative splicing of Bcl-2-related genes functional consequences and potential therapeutic applications. Cell Mol Life Sci. 61, 2189-2199 (2004).
  42. Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37, 331-340 (2005).
  43. Cheng, C., Sharp, P. A. Regulation of CD44 alternative splicing by SRm160 and its potential role in tumor cell invasion. Mol Cell Biol. 26, 362-370 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics