Imunodetecção de membrana externa proteínas por citometria de fluxo de mitocôndrias isoladas

1Department of Biochemistry, Université de Montréal, CRCHUM, 2Department of Neurosciences, Université de Montréal, CRCHUM
Biology

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Summary

Aqui descrito é um método para detectar e quantificar as proteínas da membrana exterior mitocondrial por imunomarcação das mitocôndrias isoladas a partir de tecidos de roedores e de análise por citometria de fluxo. Este método pode ser estendido para avaliar os aspectos funcionais de subpopulações mitocondriais.

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Pickles, S., Arbour, N., Vande Velde, C. Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria. J. Vis. Exp. (91), e51887, doi:10.3791/51887 (2014).

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Abstract

Métodos para detectar e monitorar os componentes proteína da membrana externa mitocondrial nos tecidos animais são vitais para estudar a fisiologia mitocondrial e fisiopatologia. Este protocolo descreve uma técnica em que as mitocôndrias isoladas de tecidos de roedores são immunolabeled e analisadas por citometria de fluxo. As mitocôndrias são isoladas a partir de medulas espinhais de roedores e submetido a um passo de enriquecimento rápido, de modo a remover a mielina, um contaminante de fracções mitocondriais preparadas a partir de tecido nervoso. Mitocôndrias isoladas são então marcadas com um anticorpo de escolha e um anticorpo secundário conjugado com fluorescência. Análise por citometria de fluxo, verifica a pureza relativa das preparações mitocondriais por coloração com um corante específico mitocondrial, seguido por detecção e quantificação de proteínas immunolabeled. Esta técnica é rápida, quantificável e de elevado rendimento, que permite a análise de centenas de milhares de mitocôndrias por amostra. É aplicável para avaliar novela proteins na superfície mitocondrial sob condições fisiológicas normais, bem como as proteínas que se podem tornar mislocalized para este organelo durante a patologia. Importante, este método pode ser acoplado a corantes indicadores fluorescentes para informar sobre certas actividades das subpopulações mitocondriais e é possível para as mitocôndrias do sistema nervoso central (cérebro e medula espinal), bem como o fígado.

Introduction

As mitocôndrias são organelas altamente dinâmicos que passam por vários ciclos de fissão e fusão, são transportados para locais de alta demanda energética e responder rapidamente a estímulos fisiológicos 1. Uma vez que é cada vez mais reconhecido que as mitocôndrias dentro de tecidos diferentes, mesmo diferentes compartimentos celulares, têm perfis funcionais distintos, são necessários novos métodos para identificar esses subconjuntos mitocondriais distintas.

Microscopia fornece um meio pelo qual as mitocôndrias individuais pode ser visualizada e a presença de uma proteína com ou em mitocôndrias pode ser determinada por imunofluorescência 2. No entanto, a análise quantitativa por este método é de trabalho intensivo e é mais adequado para as experiências utilizando linhas de células imortalizadas ou primárias. O estudo das mitocôndrias indivíduo derivado de tecido é significativamente mais difícil, e a maioria dos métodos de não permitir a fácil identificação de subconjuntos mitocondriais concorrentemente com a avação da função mitocondrial 3.

A fim de resolver este obstáculo, um novo método para immunolabel mitocôndrias isoladas a partir de tecidos de roedores e, subsequentemente, analisadas por citometria de fluxo foi desenvolvido. Isto permite a rápida detecção e quantificação de proteínas localizadas na membrana mitocondrial externa, o que em comparação com a análise por microscopia, é muito menos trabalho intensivo e permite a análise de milhares de mitocôndrias em uma única amostra. Este ensaio pode ser aplicado para monitorizar o destino e a quantidade relativa de proteínas de membrana exterior mitocondrial que se pensa estar constitutivamente presente na mitocôndria, o recrutamento de proteínas à superfície mitocondrial, ou a detecção de proteínas mislocalized para a mitocôndria em condições patológicas. Além disso, a incorporação de corantes indicadores fluorescentes convencionais permite a avaliação simultânea de certos aspectos da função mitocondrial em mitocondrial distintasubpopulações.

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Protocol

Os animais utilizados neste estudo foram tratados em estrita conformidade com um protocolo (N08001CVsr), aprovado pelo du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM) Comitê Institucional Centre de Recherche para a Protecção dos Animais, que segue padrões nacionais indicados pela Canadian Conselho on Animal Care (CCAC).

Prepare todos os reagentes necessários para realizar esse protocolo (Tabela 1). Todos os outros detalhes sobre equipamentos, suprimentos e fornecedores podem ser encontrados na lista de materiais.

Tabela 1
Tabela 1 Composições de buffer.

1 Coleção de Rat Medula Espinhal

  1. Profundamente anestesiar o rato (Sprague Dawley) com 4% isoflorane. Verifique anaesthetization pela falta de reflexo sobre beliscar of the pata dianteira. Eutanásia do rato por decapitação com uma guilhotina. Este método é o preferido da eutanásia sobre os outros, o que poderia distorcer a medula espinhal.
  2. Cortar a pele do para trás para expor a coluna vertebral. Corte a coluna vertebral com tesoura osso logo acima do osso pélvico. Visualize a abertura da coluna vertebral.
  3. Inserir uma seringa de 10 ml, com uma ponta de pipeta de 200 uL (ligado através de fusão ligeiramente mais de chama), cheio com salina tamponada com fosfato (PBS), para a coluna vertebral.
  4. Lave a espinal medula por meio da aplicação de uma quantidade de pressão para o êmbolo.
  5. Se houver sangue na medula espinhal, lavar com PBS, antes de prosseguir para o próximo passo.
    NOTA: Este método também foi validado para o cérebro e fígado. Se estes tecidos incluindo, recolher metade do cérebro do rato sacrificados e um pedaço de fígado, em igual peso para a medula espinhal. Todas as outras medidas idênticas.

2 Isolamento de Medula Espinhal Mitochondria (Adaptado de Vande Velde et al. 4)

  1. Recolhe toda a medula espinhal e lugar intacto em 5 ml homogeneizador de vidro com 5 volumes (~ 3,25 mL) Tampão de homogeneização (HB). Para a recuperação ideal de mitocôndrias isoladas, realizar todas as etapas no gelo ou em câmara fria. Homogeneizar o tecido com a mão até que não haja grandes pedaços de tecido permanecem, cerca de oito cursos. Coloque homogeneizado em duas (2 ml) ou três (1,7 ml) tubos de microcentrífuga. Centrífuga 1300 xg durante 10 min a 4 ° C numa microcentrífuga de bancada.
  2. Recuperar sobrenadante e colocar em um tubo de ultracentrífuga 5 ml. Adicionar 750 mL (~ 0,5 volumes) HB ao tubo de microcentrífuga contendo sedimento e ressuspender cuidadosamente o sedimento. Repita os passos de centrifugação e ressuspensão mais duas vezes. Piscina todos os sobrenadantes (S1a e s1b) para o mesmo tubo de 5 mL ultracentrífuga acima. Este passo serve para remover pequenos fragmentos.
  3. Centrífuga reunidas S1 usando uma ultracentrífuga equipado com uma podridão balde oscilanteou e centrifugar a 17000 xg durante 15 min a 4 ° C.
  4. Manter o sobrenadante (S2) para posterior processamento, se a fracção citosólica é de interesse (por exemplo, por análise de Western blot). Ressuspender o sedimento (P2), a fracção mitocondrial em bruto, em 4 ml de HB + 50 mM de KCl. Centrífuga 17.000 xg durante 15 min a 4 ° C num rotor de balde oscilante. Descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet gentilmente (P3) em 800 mL HB.
    NOTA: As mitocôndrias são lavadas com KCl HB + 50 mM para remover quaisquer contaminantes mitocôndrias-associados não-específicos.
  5. Em um novo tubo de 5 ml de ultracentrífuga, adicionar exactamente 800 ul do sedimento ressuspenso (P3).
  6. A este tubo adicionar, 200 ul de iodixanol (meio de gradiente de densidade), criando deste modo uma concentração final de 12% de iodixanol. Misture o conteúdo do tubo com cuidado, mas completamente via pipeta com um P1000. A adição de iodixanol primeiro, e em seguida sedimento ressuspenso (P3) pode ser preferível para facilitar a mistura completa. Centrifugar em um ultracentrifuge equipado com um rotor basculante a 17.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
  7. NOTA: O fígado não contêm mielina e, portanto, este passo não é necessário se somente o fígado está sendo processado. No entanto, se o fígado está a ser processado em simultâneo com a mitocôndria do SNC, é recomendado para o tratamento de todos os tecidos de forma igual.
  8. Aspirar a camada de mielina na parte superior do tubo e cuidadosamente remover e descartar o sobrenadante. Pellet pode estar solto. Ressuspender o sedimento em 4 ml de HB. Centrifugar novamente a 17000 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 4 ml HB. Voltar a centrifugar e remover o sobrenadante.
  9. Ressuspender o sedimento final (P7) em 100-200 ul HB e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. Este exemplo contém mitocôndrias isoladas.
  10. Vá para a quantificação de proteínas. Diluir as amostras da curva padrão e em 2% de dodecilsulfato de sódio (SDS) para assegurar a solubilização adequada das mitocôndrias during quantificação da proteína.

3. imunomarcação de mitocôndrias isoladas de Citometria de Fluxo

  1. Para cada mistura de coloração para ser testado, pipeta 25 ug de mitocôndrias isoladas para um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. Incluir uma amostra unstained em cada experimento; e para cada anticorpo, não se esqueça de incluir uma amostra para o controlo apropriado do isotipo.
  2. Centrifuga-se a 17000 xg durante 2 min a 4 ° C numa microcentrífuga de bancada.
  3. Remover o sobrenadante e ressuspender mitocôndrias isoladas em 50 uL Tampão de mitocôndrias (M Tampão) suplementado com 10% de ácido gordo livre de BSA durante 15 min a 4 ° C (passo de bloqueio).
    NOTA: Durante a rotulagem, realizar incubações em uma geladeira a 4 ° C.
  4. Adicionar o anticorpo primário (anti-coelho MFN2, 20 ug por ml) para o tubo e incubar durante 30 min a 4 ° C.
    NOTA: Determinar a concentração ideal de cada anticorpo empiricamente por titulação. Devido à variabilidade da concentração e / ou purity, diferentes lotes do mesmo anticorpo do mesmo fabricante pode levar a resultados diferentes; Por conseguinte, a titulação é necessária para cada novo lote de anticorpo.
  5. Lavar o anticorpo primário não ligado: Centrifugar a 17.000 xg durante 2 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento em 200 ul M Tampão. Centrifuga-se a 17000 xg durante 2 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 50 mL M Tampão.
  6. Adicionar anticorpo secundário (de burro anti-IgG de coelho de ficoeritrina (PE), 0,5 mg por ml) para o tubo e incubar as amostras durante 30 min a 4 ° C, protegidos da luz.
  7. Lavar o anticorpo secundário não ligado: Centrifugar a 17.000 xg durante 2 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul M Tampão. Centrifuga-se a 17000 xg durante 2 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 ul M Tampão.
  8. Para garantir os eventos são de fato mitocôndria, mancha mitocôndrias isoladas com umacorante fluorescente específico para mitocôndrias 15 min à temperatura ambiente, protegida da luz. Se a coloração de outros parâmetros funcionais (potencial transmembrana mitocondrial ou a produção de superóxido) é desejada, vá para a etapa 4 Se não, vá para a etapa 5 para aquisição.
    NOTA: É importante verificar que o espectro de emissão do anticorpo secundário é compatível com aquela dos corantes funcionais. Por exemplo, se a verificação de pureza mitocondrial com um corante comercial com propriedades espectrais semelhantes à potencial transmembrana com FITC e éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM), um anticorpo secundário seria viável aloficocianina (APC: Ex 650 nm / Em 660 nm). Adicionar controlos compensações, por exemplo, uma amostra immunolabeled ou coradas com uma única fluoroforo, quando aplicável.
  9. Transferir para um tubo de fluxo adequado para o carregamento citómetro. (Para facilitar o pequeno tamanho da amostra, um tubo de microtitulação é colocado dentro de 3 ml citômetro de fluxo tubo.) Manter as amostras em gelo e proceder imediatamente àcitometria de fluxo para a aquisição.

4. Assaying mitocondrial potencial transmembrana mitocondrial e Superoxide Produção por citometria de fluxo

  1. Verificar que as mitocôndrias isoladas têm um potencial transmembrana intacta por coloração com 100 nM TMRM (Ex 548 nm / Em 574 nm) 5, no passo 3.8, durante 15 min à temperatura ambiente, protegida da luz. Para comparação do potencial transmembranar entre as amostras e as populações, a utilização de concentrações inferior / não-extinção de TMRM (1 a 30 nM), pode ser mais adequado 6.
    1. Como controlo para a coloração TMRM, mancha mitocôndrias isoladas com 100 nM TMRM na presença de 100 ^ M de cianeto de carbonilo m-cloro-fenil hidrazina (CCCP), um desacoplador mitocondrial que despolarizará mitocôndrias. A concentração de CCCP necessária para despolarizar a mitocôndria pode ser menor se as concentrações mais baixas de corante são utilizados.
  2. Verifique se mitocôndrias isoladas produzir superóxido mitocondrial por Sãoaining com um indicador de superóxido mitocondrial 7 apropriado, também na etapa 3.8, durante 15 min à temperatura ambiente, protegida da luz.
    1. Como um controlo para a produção de superóxido mitocondrial, mancha mitocôndrias isoladas com o corante na presença de 10 uM antimicina A, um inibidor do complexo III da cadeia respiratória, que irá aumentar a produção de superóxido mitocondrial.

5. Aquisição e Análise de immunolabeled mitocôndrias isoladas por citometria de fluxo

  1. Instrumento criado: tensões mudar de linear para o modo de log para facilitar a análise das mitocôndrias isoladas e definidas tensões (FSC: 450; SSC: 250). Certifique-se de que os eventos são recolhidos em modo de FSC-A (área) bem como FSC-W (largura) e FSC-H (altura), para ser capaz de excluir dupletos (isto é, dois eventos, que passam pelo detector, ao mesmo tempo ) na análise de recolha de pós-dados. Defina o número de eventos a serem coletados para 100.000. Adquirir controles de compensação, Se aplicável.
  2. Aquisição de dados: Antes de aquisição de dados, evitar vórtex amostras. Em vez disso, misture batendo suavemente tubo. Inicialmente coletar eventos a uma pressão baixa, durante gating. Portão em população total. Ajustar tensões de histogramas em conformidade, normalmente o pico da amostra não corada irá corresponder à segunda década (10 2). Uma vez que portas estão estabelecidas, e as amostras estão sendo processados, a pressão pode ser ligado à alta.
  3. Análise: Visualize doublets traçando FSC-W contra FSC. Identificar singlets e doublet. Portão em singlets. Selecione a população mitocondrial pela passagem em eventos que são marcadas positivamente com um corante mitocondrial seletivo.
  4. Determine rotulagem fundo do controle isotipo. Utilizando o exemplo de controlo de isotipo, determinar a percentagem da população rotulagem mitocondrial positivo para anticorpo MFN2.

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Representative Results

As mitocôndrias derivadas de medulas espinais de rato pode ser immunolabeled com um anticorpo direcionado para Mitofusin2 (MFN2), uma proteína implicada na fusão da membrana externa da mitocôndria 8. A seguir ao isolamento e marcação com um anticorpo específico MFN2 e um anticorpo secundário conjugado com fluorescência, as mitocôndrias são processadas por citometria de fluxo (Figura 1). Após a aquisição de dados, as amostras são analisadas utilizando o software de análise de citometria de fluxo, pelo primeiro visualizar todos os eventos recolhidos sobre um gráfico de pontos (Figura 2A). Dupletos e singletos são diferenciadas quando os acontecimentos estão representados na FSC, a largura (W) contra a área (A) (Figura 2B). Uma vez singlets são selecionados, portão da população mitocondrial via FSC / SSC (Figura 2C), e verificar o número de eventos de coloração positiva para o corante específico da mitocôndria por co-desenhar um histograma da amostra imaculado com uma amostra corada com a mitocôndria-specorante cas. Para determinar os acontecimentos mitocondriais, colocar uma porta na intersecção dos dois picos (Figura 2D). Para as preparações da medula espinal, tipicamente> 90% dos eventos são positivas para o corante específico de mitocôndrias. Para outros tecidos, tais como fígado, ~ 98% dos eventos irá etiquetar com o corante (dados não mostrados). Depois de seleccionar apenas os eventos que marcam positivamente para o corante específico de mitocôndrias, determinar etiquetagem de fundo com o controlo do isotipo, seleccionando um portão (MFN2 +) que inclui 1% ou menos de rotulagem de isotipo (Figura 2E, esquerda). Aplicar este portão uniformemente a todas as amostras marcadas com anticorpo MFN2 para determinar a percentagem de mitocôndrias com MFN2 presente na membrana mitocondrial externa (Figura 2E, direita). Nesta experiência, 30% de derivados de mitocôndrias etiqueta medular positivo para MFN2. É importante notar aqui que, embora MFN2 é considerado para ser um mit expressa ubiquamenteproteína da membrana externa ochondrial, que não tenha sido previamente quantificada. Além disso, uma análise imuno-histoquímico de células de cultura em MFN2 mostra uma rotulagem não homogénea das mitocôndrias indivíduo 9. Também é possível que o epitopo MFN2 estava indisponível devido a postar translacionais ou devido a interações com a própria ou outros parceiros de ligação. Digno de nota, o anticorpo neste estudo foi gerado utilizando um péptido sintético para a N-terminal (aminoácidos 38-55). Existe uma variante de emenda previsto de MFN2 faltando os primeiros 302 aminoácidos, embora esta variante ainda tem que ser confirmada experimentalmente (banco de dados UniProt). Assim, este ensaio não é capaz de detectar MFN2 splicing alternativo sem a sequência N-terminal, dado que o anticorpo utilizado.

Potencial mitocondrial transmembranar (ΔΨ m) e a produção de superóxido pode ser avaliada neste ensaio. Através da membrana mitocondrial interna, há uma separação de cargas which impulsiona a produção de ATP via fosforilação oxidativa. TMRM é um corante catiónico que se acumula no interior da mitocôndria em um potencial de membrana forma dependente 5, e, por conseguinte, pode ser utilizada como um repórter do potencial transmembranar mitocondrial. A maioria das mitocôndrias (95%) são TMRM positivo após a coloração, em comparação com o controlo não coradas (Figura 3A). No entanto, quando o CCCP desacoplador é adicionado há uma diminuição significativa no número de mitocôndrias, capazes de reter TMRM (Figura 3A). CCCP permite a passagem livre de iões através da membrana mitocondrial interna, essencialmente, destruindo a separação da carga e despolarização da membrana.

As mitocôndrias superóxido libertação como um subproduto normal da fosforilação oxidativa do complexo I e III da cadeia de transporte de elétrons. Superóxido mitocondrial pode ser medido através de um corante permeável membrana que é direcionado para a mitocôndria e se torna fluorescente seguinasa de uma reação com superóxido 7. Mitocôndrias funcionais produzir uma quantidade basal de superóxido em comparação com amostras não coradas (Figura 3B). A adição do inibidor complexo III Antimicina A produz um aumento da superóxido, como pode ser visto por uma mudança para a direita em fluorescência e um elevado número de mitocôndrias (tipicamente ~ 10%) que são fluorescentes com o corante indicador de superóxido mitocondrial (Figura 3B).

Figura 1
Figura 1 Diagrama esquemático de isolamento, análise de imunomarcação e mitocôndrias. Passo 1: Coletar tecido e homogeneizar. Etapa 2: O processo de isolamento contém oito etapas de centrifugação. Mielina, um grande confinamento do tecido do sistema nervoso central é removido por diluição de mitocôndrias em iodixanol (meio de gradiente de densidade) e centrifuging, resultando na mielina que flutua para a parte superior do tubo, enquanto as mitocôndrias foram sedimentadas Etapa 3:. Seguindo o isolamento e quantificação, as mitocôndrias são bloqueados, marcado com o anticorpo primário e lava-se. É então adicionado um anticorpo secundário conjugado com um fluoróforo. Anticorpo não ligado é lavado para fora Passo 4:. Neste ponto corantes fluorescentes que relatam sobre a pureza mitocondrial, ou a função mitocondrial pode ser adicionado Passo 5:. Mitocôndrias estão agora prontos para serem analisados ​​por citometria de fluxo.

Figura 2
Figura 2 Estratégia para a análise das mitocôndrias isoladas por citometria de fluxo. Os Forward Scatter (FSC) e Side Scatter (SSC) as tensões devem ser ajustados para pequenos eventos, utilizando ambos os parâmetros no modo logarítmica. Largura FSC (FSC-W) Os dados devem serrecolhido para excluir dupletos. Note-se, na maioria dos citómetros de fluxo, a configuração padrão para FSC e SSC é o modo linear. (A) Visualize todos os eventos coletados em um gráfico de pontos. (B) Parelhas, duas mitocôndrias que passam pelo laser, ao mesmo tempo, pode ser distinguida da singlets por conspirar contra FSC FSC-W (modo linear). Os eventos são excluídos se o valor do FSC-W é mais do que duas vezes o valor do FSC-W significativo da maioria dos eventos, isto é, aqueles que são parte da nuvem densa. Eventos sobre este limiar são fechadas como singlets. (C) Mais uma vez, visualizar os eventos em um gráfico de pontos, e portão nos eventos restantes. (D) traçar um histograma da amostra sem mancha (sólido, cinzento, cheio) e amostra corada com um corante mitocondrial específica (MSD: sólido, verde). Portão os eventos que coram positivo para o MSD (MSD +) (E). Histograma do controlo do isotipo, IgG de coelho (a tracejado, preto) e MFN2 amostra marcada (sólido, cor de rosa).Defina a porta, de modo a produzir ≤ 1% MFN2 + no pico controle isotipo e aplicar este mesmo portão para amostra experimental para determinar a porcentagem de eventos marcação positiva para MFN2 (MFN2 +). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Assaying transmembranar mitocondrial potencial (ΔΨ m) e superóxido de produção em mitocôndrias isoladas por citometria de fluxo. (A) Em condições basais todas as mitocôndrias ativas irá rotular com TMRM (sólido, preto), em relação ao controle sem mácula (sólido, cinza, cheio), pois o corante se acumula nas mitocôndrias, com um potencial de membrana. Addi ção do CCCP protonophore (tracejada, azul) dissipa o potencial de membrana, causando a mitocôndria para despolarizar e reter menos corante em relação às condições basais. Os dados são referidos como a intensidade fluorescente média delta (ΔMFI), que é a intensidade de fluorescência média do controlo não corado subtraída da intensidade de fluorescência média da amostra. (B) Em condições basais, mitocôndrias produzir superóxido como um subproduto da oxidação fosforilação. Esta fonte mitocondrial de superóxido podem ser analisados ​​com um indicador mitocondrial superóxido (mitoo 2: sólido, preto) em relação ao controle sem mácula (sólido, cinza, cheio). A adição do inibidor complexo III, Antimicina A (tracejadas, laranja) resulta em aumento da produção de superóxido, em relação aos níveis basais. Os dados são apresentados como percentagem de células coradas positivamente para o indicador mitoo 2.k "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

É cada vez mais evidente que as mitocôndrias são jogadores-chave na fisiologia normal e na doença. Enquanto imunotransferência pode determinar quais as proteínas são encontradas dentro da mitocôndria ou na superfície mitocondrial em uma determinada condição, este método relatórios sobre a média da totalidade da população. Este método não pode dar informações sobre abundância relativa de subpopulações mitocondriais ou subconjuntos. Embora tenha sido previamente assumido que todas as mitocôndrias são criados iguais, o campo é cada vez mais reconhecendo que as mitocôndrias dentro de uma célula tem uma grande variabilidade em termos de morfologia e / ou função 10.

Abordagens de microscopia fluorescente que tenha em conta a heterogeneidade de mitocôndrias. Contudo, a quantificação deste tipo de dados é de trabalho intensivo. Além disso, esta abordagem é mais adequado para estudos utilizando células de cultura, tal como a rotulagem das mitocôndrias in vivo / in situ é difícil devido às excessivo número de mitocôndrias presentes, fazendo com que a diferenciação de organelos individuais inerentemente difícil. Na maior parte dos protocolos de imunocitoquímica, também não é possível marcar simultaneamente proteínas de membrana mitocondrial externa e avaliação da função mitocondrial devido ao passo de permeabilização celular necessário para a marcação de anticorpos. O actual método funciona com mitocôndrias isoladas, e, portanto, não requerem um passo de permeabilização. Além disso, a visualização das mitocôndrias individuais só é possível por meio de microscopia electrónica, o que não é favorável para a análise da função mitocondrial. Dito isto, nós reconhecemos que o isolamento de mitocôndrias de tecido leva a perturbações na rede mitocondrial e isso pode afetar alguns elementos da função mitocondrial. No entanto, as comparações de aspectos funcionais de mitocôndrias isoladas de tecidos que são processados ​​de forma semelhante, permanecem válidos.

Este método de imunomarcação de isolad derivadas de tecidoed mitocôndrias e subsequente análise por citometria de fluxo permite um método rápido e quantificável para detectar e monitorizar a presença de uma proteína localizada na membrana externa. A detecção de uma proteína mitocondrial altamente abundante (como MFN2) é possível com esta técnica. De igual modo, este método pode detectar proteínas de abundância baixa que apenas são depositadas na membrana mitocondrial na doença, como SOD1 misfolded no contexto da Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS) 11. Além disso, este método pode ser útil para controlar as proteínas que se associam com o transitoriamente mitocondrial superfície como parte da sua função normal. Exemplos incluem-Related Dynamin proteína-1 (Drp1), uma proteína citosólica que é recrutada para a mitocôndria para promover fissão mitocondrial 12 e fator associada ao receptor do factor de necrose tumoral 6 (TRAF6), que efectua a translocação para a mitocôndria para aumentar as espécies de oxigénio reactivas, como mitocondriais uma parte de uma resposta imune inata 13.

Actualmente, esta técnica só é passível de proteínas localizadas na superfície mitocondrial, como permeabilização protocolos padrão para rotulagem intracelular requerem um detergente que interrompe a integridade estrutural das mitocôndrias. Enquanto um número de possíveis reagentes foram tentados (não publicado), otimização do protocolo de imunomarcação ainda é necessário para fazer este protocolo passíveis de detectar componentes intra-mitocondriais.

Esta técnica tem amplas aplicações e podem ser usadas para detectar a presença ou o recrutamento de uma ou mais proteínas para as mitocôndrias, sob diferentes paradigmas experimentais. Além disso, as mitocôndrias pode ser co-marcado com dois anticorpos diferentes, bem como com os indicadores fluorescentes 11. Outras sondas fluorescentes podem também ser incorporadas para caracterizar aspectos adicionais da função mitocondrial. Por exemplo, corantes disponíveis comercialmente para controlar mitocondrial pH 14 15 e ATP níveis de cálcio 16 são possíveis.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

Agradecemos Laurie Destroismaisons e Sarah Peyrard para excelente suporte técnico e Dr.Alexandre Prat para o acesso ao citômetro de fluxo. Gostaríamos também de agradecer o Dr. Timothy Miller, por sua contribuição em relação à remoção da mielina dos preparativos. Este trabalho foi financiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa (CIHR) Neuromuscular Parceria de Pesquisa em Saúde, Fundação Canadense para Inovação, Sociedade ALS do Canadá, a Fundação para a Pesquisa Frick ALS, Fundação CHUM e Fonds de la Recherche en Santé du Québec (CVV). Ambos CVV e NA são estudiosos de Pesquisa do Fonds de la Recherche en Santé du Québec e CIHR novos pesquisadores. SP é apoiado pela Tim Noël Studentship da Sociedade ALS do Canadá.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rats Charles River Strain code 400 Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used.
Dounce homogenizer Kontes Glass Co.  885450-0022 Duall 22
Microcentrifuge Thermo Scientific Sorvall Legend Micro 17 R
Ultra-Clear Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 344057 Transparent, thin walled 
Sorvall Ultracentrifuge Thermo Scientific Sorvall WX UltraSeries
AH-650 rotor and buckets   Thermo Scientific
Opti-prep Axis-Shield 1114542 Iodixanol, density gradient medium
Fatty acid free Bovine Serum Albumin Sigma A8806 Must be fatty acid free for mitochondria
Sodium succinate dibasic hexahydrate   Sigma S9637
Rabbit anti-Mitofusin2 antibody Sigma M6319
Rabbit IgG Jackson Immuno Research  011-000-003
Anti-Rabbit IgG PE eBioscience 12-4739-81
Micro titer tube Bio-Rad 223-9391 For sample acquisition by flow cytometry 
MitoTrackerGreen (MTG) Invitrogen M7514 100 nM: Ex 490 nm/Em 516 nm
TMRM Invitrogen T668 100 nM: Ex 548 nm/Em 574 nm
CCCP Sigma C2759
MitoSOX Red Invitrogen M36008 5 µM: Ex 540 nm/Em 600 nm
Antimycin A Sigma A8874
LSR II flow cytometer BD
BD FACSDiva Software BD
FlowJo TreeStar Inc.  Software used for analysis
BCA protein assay kit   Pierce/Thermo Scientific 23225 Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS

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References

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