على نطاق واسع اسماك الزرد الجنينية القلب تشريح لتحليل الترانسكربتي

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

لتحليل القلب ملامح التعبير الجيني أثناء نمو القلب الزرد، لابد من استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من قلوب معزولة. هنا، نقدم بروتوكول لجمع وظيفية / قلوب الضرب السريع تشريح اليدوي من أجنة الزرد الحصول مرنا القلب محددة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lombardo, V. A., Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis. J. Vis. Exp. (95), e52087, doi:10.3791/52087 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

يتكون القلب الجنينية الزرد فقط بضعة مئات من الخلايا، التي تمثل سوى جزء صغير من الجنين بأكمله. لذلك، لمنع Transcriptome على القلب من أن تقنع من خلال Transcriptome على الجنينية العالمي، فمن الضروري لجمع أعداد كافية من قلوب لمزيد من التحليلات. وعلاوة على ذلك، مع استمرار التطور القلب الزرد بسرعة، وجمع القلب وطرق استخراج الحمض النووي الريبي تحتاج إلى أن تكون سريعة لضمان تجانس العينات. هنا، نقدم اليدوي السريع بروتوكول تشريح لجمع وظيفية / قلوب الضرب من الأجنة الزرد. هذا هو شرط أساسي لاحق القلب محددة استخراج الحمض النووي الريبي لتحديد مستويات القلب محددة التعبير الجيني عن طريق تحليل Transcriptome على مثل الكمي في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل (RT-QPCR). وتستند هذه الطريقة على الخصائص التفاضلية لاصقة من القلب الجنينية الزرد مقارنة مع الأنسجة الأخرى. وهذا يسمح للفيز السريعالفصل sical من القلب من أنسجة extracardiac من قبل مجموعة من فلويديك تعطيل قوة القص، والترشيح تدريجي وجمع اليدوي المعدلة وراثيا قلوب fluorescently المسمى.

Introduction

ويستخدم الزرد (دانيو rerio) على نطاق واسع في علم الأحياء التنموي لدراسة توالد الأعضاء في الجسم الحي بسبب تطورها الجنيني سريعة وشفافة وخارج الرحم، جنبا إلى جنب مع صغر حجمها وتوافر خطوط مراسل المعدلة وراثيا مع التعبير الأنسجة محددة من البروتينات الفلورية. بشكل خاص يناسب هذا الفقاريات الصغيرة بشكل جيد لدراسة تطوير القلب بسبب الأوكسجين للجنين الزرد في وقت مبكر لا تعتمد على ضربات القلب وتدفق الدم. وقد سمحت هذه الميزات توصيف أعداد كبيرة من المسوخ القلب والأوعية الدموية 1،2 والزرد هو الآن كائن نموذج المعترف بها على نطاق واسع لدراسة أمراض القلب 3.

لدراسة التعبير الجيني أثناء التطور الجنيني، ويتم تحليل النصوص عادة من قبل جبل لالجامع في الموقع التهجين (WISH) 4، وRT-QPCR 5، 6 ميكروأرس، أو الجيل القادم التسلسل (RNA تسلسل) 7. في حينWISH يسمح للتحليل المكاني الزماني للالتعبير الجيني داخل الجنين بأكمله، يتم تقييمها عادة مستويات النص التي كتبها RT-QPCR، ميكروأرس أو النهج RNA يليها. ومع ذلك، وهذه الأساليب تتطلب تخصيب الأنسجة لمحدد التنميط التعبير الجيني.

منذ القلب الجنينية الزرد يمثل جزءا صغيرا من جنين كامل، ودراسات Transcriptome على أثناء التطور القلب تتطلب بروتوكول للتشريح وإثراء القلوب. وبالإضافة إلى ذلك، للحصول على البيانات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية، من المهم للحفاظ على نسيج القلب تعمل بكامل طاقتها حتى استخراج الحمض النووي الريبي. هنا، نحن تصف بروتوكول للعزل بسرعة طبيعية من الناحية الفسيولوجية وضرب قلوب من مئات الأجنة الزرد الحصول على عينات الحمض النووي الريبي جودة عالية بكفاءة لمزيد من التحليلات. ويستند هذا الأسلوب على بروتوكول ذكرت من قبل بيرنز وماكراي 2006 8. لإثراء الأنسجة القلبية، سواء طرق استخدام خط مراسل عضلة القلب المعدلة وراثياوالاستفادة من الخصائص التفاضلية التصاق قلوب الجنينية الزرد مقابل الأنسجة الأخرى. لفترة وجيزة، قبل pipetting العديد من الأجنة صعودا وهبوطا من خلال طرف ماصة ضيق، يتم الإفراج قلوب في وقت واحد من الهيئات الجنينية وبعد ذلك فصل من الحطام الجنينية في خطوتين الترشيح السريعة؛ ثم يتم فرز قلوب fluorescently المسمى يدويا من الحطام المتبقي وجمع لمزيد من المعالجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من القانون الألماني والدولة برلين. تم رصد معالجة الزرد من قبل السلطة المحلية لحماية الحيوان (LaGeSo، برلين-براندنبورغ).

1. الحصول على اسماك الزرد الأجنة لاستخراج القلب

  1. عبر مراسل القلب الزرد مثل تيراغرام (myl7: EGFP) twu34 خط المعدلة وراثيا 9 من أجل الحصول على أجنة مع القلب محدد GFP التعبير.
  2. الحفاظ على الأجنة في الماء البيض في 28.5 درجة مئوية حتى المرحلة الجنينية المطلوب 10،11. ضمان حصول السكان الجنين جمعت متجانس على حد سواء وراثيا ومرحلة تنموية للحد من الاختلافات في التعبير الجيني.
  3. Dechorionate الأجنة يدويا.

2. تشريح الزرد الجنينية قلوب

ملاحظة: حافظ على كل الحلول على الجليد. إذا كان ذلك ممكنا، هل العمل الجماعي: شخص واحد يشرح قلوب من الإدارة الانتخابيةryos بينما شخص آخر فرز قلوب تحت stereomicroscope مضان. وهذا يسمح للتجهيز عدة مئات من الأجنة في غضون ساعات قليلة.

  1. نقل حوالي 100 الأجنة في أنبوب 1.5 مل الطرد المركزي. تخدير الأجنة مع تريكين (0.16 ملغ / مل في E3 المتوسطة). المضي قدما مرة واحدة يتم تخدير الأجنة بشكل واضح (لا السباحة والرواسب إلى أسفل الأنبوب، ولكن قلوبهم لا تزال الضرب).
  2. إزالة تريكين / E3 حل ويغسل الأجنة مرة واحدة مع 1 مل L-15/10٪ FBS المتوسطة والحفاظ على الجليد.
    ملاحظة: متوسطة FBS L-15/10٪ مهم للحفاظ على الأجهزة والخلايا على قيد الحياة أثناء إجراء تشريح كامل حتى تم نقل القلوب إلى RNAlater أو Trizol.
  3. إضافة 1 مل L-15/10٪ FBS المتوسطة إلى الأجنة وماصة صعودا وهبوطا 5-8 مرات مع جولة جل تحميل تلميح حتى يتم تعطيل صفار البيض تماما. ماصة الأجنة انخفاض الحكيم على سطح من الحل، حتى أن انخفاض سوف تنفجر وتتعطل الأجنة بلطف.
    ملاحظة: كيف بقوة وعدد المرات الأجنة يجب أن pipetted صعودا وهبوطا يعتمد على المرحلة التنموية للأجنة، هناك حاجة إلى أي مزيد من pipetting لفي مراحل متأخرة (على سبيل المثال في 56 HPF).
  4. لأول دفعة من الأجنة تشريح، وتقييم سلامة الأجنة ونسبة قلوب تشريح تحت stereomicroscope، منذ بعض القلوب قد تبقى تعلق على الأجنة إذا pipetted بلطف جدا. ضبط طريقة pipetting لللجولات المقبلة من تشريح وفقا لذلك.
    ملاحظة: استخدم منخفضة نصائح ماصة والاحتفاظ أنابيب microcentrifuge للحد من قلوب التمسك البلاستيك.
  5. تطبيق العينة على مرشح 100 ميكرون وضعت على أنبوب 50 مل الطرد المركزي. شطف أنبوب 1.5 مل مع 1 مل L-15/10٪ FBS المتوسطة ومن ثم تطبيق هذا إلى تصفية من أجل تقليل الخسائر في العينة (بعض القلوب قد تكون شائكة على جدران الأنبوب). غسل الفلتر مرتين مع 1 مل L-15 / 10٪ FBS. في هذه الخطوة قلوب تمر من خلال مرشح ويتم جمعها في أنبوب 50 مل.
  6. تطبيق التدفق من خلال الصعود إلى 30 ميكرون فلتر وضعت على أنبوب الطرد المركزي 15 مل وشطف مرشح مرة واحدة مع 1 مل L-15/10٪ FBS المتوسطة. في هذه الخطوة الترشيح الثانية، يتم الاحتفاظ قلوب في تصفية ويتم غسلها أصغر الحطام قبالة.
  7. تحويل مرشح رأسا على عقب وتدفق قلوب من مرشح إلى 1٪ المغلفة الاغاروز طبق بتري من خلال تطبيق ثلاث يغسل متتالية مع 1 مل L-15/10٪ FBS.
  8. فصل يدويا قلوب GFP إيجابية من تحت الانقاض الجنينية nonfluorescent (مثل عدسات العين) مع زوج من ملقط تحت stereomicroscope مضان والتركيز عليها في وسط الطبق. جمعها وفقا لالخطوة 3.
    ملاحظة: إذا الأجنة تكون أقدم من 24 HPF، وقلوب يجب الضرب، مشيرا إلى أن الأنسجة لا تزال طبيعية من الناحية الفسيولوجية.

3. عزل مرنا من Dissecتيد القلوب

  1. جمع قلوب في أصغر حجم ممكن (على سبيل المثال 10 ميكرولتر) وماصة في أنبوب 1.5 مل تحتوي على 0.75 مل RNAlater (على الجليد). تحقق من أن لا قلوب لا تزال في الطرف ماصة عن طريق عرض عليه تحت stereomicroscope مضان.
  2. بدلا من ذلك، إذا غطاء الكيميائية يوجد في الجوار المباشر لالمجهر مضان، ونقل قلوب جمعها في Trizol (تنبيه) تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية. هذا تلتف احتمال خسارة قلوب العالقة في الطرف ماصة وأيضا أثناء الطرد المركزي من قلوب (الخطوات 3.4 و 3.5 و 3.7). تجمع قلوب من عدة جولات من العزلة في نفس أنبوب مع Trizol وانتقل مباشرة إلى الخطوة 3.8. يجب أن لا تتجاوز الحجم النهائي 10٪ من حجم Trizol الأصلي.
    ملاحظة: اقرأ Trizol المواد ورقة بيانات السلامة (MSDS) قبل الاستخدام. التعامل مع Trizol كاشف تحت غطاء محرك السيارة وارتداء أوصى معدات الحماية الشخصية. تجنب ملامسة الجلد والعينين وclothiنانوغرام. إزالة جميع مصادر الإشعال.
  3. تجمع قلوب من عدة جولات من العزلة في نفس أنبوب مع RNAlater (على الجليد)، وكفاءة عزل الحمض النووي الريبي يحسن مع كمية من الأنسجة التي تم جمعها. إذا تجاوز إجمالي حجم العينة 10٪ من حجم RNAlater الأصلي، استخدام أنبوب إضافي مع 0.75 مل RNAlater للتخزين (على الجليد).
  4. أجهزة الطرد المركزي العينات في 15،700 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية إلى الرواسب القلوب.
  5. تحت stereomicroscope مضان، وجمع بعناية بقدر طاف وقت ممكن إلى 1٪ المغلفة الاغاروز طبق بتري تحتوي على 3 مل L-15/10٪ FBS المتوسطة، ولكن لا تزعج قلوب الرسوبية في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي. منذ ما يصل الى 15٪ من قلوب يمكن أن تبقى في طاف بسبب اللزوجة العالية من RNAlater، استرجاعها كما هو موضح في الخطوة 3.7.
  6. تحت غطاء الكيميائية، إضافة 0.5 مل Trizol إلى الأنبوب الذي يحتوي على قلوب الرسوبية والحفاظ على الجليد.
  7. تحت microsco الفلورسنتالمؤسسة العامة، ونقل قلوب (من الخطوة 3.5) من الطبق المغلفة الاغاروز 1٪ تحتوي على حل FBS RNAlater / L-15/10٪ في طبق آخر 1٪ المغلفة الاغاروز مع 3 مل L-15/10٪ FBS لتمييع خارج RNAlater. جمع قلوب في وسط طبق بتري ونقلها في حجم صغير في أنبوب للقلوب الرسوبية في Trizol تحت غطاء الكيميائية.
  8. دوامة أنبوب 1.5 مل تحتوي على القلوب في Trizol لتعطيل قلوب واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  9. تحت غطاء الكيميائية، إضافة 100 ميكرولتر الكلوروفورم (تنبيه)، تخلط جيدا ونقل الحل / الكلوروفورم Trizol إلى 1.5 مل نسج قبل PLG أنبوب (أجهزة الطرد المركزي 30 ثانية في أقصى سرعة قبل الاستخدام). احتضان لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: اقرأ MSDS الكلوروفورم قبل الاستخدام. التعامل مع الكلوروفورم كاشف تحت غطاء محرك السيارة وارتداء أوصى معدات الحماية الشخصية. تجنب ملامسة الجلد والعينين والملابس. الابتعاد عن المتضادين مثل المعادن والقلويات.
  10. Centrifuجنرال الكتريك العينة في 15،700 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية، ونقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد 1.5 مل.
  11. إضافة 5-10 ميكروغرام الجليكوجين و 250 ميكرولتر precooled (-20 ° C) الأيزوبروبانول. تخلط جيدا واحتضان أكثر من ليلة في -20 ° C.
  12. الطرد المركزي العينة في 15،700 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف.
  13. غسل بيليه مع 1 مل 75٪ من الإيثانول، الطرد المركزي في 15،700 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف.
  14. السماح للتتبخر الإيثانول عن طريق تجفيف بيليه في درجة حرارة الغرفة حتى يصبح أبيض (على سبيل المثال لمدة 10-15 دقيقة).
  15. إضافة 20 ميكرولتر ريبونوكلياز خالية DDH 2 O لبيليه واحتضان لمدة 10-15 دقيقة في 55 ° C بحل RNA. ثم الحفاظ على الجليد.
  16. تقييم تركيز الحمض النووي الريبي والنقاء التي كتبها قياس الامتصاصية. تقييم سلامة الحمض النووي الريبي عن طريق تشغيل العينة على هلام الاغاروز 1٪.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هنا، نحن تصف تمثيلية تجربة تشريح القلب باستخدام الزرد تيراغرام (myl7: GFP) twu34 خط المعدلة وراثيا الذي يعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) حصرا داخل عضلة القلب (الشكل 1). جمعنا كل من قلوب تشريح والأجنة من التي كانت تستمد لتقييم نقاء العينة القلب. لفترة وجيزة، متماثل تيراغرام (myl7: GFP) twu34 الزرد 9 تم outcrossed مع من النوع البري حتى يتسنى لجميع قلوب الجنينية تم GFP المسمى. تم نقل نحو 500 الأجنة (56 HPF) إلى 1.5 مل أنابيب (حوالي 100 الأجنة في كل منهما) (الشكل 1A1، 1B). تمت معالجة كل أنبوب كما هو موضح في القسم بروتوكول (الخطوة 2) وفي الشكل 1A. وأفرج عن قلوب pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات (الشكل 1A2) ثم تطبيق على 100 ميكرون فلتر (الشكل 1A3). تم الإبقاء قطع كبيرة من الأنسجة الجنينية في هذا الفلتر. تم استرجاع هذا الكسر ووضعها في Trizol FOاستخراج الحمض النووي الريبي r ليحصل على "الجنين دون القلب" عينة الحمض النووي الريبي (الشكل 1A3). ثم كان من خلال تدفق تحتوي على قلوب تطبق على مرشح 30 ميكرون (الشكل 1A4)، التي احتفظت قلوب والأنسجة الحطام مشابهة من حيث الحجم. تم مسح قلوب GFP إيجابية من مرشح إلى طبق بتري المغلفة الاغاروز (الشكل 1A5، 1C)، وجمعت بسرعة في منتصف الطبق تحت stereomicroscope الفلورسنت ونقلها إلى 0.75 مل RNAlater (الشكل 1A6). داخل هذا الأنبوب مع RNAlater، فإننا المجمعة قلوب مستمدة من 5 جولات تشريح (حوالي 300 قلوب من 500 الأجنة يمثل كفاءة استخراج حوالي 60٪). وأظهرت مقارنة بين عينات القلب قبل الفرز من تحت الانقاض من أجنة في 56 HPF (الشكل 1C) مقابل 36 HPF (الشكل 1C ') في الشكل 1. في 56 HPF، تعطل الأجنة أسفرت عن الحطام أكثر الجنينية ( مثل العدسات، رأس السهم، الشكل 1C) مما كانت عليه في 36 HPF بعد الترشيح خطوة 30 ميكرون (الشكل 1C).

لتحديد نقاء 56 HPF "قلب" عينة، قارنا مستويات التعبير عن القلب مقابل النصوص خارج القلب في "قلب" و "الجنين دون القلب" العينات بواسطة RT-QPCR. تحقيقا لهذه الغاية، فإننا استخراج مرنا من تلك العينات اثنين وتقييم نوعية RNA على agarose هلام (الشكل 2A)، والكمية التي كتبها قياس الامتصاصية (الجدول 1) كما هو موضح في قسم البروتوكول (الخطوة 3). وتقريبا. حققت 300 قلوب 660 نانوغرام RNA. وبعد ذلك، تم تصنيعه باستخدام [كدنا M-MLV عكسي الناسخ ريبونوكلياز H (-) وhexamers عشوائي وفقا لتعليمات Manufacturer's، وأجريت التجارب RT-QPCR كما هو موضح 12. تم حساب مستويات التعبير الجيني النسبية للعلامات الأنسجة محددة مختلفة مثل ضوء ميوسين ببتيد 7 [myl7، علامة عضلة القلب] كيناز مستقبلات مجال إدراج مثل [kdrl، وهو البطانية / علامة الشغافية] 13، الهيموجلوبين الجنينية بيتا-1.1 [hbbe1.1، علامة كرات الدم الحمراء] 14، غلوبولين العدسة ألفا A [cryaa، عدسة العين علامة] 15، وييفي الدبقية الحمضية البروتين [GFAP، نظام علامة العصبي المركزي] 16 (الشكل 2B). في حقيقية النواة عامل الترجمة بدء الزرد 1B [eif1b] 12 تم استخدامها بوصفها الجينات المرجعية الداخلية (انظر الجدول رقم 2 للأرقام بنك الجينات ID، متواليات التمهيدي، أحجام المنتج PCR وخصوصية النسيج لكل الجينات). كما هو متوقع، تم إثراء myl7 عالية في "قلب" عينة مقارنة "الجنين دون القلب" عينة (الشكل 2B). تم العثور على البطانية علامة الخلية kdrl لتخصيبه بدرجة متوسطة في العينة القلب، كما هو متوقع (حوالي 40٪ من خلايا القلب في 56 HPF و-expressing kdrl الخلايا داخل القلب) (الشكل 2B). تم تمثيل زائد في hbbe1.1 كرات الدم الحمراء علامة في "قلب" عينة، على الرغم من أن القلوب كانت الحاديالضرب بالمرض بعد تشريح، والتي ينبغي طرد خلايا الدم الحمراء من القلب (الشكل 2B). في المقابل، كانت مستويات التعبير في الجهاز العصبي المركزي وعلامات عدسة (GFAP وcryaa، على التوالي) منخفضة للغاية في "قلب" عينة (الشكل 2B). وإجمالا، فإننا نستنتج أن عائدات بروتوكول تشريح القلب جودة عالية وRNA القلب محددة من الأجنة الزرد بأكملها.

الشكل (1)
الشكل 1. استخراج القلب من الأجنة الزرد. (A) مخطط تصور إجراء استخراج القلب. وتجمع نحو 100 الأجنة الحية في أنبوب 1.5 مل (A1، B، B ')، تخدير ثم pipetted صعودا وهبوطا عدة مرات من خلال طرف ماصة الضيق للافراج عن قلوب (A2). ثم يتم تطبيق الحل الناتج يحتوي على الأنسجة الجنينية (A2) على مرشح 100 ميكرون (A3). الأنسجة الجنينية دون صفار البيض وحتبقى earts، والحطام الجنينية كبير في فلتر (A3). ويتم جمع من خلال تدفق في أنبوب 50 مل (A3) ثم تطبق على 30 ميكرون فلتر (A4). يتم الاحتفاظ قلوب والحطام صغيرة في تصفية 30 ميكرون ونقل الى المغلفة الاغاروز بتري صحن صغير (A5، C، C '). يتم فرز يدويا من تحت الانقاض المتبقية، مثل العدسات (C، رأس السهم)، ويتم جمع في RNAlater (A6)؛ EGFP قلوب المسمى (السهم C، C '). ويتكرر هذا الإجراء لا يقل عن 5 مرات ويتم تجميع كل القلوب معا لمزيد من المعالجة. (BC ') تراكب من مضان (EGFP باللون الأخضر) والصور الحية المعدلة وراثيا من تيراغرام (myl7: EGFP) DIC twu34 أجنة في 56 HPF (B، C) و 36 HPF (B، C') في خطوتين من القلب إجراء تشريح: قبل تشريح الجنين (B، B ') وبعد التنظيف من مرشح 30 ميكرون، قبل فرز قلوب من تحت الانقاض في طبق بتري (C، C'). شريط مقياس: 500 ميكرون.

الشكل 2
الشكل 2. تحليل الحمض النووي الريبي الجودة والنقاء من قبل الكهربائي وRT-QPCR، على التوالي. (A) إجمالي RNA من "قلب" عينة (2 ميكرولتر) ومن "الجنين دون القلب" عينة (1 ميكرولتر)، والمستمدة من 56 الأجنة HPF، تحل على هلام الاغاروز 1٪. وتشير بارزة S18 S28 والرنا الريباسي العصابات التي الرنا لا تتحلل. (B) مستويات التعبير النسبية للmyl7 علامات محددة الأنسجة (عضلة القلب)، kdrl (البطانة)، hbbe1.1 (الكريات الحمراء)، cryaa (عدسة)، وGFAP (CNS) على النحو الذي يحدده RT-QPCR ل"قلب" عينة تطبيع إلى "الجنين دون القلب" عينة. وأجريت التجارب RT-QPCR كما يثلث الفنية وتعطى البيانات كما يعني ± SEM. تم إجراء تحليل اختبار t أونبايريد. **** ف <0،0001. ** ص <0005. بي بي، زوج قاعدة.

ID عينة نانوغرام / ميكرولتر A260 A280 260/280 260/230 المءشره القيمة المطلقة. 340 الخام
قلوب 32.97 0.82 0.41 2.01 0.35 2،355 0.031
الأجنة دون القلوب 568.82 14.22 7.00 2.03 2.04 6،965 0.018

الجدول 1. كمية RNA والجودة من خلال قياس الطيفي، وكمية ونوعية الحمض النووي الريبي من "قلب" و "الجنين دون القلب" عينات تم الحصول عليها من 56 HPF الأجنة مقاسا الطيفي.

جنرال الكتريكشمال شرق بنك الجينات # تسلسل التمهيدي PCR حجم المنتج (بي بي) علامة الأنسجة محددة
myl7 BX248505 F: 5'-ACAGCAAAGCAGACAGTGAA-3 " 163 عضلة القلب
R: 5'-TAACTCCATCCCGGTTCTGA-3 "
kdrl CR759732 F: 5'-ACAACGACACTGGCATCTAC-3 " 170 البطانة / البطانة
R: 5'-TGTTCTACAGGGGACCACAA-3 "
GFAP BX324157 F: 5'-AGACAACTTGGCCTCAGAC-3 " 247 الجهاز العصبي المركزي
R: 5'-ATCCACATGAACCTGTTGGG-3 "
cryaa BX248514 190 عدسة العين
R: 5'-TCAGACCTCACCTCAGAGAC-3 "
hbbe1.1 BC095024 F: 5'-TGGTTGTGTGGACAGACTTCGA-3 "8 102 كروية حمراء في الدم
R: 5'-CGATAAGACACCTTGCCAGAGC-3 "8
eif1b BX323079 F: 5'-CAGAACCTCCAGTCCTTTGATC-3 "12 195 الجينات المرجعية
R: 5'-GCAGGCAAATTTCTTTTTGAAGGC-3 "12

الجدول 2. الاشعال المستخدمة في التجارب RT-QPCR. يتم إظهار الاسم، وبنك الجينات عدد الانضمام، تسلسل، PCR أحجام المنتج والأنسجة خصوصية لجميع الجينات التي تم تحليلها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هذا البروتوكول يسمح للتخصيب السريع للأنسجة القلب الزرد الجنينية للتعبير الجين يحلل. كمية ونوعية عينة الحمض النووي الريبي القلب محددة يعتمد إلى حد كبير على بضع خطوات حاسمة: أولا، كمية من العينة تحسنت كثيرا إذا تم منع فقدان القلوب في كل خطوة من البروتوكول، منذ تنقية RNA سوف تعمل فقط مع كافية بدءا المادية. الثانية، ونقاء من العينة، التي تعتمد اعتمادا كليا على المجرب، يتم تحديد عن طريق الفرز وجمع قلوب داخل طبق بتري مع استبعاد بدقة الأنسجة الأخرى. ثالثا، جودة العينة يعتمد بشكل كبير على الحد من تدهور RNA التي يمكن أن تحدث على تعطيل الأجنة. ويتحقق ذلك عن طريق استخدام زراعة الخلايا المتوسطة لتجنب موت الخلايا والحفاظ على عينات على الجليد. يتم إيقاف التدهور RNA مرة واحدة وقد تم نقل القلوب إلى RNAlater أو Trizol. ان قلوب والضرب في طبق بتري يدل بقوة على أن ر القلبالمسألة طبيعية من الناحية الفسيولوجية بعد تشريح.

ونحن نوصي بدءا لا يقل عن 300 قلوب (أي حوالي 500 الأجنة)، والتي يكفي RNA يمكن أن يكون بأمان وعجلت (جنبا إلى جنب مع 5-10 ميكروغرام الجليكوجين). ومع ذلك، لا يمكننا استبعاد من عدد أقل من قلوب تكفي لاجراء تجارب على نطاق صغير. هو ببساطة المهم أن يكون RNA كافية لتحديد تركيز والنقاء والنزاهة من العينة. يرجى، لاحظ أن محتويات RNA يمكن أن تختلف تبعا لمرحلة النمو، وعلى الخلفية الوراثية للجنين (على سبيل المثال في حالة من المسوخ مع القلوب غير طبيعية). وبالتالي، فإن الحد الأدنى من الأجنة اللازمة لتجربة يجب أن تحدد في كل حالة على حدة.

هناك بعض الاختلافات الفنية بين هذا البروتوكول وبروتوكول سابق بيرنز وماكراي، ونحن لا أعتقد أن هناك فرقا كبيرا في الكفاءة أو السرعة بين البروتوكولين.ومع ذلك، أدخلنا تحسينات: الأهم من ذلك، فإننا نقترح استخدام حل RNAlater الاستقرار. وهذا أمر مهم لسببين: أولا، لجمع RNA ذات جودة عالية للمزيد من التجارب مثل RT-QPCR عن طريق الحد من تدهور RNA إلى أدنى حد ممكن، كما RNAlater فورا يثبط نشاط RNases واستقرار RNA داخل أنسجة أو خلايا. ثانيا، RNAlater أمر حاسم للسماح جمع القلوب في أيام مختلفة، وهو أمر مهم عندما يكون عدد الأجنة هو العامل المحدد. كما يسمح تجميع قلوب التي قد تكون ضرورية للحصول على كمية كافية من المواد بدءا لعزل كفاءة عالية الجودة RNA مع Trizol. ان نقل قلوب مباشرة في Trizol تجاوز استخدام RNAlater، ولكن نظرا للمخاطر الصحية، هذه الخطوة سيكون لها التي يتعين القيام بها تحت غطاء الكيميائية، والتي لا يمكن أن يفترض أن تكون موجودة في المنطقة المجاورة مباشرة من المجهر مضان لجميع المجربون .

وجدنا رقبعة تشريح القلب يعمل جيدا مع الأجنة بين 20-72 HPF [12؛ بيانات غير منشورة لمدة 72 HPF]. ومع ذلك، يصبح الإجراء استخراج أكثر صعوبة مع زيادة العمر الجنيني وطول: مطلوب إضافية وpipetting لأكثر قوة لتقديم بنجاح الأجنة في تلميح طويلة وللفصل بين قلوب من الأنسجة الجنينية الأخرى. ونتيجة لذلك، والحطام أكثر الجنينية موجود ضمن إعداد العينات (انظر الشكل 1C، C ') والمجرب أن تكون أكثر حذرا في فرز قلوب في طبق بتري.

بروتوكول تشريح القلب المعروضة هنا يسمح تحليل كامل الملف الشخصي التعبير القلب من أنواع مختلفة من الخلايا، بما في ذلك عضلة القلب والبطانة. ويمكن تحقيق مزيد من الفصل بين أنواع الخلايا القلبية باستخدام خطوط endocardial- وعضلة القلب محددة-مراسل [على سبيل المثال تيراغرام (myl7: GFP) twu34 وتيراغرام (kdrl: mCherry is5] 9، 17 لاستخراج القلب جنبا إلى جنب مع FACS الفرز. وعلى النقيض من طريقة الترجمة الريبوسوم الانجذاب تنقية (TRAP) 18،19، والذي يسمح تحليل النسخي الأنسجة محددة دون تشريح الأنسجة، ونهجنا لا تقتصر على من mRNAs ترجم بنشاط، ولكن يشمل أيضا من mRNAs ترجم يست بنشاط أو الرنا غير المكودة. تطبيق بديل للبروتوكول تشريح القلب هو تحليل التعبير البروتين داخل قلوب: يمكن تقييم مستويات البروتين لطخة والبروتين الغربي التعريب يمكن تحليلها من قبل المناعية، كما هو الحفاظ على تشريح القلب أثناء إجراء تشريح.

وباختصار، فإننا نقدم هنا بروتوكول مفصلة لتشريح وظيفية / قلوب الضرب من مئات الأجنة في وقت قصير، والتي يمكن استخدامها للحصول على RNA (أو البروتين) عينات القلب محدد من نقاء عالية لمزيد من التحليلات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment for raising fish and collecting eggs  see the Zebrafish Book11 for details
Fluorescence stereomicroscope
Refrigerated Microcentrifuge
UV-Spectrophotometer e.g. Thermo Scientific Nanodrop 2000
Nucleic acid electrophoresis chamber
Petri dishes 4 cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium
Micropipettes and tips (P20, P100, P1000)
1.5 ml centrifugation tubes
15 ml and 50 ml centrifugation tubes
Pair of Dumont #5 forceps
ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl  Santa Cruz sc-201732
100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) BD Biosciences 352360
30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) Miltenyi Biotec 130-041-407
Phase lock gel, heavy, 1.5 ml tubes  Prime 2302810
Egg water medium 60 μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue
E3 medium  5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) Sigma-Aldrich A-5040 4 mg/ml Tricaine stock solution, pH 7
1% agarose (in E3 medium)
1% agarose gel (in TBE buffer)
Leibovitz´s L-15 medium  Gibco 21083-027
FBS (Fetal Bovine Serum) Sigma F4135
RNAlater Ambion AM7020
Trizol Ambion 1559606
Glycogen  Invitrogen 10814-010 20 µg/µl in RNase-free water
chloroform
isopropanol
75% ethanol (in DEPC-ddH2O)
Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O
Nucleic acid loading buffer
TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stainier, D. Y., et al. Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 123, 285-292 (1996).
  2. Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish. Development. 123, 293-302 (1996).
  3. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).
  4. Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends Genet. 10, 73-74 (1994).
  5. Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 6, 995-1001 (1996).
  6. Epstein, C. B., Butow, R. A. Microarray technology - enhanced versatility, persistent challenge. Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).
  7. Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics. OMICS. 18, 98-110 (2014).
  8. Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. Biotechniques. 40, 274-278 (2006).
  9. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
  10. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  11. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th, University of Oregon Press. Eugene. (2000).
  12. Veerkamp, J., et al. Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry). Dev Cell. 24, 660-667 (2013).
  13. Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
  14. Brownlie, A., et al. Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish. Dev Biol. 255, 48-61 (2003).
  15. Marvin, M., et al. Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins. Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).
  16. Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain. Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).
  17. Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
  18. Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
  19. Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics