Крупномасштабные данио рерио эмбриональных Сердце Вскрытие для транскрипционных анализа

1Max Delbrück Center for Molecular Medicine, 2Institute of Biochemistry and Biology, University of Potsdam, 3Institute of Molecular Biology, Medizinische Hochschule Hannover
* These authors contributed equally
Published 1/12/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Для анализа профилей экспрессии генов сердечных во данио развития сердца, общей РНК должны быть извлечены из изолированных сердцах. Здесь мы приводим протокол для сбора функционал / бьющееся сердце быстрым ручной вскрытия из эмбрионов данио рерио, чтобы получить сердечно-специфической мРНК.

Cite this Article

Copy Citation

Lombardo, V. A., Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis. J. Vis. Exp. (95), e52087, doi:10.3791/52087 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Данио рерио эмбриональных сердце состоит только из нескольких сотен клеток, что составляет лишь небольшую часть всей эмбриона. Поэтому, чтобы предотвратить сердечный транскриптом от маскируется глобальной эмбрионального транскриптома, необходимо собрать достаточное количество сердец для дальнейшего анализа. Кроме того, как данио сердца развитие протекает быстро, сбор сердца и методы экстракции РНК должны быть быстрым, чтобы обеспечить однородность образцов. Здесь мы представляем быстрый ручной протокол вскрытия для сбора функционал / бьющееся сердце из эмбрионов данио рерио. Это является необходимым условием для последующего извлечения сердца РНК с определения сердечно-определенные уровни экспрессии генов с транскриптомный анализы, такие как количественное ПЦР в реальном времени (RT-КПЦР). Метод основан на дифференциальных адгезивных свойств данио эмбрионального сердца по сравнению с другими тканями; Это позволяет быстро PHYSical разделение сердечной ткани от экстракардиальной сочетанием текучей нарушения силы сдвига, ступенчатой ​​фильтрации и ручного сбора трансгенных флуоресцентно меченных сердца.

Introduction

Данио рерио (Danio rerio) широко используется в биологии развития для изучения органогенеза в естественных условиях из-за его быстрого, прозрачного и внематочной эмбрионального развития, в сочетании с малым размером и наличием трансгенных репортеров линий с тканевой экспрессией флуоресцентных белков. Этот небольшой позвоночных особенно хорошо подходит для изучения развития сердца, потому что оксигенации начале данио эмбриона не зависит от сердечного ритма и потока крови; Эти особенности позволили охарактеризовать большого числа сердечно-сосудистых мутантов 1,2 и данио сейчас широко признается модельным организмом для изучения сердечных заболеваний 3.

Для изучения экспрессии генов в ходе эмбрионального развития, стенограммы, как правило, анализируется целом монтажа в гибридизация (желанию) 4, RT-КПЦР 5, микрочипы 6, или следующего поколения секвенирования (RNA-Seq) 7. В то время какWISH позволяет пространственно-временной анализ экспрессии генов в пределах всего эмбриона, уровни транскриптов, как правило, оценивали с помощью RT-количественной ПЦР, микрочипов, или РНК-Seq подходов. Однако эти способы требуют обогащения тканей для конкретного профилирования экспрессии генов.

С данио эмбриональных сердце представляет собой небольшую долю всего эмбриона, транскриптом исследования во время развития сердца требуют протокол вскрытия и обогащения сердец. Кроме того, для получения физиологически релевантных данных, важно поддерживать сердечную ткань полностью функциональный до экстракции РНК. Здесь мы опишем протокол для быстрого выделения физиологически нормальным и избиения сердца сотен эмбрионов данио эффективно получить образцы РНК высокого качества для дальнейшего анализа. Данный способ основан на протоколе сообщалось Бернсом и MacRae, 2006 8. Для обогащения сердечной ткани, оба метода используют трансгенное миокарда репортер линиии воспользоваться дифференциальных адгезионные свойства данио эмбриональных сердцах по сравнению с другими тканями. Вкратце, с помощью пипетки много эмбрионов вверх и вниз через узкий кончик пипетки, сердца одновременно выпустили из эмбриональных органов, а затем отделяется от эмбриональной мусора в два этапа быстрой фильтрации; флуоресцентно меченных сердца вручную сортируются от оставшегося мусора и собирают дл дальнейшей обработки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этот протокол следует руководству по уходу за животными немецкой и Берлин государственного права; Данио обработки контролировали местные органы власти для защиты животных (LaGeSo, Берлин-Бранденбург).

1. Получение эмбрионов данио для сердца Добыча

  1. Кросс сердечной репортер данио, такие как Tg (myl7: EGFP) трансгенной линии twu34 9 с целью получения эмбрионов с сердечной-специфической экспрессии GFP.
  2. Поддерживать эмбрионов в яйце воды на 28,5 ° С до желаемой эмбриональной стадии 10,11. Убедитесь, что собрали население эмбрион является однородным как генетически, так и стадии развития, чтобы ограничить изменения в экспрессии генов.
  3. Dechorionate эмбрионов вручную.

2. Режущая рыбок данио эмбриональных Сердца

ПРИМЕЧАНИЕ: Держите все решения на льду. Если возможно, совместную работу: один человек рассекает сердца от набryos в то время как другой человек сортирует сердца под флуоресцентным стереомикроскопа. Это позволяет обрабатывать несколько сотен эмбрионов в течение нескольких часов.

  1. Перевести около 100 эмбрионов в 1,5 мл центрифужную пробирку. Обезболить эмбрионов с Tricaine (0,16 мг / мл в E3 среда). Продолжить когда зародыши четко наркозом (они не плавать, а осадок на дне пробирки, но их сердца все еще бьется).
  2. Снимите Tricaine решение / E3 и мыть эмбрионов один раз 1 мл L-15/10% FBS среде и поддерживать на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: L-15/10% FBS средой важно сохранить органы и клетки живых в течение всей процедуры вскрытия до сердца не были переданы в RNAlater или TRIZOL.
  3. Добавить 1 мл L-15/10% FBS среду с эмбрионами и пипетки вверх и вниз 5-8 раз с круглым Гель наливного наконечника до желтка не полностью нарушена. Пипетки эмбрионы каплям на поверхности раствора, так что падение лопнет иэмбрионы аккуратно нарушена.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как энергично и как часто эмбрионы должны быть пипеткой вверх и вниз, зависит от стадии развития эмбрионов, т.е. более пипетки необходимо на поздних стадиях (например, на 56 часов после оплодотворения).
  4. Для первой партии расчлененный эмбрионов, оценить целостность эмбрионов и доли расчлененный сердца под стереомикроскопом, так как некоторые сердца может оставаться присоединенным к эмбрионов, если слишком мягко пипеткой. Отрегулируйте манеру пипетки для следующих раундов вскрытия соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте низкие советы удержание пипетки и микроцентрифужных трубы, чтобы свести к минимуму сердца, торчащие на пластик.
  5. Применение пробы на 100 мкм фильтре, расположенном на 50 мл центрифужную пробирку; промыть 1,5 мл пробирку с 1 мл L-15/10% FBS среде, а затем применить это к фильтру, чтобы минимизировать потерю образца (около сердца может быть прилипание к стенкам трубки). Промойте фильтр в два раза с 1 мл L-15/10% FBS. На этом этапе сердца проходит через фильтр и собирают в 50 мл пробирку.
  6. Применение проточного на фильтр 30 мкм помещали на 15 мл центрифужную пробирку и промыть фильтр один раз 1 мл L-15/10% FBS средой. В этой второй стадии фильтрации, сердца, сохраняются в фильтре и меньше мусора смывается.
  7. Поверните фильтр с ног на голову и промойте сердца из фильтра в 1% агарозном покрытием чашке Петри, применяя три последовательных промывок 1 мл L-15/10% FBS.
  8. Вручную отделяют GFP-положительных сердца от нефлуоресцентный эмбрионального мусора (например, глазные линзы) с парой щипцов под флуоресцентным стереомикроскопа и концентрируют их в центр чашки. Соберите их в соответствии со стадией 3.
    Примечание: Если эмбрионы старше 24 HPF, сердца следует бить, указывающий, что ткани еще физиологически нормальным.

3. Изоляция мРНК из DissecТед Сердца

  1. Сбор сердца в наименьшей возможной объема (например, 10 мкл) и пипеткой в 1,5 мл пробирку, содержащую 0,75 мл RNAlater (на льду). Убедитесь, что нет сердца остаются на кончике пипетки, просмотрев его под флуоресцентным стереомикроскопа.
  2. Кроме того, если химический капот в непосредственной близости от флуоресцентного микроскопа, передачи собранных сердца в триазол (Предостережение) под капотом химической. Это обходит возможную потерю сердца, торчащие в наконечника пипетки, а также во время центрифугирования из сердца (шаги 3,4, 3,5 и 3,7). Бассейн сердца из нескольких раундов изоляции в одной пробирке с TRIZOL и перейдите к шагу 3.8; Конечный объем не должен превышать 10% от первоначального объема Trizol.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Читайте Trizol Паспорт безопасности (MSDS) перед использованием. Ручка тризола реагента под капотом и рекомендуется использовать индивидуальные средства защиты. Избегать контакта с кожей, глазами и Женсканг. Удалить все источники возгорания.
  3. Бассейн сердца из нескольких этапов изоляции в одной и той же трубе с RNAlater (на льду), а эффективность выделения РНК увеличивается с ростом объема собранной ткани. Если полный объем образца превышает 10% от исходного объема RNAlater, использовать дополнительную трубку с 0,75 мл RNAlater для хранения (на льду).
  4. Центрифуга образцов при 15700 мкг в течение 20 мин при 4 ° С для осаждения сердца.
  5. Под флуоресцентным стереомикроскопа, собирать тщательно столько супернатант насколько это возможно в 1% -ном агарозном покрытием чашку Петри, содержащую 3 мл L-15/10% FBS среду, но не мешать осевших сердца в нижней части центрифужную пробирку. Поскольку до 15% от сердца может оставаться в супернатанте из-за высокой вязкости RNAlater, извлекать их, как описано выше в стадии 3,7.
  6. Под химической капотом, добавить 0,5 мл Trizol в пробирку, содержащую осевших сердца и держать на льду.
  7. Под флуоресцентным microscoPE, передать сердца (из шага 3.5) из 1% агарозном покрытием блюдо, содержащие RNAlater / L-15/10% -ный раствор FBS в другой 1% агарозном покрытием блюдо с 3 мл L-15/10% FBS, чтобы разбавить из в RNAlater. Сбор сердца в центре чашки Петри и передавать их в небольшом объеме в трубку из осажденных сердца в триазол под капотом химической.
  8. Vortex 1,5 мл пробирку, содержащую сердца в TRIZOL сорвать сердца и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
  9. Под химической капотом, добавить 100 мкл хлороформа (Предупреждение), тщательно перемешать и перенести / хлороформ решение тризола в 1,5 мл предварительно развернулся PLG трубку (центрифуга 30 сек при максимальной скорости перед использованием). Инкубируют в течение 3 мин при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Читайте хлороформа паспорт безопасности перед использованием. Ручка хлороформ реагента под капотом и рекомендуется использовать индивидуальные средства защиты. Избегать контакта с кожей, глазами и одеждой. Хранить вдали от несовместимых, таких как металлы, щелочи.
  10. CentrifuGE образца при 15700 х г в течение 15 мин при 4 ° С и передачи водной фазы в новую пробирку 1,5 мл.
  11. Добавить 5-10 мкг гликогена и 250 мкл предварительно охлажденный (при -20 ° C) изопропанол; хорошо перемешать и инкубировать в течение ночи при -20 ° С.
  12. Центрифуга образца при 15 700 х г в течение 30 мин при 4 ° С и отбросить супернатант.
  13. Промыть гранулу с 1 мл 75% -ного этанола, центрифуге при 15700 х г в течение 15 мин при 4 ° С и отбросить супернатант.
  14. Пусть этанола испаряется при сушке гранул при комнатной температуре, пока он не станет белым (например, в течение 10-15 мин).
  15. Добавить 20 мкл РНКазы свободной DDH 2 O, чтобы гранулы и инкубировать в течение 10-15 мин при 55 ° С, чтобы растворить РНК; затем держать на льду.
  16. Оценка концентрации РНК и чистоту на измерении оптической плотности. Оценка целостности РНК, выполнив образец на 1% агарозном геле.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Здесь мы опишем представительство сердце рассечение эксперимент с использованием данио TG (myl7: GFP) twu34 трансгенной линии 9, в котором выражается зеленый флуоресцентный белок (GFP) исключительно в миокарде (рис 1).. Мы собрали оба расчлененный сердца и эмбрионы, из которых они были получены, чтобы оценить чистоту образца сердца. Вкратце, гомозиготные Tg (myl7: GFP), twu34 данио 9 были ауткроссной дикого типа, так что все эмбриональные сердца GFP с меткой. Некоторые 500 эмбрионов (56 HPF) были переданы в 1,5 мл пробирки (прим. 100 эмбрионов в каждой) (рис. 1А1, 1В). Каждая трубка была обработана, как описано в разделе протокола (этап 2) и на фиг.1А. Сердца были освобождены пипетированием вверх и вниз несколько раз (рис. 1A2), а затем наносили на фильтр 100 мкм (фиг. 1A3). Большие куски эмбриональной ткани были сохранены в этом фильтре; эта доля была извлечена и поставить в TRIZOL FOВыделение РНК R, чтобы получить "эмбрион без сердца" образца РНК (рис. 1A3). Проточный, содержащий сердца затем наносили на 30 мкм фильтр (рис. 1A4), которая сохранила сердцах и тканей мусора аналогичного размера. Из фильтра GFP-положительных сердца промыть в агарозном покрытием чашке Петри (рис. 1А5, 1С), быстро, собранной в середине тарелки под флуоресцентным стереомикроскопа и переносили в 0,75 мл RNAlater (фиг. 1A6). В этой трубки с RNAlater, мы объединили сердца, полученные из 5 рассечение раундов (прибл. 300 сердца от 500 эмбрионов, представляющих эффективность экстракции около 60%). Сравнение образцов сердца до сортировки из-под обломков от эмбрионов на 56 часов после оплодотворения (рис. 1в) по сравнению с 36 часов после оплодотворения (рис. 1C ») показан на рисунке 1. На 56 часов после оплодотворения, нарушение эмбрионов дали более эмбрионального мусора ( таких как линзы, стрелок, рис. 1в), чем в 36 часов после оплодотворения после фильтрации шаг 30 мкм (рис. 1C »).

Чтобы определить чистоту 56 часов после оплодотворения «сердце» образца, мы сравнили уровни экспрессии сердца по сравнению с экстра-сердечных транскриптов в "сердце" и "эмбриона без сердца» образцов по RT-КПЦР. Для этого, мы извлекли мРНК из этих двух образцов и оценили качество РНК на агарозном геле (рис 2А) и количества путем измерения оптической плотности (таблица 1), как описано в разделе протокола (шаг 3). Ок. 300 сердца дали 660 нг РНК. Далее, кДНК синтезировали с использованием М-MLV обратной транскриптазы РНКазы H (-) и случайные гексамеры в соответствии с инструкциями постав и РТ-КПЦР Эксперименты проводили, как описано 12. Относительные уровни экспрессии генов были рассчитаны для различных тканей-специфических маркеров, таких как миозин свет полипептидной 7 [myl7, инфаркта маркера] 9, киназы рецептора домена вставки, как [kdrl, эндотелия / эндокарда маркер] 13, гемоглобин бета эмбриональных-1.1 [hbbe1.1, эритроцитов маркер] 14, кристаллин-альфа [cryaa, хрусталик глаза маркер] 15 и глиальных фибриллярный кислый белок [GFAP, центральная нервная система маркер] 16 (2В). Данио эукариотической фактором инициации трансляции 1B [eif1b] 12 использовали в качестве внутреннего контрольного гена (см таблицу 2 для чисел GenBank ID, последовательностей праймеров, размеров продукта ПЦР и тканевой специфичности для каждого гена). Как и ожидалось, myl7 был высоко обогащенного в «сердце» образца по сравнению с "эмбриона без сердца" образца (рис. 2В). Эндотелиальных клеток маркера kdrl было установлено, что умеренно обогащенную образца сердца, как и ожидалось (примерно на 40% из сердечных клеток в 56 часов после оплодотворения которые kdrl экспрессирующие клетки эндокарда) (рис. 2B). Эритроцитов маркер hbbe1.1 был чрезмерно в «сердце» образца, хотя сердца были улболен биение после вскрытия, которое должно вытеснить эритроциты от сердца (рис. 2В). В отличие от этого, уровни экспрессии ЦНС и маркеров объектива (GFAP и cryaa, соответственно) были крайне низкими в «сердце» образца (рис. 2В). В целом, мы приходим к выводу, что выход протокола сердце рассечение высокое качество и сердечно-специфическая РНК из целых эмбрионов данио рерио.

Рисунок 1
Рисунок добыча 1. Сердце из эмбрионов данио рерио. () Схема, изображающая процедуру экстракции сердце. Около 100 живых эмбрионов собираются в 1,5 мл трубки (А1, В, В '), а затем анестезировали с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз через узкий кончик пипетки, чтобы освободить сердца (A2). Полученный раствор, содержащий эмбриональных тканей (А2), затем наносили на 100 мкм фильтр (A3). Эмбриональные ткани без желтка и чearts, и большой эмбриональной мусор остаются в фильтре (A3). Проточный собирают в 50 мл пробирку (A3), а затем наносили на фильтр 30 мкм (A4). Сердца и мелкий мусор остаются в фильтре 30 мкм и переносят в небольшой агарозном покрытием чашке Петри (A5, C, C '). EGFP помечены сердца (C, C '; стрелка) вручную сортируются от остальной мусор, например объективов (С, стрелки), и собираются в RNAlater (A6). Эту процедуру повторяют, по меньшей мере в 5 раз и все сердца объединяются вместе для дальнейшей обработки. (BC ') Наложение флуоресценции (EGFP в зеленый цвет) и DIC образы живой трансгенных TG (myl7: EGFP) twu34 эмбрионов на 56 часов после оплодотворения (B, C) ​​и 36 часов после оплодотворения (B', C ') в двух шагах от центра Процедура вскрытия: до вскрытия эмбриона (В, В ') и только после промывки от 30 мкм фильтр, до сортировки сердца от мусора в чашку Петри (C, C'). Масштабная линейка: 500 мкм.

Фиг.2
Рисунок 2. Анализ качества РНК и чистоты с помощью электрофореза и RT-КПЦР, соответственно. () Общая РНК из "сердца" образца (2 мкл) и от «зародыша без сердца" образца (1 мкл), полученных от 56 Эмбрионы HPF, разделяли на 1% агарозном геле. Известный S18 и S28 рРНК полос, показывают, что РНК не деградировали. (B) Относительные уровни экспрессии по myl7 ткани специфических маркеров (миокарда), kdrl (эндотелий), hbbe1.1 (эритроциты), cryaa (линзы), и GFAP (ЦНС), как определено RT-КПЦР для "сердца" образца нормированная на "эмбрион без сердца" образца. Эксперименты RT-КПЦР проводили, как технических трижды, и данные представлены в виде означает ± SEM. Непарный анализ Т-тест был проведен. **** Р <0,0001; ** Р <0,005. ВР, пара оснований.

образец ID нг / мкл A260 A280 260/280 260/230 курсор абс. 340 сырье
сердца 32.97 0,82 0,41 2.01 0,35 2.355 0,031
эмбрионы без сердца 568,82 14.22 7.00 2.03 2,04 6,965 0,018

Таблица 1. Количество РНК и качество спектрофотометрическим измерением. Количество и качество РНК "сердце" и "эмбриона без сердца" образцов, полученных из 56 оплодотворения эмбрионов, как измеряется спектрофотометрически.

GEНебраска GenBank # праймера Размер продукта ПЦР (BP) Tissue-специфическим маркером
myl7 BX248505 F: 5'-ACAGCAAAGCAGACAGTGAA-3 ' 163 миокард
Р: 5'-TAACTCCATCCCGGTTCTGA-3 '
kdrl CR759732 F: 5'-ACAACGACACTGGCATCTAC-3 ' 170 эндотелий / эндокард
Р: 5'-TGTTCTACAGGGGACCACAA-3 '
GFAP BX324157 F: 5'-AGACAACTTGGCCTCAGAC-3 ' 247 центральная нервная система
Р: 5'-ATCCACATGAACCTGTTGGG-3 '
cryaa BX248514 190 хрусталик глаза
Р: 5'-TCAGACCTCACCTCAGAGAC-3 '
hbbe1.1 BC095024 F: 5'-TGGTTGTGTGGACAGACTTCGA-3 "8 102 эритроцит
R: 5'-CGATAAGACACCTTGCCAGAGC-3 "8
eif1b BX323079 F: 5'-CAGAACCTCCAGTCCTTTGATC-3 '12 195 ссылка ген
Р: 5'-GCAGGCAAATTTCTTTTTGAAGGC-3 '12

Таблица 2. Праймеры, используемые для экспериментов РТ-КПЦР. Имя, GenBank инвентарный номер, последовательность, размеры продукта ПЦР и тканеспецифичность показываются для всех проанализированных генов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол позволяет быстрое обогащение данио эмбриональных тканей сердца для экспрессии гена анализа. Количество и качество сердечно-конкретного образца РНК во многом зависит от нескольких важных этапов: во-первых, количество образца значительно улучшено, если потеря сердца предотвращается на каждом шагу протокола, так как очистка РНК будет работать только с достаточно исходного материала. Во-вторых, чистота образца, который полностью зависит от экспериментатора, определяется сортировки и сбора сердца в чашку Петри, строго не включенные в другие ткани. В-третьих, качество образца критически зависит от ограничения деградации РНК, которые могут возникнуть при нарушения эмбрионов; это достигается с помощью клеточную культуральную среду, чтобы избежать гибели клеток и выдержки образцов на льду. Деградация РНК прекращается после того, как сердца были переданы в RNAlater или TRIZOL. Это сердца бить в чашку Петри сильно показывает, что сердечная тВопрос физиологически нормальным после вскрытия.

Мы рекомендуем начать с, по меньшей мере, 300 сердец (то есть около 500 эмбрионов), из которых достаточно РНК может быть безопасно осажденных (вместе с 5-10 мкг гликогена). Тем не менее, мы не можем исключить, чем меньше сердца хватит на небольших экспериментов. Это просто важно иметь достаточное РНК для определения концентрации, чистоты и целостности образца. Пожалуйста, обратите внимание, что содержание РНК может варьировать в зависимости от стадии развития, и от генетического фона эмбриона (например, в случае мутантов с аномальными сердца). Таким образом, минимальное количество эмбрионов, необходимых для эксперимента должны быть определены в каждом конкретном случае.

Есть несколько технических различий между настоящим Протоколом и ранее протокола ожогами и МакРей, и мы не думаем, что есть существенная разница в эффективности или скорости между двумя протоколами.Тем не менее, мы ввели новые возможности: Самое главное, мы предлагаем использовать решения по стабилизации RNAlater. Это важно по двум причинам: во-первых, для сбора высокого качества РНК для дальнейших экспериментов, таких как RT-количественной ПЦР путем уменьшения деградации РНК к минимуму, так как сразу же RNAlater инактивирует РНКазы и стабилизирует РНК в ткани или клетки. Во-вторых, RNAlater имеет решающее значение для обеспечения возможности сбора сердца на разные дни, что очень важно, когда количество эмбрионов является ограничивающим фактором. Это также позволяет объединение сердец, которые могут быть необходимы, чтобы получить достаточное количество исходного материала для эффективного выделения высококачественной РНК с триазол. Передача сердца непосредственно в триазол обход использование RNAlater, однако, из-за опасности для здоровья, этот шаг должен был бы быть выполнен в соответствии с химической капот, которые не могут считаться расположен в непосредственной близости от флуоресцентного микроскопа для всех экспериментаторов ,

Мы нашли тшляпа сердце рассечение хорошо работает с эмбрионами между 20-72 часов после оплодотворения [12; неопубликованные данные для 72 оплодотворения]. Однако процедура экстракции становится более трудным с увеличением возраста и эмбриональных длина: дополнительные и более сильный пипетки, чтобы успешно вводить эмбрионов в конечном наконечника и отделить сердца из других эмбриональных тканей. В результате, более эмбриональных мусор присутствует в рамках подготовки образца (рис 1С, C ') и экспериментатору приходится быть более осторожным в сортировке сердца в чашке Петри.

Протокол вскрытия сердца, представленные здесь позволяет анализ всему профилю сердечной экспрессии различных типов клеток, в том числе миокарда и эндокарда. Дальнейшее разделение видов клеток сердца может быть достигнута с помощью endocardial- и инфаркт-Specific-репортер линии [например, Tg (myl7: GFP) twu34 и ТГ (kdrl: mCherry IS5] 9, 17 для извлечения сердца в сочетании с FACS сортировки. В отличие от метода 18,19 Перевод Рибосомы Affinity Очистка (TRAP), которая позволяет тканеспецифичную анализ транскрипции без рассечения тканей, наш подход не ограничивается активно-переведенных мРНК, но также включает в себя не-активное-переведены мРНК или некодирующие РНК. Альтернативный применение протокола сердца рассечение для анализа экспрессии белка в пределах сердца: уровни белка может быть оценена с помощью Вестерн-блот-локализации и белка могут быть проанализированы с помощью иммуногистохимии, как анатомия сердца сохраняется во время процедуры вскрытия.

Таким образом, мы представляем здесь детальный протокол вскрытия функционал / бьющееся сердце из сотен эмбрионов в течение короткого времени, которые могут быть использованы для получения образцов для сердца специфическая РНК (или белков) высокой чистоты для дальнейшего анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment for raising fish and collecting eggs  see the Zebrafish Book11 for details
Fluorescence stereomicroscope
Refrigerated Microcentrifuge
UV-Spectrophotometer e.g. Thermo Scientific Nanodrop 2000
Nucleic acid electrophoresis chamber
Petri dishes 4 cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium
Micropipettes and tips (P20, P100, P1000)
1.5 ml centrifugation tubes
15 ml and 50 ml centrifugation tubes
Pair of Dumont #5 forceps
ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl  Santa Cruz sc-201732
100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) BD Biosciences 352360
30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) Miltenyi Biotec 130-041-407
Phase lock gel, heavy, 1.5 ml tubes  Prime 2302810
Egg water medium 60 μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue
E3 medium  5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) Sigma-Aldrich A-5040 4 mg/ml Tricaine stock solution, pH 7
1% agarose (in E3 medium)
1% agarose gel (in TBE buffer)
Leibovitz´s L-15 medium  Gibco 21083-027
FBS (Fetal Bovine Serum) Sigma F4135
RNAlater Ambion AM7020
Trizol Ambion 1559606
Glycogen  Invitrogen 10814-010 20 µg/µl in RNase-free water
chloroform
isopropanol
75% ethanol (in DEPC-ddH2O)
Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O
Nucleic acid loading buffer
TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stainier, D. Y., et al. Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 123, 285-292 (1996).
  2. Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish. Development. 123, 293-302 (1996).
  3. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).
  4. Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends Genet. 10, 73-74 (1994).
  5. Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 6, 995-1001 (1996).
  6. Epstein, C. B., Butow, R. A. Microarray technology - enhanced versatility, persistent challenge. Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).
  7. Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics. OMICS. 18, 98-110 (2014).
  8. Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. Biotechniques. 40, 274-278 (2006).
  9. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
  10. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  11. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th, University of Oregon Press. Eugene. (2000).
  12. Veerkamp, J., et al. Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry). Dev Cell. 24, 660-667 (2013).
  13. Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
  14. Brownlie, A., et al. Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish. Dev Biol. 255, 48-61 (2003).
  15. Marvin, M., et al. Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins. Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).
  16. Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain. Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).
  17. Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
  18. Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
  19. Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats