Immunodétection de la membrane externe de protéines par cytométrie en flux de mitochondries isolées

1Department of Biochemistry, Université de Montréal, CRCHUM, 2Department of Neurosciences, Université de Montréal, CRCHUM
Biology

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Summary

Décrit ici est un procédé pour détecter et quantifier les protéines de la membrane externe des mitochondries par immunomarquage des mitochondries isolées à partir de tissus et l'analyse par cytométrie en flux rongeur. Cette méthode peut être étendue à évaluer les aspects fonctionnels des sous-populations mitochondriales.

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Pickles, S., Arbour, N., Vande Velde, C. Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria. J. Vis. Exp. (91), e51887, doi:10.3791/51887 (2014).

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Abstract

Les méthodes de détection et de surveiller mitochondriales composants extérieurs de protéines membranaires dans les tissus animaux sont essentiels pour étudier la physiologie mitochondriale et la physiopathologie. Ce protocole décrit une technique où les mitochondries isolées à partir de tissus de rongeurs sont immunomarquées et analysées par cytométrie en flux. Les mitochondries sont isolées à partir de moelle épinière de rongeurs et soumis à une étape d'enrichissement rapide de manière à éliminer la myéline, un contaminant majeur des fractions mitochondriales préparés à partir de tissu nerveux. Mitochondries isolées sont ensuite marquées avec un anticorps de choix et un anticorps secondaire conjugué à fluorescence. Analyse par cytométrie en flux vérifie la pureté relative de préparations mitochondriales par coloration avec un colorant spécifique des mitochondries, suivie de la détection et la quantification de la protéine immuno-. Cette technique est rapide, quantifiable et à haut débit, ce qui permet l'analyse de centaines de milliers de mitochondries par échantillon. Il est applicable à évaluer roman proteins à la surface mitochondriale dans des conditions physiologiques normales, ainsi que les protéines qui peuvent devenir mislocalized à cet organite pendant pathologie. Fait important, cette méthode peut être couplé à des colorants fluorescents indicateurs de rendre compte de certaines activités de sous-populations mitochondriales et pour les mitochondries est possible à partir du système nerveux central (cerveau et moelle épinière), ainsi que le foie.

Introduction

Les mitochondries sont des organites très dynamiques qui subissent de multiples séries de fission et de fusion, sont transportés vers les sites de forte demande d'énergie et répondre rapidement aux stimuli physiologiques 1. Comme il est de plus en plus reconnu que les mitochondries dans différents tissus, même différents compartiments cellulaires, ont des profils fonctionnels distincts, de nouvelles méthodes sont nécessaires pour identifier ces sous-ensembles mitochondriales distinctes.

Microscopie fournit un moyen par lequel les mitochondries individuels peuvent être visualisés et la présence d'une protéine ou à des mitochondries peut être déterminée par immunofluorescence 2. Cependant, l'analyse quantitative par cette méthode demande beaucoup de travail et est plus appropriée pour des expériences utilisant des lignées cellulaires immortalisées ou primaires. L'étude des mitochondries individu provenant de tissus est beaucoup plus difficile et la plupart des méthodes ne permettent pas d'identifier facilement les sous-ensembles mitochondriales en même temps que l'évaation de la fonction mitochondriale 3.

Afin de remédier à cet obstacle, une nouvelle méthode pour immunolabel mitochondries isolées de tissus de rongeurs et par la suite analysées par cytométrie de flux a été développé. Ceci permet la détection rapide et la quantification des protéines localisées sur la membrane externe des mitochondries, ce qui par rapport à l'analyse par microscopie, est beaucoup moins de travail et permet l'analyse de milliers de mitochondries dans un seul échantillon. Cet essai peut être appliqué pour contrôler le sort et la quantité relative des mitochondries des protéines de la membrane externe qui sont censés être constitutivement présent à la mitochondrie, le recrutement de protéines de la surface mitochondriale, ou la détection de protéines mislocalized vers les mitochondries dans des conditions pathologiques. En outre, l'incorporation de colorants indicateurs fluorescents conventionnels permet l'évaluation simultanée de certains aspects de la fonction mitochondriale dans des mitochondries distinctesous-populations.

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Protocol

Les animaux utilisés dans cette étude ont été traitées en stricte conformité à un protocole (N08001CVsr) approuvé par le du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM) Commission institutionnelle du Centre de Recherche pour la protection des animaux qui est conforme aux normes nationales telles que définies par le Canadien Conseil de protection des animaux (CCPA).

Préparer tous les réactifs nécessaires pour effectuer ce protocole (tableau 1). Tous les autres détails concernant l'équipement, les fournitures et fournisseurs peuvent être trouvés dans la liste des matériaux.

Tableau 1
Tableau 1 Compositions tampons.

1 Collection de Rat moelle épinière

  1. Profondément anesthésier le rat (Sprague Dawley) avec 4% isoflorane. Vérifiez anesthésie par un manque de réflexe sur le pincement de ee patte. Euthanasier le rat par décapitation par guillotine. Cette méthode d'euthanasie est préférée à d'autres, ce qui pourrait fausser la moelle épinière.
  2. Couper la peau du dos pour exposer la colonne vertébrale. Couper la colonne vertébrale avec des ciseaux d'os juste au-dessus de l'os iliaque. Visualiser l'ouverture de la colonne vertébrale.
  3. Insérer une seringue de 10 ml, avec une pointe de 200 ul de pipette (lié par l'intermédiaire de fusion légèrement supérieur à la flamme), rempli de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), dans la colonne vertébrale.
  4. Rincer la moelle épinière par l'application d'une quantité moyenne de pression sur le piston.
  5. Si du sang est présent sur la moelle épinière, rincer avec du PBS avant de passer à l'étape suivante.
    NOTE: Cette méthode a également été validé pour le cerveau et le foie. Si y compris ces tissus, de recueillir la moitié du cerveau de rat euthanasié et un morceau de foie poids égal à la moelle épinière. Toutes les autres étapes restent identiques.

2 Isolement de la moelle épinière Mitochondria (Adapté de Vande Velde et al. 4)

  1. Recueillir l'ensemble de la moelle épinière et le lieu intact dans 5 ml homogénéiseur en verre avec 5 volumes (~ 3,25 ml) Homogénéisation tampons (HB). Pour une récupération optimale des mitochondries isolées, effectuer toutes les étapes sur la glace ou dans une chambre froide. Homogénéiser le tissu à la main jusqu'à ce que plus de gros morceaux de tissu restent, à environ huit coups. Placez homogénat en deux (2 ml) ou trois (1,7 ml) microtubes. Centrifugeuse de 1300 xg pendant 10 min à 4 ° C dans une microcentrifugeuse de paillasse.
  2. Récupérer le surnageant et le placer dans un tube d'ultracentrifugation de 5 ml. Ajouter 750 pi (~ 0,5 volumes) HB au microtube contenant des pastilles et remettre en suspension le culot doucement. Répéter les étapes centrifugation et remise en suspension deux fois de plus. Piscine tous les surnageants (S1a et S1b) dans le même tube d'ultracentrifugation 5 ml ci-dessus. Cette étape sert à éliminer les petits débris.
  3. Centrifugeuse regroupé S1 en utilisant une ultracentrifugation équipé d'une pourriture à godets oscillantsou et centrifuger à 17 000 g pendant 15 min à 4 ° C.
  4. Gardez surnageant (S2) pour un traitement ultérieur si la fraction cytosolique est d'intérêt (par exemple pour l'analyse Western blot). Remettre en suspension le culot (P2), la fraction mitochondriale brute, dans 4 ml de HB + 50 mM de KCl. Centrifuger 17 000 xg pendant 15 min à 4 ° C dans un rotor à godets oscillants. Jeter le surnageant et remettre délicatement le culot (P3) dans 800 ul HB.
    REMARQUE: Les mitochondries sont lavées avec mM KCl + HB 50 pour éliminer tous les contaminants associés mitochondries non spécifiques.
  5. Dans un nouveau tube de 5 ml ultracentrifugation, ajouter exactement 800 ul d'extrait concentré (P3).
  6. Pour ajouter ce tube, 200 pl d'iodixanol (milieu à gradient de densité), créant de ce fait une concentration finale de 12% iodixanol. Mélanger le contenu du tube en douceur, mais en profondeur par pipetage avec un P1000. L'addition d'iodixanol première, et pastille, puis remis en suspension (P3) peut être préférable pour faciliter un mélange complet. Centrifuger dans un ultracentrifuge équipé d'un godet rotor oscillant à 17 000 xg pendant 15 min à 4 ° C.
  7. REMARQUE: foie ne contient pas de myéline et donc cette étape n'est pas nécessaire si ce n'est que le foie est en cours de traitement. Cependant, si le foie est en cours en même temps que les mitochondries du système nerveux central, il est recommandé de traiter tous les tissus également.
  8. Aspirer la couche de myéline dans la partie supérieure du tube et retirez soigneusement et jeter le surnageant. Pellet peut être lâche. Reprendre le culot dans 4 ml HB. Centrifugeuse à nouveau à 17 000 g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 4 ml HB. Répétez la centrifugation et éliminer le surnageant.
  9. Reprendre le culot final (P7) à 100-200 pi HB et transférer dans un tube de 1,7 ml à centrifuger. Cet échantillon contient des mitochondries isolées.
  10. Passez à la quantification des protéines. Diluer les échantillons et la courbe standard dans 2% de dodécyl sulfate de sodium (SDS) pour assurer une solubilisation suffisante des mitochondries during protéine quantification.

3 immunomarquage des mitochondries isolées de cytométrie en flux

  1. Pour chaque mélange de coloration à tester, une pipette 25 pg de mitochondries isolées dans un tube à centrifuger de 1,7 ml. Inclure un échantillon non coloré dans chaque expérience; et pour chaque anticorps, n'oubliez pas d'inclure un échantillon pour le contrôle isotypique approprié.
  2. Centrifuger à 17 000 g pendant 2 min à 4 ° C dans une microcentrifugeuse de paillasse.
  3. Retirer le surnageant et remettre en suspension les mitochondries isolées dans 50 ul de tampon de mitochondries (M Buffer) additionné de 10% de BSA acide gras libre pendant 15 min à 4 ° C (étape de blocage).
    REMARQUE: Lors de l'étiquetage, effectuer des incubations dans un réfrigérateur à 4 ° C.
  4. Ajouter anticorps primaire (de lapin anti-Mfn2, 20 ug par ml) au tube et incuber pendant 30 min à 4 ° C.
    NOTE: Déterminer la concentration optimale de chaque anticorps empiriquement par titrage. En raison de la variabilité de la concentration et / ou la purity, différents lots d'un même anticorps à partir du même fabricant, peuvent conduire à des résultats différents; donc titrage est nécessaire pour chaque nouveau lot d'anticorps.
  5. Laver anticorps primaire non lié: Centrifugeuse à 17.000 g pendant 2 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre délicatement le culot dans 200 ul de tampon M. Centrifugeuse à 17.000 g pendant 2 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 50 ul M tampon.
  6. Ajouter l'anticorps secondaire (anti-lapin d'âne IgG phycoérythrine (PE), 0,5 pg par ml) à tube et incuber les échantillons pendant 30 min à 4 ° C, à l'abri de la lumière.
  7. Laver anticorps secondaire non lié: Centrifugeuse à 17.000 g pendant 2 min à 4 ° C. Enlever le surnageant et remettre le culot dans 200 pi M tampon. Centrifugeuse à 17.000 g pendant 2 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 500 ul M tampon.
  8. Pour assurer événements sont en fait des mitochondries, taches isolé mitochondries avec unemitochondries colorant fluorescent spécifique pendant 15 min à température ambiante, à l'abri de la lumière. Si une coloration d'autres paramètres fonctionnels (potentiel transmembranaire mitochondrial ou de production de superoxyde) est souhaitée, passez à l'étape 4 Si non, passez à l'étape 5 pour l'acquisition.
    NOTE: Il est important de vérifier que le spectre d'émission de l'anticorps secondaire est compatible avec celle des colorants fonctionnels. Par exemple, si la vérification de la pureté mitochondrial avec un colorant commercial avec des propriétés spectrales similaires à potentiel transmembranaire avec FITC et tétraméthylrhodamine ester méthylique (TMRM), un anticorps secondaire serait viable allophycocyanine (APC: Ex 650 nm / Em 660 nm). Ajouter des contrôles de compensations, à savoir, un échantillon immuno-ou teinté avec un fluorophore unique, le cas échéant.
  9. Transférer dans un tube approprié pour le débit de chargement cytomètre. (Pour faciliter la petite taille de l'échantillon, un tube de microtitration est placé à l'intérieur 3 ml cytomètre en flux tube.) Conserver les échantillons sur la glace et procéder immédiatement àcytomètre en flux pour l'acquisition.

4 Dosage mitochondrial potentiel transmembranaire mitochondrial et production de superoxyde par cytométrie en flux

  1. Vérifiez que les mitochondries isolées ont un potentiel transmembranaire intacte par coloration avec 100 nM TMRM (Ex 548 nm / Em 574 nm) 5, à l'étape 3.8, pendant 15 min à température ambiante, à l'abri de la lumière. Pour comparaison du potentiel transmembranaire entre les échantillons et les populations, l'utilisation des concentrations inférieures / non-extinction de TMRM (1 à 30 nM), peut être plus approprié 6.
    1. En tant que témoin pour TMRM coloration, teinture mitochondries isolées avec 100 nM TMRM en présence de 100 uM carbonyl cyanide m-chloro phényl hydrazine (CCCP), un découpleur mitochondrial qui dépolariser les mitochondries. La concentration de CCCP nécessaire pour dépolariser les mitochondries peut être moindre si des concentrations plus faibles de colorant sont utilisés.
  2. Vérifiez que les mitochondries isolées produisent dismutase mitochondriale par staining avec un indicateur approprié de la superoxyde mitochondriale 7, également à l'étape 3.8, pour 15 minutes à température ambiante, à l'abri de la lumière.
    1. En tant que contrôle pour la production de superoxyde mitochondriale, de la teinture des mitochondries isolées de colorant en présence de 10 pM antimycine A, un inhibiteur de complexe III de la chaîne respiratoire qui va augmenter la production de superoxyde mitochondriale.

5 Acquisition et analyse de immunomarquées mitochondries isolées par cytométrie en flux

  1. Instrument mis en place: des tensions de commutation de linéaire en mode Connectez-vous pour faciliter l'analyse des mitochondries isolées et les tensions prévues (FSC: 450; SSC: 250). Veiller à ce que les événements sont collectés dans des FSC mode A (zone), ainsi que FSC-W (largeur) et FSC-H (hauteur), pour être en mesure d'exclure doublets (c'est à dire, deux événements, en passant par le détecteur en même temps ) dans la collecte de post-analyse des données. Définissez le nombre d'événements à collecter à 100.000. Acquérir des contrôles de compensation, Le cas échéant.
  2. L'acquisition des données: Avant l'acquisition des données, éviter vortex échantillons. Au lieu de mélanger en tapotant doucement tube. Initialement, les événements à collecter une faible pression, au cours de déclenchement. Porte sur la population totale. Ajuster les tensions d'histogrammes en conséquence, habituellement au sommet de l'échantillon non coloré correspond à la deuxième décennie (10 2). Une fois les portes sont établis, et les échantillons sont en cours de traitement, la pression peut être réglé à sa grande.
  3. Analyse: Visualisez doublets en traçant FSC-W en fonction de FSC. Identifier les maillots et les doublets. Porte sur maillots. Sélectionnez la population mitochondriale par gating sur les événements qui sont colorées positivement avec un colorant mitochondrial sélectif.
  4. Déterminer l'étiquetage de fond du contrôle isotypique. Utilisation de l'échantillon témoin d'isotype, déterminer le pourcentage de la population mitochondriale marquage des anticorps dirigés contre Mfn2.

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Representative Results

Les mitochondries dérivées de la moelle épinière chez le rat peuvent être immunomarquées avec un anticorps cible à Mitofusin2 (Mfn2), une protéine impliquée dans la fusion de la membrane externe des mitochondries 8. Suite à l'isolation et l'étiquetage avec un anticorps spécifique Mfn2 et un anticorps secondaire conjugué à fluorescence, les mitochondries sont traitées par cytométrie de flux (figure 1). Suite à l'acquisition de données, les échantillons sont analysés en utilisant la cytométrie de flux logiciel d'analyse, d'abord de visualiser tous les événements collectés sur un tracé de points (figure 2A). Doublets et maillots sont différenciés lorsque les événements sont tracés dans le FSC, la largeur (W) par rapport à la zone (A) (figure 2B). Une fois maillots sont choisis, porte la population mitochondriale via FSC / SSC (figure 2C), et de vérifier le nombre d'événements coloration positive pour colorant spécifique des mitochondries par co-tracer un histogramme de l'échantillon sans tache avec un échantillon coloré avec les mitochondries-specolorant cifique. Pour déterminer les événements mitochondriaux, placer une grille à l'intersection des deux pics (Figure 2D). Pour les préparations de la moelle épinière, typiquement> 90% des événements sont positifs pour le colorant spécifique des mitochondries. Pour d'autres tissus tels que le foie, environ 98% des événements sera étiqueter avec le colorant (données non présentées). Après la sélection d'événements qui ne marquent les positivement pour le colorant spécifique des mitochondries, déterminer l'étiquetage de fond avec le contrôle isotypique par la sélection d'une grille (Mfn2 +) qui comprend 1% ou moins marquage isotypique (figure 2E, gauche). Appliquer cette porte uniformément à tous les échantillons marqués avec l'anticorps Mfn2 pour déterminer le pourcentage des mitochondries avec Mfn2 présents sur la membrane mitochondriale externe (Figure 2E, à droite). Dans cette expérience, 30% des mitochondries dérivé d'étiquette de la moelle épinière pour Mfn2 positif. Il est important de noter ici que, bien que Mfn2 est considéré comme un mit ubiquitaire,ochondrial protéine de membrane externe, il n'a pas encore été quantifiée. En outre, une analyse immunocytochimique de cellules cultivées dans Mfn2 montre un marquage non-homogène des mitochondries individuel 9. Il est également possible que l'épitope Mfn2 était indisponible en raison de modifications post-traductionnelles ou en raison d'interactions avec lui-même ou d'autres partenaires de liaison. Il faut noter que l'anticorps dans la présente étude a été généré en utilisant un peptide synthétique de l'extrémité N-terminale (acides aminés 38-55). Il est un variant d'épissage prédits de Mfn2 dépourvu des 302 premiers acides aminés, bien que cette variante n'a pas encore été confirmée expérimentalement (base de données UniProt). Ainsi, ce test ne peut pas détecter Mfn2 épissage alternatif dépourvu de la séquence N-terminale, étant donné l'anticorps utilisé.

Potentiel transmembranaire mitochondrial (ΔΨ m) et la production de superoxyde peut être évaluée dans cet essai. À travers la membrane mitochondriale interne, il ya une séparation de charge which entraîne la production d'ATP par la phosphorylation oxydative. TMRM est un colorant cationique qui s'accumule dans les mitochondries d'une manière dépendante de potentiel de la membrane 5, et peut donc être utilisé en tant que rapporteur de potentiel transmembranaire mitochondrial. La majorité des mitochondries (95%) sont positifs TMRM après coloration, par rapport au témoin non coloré (figure 3A). Toutefois, lorsque le découpleur de CCCP est ajouté on observe une diminution significative du nombre de mitochondries capables de retenir TMRM (figure 3A). CCCP permet le libre passage des ions à travers la membrane mitochondriale interne, détruire essentiellement la séparation de la charge et la dépolarisation de la membrane.

Les mitochondries libération de superoxyde comme un sous-produit normal de la phosphorylation oxydative de complexe I et III de la chaîne de transport d'électrons. Superoxyde mitochondriale peut être mesurée au moyen d'un colorant perméable à la membrane qui est ciblé vers les mitochondries et devient fluorescent folloaile une réaction avec le superoxyde 7. Mitochondries fonctionnelles produisent une quantité basale de superoxyde par rapport aux échantillons non colorés (figure 3B). L'addition de l'inhibiteur complexe III antimycine A donne une augmentation de la superoxyde, comme on le voit par un déplacement vers la droite en fluorescence et un plus grand nombre de mitochondries (typiquement environ 10%) qui sont fluorescents avec ce colorant indicateur dismutase mitochondriale (figure 3B).

Figure 1
Figure 1: Schéma de l'isolement, immunomarquage et analyse des mitochondries. Étape 1: Récupérer le tissu et homogénéiser Etape 2:. La procédure d'isolement comporte huit étapes de centrifugation. La myéline, un confinement important des tissus du système nerveux central est éliminé par dilution dans les mitochondries iodixanol (milieu à gradient de densité) et centrifuging, ce qui entraîne la myéline flottant à la partie supérieure du tube, tandis que les mitochondries sont rassemblées en un culot. Étape 3: À la suite de l'isolement et de la quantification, les mitochondries sont bloqués, marquée avec l'anticorps primaire et on le lave. Un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore est ensuite ajouté. L'anticorps non lié est éliminé par lavage. Etape 4: A ce stade, des colorants fluorescents qui rendent compte de la pureté mitochondrial, ou la fonction mitochondriale peuvent être ajoutés. Etape 5: Les mitochondries sont maintenant prêtes à être analysées par cytométrie en flux.

Figure 2
Figure 2: Stratégie pour l'analyse des mitochondries isolées par cytométrie de flux. Les Forward Scatter (FSC) et Side Scatter (SSC) des tensions doit être ajustée pour les petits événements, en utilisant les deux paramètres en mode logarithmique. largeur de FSC (FSC-W) de données doit êtrerecueillies à exclure doublets. Remarque, sur la plupart des cytomètres, le réglage par défaut de FSC et SSC est le mode linéaire. (A) Visualiser tous les événements collectés sur un tracé de points. (B) doublets, deux mitochondries passant par le laser en même temps, peut être distinguée de maillots en traçant FSC en fonction de FSC-W (mode linéaire). Les événements sont exclues si la valeur FSC-W est plus de deux fois la valeur FSC-W moyenne de la plupart des événements, c'est à dire, ceux qui font partie de l'épais nuage. Evénements sous ce seuil sont déclenchés comme maillots. (C) Encore une fois, de visualiser les événements dans un tracé de points, et porte sur les autres épreuves. (D) Tracer un histogramme de l'échantillon sans tache (solide, gris, rempli) échantillon et colorées avec un colorant mitochondrial spécifique (MSD: solide, vert). Porte les événements coloration positive pour la MSD (MSD +). (E) Histogramme du contrôle isotype, IgG de lapin (en pointillés, noir) et Mfn2 échantillon marqué (solide, rose).Réglez la porte de manière à donner ≤ 1% Mfn2 + sur la crête de contrôle isotypique et d'appliquer cette même porte à échantillon expérimental pour déterminer le pourcentage d'événements étiquetage positif pour Mfn2 (Mfn2 +). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Dosage potentiel transmembranaire mitochondrial (ΔΨ m) et production de superoxyde dans les mitochondries isolées par cytométrie en flux. (A) Dans des conditions basales tous les mitochondries actives étiquette avec TMRM (solide, noir), par rapport au témoin non coloré (solide, gris, rempli) parce que le colorant s'accumule dans les mitochondries avec un potentiel transmembranaire. Addi tion de la CCCP protonophore (en pointillé, bleu) dissipe le potentiel transmembranaire des mitochondries à provoquer et maintenir dépolariser moins un colorant par rapport aux conditions de base. Les données sont déclarées comme le delta intensité moyenne de fluorescence (ΔMFI), qui est l'intensité de fluorescence moyenne de la commande sans tache soustraite de l'intensité de fluorescence moyenne de l'échantillon. (B) Dans des conditions basales, les mitochondries produisent superoxyde comme un sous-produit de l'oxydation phosphorylation. Cette source de superoxyde mitochondriale peut être testée avec un indicateur mitochondrial superoxyde, (mitoo 2: solide, noir) par rapport au témoin non coloré (solide, gris, remplis). Addition de l'inhibiteur complexe III, antimycine A (pointillés, orange) entraîne une augmentation de la production de superoxyde, par rapport aux niveaux de base. Les données sont déclarées comme pour cent des cellules présentant une coloration positive pour l'indicateur mitoo 2.k "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Il est de plus en plus évident que les mitochondries sont des acteurs clés dans les deux physiologie normale et la maladie. Bien immuno peut déterminer quelles protéines se trouvent dans les mitochondries ou à la surface des mitochondries dans un certain état, cette méthode des rapports sur la moyenne de l'ensemble de la population. Cette méthode ne peut pas donner d'informations sur l'abondance relative des sous-populations ou sous-ensembles mitochondriales. Bien qu'il ait été supposé précédemment que toutes les mitochondries sont créés égaux, le terrain est de plus en plus reconnaître que les mitochondries dans une cellule ont une grande variabilité en termes de morphologie et / ou de la fonction 10.

Des approches de microscopie à fluorescence ne prennent en compte l'hétérogénéité des mitochondries. Cependant, la quantification de ce type de données est un travail intensif. En outre, cette approche est mieux adaptée à des études utilisant des cellules en culture, que l'étiquetage des mitochondries in vivo / in situ est difficile en raison des excessive nombre de mitochondries présents, ce qui rend la différenciation des organites individuels par nature difficiles. Dans la plupart des protocoles d'immunocytochimie, il n'est également pas possible de marquer simultanément les protéines de membrane mitochondriale externe et évaluer la fonction mitochondriale en raison de l'étape de perméabilisation cellulaire nécessaire pour le marquage de l'anticorps. La méthode actuelle fonctionne avec des mitochondries isolées, et ne nécessite donc pas une étape de perméabilisation. En outre, la visualisation de chaque mitochondrie n'est possible que par microscopie électronique, ce qui ne se prête pas à l'analyse de la fonction mitochondriale. Cela étant dit, nous reconnaissons que l'isolement des mitochondries du tissu conduit à la rupture du réseau mitochondrial, ce qui pourrait affecter certains éléments de la fonction mitochondriale. Cependant, la comparaison des aspects fonctionnels de mitochondries isolées à partir de tissus qui sont traités de la même restent valables.

Cette méthode d'immunomarquage d'isolat d'origine tissulaireed mitochondries et l'analyse ultérieure par cytométrie en flux permet d'une méthode rapide et quantifiable pour détecter et surveiller la présence d'une protéine située sur la membrane externe. La détection d'une protéine mitochondriale très abondants (comme Mfn2) est possible avec cette technique. De même, cette méthode permet de détecter les protéines de faible abondance, qui ne sont déposées sur la membrane mitochondriale dans la maladie, comme SOD1 mal repliée dans le contexte de la sclérose latérale amyotrophique (ALS) 11. En outre, cette méthode peut être utile de surveiller les protéines qui s'associent de manière transitoire avec la surface mitochondriale dans le cadre de leur fonction normale. Des exemples comprennent Dynamin-related protein-1 (DRP1), une protéine cytosolique qui est recruté à la mitochondrie, de promouvoir fission mitochondriale 12 et facteur de nécrose tumorale associée au récepteur facteur six (TRAF6), qui subit une translocation vers les mitochondries pour augmenter les espèces réactives de l'oxygène mitochondrial comme une partie d'une réponse immunitaire innée 13.

Actuellement, cette technique ne se prête à des protéines situées à la surface mitochondriale, comme les protocoles de perméabilisation standard pour marquage intracellulaire nécessitent un détergent qui rompt l'intégrité de la structure des mitochondries. Bien qu'un certain nombre de réactifs possibles ont été essayées (non publié), l'optimisation du protocole de immunomarquage sont encore nécessaires pour faire de ce protocole se prête à la détection des composants intra-mitochondriaux.

Cette technique a de larges applications et peut être utilisé pour détecter la présence ou le recrutement d'une ou plusieurs protéines de la mitochondrie sous différents paradigmes expérimentaux. En outre, les mitochondries peuvent être co-marquées avec deux anticorps différents, et aussi par des indicateurs fluorescents 11. D'autres sondes fluorescentes peuvent également être incorporés pour caractériser d'autres aspects de la fonction mitochondriale. Par exemple, les colorants disponibles dans le commerce pour contrôler le pH 14 mitochondriale 15, et ATP 16 niveaux sont possibles.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Acknowledgements

Nous remercions Laurie Destroismaisons et Sarah Peyrard pour le support technique exceptionnelle et Dr.Alexandre Prat pour l'accès au cytomètre de flux. Nous tenons également à remercier le Dr Timothy Miller pour sa contribution en ce qui concerne la suppression de la myéline des préparations. Ce travail a été financé par les Instituts canadiens de recherche (IRSC) partenariat pour la santé de recherche neuromusculaire, la Fondation canadienne pour l'innovation, Société de la SLA du Canada, la Fondation Frick recherche sur la SLA, Fondation du CHUM et le Fonds de la Recherche en Santé du Québec (CVV). Les deux CVV et NA sont Chercheurs-boursiers du Fonds de la Recherche en Santé du Québec et nouveaux chercheurs des IRSC. SP est soutenu par Tim Noël de stagiaire de la Société canadienne de la SLA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rats Charles River Strain code 400 Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used.
Dounce homogenizer Kontes Glass Co.  885450-0022 Duall 22
Microcentrifuge Thermo Scientific Sorvall Legend Micro 17 R
Ultra-Clear Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 344057 Transparent, thin walled 
Sorvall Ultracentrifuge Thermo Scientific Sorvall WX UltraSeries
AH-650 rotor and buckets   Thermo Scientific
Opti-prep Axis-Shield 1114542 Iodixanol, density gradient medium
Fatty acid free Bovine Serum Albumin Sigma A8806 Must be fatty acid free for mitochondria
Sodium succinate dibasic hexahydrate   Sigma S9637
Rabbit anti-Mitofusin2 antibody Sigma M6319
Rabbit IgG Jackson Immuno Research  011-000-003
Anti-Rabbit IgG PE eBioscience 12-4739-81
Micro titer tube Bio-Rad 223-9391 For sample acquisition by flow cytometry 
MitoTrackerGreen (MTG) Invitrogen M7514 100 nM: Ex 490 nm/Em 516 nm
TMRM Invitrogen T668 100 nM: Ex 548 nm/Em 574 nm
CCCP Sigma C2759
MitoSOX Red Invitrogen M36008 5 µM: Ex 540 nm/Em 600 nm
Antimycin A Sigma A8874
LSR II flow cytometer BD
BD FACSDiva Software BD
FlowJo TreeStar Inc.  Software used for analysis
BCA protein assay kit   Pierce/Thermo Scientific 23225 Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS

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References

  1. Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H. Mitochondrial dynamics in neurodegeneration. Trends Cell Biol. 23, 64-71 (2013).
  2. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. J Cell Biol. 183, 795-803 (2008).
  3. Zorov, D. B., Kobrinsky, E., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Examining intracellular organelle function using fluorescent probes: from animalcules to quantum dots. Circ Res. 95, 239-252 (2004).
  4. Vande Velde, C., Miller, T., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4022-4027 (2008).
  5. Loew, L. M., Tuft, R. A., Carrington, W., Fay, F. S. Imaging in five dimensions: time-dependent membrane potentials in individual mitochondria. Biophys J. 65, 2396-2407 (1993).
  6. Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50, 98-115 (2011).
  7. Xu, X., Arriaga, E. A. Qualitative determination of superoxide release at both sides of the mitochondrial inner membrane by capillary electrophoretic analysis of the oxidation products of triphenylphosphonium hydroethidine. Free Radic Biol Med. 46, 905-913 (2009).
  8. Otera, H., Ishihara, N., Mihara, K. New insights into the function and regulation of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta. 1833, 1256-1268 (2013).
  9. de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456, 605-610 (2008).
  10. Wikstrom, J. D., Twig, G., Shirihai, O. S. What can mitochondrial heterogeneity tell us about mitochondrial dynamics and autophagy. Int J Biochem Cell Biol. 41, 1914-1927 (2009).
  11. Pickles, S., Destroismaisons, L., Peyrard, S. L., Cadot, S., Rouleau, G. A., Brown, R. H. Jr, Julien, J. P., Arbour, N., Vande Velde, C. Mitochondrial damage revealed by immunoselection for ALS-linked misfolded SOD1. Hum Mol Genet. 22, 3947-3959 (2013).
  12. Frank, S., Gaume, B., Bergmann-Leitner, E. S., Leitner, W. W., Robert, E. G., Catez, F., Smith, C. L., Youle, R. J. The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis. Dev Cell. 1, 515-525 (2001).
  13. West, A. P., Brodsky, I. E., Rahner, C., Woo, D. K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Walsh, M. C., Choi, Y., Shadel, G. S., Ghosh, S. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472, 476-480 (2011).
  14. Abad, M. F., Di Benedetto, G., Magalhães, P. J., Filippin, L., Pozzan, T. Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant. J Biol Chem. 279, 11521-11529 (2004).
  15. Murphy, A. N., Bredesen, D., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9893-9898 (1996).
  16. Tantama, M., Martinez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nat Commun. 4, 2550 (2013).

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