Étiquetage spécifique de la séquence des acides nucléiques et des protéines avec Methyltransferases et le cofacteur Analogues

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Biology

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Summary

ADN et les protéines sont-séquence spécifiquement étiquetés avec une affinité ou groupes rapporteurs fluorescents à l'aide ADN ou de protéines méthyltransférases et analogues de cofacteur synthétiques. En fonction de la spécificité du cofacteur des enzymes, aziridine ou doubles analogues de cofacteurs activés sont utilisés pour l'étiquetage d'une ou deux étapes.

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Hanz, G. M., Jung, B., Giesbertz, A., Juhasz, M., Weinhold, E. Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues. J. Vis. Exp. (93), e52014, doi:10.3791/52014 (2014).

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Abstract

-Adenosyl S-L-méthionine (SAM ou AdoMet) méthyltransférases dépendantes (MTAse) catalysent le transfert du groupe méthyle de l'AdoMet activé à des positions spécifiques dans l'ADN, l'ARN, les protéines et les petites biomolécules. Cette réaction de méthylation naturel peut être étendue à une grande variété de réactions d'alkylation utilisant des analogues de synthèse de cofacteurs. Remplacement du centre de sulfonium de AdoMet réactif avec un cycle aziridine conduit à des co-facteurs qui peuvent être couplés avec de l'ADN par diverses MTases d'ADN. Ces cofacteurs aziridine peuvent être équipés avec des groupes rapporteurs à différentes positions de la fraction de l'adénine et utilisés pour S spécifique M equence ethyltransferase- je nduced L abel ING de l'ADN (DNA Sourire). Comme exemple typique, nous donnons un protocole de biotinylation de l'ADN de plasmide pBR322 à la séquence 5'-ATCG A T-3 'avec l'ADN MTase M.BseCI et le cofacteur aziridine dans 6BAzune étape. Extension du groupe méthyle activé avec insaturés groupes alkyle résultats dans une autre classe d'analogues AdoMet qui sont utilisés pour m ethyltransferase dirigée de Transfert d'un G roupes ctivated (MTAG). Étant donné que les chaînes latérales longues sont activés par le centre de sulfonium et de la liaison insaturée, ces co-facteurs sont appelés analogues AdoMet double-activées. Ces analogues, non seulement fonction de cofacteurs de l'ADN, comme MTases les co-facteurs d'aziridine, mais aussi pour un ARN, de protéines et de petites molécules. MTases Ils sont généralement utilisés pour la modification enzymatique de substrats MTAse uniques avec des groupes fonctionnels qui sont marqués avec des groupes rapporteurs dans une deuxième étape chimique. Ceci est illustré dans un protocole de marquage par fluorescence de la protéine histone H3. Un petit groupe propargyle est transférée du cofacteur SeAdoYn analogue à la protéine par l'histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 suivie d'étiquetage du clicalkynylated histone H3 avec TAMRA azoture. Étiquetage MTase médiation avec des analogues de cofacteur est une technologie habilitante pour de nombreuses applications intéressantes, dont l'identification et l'étude fonctionnelle des substrats MTASE ainsi que l'ADN de génotypage et de détection de la méthylation.

Introduction

Étiquetage spécifique d'acides nucléiques et de protéines 1,2 3,4 est d'un intérêt majeur pour les caractérisations fonctionnelles, le diagnostic médical et (nano) la biotechnologie. Nous présentons ici une méthode de marquage enzymatique pour ces biopolymères qui est basé sur S -adenosyl-L-méthionine (SAM ou AdoMet) méthyltransférases dépendantes (de MTases). Cette classe d'enzymes (EC 2.1.1.) Cible nucléophiles positions individuelles (azote, d'oxygène, de soufre et des atomes de carbone) à l'intérieur des résidus spécifiques d'acides nucléiques et de protéines et transfère le groupe méthyle activé de l'AdoMet cofacteur (figure 1A) 5 naturellement. En outre, MTases peuvent utiliser des analogues synthétiques de cofacteurs pour un étiquetage spécifique avec des étiquettes d'affinité, des fluorophores ou d'autres étiquettes (figure 1B) 6. Deux classes d'analogues AdoMet ont été développés: cofacteurs aziridine pour S equence spécifique M ethyltransferase- I L abel ING (Sourire) 7 et doubles analogues AdoMet activés pour m ethyltransferase dirigée de Transfert d'un G roupes ctivated (MTAG) 8.

Figure 1
Figure 1: Réactions catalysées par des méthyltransférases (MTases) de transfert de groupe A. méthyle à partir du cofacteur naturel AdoMet (SAM) sur divers substrats, y compris l'ADN, l'ARN, les protéines et les petites biomolécules B. Identification / fonctionnalisation des acides nucléiques et des protéines (NNNNN =.. paires de bases de l'ADN, des nucleotides de l'ARN et des acides aminés pour les protéines; XXXXX = séquence de reconnaissance de la MTase résidu avec de cible en vert) avec des analogues de synthèse de cofacteurs. Cofacteurs aziridine contenant un groupe rapporteur (sphère bleue)fixé au noyau adenine sont séquence spécifique couplé avec le résidu cible (à gauche) et analogues doubles activé AdoMet conduit au transfert de chaînes alkyle étendues portant un reporter chimique Y (à droite) qui peut être marqué par bioorthogonal clic réaction dans une seconde étape. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Cofacteurs aziridine fonctionnent mieux avec des ADN MTases. Ils contiennent un cycle à trois à un atome d'azote 9 (ou un N de moutarde 10,11) à la place du centre de sulfonium en tant que groupe réactif. La protonation de cet atome d'azote active le cycle aziridine pour une attaque nucléophile par le nucléotide cible qui entraîne le couplage covalent de l'ensemble avec de l'ADN cofacteur. En attachant des groupes rapporteurs à l'anneau de l'adénine les cofacteurs d'aziridine peuvent être utilisés en combinaison avec de l'ADN pour marquer MTases ADN en une étape ( g> Figure 1B, de gauche) 7,12. Cela est démontré en détail pour la biotinylation de l'ADN avec 6BAz 13-15 (cofacteur aziridine avec de la biotine attachée à la position 6 du cycle adénine) et l'ADN spécifique à l'adénine MTase de Bacillus stearothermophilus (M.BseCI) 16 (Figure 2, voir la section 2 du protocole: étiquetage en une seule étape de l'ADN via aziridine cofacteurs). En plus de M.BseCI («séquence de reconnaissance, l'ADN MTases à partir de Thermus aquaticus (M.TaqI, 5'-TCG A -3 5'-ATCG Un T-3) '), à partir de Haemophilus heamolyticus (M.HhaI, 5 »-G C GC-3 '), et de Spiroplasma (M.SssI, 5'-C G-3') ont été utilisés avec succès pour biotinyler ADN avec 6BAz 17. En outre, des cofacteurs aziridine peuvent être utilisés pour une étape de marquage d'ADN par fluorescence 18,19.

ontenu "fo: keep-together.within-page =" always "> Figure 2
Figure 2:. Séquence spécifique à une étape de biotinylation avec M.BseCI ADN et l'ADN MTase 6BAz M.BseCI reconnaît la séquence d'ADN double brin 5'-ATCG A T-3 'et méthylation du groupe amino de la seconde adénine naturellement résidu (vert) en utilisant AdoMet. Avec le cofacteur aziridine 6BAz le cours de la réaction est changé et M.BseCI conduit à séquencer biotinylation spécifique d'ADN en couplant l'ensemble cofacteur y compris biotine (bleu) avec l'adénine cible. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Double analogues activés AdoMet contient étendues de chaînes latérales insaturées au lieu d'un groupe méthyle au centre de sulfonium (figure 1B 20. Le double ou triple liaison insaturée dans β-position pour le centre de sulfonium compense électroniquement effets stériques défavorables au sein de l'état de transition par la stabilisation de conjugaison. Étant donné que le centre de sulfonium et activent la liaison insaturée de la chaîne latérale pour le transfert enzymatique, ces co-facteurs ont été nommés analogues AdoMet double-activées. Typiquement, ils sont utilisés pour transférer des chaînes latérales avec des groupes uniques chimiques (reporters chimiques), comme les groupes amino, alcyne et azoture, par chimio-sélective étiquetage dans une deuxième étape 8,21. En général, les analogues doubles activé AdoMet peut non seulement fonctionner comme cofacteurs pour l'ADN MTases 8,20,21 mais aussi pour l'ARN MTases 22,23 et MTases de protéines de 24 à 28 permettant étiquetage supplémentaire de l'ARN et des protéines. Cependant, les longues chaînes latérales sont stériquement plus exigeant que un groupe méthyle et en élargissant les sites actifs MTASE par ingénierie des protéines est souventfr nécessaire pour obtenir des taux de transfert efficaces. Une autre solution à ce problème est d'utiliser un analogue AdoMet avec un petit groupe de propargyle (trois carbones) où l'alcyne terminale sert deux fonctions: 1. La stabilisation de l'état de transition pendant le transfert enzymatique et 2. poignée réactif pour la suite de modifications chimiques de cuivre catalysée cycloaddition azoture-alcyne (CuAAC) click chemistry. Il se est avéré que le propargylique résultant AdoMet analogique 29 est assez instable dans des conditions neutres ou légèrement basiques et seulement d'une utilité limitée. Cet inconvénient peut être résolu en remplaçant l'atome de soufre par le sélénium. Le cofacteur résultant 5 '- [(Se) [(3 S) -3-amino-3-carboxypropyle] prop-2-ynylselenonio] -5'-désoxyadénosine (SeAdoYn, figure 3) est acceptée par l'ADN de type sauvage, l'ARN MTases et de protéines de 30 à 32 qui abroge la nécessité d'ingénierie des protéines dans de nombreux cas. Ceci est illustré par fluorescence pro étiquetage protéine avec l'histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 33 (Figure 3, voir la section de protocole 3: Deux étapes étiquetage de protéine via doubles cofacteurs activés).

Figure 3
Figure 3:. Spécifique de séquence à deux étapes marquage par fluorescence de l'histone H3 avec Set7 / 9, SeAdoYn et TAMRA azide La protéine MTase Set7 / 9 méthylation naturellement le groupe amino de la lysine 4 de l'histone H3 (H3K4, vert) à l'aide AdoMet. Avec le cofacteur double-activé SeAdoYn l'MTase transfère un petit groupe propargyle (rouge) au résidu de lysine. Le triple liaison terminal connecté est alors modifiée sélectivement en un clic réaction bioorthogonal (cuivre-catalysée azoture-alcyne cycloaddition, CuAAC) avec l'azoture-dérivé TAMRA (tétraméthylrhodamine, bleu) fluorophore.charge / 52014 / 52014fig3highres.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Protocol

1. Instructions générales

  1. aziridine de magasin cofacteur 6BAz (dans du DMSO) et de la protéine MTase Set7 / 9 à -80 ° C et tous les autres réactifs, y compris cofacteur double-activé et SeAdoYn ADN MTase M.BseCI (dans 50% de glycerol) à -20 ° C.
  2. Déterminer la concentration de 6BAz et SeAdoYn par spectroscopie UV / VIS à l'aide de 269nm (6BAz) = 16,000 cm -1 M -1 et ε 260nm (SeAdoYn) = 15,400 cm -1 M de coefficients d'extinction -1 dans l'eau déminéralisée. Déterminer la concentration de MTases par le dosage de Bradford ou, si le coefficient d'extinction est disponible, par absorption directe à 280 nm.
  3. Essayez d'éviter de créer des bulles par la pipette ou vortex intensive pour éviter la perte de l'activité enzymatique. Au lieu de cela, mélanger en pipetant doucement monter et descendre.
  4. Lors de l'ajout de cofacteurs aziridine partir de solutions mères dans du DMSO se assurer que la concentration finale de DMSO dans le dosage est moinsà 5%. Toujours inclure des ions de magnésium 10 mM dans le tampon d'essai pour empêcher des réactions non spécifiques avec l'ADN.
  5. Lors de l'ajout doubles cofacteurs activés partir de solutions mères acides utiliser de petits volumes (solutions mères très concentrés) pour éviter les changements de pH et de se assurer que le pH de la solution de dosage ne change pas de façon significative. Eviter les thiols, par exemple, β-mercaptoéthanol ou le dithiothréitol (DTT), dans le tampon de dosage, car ils peuvent interférer avec la réaction clic par complexation des ions de cuivre est requise.

2. Une étape marquage de l'ADN via AZIRIDINE cofacteurs

  1. Methyltransferase induite label ING spécifiques de séquence (Sourire) de l'ADN plasmidique avec M.BseCI ADN MTase et aziridine cofacteur 6BAz.
    1. Décongeler la solution de cofacteurs à 20 ° C et préparer les mélanges réactionnels sur de la glace.
    2. En plus du dosage effectuer un contrôle "cofacteur", pour visualiser les modifications non spécifiques, et un & #8220; enzyme "le contrôle, pour se assurer que la préparation MTase est libre de la AdoMet cofacteur naturel.
    3. Pour le dosage mélange 2 pi de 10 x tampon de modification (contenant 100 mM de Tris-HCl, 100 mM de MgCl2, 20 mM de β-mercaptoéthanol, pH 7,4), 2 ul de pBR322 (0,5 ug / ul), 10 éq. M.BseCI par séquence de reconnaissance sur l'ADN (séquence de reconnaissance dans une pBR322) et le cofacteur aziridine 6BAz à une concentration finale de 60 uM dans un volume total de 20 ul. Ajouter cofacteur et l'ADN MTase dernière.
      REMARQUE: β-mercaptoéthanol est toxique, corrosif et dommageables pour l'environnement.
    4. Pour le contrôle "cofacteur" ajouter de l'eau déminéralisée à la place de M.BseCI et pour le contrôle "de l'enzyme" ajouter de l'eau déminéralisée à la place de 6BAz.
    5. Mélanger les solutions en pipetant doucement monter et descendre.
    6. Incuber les tubes à 55 ° C pendant 1 heure.
    7. Centrifuger brièvement pour collecter tout liquide au fond des tubes.
  2. Test de restriction-modification de vérifier modification de l'ADN.
    1. Préparer une solution en mélangeant 10 pi de tampon 10x R.TaqI (contenant 100 mM de Tris-HCl, 50 mM de MgCl2, 1 M de NaCl, 1 mg / ml d'albumine de sérum bovin, pH 8,0), 80 pi d'eau désionisée et 3,3 ul de la endonucléase de restriction (Rease) à partir de Thermus aquaticus (R.TaqI, 10 U / pl). Assurez-vous d'ajouter le Rease dans la dernière étape.
    2. A chaque tube de 2.1.7 ajouter 2 ul de tampon 10X Taq I et R. 28 ul de la solution ci-dessus à partir de (2.2.1).
    3. Mélanger les solutions en pipetant doucement monter et descendre.
    4. Incuber les tubes à 65 ° C pendant 30 min.
    5. Centrifuger brièvement pour collecter tout liquide au fond des tubes.
  3. Électromobilité dosage de décalage (EMSA) avec de la streptavidine pour vérifier modification fonctionnelle.
    1. Retirer 25 pi de chaque tube (2.2.5) et ajouter 2,4 ul d'une solution de streptavidine (1 mM par rapport à la streptavidine monomer dans un tampon de streptavidine contenant 100 mM de Na 2 HPO 4, NaCl 100 mM, pH 7,5; 4 équivalents de biotine total). Ajouter 2,4 pi de tampon de streptavidine dans les tubes restants.
    2. Incuber tous les tubes à 37 ° C pendant 1 heure.
  4. L'analyse par électrophorèse sur gel d'agarose.
    1. Ajouter 5 ul de tampon 6x de chargement (0,25% de bleu de bromophénol, 30% de glycerol) à chaque tube.
    2. Mélanger délicatement les solutions.
    3. Charge 10 pi de chaque échantillon dans les puits d'un gel d'agarose (1% d'agarose dans un tampon 0,5x TBE contient 1x GelRed partir d'une solution 10.000 fois de stock).
    4. Exécutez le gel dans du tampon TBE 0,5x avec 80 V env. 1 h.
    5. Visualiser les bandes d'ADN sur une table UV (312 nm) avec une caméra CCD équipé d'un filtre (540 ± 50 nm).
      REMARQUE: la lumière UV est dommageable pour les yeux et la peau.

3. Deux étapes Protein Labeling via cofacteurs Double Activé

  1. MethyltransfTransfert de groupes activés (MTAG) avec Set7 / 9 et le cofacteur double-SeAdoYn activé pour histone H3 lysine 4 étiquetage (étape de modification) l'effacement Réalisé.
    1. Décongeler les composants et préparer les mélanges de réaction sur de la glace. REMARQUE: Toujours garder SeAdoYn refroidi pour éviter la dégradation.
    2. En plus du dosage effectuer un contrôle "cofacteur", pour visualiser les modifications non spécifiques, et une commande "enzyme", d'exclure les réactions non-spécifiques de la sonde fluorescente.
    3. Préparer une solution d'essai (20 ul) contenant du tampon de modification (50 mM Tris-HCl, 5% de glycerol, pH 8,5), 10 uM d'histone H3, 10 uM Set7 / 9 et 600 uM SeAdoYn (mélange des deux épimères en sélénium). Dans les dernières étapes ajouter cofacteur puis MTase.
    4. Pour le contrôle "cofacteur" préparer une solution de dosage en 3.1.3 et ajouter 60 mM AdoMet de rivaliser avec le cofacteur synthétique. Pour le contrôle "de l'enzyme" ajouter de l'eau déminéralisée à la place de SeAdoYn.
    5. Mélanger les solutions en pipettant doucement de haut en bas. Vérifier le pH en ajoutant 1 ul de chaque solution dans le domaine supérieur d'une bande de pH (plage de pH 5-10).
    6. Incuber à 37 ° C pendant 2 heures.
    7. En attendant, le gel préparer un gel à 12% de polyacrylamide-SDS (course: Bis-Tris 357 mM, pH 6.5 à 6.8, 0,1% (p / v) APS, 0,04% (v / v) de TEMED et 12% d'acrylamide / bisacrylamide 37,5: 1 ; gel de chargement: 357 mM de Bis-Tris, pH 6.5 à 6.8, 0,1% (p / v) APS, 0,04% (v / v) de TEMED et 5% d'acrylamide / bisacrylamide 37,5: 1).
      NOTE: L'acrylamide / bisacrylamide est toxique et dangereux pour la santé. Porter des gants lors de cette procédure.
  2. Marquage chimique de la lysine dans alkinylated 4 histone H3 par cycloaddition de l'azide-alcyne (CuAAC) (étape de marquage) catalysée par le cuivre.
    1. Juste avant la fin de la réaction de modification préparer un clic 5x mélange contenant 3 mM de CuSO 4, 3 mM de tris (3-hydroxypropyl-triazolylméthyl) amine (THPTA), l'ascorbate de sodium 250 mM et 6 mM d'azide avec un TAMRAvolume total de 20 ul.
    2. Ajouter 5 ul de la 5x clic mélange fraîchement préparé dans chaque tube pour démarrer le CuAAC et éteindre la réaction de modification.
    3. Mélanger doucement en pipetant.
    4. Protéger tous les tubes avec une feuille d'aluminium de la lumière pour éviter photo-blanchiment du fluorophore.
    5. Incuber à 20 ° C pendant 1 heure.
  3. La précipitation des protéines pour enlever l'excès de la libre fluorophore TAMRA.
    1. Pour éviter resplendissement de l'histone H3 marqué fluorescent par intensive fluorescence dans-gel de la libre fluorophore TAMRA, enlever l'excès de fluorophore par précipitation des protéines (3.3.2 - 3.3.4) 34.
    2. Ajouter 75 ul méthanol, 18,8 pi chloroforme et 50 pi d'eau déminéralisée à chaque tube et vortex brièvement après chaque addition. Centrifuger à 16 000 g pendant 5 min. Retirer la phase supérieure sans perturber la couche d'interface, qui contient la protéine.
    3. Ajouter 56,3 pi méthanol à la phase restante in chaque tube vortex et centrifuger à 16 000 xg pendant 5 min pour sédimenter les protéines. Eliminer le surnageant. Répétez cette étape pour laver le culot.
    4. Couvrir les tubes ouverts avec un tissu non pelucheux et laissez-les sécher pendant 15 à 30 min.
  4. Analyse par SDS PAGE.
    1. Dissoudre les protéines précipitées du 3.3.4 dans 20 ul de tampon de charge SDS (50 mM de Tris-HCl, 2,5% (p / v) de SDS, 10% (v / v) de glycerol, 320 mM de β-mercaptoéthanol et 0,05% (p / v) de bleu de bromophénol, pH 6,8). Assurez-vous de dissoudre complètement la pastille en rinçant les parois des tubes avec une pipette.
    2. Incuber les échantillons à 95 ° C pendant 10 min et laisser refroidir à 20 ° C.
    3. Centrifuger brièvement pour collecter tout liquide au fond des tubes.
    4. Charger la totalité du montant de chaque échantillon dans les puits d'un gel de polyacrylamide SDS (3.1.7). Utiliser 50 mM MOPS, 50 mM de Tris-X (Tris-base), EDTA 5 mM, 0,1% (p / v) de SDS comme tampon pour électrophorèse.
    5. Exécutez le gel avec 120 V pendant env. 90 min.
    6. Visualiser la fluorescence dans le gel sur une table UV (312 nm) avec une caméra CCD équipé d'un filtre (540 nm ± 50 nm).
      REMARQUE: la lumière UV est dommageable pour les yeux et la peau.

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Representative Results

Une étape marquage de l'ADN via AZIRIDINE cofacteurs

Cet exemple réaction est effectuée avec l'ADN MTase M.BseCI, qui modifie le second résidu d'adénine dans le A T-3 'la séquence à double brin 5'-ATCG et a un site de reconnaissance sur le plasmide pBR322 (figure 4A). Pour tester l'étiquetage du plasmide pBR322 est contestée par l'endonucléase de restriction (Rease) R.TaqI (5'-TCGA-3 '). R.TaqI possède sept sites sur pBR322, dont l'un est inclus dans le site M.BseCI. Si l'étiquetage se produit, le site M.BseCI sera protégé contre clivage et un nouveau fragment avec 683 paires de bases (pb) formera alors que deux autres fragments vont disparaître (315 et 368 pb). Bien sûr, lors de l'analyse d'ADN étiquetage avec d'autres MTases d'ADN différents REases avec des séquences de reconnaissance correspondantes doivent être employées.

Le gel d'agarose de la figure 4B montre clairement apparaître lament d'un nouveau fragment avec 683 pb (piste 3). Cela démontre que l'étiquetage du site M.BseCI se est produite. Seul l'essai (piste 3) montre ce fragment. Le contrôle "cofacteur" (piste 5) ainsi que le contrôle "de l'enzyme" (piste 7) sont absents cette bande. En particulier, la commande "enzyme" est important car il démontre que la co-facteur naturel AdoMet ne est pas présente dans la préparation d'enzyme. La spécificité de la réaction de marquage est mise en évidence par dosage mobilité électrique de changement de vitesse (EMSA) lors de l'addition de streptavidine (figure 4B et 4C en détail). Électromobilité de la pb 683 est retardée tandis que la mobilité de tous les autres fragments sans place M.BseCI est inchangé par rapport aux témoins (comparer avec la piste 4 voies 6 et 8).

Figure 4
Figure 4: Séquencebiotinylation spécifique de l'ADN de plasmide pBR322 avec M.BseCI et 6BAz. La carte A. Le plasmide pBR322 montrant de sites de reconnaissance pour M.BseCI (rouge) et R.TaqI (vert), ainsi que la longueur de fragments d'ADN attendus en paires de bases (pb) après restriction avec R.TaqI. B. Analyse de l'ADN la fragmentation et l'EMSA par électrophorèse sur gel d'agarose. M = Marker, voies 1 et 2: ADN plasmidique seulement, les pistes 3 et 4: dosage, voies 5 et 6: contrôle »de cofacteur ', voies 7 et 8: contrôle' enzyme". Les pistes 2, 4, 6 et 8 contiennent en outre streptavidine. C. élargi encart de B. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Deux étapes marquage des protéines par l'intermédiaire cofacteurs Double Activé

A titre d'exemple pour l'étiquetage en deux étapes de MTase substrats avec des analogues doubles activé AdoMet nous avons choisi l'histoneH3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 et le petit cofacteur SeAdoYn. Après le transfert enzymatique du groupe propargyle activé au substrat d'histone H3 (première étape), l'alcyne terminal est chimiquement étiquetée avec un azide fluorophore TAMRA modifié par click chemistry CuAAC (seconde étape) (comparer la figure 3). L'analyse de la réaction de marquage est effectuée par SDS-PAGE et détection de la fluorescence sur gel (Figure 5A). Le dosage (piste 1) montre une bande fluorescente correspondant à l'histone H3 indiquant que la chaîne latérale du cofacteur a été transféré avec succès et la protéine modifiée marqué avec le fluorophore TAMRA. Aucune bande sont visibles dans le "cofacteur" et des contrôles "de l'enzyme" (lignes 2 et 3) démontrant que l'étiquetage de l'histone H3 est médiée par le MTase. Par conséquent, l'étiquetage des produits chimiques non spécifique soit par le cofacteur seul (première étape) ou pendant CuAAC (deuxième étape) peut être exclue. Le contrôle "cofacteur" est effectuée differently que dans le protocole pour une étape marquage d'ADN. Ce est parce que la précipitation de l'histone H3 est plus efficace en présence d'Set7 / 9 et en omettant la protéine MTase peut conduire à des quantités réduites de l'histone H3 dans la commande de chargement. Ainsi, nous avons ajouté une forte concentration de l'AdoMet cofacteur naturel de rivaliser avec SeAdoYn. Chargement de l'histone H3 peut être facilement contrôlé par coloration du gel au bleu de Coomassie après la détection de la fluorescence.

MTAse substrats peuvent également être marqués avec de la biotine à la place de fluorophores à l'aide de biotine azide en dérivé dans la seconde étape de 30 chimique. Biotinylation de protéines est idéalement analysés par Western blot avec la peroxydase de raifort conjugué avidine. Ceci est représenté sur la figure 5B pour la biotinylation de l'histone H3 avec Set7 / 9, et la biotine SeAdoYn azoture modifié. Le dosage dans la piste 1 montre une bande claire pour la histone H3 marqué. L'absence de bandes dans la "enzyme" (piste 2)et "cofacteur" contrôle (piste 3) démontre une nouvelle fois que l'étiquetage est spécifique pour la MTase. La commande "cofacteur" est simplement réalisée en l'absence de protéine MTase parce que l'analyse Western blot ne nécessite pas l'enlèvement de l'excès de biotine par précipitation des protéines.

Figure 5
Figure 5: Étiquetage de l'histone H3 avec la protéine MTase Set7 / 9 et SeAdoYn suivie par clic réactions avec des étiquettes de azoture dérivé. A. Dans la fluorescence-gel du TAMRA marqué histone H3 et les contrôles ainsi que la coloration au bleu de Coomassie pour le contrôle de chargement. B. analyse Western blot des biotinylé histone H3 et les contrôles à l'aide de l'avidine-peroxydase de raifort (HRP). Les conditions expérimentales étaient très similaires à ceux pour le marquage de fluorescence dans A (modification enzymatique: 6,581; M histone H3, 10 uM Set7 / 9, 600 uM SeAdoYn, dans 50 mM de Tris-HCl, 5 mM de MgCl2, 5% de glycerol, pH 9,0, 30 ° C, 3 h; étiquetage chimique:. 0,6 mM CuSO 4, 0,6 mM THPTA, l'ascorbate de sodium à 50 mM, 1,2 mM biotine-azoture, 37 ° C, 1 h) Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Étiquetage en une seule étape de l'ADN avec MTases d'ADN et des cofacteurs d'aziridine (ADN Sourire) est une méthode robuste mais certains aspects doivent être considérés lors de la planification de l'expérience.

Cofacteur aziridine: La concentration 6BAz pour l'étiquetage d'ADN avec M.BseCI était de 60 uM. Lors de l'utilisation d'autres MTases ADN la concentration de cofacteur doit être optimisée, par exemple des concentrations aussi faibles que 20 uM ont été employées avec l'ADN MTase M.TaqI 19. De faibles concentrations 6BAz ont l'avantage qu'un excès quadruple de streptavidine (les sites à l'égard de la totalité du montant de la biotine dans le test de liaison) peut être ajouté directement après incubation avec Rease sans interférer avec l'analyse par l'EMSA. Autrement doit être purifié l'ADN biotinylé pour éliminer l'excès et éviter étalement cofacteur de l'ADN durant l'électrophorèse sur gel d'agarose. Lors de l'ajout de cofacteurs aziridine partir de solutions mères dans du DMSO se assurer que la concentration finale de DMSO dans ee essai est inférieure à 5%. Trop peut DMSO inactiver les enzymes. Toujours stocker aziridine cofacteurs à -80 ° C pour éviter la dégradation.

ADN MTase: couplage enzymatique de cofacteurs d'aziridine avec de l'ADN peut conduire à des inhibiteurs de produits solides et les MTases ADN doivent être utilisés en quantités stoechiométriques. Par conséquent toujours utiliser plus de 1 équivalent de l'ADN MTase. La plupart des MTases ADN copurify avec AdoMet lié qui doit être éliminé par dialyse poussée ou le lavage des enzymes sur une colonne avec de grands volumes de tampon. Le contrôle "enzymatique" dira si AdoMet est toujours présent dans la préparation enzymatique. Le marquage avec M.BseCI peut également être effectuée par incubation pendant une nuit à 37 ° C.

tampon de modification: 10 Ajouter les ions mM de magnésium dans le tampon pour empêcher des réactions non-spécifiques des cofacteurs d'aziridine avec l'ADN. Si des ions magnésium conduisent à l'activation des nucleases contaminantes, des ions baryum peuvent être ajoutés à la place.

Pour le marquage spécifique de la séquence de l'ADN non seulement Sourire ADN mais aussi MTAG peut être employé. Voici deux cofacteurs activés sont utilisés pour le transfert enzymatique des chaînes latérales avec des groupes fonctionnels uniques à l'ADN. Ces groupes fonctionnels, les amines primaires par exemple, peuvent être modifiés avec une grande variété de groupes rapporteurs, y compris la biotine ou fluorophores, par la chimie ester NHS dans une deuxième étape 8,35,36. Sinon, nous avons commencé à synthétiser des analogues doubles AdoMet activés avec de grandes chaînes latérales contenant déjà le groupe rapporteur et les a utilisés pour le marquage de l'ADN en une étape.

Les deux étapes MTAG procédure de labellisation pour les protéines avec la double cofacteur activé SeAdoYn a été utilisé avec succès un certain nombre de MTases de protéines 30,31. Cependant, les observations suivantes doivent être envisagées avant d'effectuer l'expérience.

Double cofacteur activé: Ces cofacteurs, y compris la merdoYn, sont stockés dans des conditions acides et des soins doivent être pris que le pH de la solution de modification ne change pas de manière significative lors de l'ajout de cofacteur. On vérifie toujours le pH en ajoutant 1 ul de la solution de modification à une bande de pH et, si le pH est trop faible, ajouter de petites quantités de solution d'hydroxyde de sodium (50 mM) pour ajuster le pH. En plus des analogues de cofacteurs doivent être ajoutées dans un volume faible pour éviter des changements de pH. Ainsi, les concentrations de cofacteur minimales nécessaires à la modification complète devraient être déterminés pour d'autres MTases et solutions cofacteur d'achat d'actions à forte concentration sont préférés. Les concentrations de cofacteurs sont typiquement varier entre 10 uM et 600 uM. La synthèse chimique des doubles cofacteurs activés donne typiquement un d'environ 1: 1 mélange d'épimères au niveau du soufre ou du sélénium et la séparation de l'épimère biologiquement active, correspondant à l'épimère S de l'AdoMet, de l'épimère inactif est souvent difficile à réaliser. Ainsi, les concentrations de cofacteurs sontgénéralement donnée pour un mélange d'isomères. Double analogues de cofacteurs activés sont très instables à température ambiante et doivent être conservés à -20 ° C. Veillez aussi à dégeler les solutions d'achat d'actions sur la glace et garder au froid pendant le pipetage. Ils peuvent être congelés à nouveau, mais pour assurer l'activité reproductible nous vous recommandons de faire aliquotes.

Protein MTase: Pour les transformations avec des cofacteurs doubles activées les MTases peuvent être utilisés en quantités catalytiques. Cependant, MTases sont souvent lents enzymes dont le nombre de chiffre d'affaires dans le min -1 gamme avec le AdoMet cofacteur naturel. Pour des raisons pratiques, nous utilisons souvent les MTases en quantités stoechiométriques et minimiser le temps d'incubation et de la température (généralement de 10 minutes à 2 heures et 20 ° C à 37 ° C). La commande "cofacteur" varie en fonction du type de groupe rapporteur et la détection. Pour le marquage de biotine MTase est simplement omise et l'analyse peut être effectuée par Western blot (Figure 5B (figure 5A). Toutefois, si les précipitations de l'histone H3 conduit à la perte de protéines, SDS-PAGE peut être étendue et l'excès du libre fluorophore TAMRA se déroulera du gel avec le front bleu de bromophénol.

un tampon de mise à jour: Le tampon d'enzyme optimale peut être utilisé, mais les thiols, comme le dithiothréitol (DTT) et β-mercaptoéthanol, doivent être évités. Ils se lient aux ions de cuivre et b verrouiller le CuAAC clic réaction suivante.

CuAAC cliquez réaction: La concentration finale de TAMRA azoture devrait être deux fois plus élevée que la concentration alcyne. Lors de l'utilisation d'extraits biologiques de la concentration de cuivre et le ligand doit être augmentée jusqu'à 5 mM chacune. TAMRA azoture est mieux solubles dans le DMSO que dans l'eau. Se assurer que la concentration finale de DMSO est inférieure à 12%. Temps d'incubation prolongées peuvent conduire à des dommages de protéines et de bavures sur le gel de polyacrylamide SDS. Ainsi, la réaction de marquage doit être arrêté soit par précipitation de la protéine ou addition de thiols.

Cette procédure de marquage en deux étapes peut également être utilisé pour étiqueter des substrats de protéine avec de la biotine MTAse soit pour la détection par Western blot (figure 5B) ou d'isolement avec des billes magnétiques revêtues de streptavidine. En outre, les doubles AdoMet analogues actifs peuvent être utilisés pour marquer l'ADN, de l'ARN et de petits produits naturels avec MTases correspondants.

ve_content "> En comparaison à la plupart des autres méthodes de marquage des acides nucléiques et des protéines, l'étiquetage MTase médiée présente l'avantage que les substrats natifs peuvent être directement utilisés, et aucune autre modification ne est requise. Bien entendu, il faut veiller à ce que les substrats naturels ne sont pas bloqués par méthylation par une MTase correspondant in vivo. En outre, l'étiquetage MTase médiation est très flexible en termes de groupes rapporteurs, qui comprennent la biotine, des fluorophores ou autres balises moléculaires, ainsi que des objectifs pour MTases. REBASE, une base de données pour la restriction endonucléases et ADN MTases, énumère plus de 700 caractérisé expérimentalement MTases ADN avec des centaines de différentes séquences de reconnaissance allant de deux à huit pb 37 et il est prévu que plus de 200 MTases différents de tous les types sont produites dans la cellule humaine 38. Un facteur important pour l'activité MTase est de savoir si l'analogue AdoMet se insère dans le site actif de l'enzyme. Bien que les cofacteurs présentés 6Baz et SeAdoYn sont conçus pour avoir des petits groupes réactifs, certains MTases peuvent pas facilement accepter. Dans ces cas, les sites actifs pourraient être agrandies en ingénierie des protéines comme cela a été démontré pour l'ADN 35, 23 et MTases ARN en protéines de 25 à 28 avec encombrement plus exigeantes doubles analogues AdoMet activés.

marquage spécifique de la séquence de l'ADN et de l'ARN avec des analogues AdoMet est d'un intérêt majeur pour le génotypage (cartographie de l'ADN) 36 et la méthylation de détection 39, des études fonctionnelles de l'ADN / ARN et ADN / enzymes à ARN modifiant 15 ainsi que pour les (nano) biotechnologie 13, 14 et la livraison de gènes 19. D'autres méthodes de séquence spécifique d'ADN étiquetage covalente comptent sur oligodéoxynucléotides synthétiques triple hélice formant, acides nucléiques peptides ou des polyamides en épingle à cheveux en tant que dispositifs de ciblage ou séquence endonucléases de césure spécifiques (NEases), suivie par nick étiquetage de traduction. 37) est limitée ce qui rend l'étiquetage ADN MTase médiée plus générale.

Un étiquetage spécifique des protéines avec doubles analogues AdoMet activées a été principalement orientée vers les applications dans la recherche protéomique, par exemple l'identification de nouveaux substrats pour MTases de protéines dans des mélanges biologiques complexes 27,28, mais d'autres applications, comme des études fonctionnelles, devrait également être possible. Bien que l'étiquetage MTase médiée a été effectuée principalement avec MTases purifiées in vitro, l'étiquetage peut également être réalisée dans des cellules vivantes comme cela a été rapporté récemment 40. Bien sûr, de nombreuses autres méthodes pour l'étiquetage de protéine spécifique sont disponibles 3,4. Outre l'incorporation d'acides aminés non naturels à l'aide de cellules modifiées ils exigent habituellement des fusions génétiques de la protéine d'intérêt avec des étiquettes auto-étiquetage / proteins ou des étiquettes pour l'étiquetage de médiation enzymatique. A cet égard courtes séquences peptidiques agissant comme des substrats pour MTases de protéines, par exemple des queues d'histone N-terminaux, peuvent être fusionnés à une protéine d'intérêt et plus particulièrement des analogues marqués avec AdoMet et MTases protéiques correspondantes.

Enfin, le répertoire biocatalytique de petites MTases molécules peut être étendue avec AdoMet analogues synthétiques 41-44. Cela représente une nouvelle approche pour introduire la diversité structurelle en produits naturels, par exemple des antibiotiques ou polykétides, qui devrait trouver des applications intéressantes dans le dépistage pour les nouveaux activités biologiques.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
6BAz Synthesized according to Weinhold et al., Patent number US 8,129,106, published March 6, 2012.
β-Mercaptoethanol Serva 28625
Acetic acid Fisher Scientific 10304980
Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 Serva 10688
UltraPure Agarose Invitrogen 16500100
Ammonium persulfate (APS) Serva 13375
Bis-Tris Gerbu 1304
Boric acid Gerbu 1115
Bromophenol blue Na salt Serva 15375
Copper(II) sulfate Aldrich C1297
Chloroform Fisher Scientific 10020090
Coomassie Brilliant Blue Serva 17525
EDTA disodium salt Gerbu 1034
Ethanol Merck 100983
GelRed (10,000x in water) Biotium 41003
Glycerol (99.5%) Gerbu 2006
FastRuler Low Range DNA Ladder Thermo Scientific SM1103
Histone H3 Expression plasmid obtained from Dr. Philipp Voigt and Prof. Danny Reinberg; expression and isolation according to T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311.
M.BseCI Expression plasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14.
Methanol Fisher Scientific 10675112
Magnesiumchloride  hexahydrate J.T. Baker 4003
MOPS Gerbu 1081
Sodium chloride Gerbu 1112
pH strip (Neutralit) Merck 1,095,330,001
pBR322 Thermo Scientific SD0041
R.TaqI (10 u/µl) Thermo Scientific ER0671
SeAdoYn Synthesized according to Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.
Set7/9 Expression plasmid obtained from Prof. Danny Reinberg, expression and isolation according to D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489.
Streptavidin Gerbu 3058
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma Life Science A7631
SDS Granular Gerbu 1833
di-Sodium hydrogenphosphate Merck 106,586
TAMRA azide Synthesized according to reference 30: Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.
TaqI buffer (10x) Thermo Scientific B28
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Acros Organics 42058
Tris-HCl Gerbu 1028
Tris-X (TRIS-base) Gerbu 1018
Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA) Sigma-Aldrich 762342

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