प्रतिदीप्ति आधारित प्राइमर एक्सटेंशन तकनीक Transcriptional शुरू अंक और RNases की दरार साइटों का निर्धारण करने के

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Schuster, C. F., Bertram, R. Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo. J. Vis. Exp. (92), e52134, doi:10.3791/52134 (2014).

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Abstract

प्रतिदीप्ति आधारित प्राइमर विस्तार (एफपीई) ट्रांस्क्रिप्शनल शुरू अंक या आरएनए अणुओं के प्रसंस्करण साइटों का निर्धारण करने के लिए एक आणविक विधि है. इस विशिष्ट fluorescently लेबल प्राइमरों और polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन denaturing द्वारा परिणामस्वरूप सीडीएनए टुकड़े के बाद के विश्लेषण का उपयोग ब्याज की शाही सेना की रिवर्स प्रतिलेखन द्वारा हासिल की है. इसके साथ ही, एक पारंपरिक सेंगर अनुक्रमण प्रतिक्रिया उनके सटीक इसी अड्डों को सीडीएनए टुकड़े के सिरों नक्शा करने के लिए जेल पर चलाया जाता है. उत्पाद क्लोन किया जाना चाहिए और कई उम्मीदवारों अनुक्रम जहां 5'-दौड़ (सीडीएनए रुप से रैपिड प्रवर्धन), के विपरीत, प्राइमर विस्तार से उत्पन्न सीडीएनए टुकड़े के थोक एक साथ एक जेल समय में पता लगाया जा सकता है. इसके अलावा, (परिणाम की अंतिम विश्लेषण करने के लिए रिवर्स प्रतिलेखन से) पूरी प्रक्रिया एक काम कर दिन में पूरा किया जा सकता है. Fluorescently लेबल प्राइमरों का उपयोग करके, खतरनाक रेडियोधर्मी आइसोटोप का उपयोग अभिकर्मकों लेबलबचा जा सकता है और उत्पादों वैद्युतकणसंचलन प्रक्रिया के दौरान पता लगाया जा सकता है के रूप में प्रसंस्करण बार कम हो रहे हैं.

निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम मज़बूती से और तेजी से एस में (जैसे, विष-अतिविष सिस्टम घटकों द्वारा) शुरू अंक और आरएनए प्रसंस्करण साइटों ट्रांस्क्रिप्शनल परिणाम निकालना RNAs के 5 'समाप्त होता है पता लगाने के लिए एक vivo में फ्लोरोसेंट प्राइमर विस्तार विधि का वर्णन ऑरियस, ई कोलाई और अन्य जीवाणुओं.

Introduction

प्राइमर विस्तार 1 एक एक आधार संकल्प अप करने के लिए विशिष्ट आरएनए अणुओं के 5 'समाप्त होता है निर्धारित करने के लिए एक आणविक विधि है. ऐसे 5'-दौड़ (सीडीएनए की तेजी प्रवर्धन समाप्त होता है) के रूप में अन्य तरीकों को लाभ तेजी से बदलाव समय और आसानी से आरएनए अणुओं के अलग अलग लंबाई का एक मिश्रण का विश्लेषण करने की क्षमता है.

इस विधि आरएनए अणुओं निश्चित लंबाई की सीडीएनए टुकड़े पैदा करने, विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्राइमर का उपयोग प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं रिवर्स करने के लिए subjecting द्वारा काम करता है. ये सीडीएनए अणुओं denaturing polyacrylamide जैल पर पारंपरिक सेंगर अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं 2 के साथ चलाए जा रहे हैं और कारण fluorescently लेबल प्राइमरों का उपयोग करने के लिए उनके प्रतिदीप्ति द्वारा पता लगाया जा सकता है. सीडीएनए टुकड़े की लंबाई तो 5 'शाही सेना सिरों की मैपिंग की अनुमति, अनुक्रमण सीढ़ी की तुलना द्वारा मूल्यांकन कर रहे हैं.

परंपरागत रूप से, प्राइमर विस्तार प्रतिक्रियाओं संयोजन के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैंरेडियोधर्मी आइसोटोप के साथ एक्स-रे फिल्मों पर सीडीएनए अणुओं का पता लगाने के लिए. उनकी संवेदनशीलता से थोड़ा कम है यद्यपि कारण स्वास्थ्य को खतरा, अपशिष्ट निपटान के मुद्दों और हैंडलिंग की आसानी के लिए, नए प्रोटोकॉल, स्वचालित sequencers साथ प्राइमर विस्तार का पता लगाने के लिए प्रतिदीप्ति का उपयोग. फ्लोरोसेंट प्राइमर (हमारे हाथों में एक वर्ष से अधिक) एक लंबे समय के लिए स्थिर रहे हैं के रूप में fluorescently लेबल प्राइमरों का प्रयोग, आवर्ती रेडियो-लेबलिंग प्रक्रिया, छोड़ा जा सकता है.

हम यहाँ वर्णन विधि एक स्वचालित जेल Sequencer का इस्तेमाल करता है, लेकिन मामूली संशोधनों के साथ, केशिका sequencers भी सीडीएनए जुदाई और पहचान 3 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जेल विश्लेषण के समानांतर प्रकृति यह संभव आरएनए दरार या प्रसंस्करण की भी एक छोटी राशि का पता लगाने के लिए बनाता है. एक और लाभ यह पता लगाया जा सकता टर्मिनल दरार या यहां तक ​​कि एक आधार के प्रसंस्करण के रूप में, इस विधि के उच्च संकल्प है.

शाही सेना दरार या प्रसंस्करण, टी का पता लगाने के संबंध मेंप्राइमर एक्सटेंशन के ypically दो अलग अलग प्रकार प्रतिष्ठित हैं. अन्य मामले में, प्रसंस्करण विवो में किया जाता है और जिसके परिणामस्वरूप शाही सेना शुद्ध होता है, जबकि एक मामले में, एंजाइमी उपचार, शुद्ध शाही सेना और शुद्ध एंजाइम का उपयोग कर इन विट्रो में किया जाता है. एक प्राइमर विस्तार विट्रो में किए गए करने के लिए दोनों ही मामलों में शाही सेना के शाही सेना के स्रोत पर निर्भर करता है, तथापि, अधीन है, विधि इन विट्रो या vivo में प्राइमर एक्सटेंशन कहा जाता है या तो. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, हम क्योंकि उपयोग की आसानी (कोई शुद्ध प्रोटीन आवश्यक) और एक ही समय में ट्रांस्क्रिप्शनल शुरू अंक और प्रसंस्करण निर्धारित करने के लिए संभावना की, केवल इन विवो प्राइमर विस्तार पर ध्यान केंद्रित. हालांकि, इन विट्रो प्राइमर एक्सटेंशन उसी तरह स्थापित सिद्धांत में हैं और इस प्रोटोकॉल एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में सेवा कर सकते हैं.

यहाँ सचित्र विधि के रूप में वे उच्च करने के लिए उत्तरदायी हैं के रूप में कई बैक्टीरिया की प्रजातियों के लिए लागू किया जा सकता हैन्यूक्लिक एसिड की पवित्रता और उच्च उपज तैयारी.

हमारी प्रयोगशाला में अनुसंधान विष-अतिविष (टा) सिस्टम 4,5, प्राइमर विस्तार विधि बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया जाता है, जिसमें एक क्षेत्र के नियामक दायरे पर केंद्रित है. टीए-सिस्टम एक स्थिर और endogenously सक्रिय जहरीले प्रोटीन और विषाक्तता 6,7 counteracts कि एक ज्यादातर अस्थिर प्रोटीन या शाही सेना अतिविष से मिलकर उस प्रोकार्योटिक जीनोम में मौजूद छोटे आनुवंशिक तत्व हैं. विष गतिविधि कभी कभी RNase गतिविधि 8,9 से सबसे अधिक बार प्रतिकृति, कोशिका दीवार संश्लेषण या अन्य तंत्र का निषेध द्वारा लगाए गए, लेकिन है. आमतौर पर, RNase विशिष्टता प्राइमर विस्तार विधि है, जिनमें से एक अलग परीक्षण का आयोजन द्वारा निर्धारित किया जाता है. Cleaved और पूर्ण लंबाई के टुकड़े का एक मिश्रण एक साथ उनके 5 'समाप्त होता है निर्धारित करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है के रूप में प्राइमर विस्तार प्रतिक्रियाओं, इस आवेदन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं. इन विट्रो की और इन विवो प्राइमर एक्सटेंशन में एक मिश्रण का उपयोग करना,विशिष्ट विष RNase दरार, जैसे, अनुक्रम विशिष्टता 10-13 निर्धारित किया जा सकता है.

चित्रा 1
. प्राइमर विस्तार प्रक्रिया 1. अवलोकन चित्रा बैक्टीरियल संस्कृतियों प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार incubated और इलाज कर रहे हैं. कुल शाही सेना कोशिकाओं, सीडीएनए उपज लक्ष्य विशिष्ट फ्लोरोसेंट डीएनए प्राइमरों का उपयोग कर एक रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के लिए डीएनए निशान को दूर करने के लिए DNase मैं के साथ व्यवहार और अधीन से निकाला जाता है. जीनोमिक डीएनए या प्लास्मिड निकाली और बाद में सीडीएनए टुकड़े के साथ आकार तुलना के लिए फ्लोरोसेंट सेंगर अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं के लिए उपयोग किया जाता है. प्राइमर विस्तार उत्पादों एक denaturing यूरिया polyacrylamide जेल पर सेंगर अनुक्रमण उत्पादों के साथ चलाने के लिए और एक स्वचालित लेजर और माइक्रोस्कोप के साथ विश्लेषण कर रहे हैं. ला सीडीएनए बैंड के साथ लाइनों है कि अनुक्रमण आधारसेंट 5 'सीडीएनए अंत (नीले तीर) के आधार. Fekete में अधिक जानकारी, एट अल. 3 इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

पूरे प्राइमर विस्तार प्रक्रिया का अवलोकन चित्रा 1 में पाया जा सकता है. संक्षेप में, बैक्टीरियल कोशिकाओं काटा, सुसंस्कृत हैं, सेल गोली lysed और शाही सेना निकाली. शुद्ध आरएनए तो रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस के लिए टेम्पलेट्स के रूप में कार्य कर सकता है जो डीएनए अणु के निशान को दूर करने के लिए DNase मैं के साथ व्यवहार किया जाता है. विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्राइमरों ब्याज के क्षेत्र को संकरित और बाद में एकल असहाय पूरक डीएनए (सीडीएनए), जिसके परिणामस्वरूप लिखित रिवर्स, शाही सेना को जोड़ रहे हैं. एक अनुक्रमण सीढ़ी फ्लोरोसेंट प्राइमरों रोजगार पारंपरिक सेंगर अनुक्रमण के द्वारा बनाई गई और प्राइमर विस्तार सीडीएनए टुकड़े के साथ एक denaturing polyacrylamide जेल पर अलग किया जाता है. जिसके परिणामस्वरूपजेल ब्याज की 5 'सिरों की पहचान की अनुमति, फ्लोरोसेंट बैंड की तुलना द्वारा विश्लेषण किया है. Transcriptional शुरू अंक और प्रसंस्करण साइटों तो अनुक्रम तुलना द्वारा व्यक्तिगत रूप से मूल्यांकन कर रहे हैं.

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Protocol

1. उच्च मार्ग आरएनए तैयारी

  1. शाही सेना अलगाव
    नोट: कुल शाही सेना के उच्च सांद्रता प्राइमर विस्तार प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक हैं. स्पिन स्तंभ किट आमतौर पर जरूरत शाही सेना की राशि उपज नहीं है (~ 5-16 माइक्रोग्राम प्रति 5 μl मात्रा में). इसलिए एसिड guanidinium thiocyanate-फिनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण विधि का उपयोग शुद्धि नीचे दिये, की सिफारिश की है.
    नोट: Phenol, कैंसर विषाक्त और संक्षारक है. सामग्री सुरक्षा डाटा शीट पढ़ सकते हैं और उचित संरक्षण के साथ एक धूआं हुड के अंतर्गत प्रयोग करें!
    1. वांछित और फसल 4600 × पर 10 मिनट centrifugation के और 4 डिग्री सेल्सियस तक के रूप में बैक्टीरियल कोशिकाओं (इस उदाहरण में एस aureus या ई कोलाई) बढ़ने या इलाज. नोट: आमतौर पर हम 20 से 600 कुल आयुध डिपो फसल - 70 सेल छर्रों -20 डिग्री सेल्सियस पर कई हफ्तों के लिए भंडारित किया जा सकता है.
    2. एसिड guanidinium thiocyanate-फिनोल-क्लोरोफॉर्म समाधान के 1 मिलीलीटर में सेल गोली Resuspend और एक करने के लिए स्थानांतरण2 मिलीलीटर 0.1 मिमी कांच zirconium / सिलिका मोतियों की 0.5 मिलीलीटर युक्त कप पेंच.
    3. Lyse कोशिकाओं प्रत्येक रन के बाद 5 मिनट के लिए बर्फ पर नमूने ठंडा तीन राउंड के लिए 30 सेकंड के लिए 6.5 मीटर / सेकंड में एक तेजी से प्रस्तुत करने का / मनका डिब्बा में तीन बार,. नोट: homogenized नमूना कई हफ्तों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
    4. आरटी पर 5 मिनट के लिए lysate सेते हैं और फिर क्लोरोफॉर्म की 200 μl जोड़ें.
    5. सख्ती से हिला या शाही सेना को निकालने के लिए 30 सेकंड के लिए नमूना भंवर.
    6. 15,000 × जी और 4 डिग्री सेल्सियस - फिर 13,000 पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र 3 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं. नोट: सॉल्वैंट्स (, सफेद डीएनए में शामिल है), (गुलाबी, प्रोटीन होता है) एक कम जैविक चरण में एक interphase अलग कर दिया और एक ऊपरी जलीय चरण (स्पष्ट, शाही सेना में शामिल है) कर रहे हैं.
      नोट: इस कदम से उपयोग पर केवल RNase मुक्त अभिकर्मकों और प्लास्टिक के बर्तन!
    7. उचित ताजा RNase मुक्त 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब, लेबल तैयार है और लगभग एक ही VO उपयोग (100% RNase मुक्त isopropanol प्रत्येक के बारे में 500 μl जोड़नेlume) पिछले ट्यूब में जलीय चरण के रूप में.
    8. एक कोण पर ट्यूब पकड़ो और RNase मुफ्त सुझावों का उपयोग कर तैयार ट्यूबों के लिए जलीय चरण (लगभग 500 μl) हस्तांतरण. Interphase परेशान मत करो.
    9. कई बार inverting और आरटी पर 10 मिनट के लिए incubating द्वारा शाही सेना वेग.
    10. 15,000 × जी और 4 डिग्री सेल्सियस और pipetting या आकांक्षा (पानी जेट पंप और खिलाने की बोतल) से सतह पर तैरनेवाला हटाने - 13,000 पर 15 मिनट के लिए नमूने अपकेंद्रित्र. तल पर सफेद पारदर्शी शाही सेना गोली परेशान मत करो.
    11. धोने के लिए 70-80% RNase मुक्त इथेनॉल (ऐसा नहीं भंवर) के 1 मिलीलीटर जोड़ें. नोट: इथेनॉल में शाही सेना -20 डिग्री सेल्सियस पर कई हफ्तों के लिए भंडारित किया जा सकता है.
    12. 7,500 × जी पर 5 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र और pipetting या बेहतर आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
    13. धूआं हुड के तहत 30 मिनट - 15 के लिए शुष्क हवा आरएनए गोली. Overdry न करें, अन्यथा छर्रों redissolve के लिए मुश्किल हो सकता है.
    14. 5 में गोली ResuspendRNase मुक्त DDH 2 हे या आरएनए भंडारण बफर के 0 μl.
    15. एक microvolume यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर या एक क्वार्ट्ज क्युवेट (और पारंपरिक दीप्तिमापी) के साथ शाही सेना एकाग्रता उपाय और DNase मैं पाचन के लिए आगे बढ़ें.
  2. शाही सेना के DNase मैं पाचन डीएनए के निशान को दूर करने के लिए
    नोट: डीएनए रिवर्स प्रतिलेखन (प्राइमर विस्तार) प्रतिक्रिया में एक नकली टेम्पलेट के रूप में कार्य कर सकते हैं, यह नमूना से हटा दिया जाना चाहिए. शाही सेना के समाधान से डीएनए को दूर करने के लिए विभिन्न तरीकों आमतौर पर DNase पाचन पर भरोसा करते हैं जो उपलब्ध हैं. डीएनए को हटाने के लिए एक सरल लेकिन प्रभावी और लागत प्रभावी विधि नीचे उल्लिखित है.
    1. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पहले से गरम पानी से स्नान.
    2. एक 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में 1 टेबल में सूचीबद्ध यौगिकों मिलाएं.
    3. एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मिश्रण सेते हैं, और फिर फिनोल / क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण के लिए सीधे आगे बढ़ना. नोट: DNase मैं की गर्मी निष्क्रियता की सिफारिश नहीं है, यह आरएनए नीचा हो सकता है.
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  3. DNase मैं पाचन के बाद शाही सेना के फिनोल / क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण
    नोट: आरएनए DNase मैं पाचन से मुक्त न्यूक्लियोटाइड, डीएनए टुकड़े और बफर घटकों को दूर करने के लिए शुद्ध किया जाना चाहिए. Phenol / क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण शाही सेना के नमूने की उच्च वसूली और एकाग्रता के लिए अनुमति देता है और इसलिए नीचे उल्लिखित है. वे इन आवश्यकताओं को पूरा अगर शाही सेना शुद्धि के लिए अन्य तरीकों में भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
    1. मैं पाचन 500 μl DNase 2 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में दो 250 μl नमूने में मिश्रण विभाजित.
    2. अम्लीय पी / सी / मैं समाधान की 1 मात्रा (250 μl) (: 24: - 5 1, पीएच 4.5 पानी संतृप्त फिनोल, क्लोरोफॉर्म और isopentanol में, 25 का अनुपात) जोड़ें.
      नोट: पी / सी / मैं समाधान, कैंसर विषाक्त और संक्षारक है. सामग्री सुरक्षा डाटा शीट पढ़ सकते हैं और उचित संरक्षण के साथ एक धूआं हुड के अंतर्गत प्रयोग करें!
    3. 3 मिनट - 1 के लिए एक vortexing मंच में सख्ती भंवर या जगह.
    4. 15,000 × जी और 4 डिग्री सेल्सियस - 13,000 पर 30 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
    5. ऊपरी (जलीय) चरण लीजिए और ताजा ट्यूब (250 μl) को हस्तांतरण.
    6. 3 एम सोडियम एसीटेट पीएच 5.2 की 1/9 मात्रा (28 μl) जोड़ें.
    7. शुद्ध इथेनॉल (700 μl) का 2.5-3 संस्करणों जोड़ें.
    8. 3 घंटा - 30 मिनट के लिए या 2 के लिए -20 डिग्री सेल्सियस -80 डिग्री सेल्सियस पर शीघ्र ही और जगह vortexing द्वारा मिक्स. यदि आवश्यक हो, -20 डिग्री सेल्सियस पर शाही सेना हे / एन की दुकान.
    9. 15,000 × जी और 4 डिग्री सेल्सियस - 13,000 पर 60 मिनट - 30 के लिए अपकेंद्रित्र.
    10. Pipetting या आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला निकालें.
    11. गोली पर 70% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़कर धो गोली. भंवर नमूना नहीं है.
    12. 15,000 × जी और 4 डिग्री सेल्सियस - 13,000 पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र नमूना.
    13. Pipetting या आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला निकालें.
    14. धूआं हुड के तहत शुष्क हवा गोली. जरूरत -20 डिग्री सीओ पर / एन अगर गोली स्टोर.
    15. 2 मिनट के लिए vortexing द्वारा एच 2 ओ इलाज किया 30 μl DEPC में गोली भंग और पीई भंग करने के लिए इस समाधान का उपयोगनमूना प्रति इसी दूसरा ट्यूब की llet (एक निष्कर्षण जोड़ी प्रति 30 μl समाधान).
    16. शाही सेना एकाग्रता उपाय है, और यह औसतम व्यक्त mRNAs का प्राइमर विस्तार में उपयोग के लिए 1 माइक्रोग्राम प्रति / μl से अधिक है कि यह सुनिश्चित करें.
    17. यदि आवश्यक हो, कुछ महीनों के लिए कई हफ्तों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर शाही सेना की दुकान.

2. प्राइमर एक्सटेंशन रिएक्शन

  1. प्रथम डिजाइन
    नोट: एक प्राइमर विस्तार के प्रयोग के लिए प्राइमर डिजाइनिंग, (मैनुअल इस पत्र में अधिक जानकारी और चर्चा अनुभाग के लिए स्वचालित जेल Sequencer साथ देखें) पीसीआर प्रथम डिजाइन के सामान्य दिशा-निर्देशों का पालन करना.
    1. विशेष रूप से, प्राइमरों (मैं) अड्डों में से रन शामिल नहीं है कि यह सुनिश्चित करें, (द्वितीय) 3 'अंत में एक जी या सी, अधिकारी (तीन) एक संतुलित जीसी है: अनुपात में, (चतुर्थ) के बारे में एक annealing तापमान है 55 - हित के क्षेत्र के बहाव में 60 डिग्री सेल्सियस और (v) बाँध कम से कम 50 बीपी, बेहतर 100 बीपी स्पष्ट चित्र प्राप्त करने के लिए.
  2. प्राइमर विस्तार प्रतिक्रिया
    नोट: प्राइमर विस्तार प्रतिक्रिया (सीडीएनए संश्लेषण) टेम्पलेट शाही सेना की उच्च मात्रा की आवश्यकता है. इस्तेमाल किया शाही सेना की मात्रा कम करने के लिए चुना जाता है, तो संकेत का पता लगाने के लिए भी कम हो सकता है! जैसा कि ऊपर वर्णित इसलिए हम शाही सेना के शोधन की सलाह देते हैं.
    नोट: चेतावनी: प्रयोग RNase मुक्त अभिकर्मकों और प्लास्टिक के बर्तन !!!
    1. 95 डिग्री सेल्सियस के तापमान को थर्मामीटरों cycler पहले से गरम और उपयोग और reproducibility की आसानी के लिए एक थर्मामीटरों cycler में सब आगे ऊष्मायन कदम बाहर ले.
    2. प्रत्येक शाही सेना के नमूने के लिए एक पीसीआर ट्यूब में 2 टेबल से यौगिकों मिलाएं.
    3. 95 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए नमूने denature.
    4. RNAs और प्राइमरों संकरण करने के लिए 5 मिनट के लिए बर्फ और ठंड पर ट्यूबों रखें.
    5. 47 डिग्री सेल्सियस पीसीआर मशीन सेट करें.
    6. तालिका 3 में वर्णित के रूप में इस दौरान रिवर्स प्रतिलेखन मास्टर मिश्रण तैयार करते हैं.
    7. प्रत्येक संकरित शाही सेना को रिवर्स प्रतिलेखन मास्टर मिश्रण के 4 μl जोड़ेंनमूना.
    8. 47 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए ट्यूबों सेते हैं. नोट: AMV के आरटी के लिए अधिकतम तापमान 42 डिग्री सेल्सियस है, लेकिन उच्च तापमान आरएनए अणुओं के माध्यमिक संरचनाओं से उबरने के लिए मदद करते हैं.
    9. 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के लिए नमूने हीटिंग द्वारा प्रतिक्रिया बंद करो.
      नोट: Formamide, संक्षारक विषाक्त है और अजन्मे बच्चे के लिए हानिकारक हो सकता है. , सामग्री सुरक्षा डाटा शीट पढ़ने के देखभाल के साथ संभाल और उचित संरक्षण पहनने करें!
    10. अंधेरे में -20 डिग्री सेल्सियस पर हे / N के लिए और दुकान में दो सप्ताह के लिए (/ वी) नीला bromophenol डब्ल्यू 0.05% (95% (वी / वी) विआयनीकृत Formamide, 10 मिमी EDTA,) formamide लोडिंग डाई के 6 μl जोड़ें.

अनुक्रमण सीढ़ी के 3. तैयारी

नोट: अनुक्रमण सीढ़ी प्रतिक्रिया प्लास्मिड या जीनोमिक डीएनए की उच्च मात्रा की मात्रा नरमपंथी या तो की आवश्यकता है. जब भी संभव हो, अनुक्रम प्रतिक्रिया में plasmids के उपयोग के कारण अलगाव और उच्च हस्ताक्षर की आसानी के लिए सिफारिश की हैएनएएल तीव्रता. अन्य मामलों में, हम नियमित रूप से से जीनोमिक डीएनए तैयार करने के लिए Marmur 5,14 से अपनाया एक विधि का उपयोग कोलाई और एस आवश्यकता के बिना ऑरियस कोशिकाओं फिनोल उपयोग करने के लिए. प्रिंसिपल में उच्च मात्रा और जीनोमिक डीएनए की पवित्रता पैदावार कि कोई भी तरीका इस्तेमाल किया जा सकता है.

  1. जीनोमिक डीएनए अलगाव
    1. के 10 मिलीलीटर बढ़ो कोलाई या एस ऑरियस कोशिकाओं हे / पौंड, बी.एम. 5 या टीएसबी माध्यम में एन.
    2. एक 15 एमएल फाल्कन ट्यूब में 4,600 × पर 10 मिनट के लिए centrifugation द्वारा हार्वेस्ट कोशिकाओं.
    3. कुछ मिनी तैयारी किट के रूप में पाया 2 मिलीलीटर बफर P1 में resuspended गोली (50 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 8.0, 10 मिमी EDTA, 100 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर RNase ए).
    4. 40 μl lysostaphin (-20 डिग्री सेल्सियस पर 0.5 मिलीग्राम / एमएल, भंडारण) - 20 से 60 मिनट - 45 के लिए Lyse कोशिकाओं. नोट: के लिए कोलाई कोशिकाओं एंजाइमी पूर्व उपचार छोड़ा जा सकता है या लाइसोजाइम इस्तेमाल किया.
    5. निलंबन और incubat करने के लिए (45% इथेनॉल में) संतृप्त एसडीएस समाधान के 100 μl जोड़ें37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ई.
    6. 650 μl 5 एम NaClO 4 और संक्षेप में भंवर कोशिकाओं जोड़ें.
      नोट: क्लोरोफॉर्म एक संभावित कैसरजन है. सामग्री सुरक्षा डाटा शीट पढ़ सकते हैं और उचित संरक्षण के साथ एक धूआं हुड के अंतर्गत प्रयोग करें !!!
    7. मिश्रण करने के लिए: (1 अनुपात 24) और कम से कम 60 सेकंड के लिए हिला क्लोरोफॉर्म / isopentanol के 3 मिलीलीटर जोड़ें. नोट: तरल एक समरूप सफेद पायस में बदल देना चाहिए.
    8. चरणों अलग करने के लिए 10 मिनट में 4,600 × छ और आरटी के लिए अपकेंद्रित्र नमूना.
    9. ध्यान से एक ताजा ट्यूब को स्पष्ट ऊपरी (जलीय) चरण हस्तांतरण. समाधान परेशान है, क्लोरोफॉर्म / isopentanol निष्कर्षण दोहराएँ. डीएनए समाधान की मात्रा को मापने और इथेनॉल (100%) के 2 संस्करणों के साथ एक ताजा ट्यूब तैयार करते हैं.
    10. धीरे धीरे छानना या ट्यूब युक्त इथेनॉल में डीएनए समाधान पिपेट. नोट: डीएनए नीचे या जब पूरी तरह से सूखे चूर्ण एक अस्थायी सफेद क्लस्टर के रूप में के रूप में पारदर्शी, घने कॉयल वेग चाहिए.
    11. डी निकालते हैंएनए गिलास पाश्चर pipettes (चित्रा 2) से बने हुक का उपयोग और 1 मिलीलीटर 70% इथेनॉल के एक व्यक्ति ट्यूब में सूई से दो बार प्रत्येक नमूने धो लो.
    12. एक रैक में ईमानदार हुक प्लेस और हवा में 60 मिनट के लिए गोली सूखी. यदि आवश्यक हो, आरटी पर कई दिनों के लिए सूखे डीएनए की दुकान.
    13. 500 μl DDH 2 ओ - डीएनए कवर कांच हुक बंद तोड़ने और 100 युक्त एक 2.0 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में रखकर डीएनए भंग 1500 एनजी / μl - 1000 के अंतिम डीएनए एकाग्रता के लिए मात्रा समायोजित करें. जीनोमिक डीएनए के 18 माइक्रोग्राम प्रति - एक अनुक्रमण प्रतिक्रिया के लिए, 10 का उपयोग करें.

चित्रा 2
चित्रा एक डीएनए मछली पकड़ने वाली छड़ी बनाने के लिए पर 2. निर्देश. एक लैम्प बर्नर की लौ में एक गिलास पाश्चर पिपेट की नोक पकड़ो. यह टी में एक छोटे हुक बनाने, कई सेकंड के बाद पिघलने शुरू करने के लिए कांच का कारण बनता हैवह खत्म होता है. जल्दी लौ से हटाने और 1 मिनट के लिए शांत करते हैं.

  1. प्लाज्मिड अलगाव
    1. मानक मिनी तैयारी किट का उपयोग प्लास्मिड तैयार है और क्षालन बफर (10 मिमी Tris-सीएल, पीएच 8.5) में भंग. एक अनुक्रमण सीढ़ी के लिए प्लाज्मिड के 500 एनजी - प्लाज्मिड आकार पर निर्भर करता है, 100 का उपयोग करें.
  2. सेंगर अनुक्रमण प्रतिक्रिया
    नोट: प्राइमर एक्सटेंशन के प्रयोजन के लिए अच्छी तरह से काम करता है कि 7 DEÄžÄ-dGTP साथ एक fluorescently लेबल प्राइमर अनुक्रमण किट का उपयोग करता है कि एक साधारण प्रोटोकॉल नीचे लगता है. विस्तृत जानकारी के लिए अनुक्रमण किट पुस्तिका का संदर्भ लें. अनुक्रमण प्रतिक्रिया में एक ही लंबाई के उत्पादों को बनाने के लिए प्राइमर विस्तार प्रतिक्रिया के रूप में एक ही प्राइमर का उपयोग करना चाहिए कि कृपया ध्यान दें.
    1. 1 μl DMSO के और 1 μl fluorescently लेबल प्राइमर (/ μl 2 pmol) के साथ - (15 माइक्रोग्राम प्रति ~ 10) जीनोमिक डीएनए के 12 μl मिक्स.
    2. चार अनुक्रमण प्रतिक्रिया घोला जा सकता है (ए, सी, जी या टी) के प्रत्येक 1 μl करने के लिए, डीएनए / DMSO / प्राइमर मिश्रण के 3 μl जोड़ें. एक पीसीआर मशीन में नमूने रखें, और निम्न पीसीआर कार्यक्रम चलाने: 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 20 सेकंड, 20 सेकंड के लिए 54 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड के लिए 70 डिग्री सेल्सियस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्रों; 4 डिग्री सेल्सियस पर हमेशा के लिए रहते हैं.
    3. चलाने के बाद, मशीन से नमूनों को दूर हफ्तों के लिए कई दिनों तक बर्फ (अल्पावधि) या -20 डिग्री सेल्सियस पर लोडिंग डाई और दुकान के 6 μl जोड़ें.

4. जेल सेटअप और उपकरण चलाएँ

नोट: अनुक्रमण जेल उपकरण इकट्ठा किया है के बारे में विस्तृत जानकारी, जेल तैयार किया जाता है और कैसे जेल चलाया जाता है निर्माता प्रोटोकॉल में पाया जा सकता है.

  1. तैयारी
    1. तालिका 4 में संकेत के रूप में 10x TBE तैयार करें.
    2. जेल रन के दिन ultrapure DDH 2 ओ के साथ 1x TBE बफर के 1 एल तैयार
    3. 10% (डब्ल्यू / वी) ए पी एस तैयार करें. नोट: कई महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 200 μl aliquots में संग्रहित किया जा सकता है, लेकिन गतिविधि समय के साथ कम हो सकती है <./ ली>
  2. जेल कास्टिंग चैंबर के विधानसभा
    1. कांच की प्लेटों के बीच धूल और एक प्रकार का वृक्ष से बचें. गीले पोंछे का उपयोग इसलिए अच्छी तरह से साफ काम कर सतहों.
    2. गिलास प्लेट के भीतर की ओर के लिए isopropanol तो दोनों पक्षों पर डिस्पोजेबल कागज तौलिए और आसुत जल का उपयोग कर 25 सेमी गिलास प्लेट की एक जोड़ी साफ और.
    3. (चित्रा 3) के पीछे गिलास प्लेट पर 0.25 मिमी spacers के प्लेस और शीर्ष पर नोकदार गिलास प्लेट कम है.
    4. नोकदार अंत के साथ गिलास प्लेट और ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रेल प्रविष्टि पायलटों के दोनों पक्षों के लिए जेल रेल देते हैं और हल्के से knobs के कस लें.

चित्रा 3
चित्रा 3. जेल वैद्युतकणसंचलन गिलास प्लेट को देखते हुए विस्फोट हो गया. गिलास प्लेट directionally इस्तेमाल किया जाना चाहिए. अंदर की ओर गिलास प्लेट के भीतर की ओर और बाहरी सामना करने के लिए ध्यान रखनाबाहर की ओर.

चित्रा 4
चित्रा 4. एक इकट्ठे जेल तंत्र के देखें. जेल समाधान इंजेक्शन लगाने के बाद, जेब स्पेसर गिलास प्लेटों के बीच समाधान में रखा गया है. कास्टिंग थाली तो सामने गिलास प्लेट और जेल पटरियों के बीच गिरावट और रेल knobs के बन्धन से सुरक्षित है.

  1. जेल कास्टिंग
    नोट: गैर polymerized एक्रिलामाइड न्यूरोटौक्सिक है! सामग्री सुरक्षा डाटा शीट पढ़ सकते हैं और उचित संरक्षण के साथ उपयोग करें !!!
    1. एक बीकर में 5 तालिका में सूचीबद्ध यौगिकों जोड़ें और हलचल बार और एक चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग कर मिश्रण.
    2. इसके तत्काल बाद ए पी एस और TEMED जोड़ने के बाद, एक 50 मिलीलीटर सिरिंज में जेल समाधान को लेकर नोक पर एक 0.45 एनएम फिल्टर जगह है.
    3. या तो एक हाथ से गिलास प्लेट के ऊपर बढ़त पकड़ या sandwic जगह20 डिग्री - एक जेल कास्टिंग में एच 10 कोणीय एक ढाल बनाने के लिए खड़े हो जाओ.
    4. धीरे-धीरे लगातार दूसरे के लिए एक तरफ से सिरिंज टिप चलती है, जबकि गिलास प्लेट के बीच जेल समाधान बांटना और जेल समाधान नीचे अंत से मिलता है एक बार बंद करो.
    5. ओर ले जाएं या पूरी तरह से एक बुलबुला हुक का उपयोग कर किसी भी गठन बुलबुले को हटा दें.
    6. नोकदार अंत में कांच की प्लेटों के बीच जेल जेब स्पेसर (0.25 मिमी) स्लाइड, जेल समाधान में डूब और कास्टिंग प्लेट संलग्न द्वारा तय कर लो.
    7. जकड़ना ऊपरी रेल शिकंजा हल्के से (पूरी तरह से इकट्ठे तंत्र के लिए चित्रा 4 देखें).
    8. 2 घंटा - 1 के लिए जेल सेट करते हैं.
    9. कास्टिंग प्लेट और जेब स्पेसर निकालें और नमक और जेल अवशेषों से जेब साफ.
    10. DDH 2 ओ के साथ कुल्ला और ऊतक कागजात के साथ अतिरिक्त समाधान पोंछ.
  2. चल रहा है और जेल visualizing
    नोट: अनुक्रमण जैल सीधे जबकि, जेल इमेजर में वैद्युतकणसंचलन के अधीन हैंप्रतिदीप्ति एक साथ एक लेजर खुर्दबीन से पता चला है. जेल पहला चलाने के लिए और फिर दाग और कल्पना है, जहां पारंपरिक जेल वैद्युतकणसंचलन, के विपरीत, पता लगाने इकाई तय हो गई है और वे लेजर पारित रूप में वास्तविक समय में बैंड को स्कैन करता है. अधिक हाल के संस्करण को अपनाया जा सकता है जो उल्लिखित है ओएस / 2 पर ImagIR डाटा संग्रह सॉफ्टवेयर के लिए एक प्रक्रिया है, नीचे. अधिक जानकारी के लिए उपयोगकर्ता पुस्तिका देखें.
    1. सामने गिलास प्लेट पर जेल रेल में बफर टैंक धारक स्लाइड और knobs कस लें.
    2. हीटिंग थाली के खिलाफ स्वचालित जेल इमेजर के निचले जेल टैंक में जेल प्लेस और तंत्र कोष्ठक में रेल प्रविष्टि पायलट फिसलने से तय कर लो.
    3. पावर कॉर्ड का उपयोग कर सत्ता में ऊपरी बफर चैम्बर कम बफर चैम्बर बंद और कनेक्ट, निचले और ऊपरी जेल बफर कक्षों में 1x TBE बफर भरें.
    4. अगर मौजूद है, बार-बार जेब में बफर pipetting द्वारा नमक-अवशेषों से जेल जेब साफ.
    5. शीर्ष बफर ढक्कन का उपयोग शीर्ष बफर टैंक चैम्बर बंद करें.
    6. मशीन दरवाजा बंद करो और इमेजर और कंप्यूटर पर स्विच और बेस ImagIR डाटा संग्रह सॉफ्टवेयर शुरू करते हैं.
    7. एक नई परियोजना फ़ाइल (फ़ाइल> नई ...) बनाने के लिए, एक परियोजना फ़ाइल नाम दर्ज उपयुक्त लेजर पर्वतमाला (700 या 800 एनएम) का चयन करें और ठीक से पुष्टि करें.
    8. विकल्प-> ऑटो लाभ ... शीर्ष पर छवि मेनू से चुनें, ऑटो लाभ माप शुरू करें और ठीक क्लिक करके सेटिंग स्वीकार करने के लिए ऑटो पर क्लिक करें.
    9. ध्यान केंद्रित ... स्कैनर नियंत्रण मेनू से, ऑटो बटन पर क्लिक करें और ठीक क्लिक करके सेटिंग को स्वीकार> विकल्प- चुनकर लेजर फोकस.
    10. नव केंद्रित क्षेत्र को समायोजित करने के लिए स्वत: प्राप्त प्रक्रिया दोहराएं.
    11. सेटअप इन सेटिंग्स के अनुसार स्कैनर नियंत्रण: 2,000 वी, 35 एमए, 45 डब्ल्यू, 45 डिग्री सेल्सियस, स्कैन फिल्टर: 3, स्कैन गति: 3.
    12. 20 मिनट के लिए खाली जेल (चुनिंदा वोल्टेज पर और प्रेस Prerun <enter> ).
    13. इस बीच, फिर 90 डिग्री सेल्सियस के लिए 2 मिनट के लिए एक पीसीआर मशीन में अनुक्रमण सीढ़ी और प्राइमर विस्तार उत्पादों गर्मी बर्फ पर शांत.
    14. , वैद्युतकणसंचलन बंद करो स्वचालित जेल Sequencer खोलने के लिए और ऊपरी बफर टैंक ढक्कन हटा दें.
    15. गिलास प्लेट के बीच में शार्क दांत-कंघी डालें और थोड़ा शार्क दांत के साथ जेल पियर्स (चित्रा 5 देखें).

चित्रा 5
चित्रा 5. बंद हुआ शार्क दाँत कंघी के साथ जेल के दृश्य. नमूना (बैंगनी) शार्क दांत के बीच में लागू किया जाता है.

  1. पिपेट या तो 1 - (शार्क दांत द्वारा गठित) प्रत्येक जेल की जेब में विस्तार उत्पादों या अनुक्रमण सीढ़ी प्रतिक्रियाओं प्राइमर के 2 μl.
  2. नहीं सभी जेब की जरूरत है, में रोकने के लिए लोडिंग डाई के साथ खाली जेब भरनेलगातार चल व्यवहार.
  3. जेल Sequencer के बफर टैंक और दरवाजा बंद कर दें.
  4. वैद्युतकणसंचलन आरंभ और लेजर (चयन वोल्टेज पर और लेजर पर और प्रेस पर बारी ) <Enter>.
  5. ब्याज के क्षेत्र लेजर बीत चुका है एक बार वैद्युतकणसंचलन बंद करो.

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Representative Results

चित्रा 6 में दर्शाया के रूप में, एक प्राइमर विस्तार प्रतिक्रिया ब्याज के टेप के transcriptional शुरू अंक निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और (आमतौर -10 और -35 तत्वों द्वारा की पहचान) प्रमोटर क्षेत्रों परिणाम निकालना कर सकते हैं. सर्वोच्च (सबसे लंबे समय तक) सीडीएनए टुकड़ा mRNA की 5 'अंत का प्रतिनिधित्व करता है और इस प्रकार अनुक्रमण सीढ़ी की तुलना में आसानी से जब मैप किया जा सकता है.

चित्रा 6
एक किताब के विस्तार प्रतिक्रिया की चित्रा 6. प्रतिनिधि परिणाम. बाईं ओर से एक पूर्ण vivo में प्राइमर विस्तार जेल पर विभिन्न plasmids के साथ कोलाई दिखाया गया है. ब्याज की अलग-अलग क्षेत्रों बढ़े हैं. शीर्ष भाग (ए) में, OMPA ट्रांस्क्रिप्शनल प्रारंभिक बिंदु के निर्धारण में दिखाया गया है. रिवर्स प्रतिलेखन mRNA की 5 'अंत में बंद हो जाता है और इस प्रकार इंडस्ट्रीज़ (पूर्ण लंबाई शाही सेना के एक बैंड बनाता है) एक तीर से icated. साथ अनुक्रम में दिखाया गया है अनुक्रमण सीढ़ी के साथ सीडीएनए बैंड aligning से, mRNA की 5 'अंत निर्धारित किया जा सकता है. निचले हिस्से (बी) में, YoeB-seq2 RNase द्वारा OMPA प्रतिलेख की दरार दिखाया गया है. 1 गलियों - अभाव और सीडीएनए उत्पादों की उपस्थिति के साथ coinciding, 5 एक सक्रिय RNase साथ नमूनों का प्रतिनिधित्व करते हैं - 3 4 लेन जबकि विष YoeB-seq2 लापता या निष्क्रिय है जिसमें नमूने का प्रतिनिधित्व करते हैं. तीर द्वारा संकेत के रूप में दो मुख्य दरार उत्पादों बनाई गई हैं. प्रत्येक लेन और अनुक्रमण सीढ़ी की इसी शाही सेना बेस में इस्तेमाल किया ddNTP लेबल है. ट्रांसक्रिप्ट भागों मैजंटा फॉन्ट द्वारा कोडोन नीले फ़ॉन्ट, प्रमोटर तत्वों और अगस्त शुरू से संकेत कर रहे हैं. अधिक जानकारी के लिए; Nolle एट अल से मूल शोध आलेख देखें., सूक्ष्म जीव विज्ञान 159, 1575-1585 (2013). के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने.

चित्रा 6 में दिखाए गए उदाहरण में, OMPA mRNA की टीएसपी (जेल नीचे अनुक्रम में एक तीर के साथ चिह्नित) एक जी आधार होने के लिए निर्धारित किया गया था. यह 15 से पहले प्रकाशित OMPA टीएसपी के अनुरूप है. रूपांकनों केवल अपने संबंधित सर्वसम्मति दृश्यों (क्रमशः TTGACA और TATAAT) से दो कुर्सियां ​​प्रत्येक भिन्न रूप में प्रमोटर के -35 और -10 तत्वों TTGTAA और TAGACT 16 होने की deduced किया जा सकता है.

इस तरह 5 'जाति के रूप में अन्य तरीकों के विपरीत, प्राइमर विस्तार प्रतिक्रियाओं सही रूप में निर्धारित और आरएनए अणुओं की दरार यों इस्तेमाल किया जा सकता है. आरएनए अणुओं की दरार एक साथ जेल में सीडीएनए बैंड के रूप में पता लगाया जा सकता है, जो नि: शुल्क 5 'समाप्त होता है, बनाता है. कई पीसीआर उत्पादों दरार उत्पादों को प्राप्त करने के अनुक्रम किया जाना चाहिए क्योंकि एक mRNA की कई दरार उत्पादों की पहचान करना, 5 'रेस प्रयोगों में अधिक मुश्किल हैकि केवल कुल (असंसाधित) आरएनए थोक का एक छोटा सा अंश का प्रतिनिधित्व करते.

चित्रा 6 के निचले हिस्से में, एक RNase से दरार की शाही सेना मानचित्रण दिखाया गया है. पहले 5, RNase YoeB-seq2, एस से एक टीए-प्रणाली का हिस्सा के रूप में वर्णित 17 equorum, शुरू कोडोन के करीब cleaves mRNAs. इस दरार आत्मीय विरोधी विष YefM-seq2 से हिचकते जा सकता है. RNase YoeB (गलियों 1 - 3) वर्तमान या निष्क्रिय नहीं है, कोई प्राइमर विस्तार उत्पादों करीबी शुरुआत के कोडोन के लिए बनते हैं. RNase गतिविधि शीघ्र ही नीचे की ओर कोडोन प्रकट शुरू की वर्तमान (गलियों 4 और 5), दो मजबूत बैंड है जब भी. इस दृष्टिकोण का प्रयोग, दरार पैटर्न को आसानी से पहचाना जा सकता है.

चित्रा 7 एक असफल प्राइमर विस्तार प्रयोग से पता चलता है. रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में अतिरिक्त शाही सेना को, सीडीएनए के उत्पन्न राशि इस तरह के एक मजबूत संकेत बनाता कारण, कि व्यक्ति सीडीएनए बैंडएस प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है. इस 5 'शाही सेना अंत दृढ़ संकल्प असंभव बना देता है.

(चित्रा 7 में दर्शाया के रूप में) एक ऐसी ribosomal शाही सेना के रूप में प्राइमर विस्तार प्रतिक्रिया में अत्यधिक व्यक्त RNAs, का उपयोग करते हैं, तो अधिक क्षेत्रों उजागर का खतरा बढ़ जाता. इसलिए, कुल टेम्पलेट शाही सेना की राशि ब्याज की शाही सेना की बहुतायत को समायोजित किया जाना चाहिए. ब्याज के टेप केवल कुल शाही सेना की एक छोटी राशि का गठन जब इसके विपरीत, रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में राशि अन्यथा संकेत भी बेहोश हो जाएगा, वृद्धि की जानी चाहिए () नहीं दिखाया. यह भी बहुत मजबूत संकेतों में परिणाम (जैसे rRNA जीन या प्लास्मिड पर इनकोडिंग जीन के रूप में) सेल प्रति multicopy टेम्पलेट्स के रूप में, सेंगर अनुक्रमण प्रतिक्रिया के लिए लागू होता है.

चित्रा 7
चित्रा 7. से एक असफल प्राइमर विस्तार के प्रतिनिधि परिणाम एनजी> एस ऑरियस. -16 आरएनए बैक्टीरियल कोशिकाओं में अत्यधिक प्रचुर मात्रा में है. कुल शाही सेना के मध्यम मात्रा में उपयोग किया जाता है जब यह मजबूत रिवर्स प्रतिलेखन संकेतों की ओर जाता है. यहाँ दर्शाया मामले में, मजबूत सीडीएनए बैंड सटीक 5 'अंत और इसलिए 5 रोकने के' मुखौटा मानचित्रण. इसके अलावा, ribosomal RNAs के उच्च संरचित कर रहे हैं और इसलिए पूरी लंबाई के टुकड़े का प्रतिनिधित्व नहीं करते कि कम सीडीएनए उत्पादों के उत्पादन, समय से पहले रिवर्स प्रतिलेखन समाप्त कर सकते हैं. एक गर्मी प्रतिरोधी रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस के साथ एक साथ, रिवर्स प्रतिलेखन तापमान में वृद्धि इस मामले में यह आसान अतीत माध्यमिक संरचनाओं synthesize करने के लिए कर सकते हैं. कारण जीनोमिक डीएनए अनुक्रम के कई प्रतियां के लिए, सेंगर अनुक्रमण सीढ़ी भी कॉपी जीन के लिए की तुलना में मजबूत है. जेल तस्वीर सुधारने के लिए, आरएनए और डीएनए रिवर्स प्रतिलेखन के लिए बराबर है और सेंगर प्रतिक्रिया कम किया जाना चाहिए और / या कम उत्पाद जेल के लिए आवेदन किया._upload / 52134 / 52134fig7large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

तालिका 1: शाही सेना के DNase मैं पाचन.

पदार्थ मात्रा
ऊपर कदम से शाही सेना 70-100 माइक्रोग्राम प्रति
10x DNase मैं बफर (100 मिमी Tris, पीएच 7.5, 25 मिमी 2 MgCl, 2 से 5 मिमी CaCl) 50 μl
DNase मैं, RNase मुक्त (2 यू / μl) 10.0 μl (आरएनए का 10 माइक्रोग्राम प्रति DNase मैं के 1 μl प्रति)
DDH 2 हे के साथ 500 μl के लिए मात्रा लाओ (DEPC इलाज)

DNase की प्रतिक्रिया मात्रा और राशि मैं राशि ओ के आधार पर बढ़ाया या नीचे जा सकता हैएफ शाही सेना का इस्तेमाल किया.

तालिका 2: शाही सेना प्राइमर संकरण.

यौगिक एक प्रतिक्रिया के लिए राशि
शाही सेना 5-15 माइक्रोग्राम प्रति
Fluorescently लेबल प्राइमर 2 pmol
DDH साथ 6 μl के मात्रा लाओ 2 ओ (DEPC इलाज)

शाही सेना नमूना और प्राइमर प्रति एक प्रतिक्रिया सेट करें.

तालिका 3: प्राइमर एक्सटेंशन मास्टर मिश्रण.

यौगिक एक प्रतिक्रिया के लिए राशि
DDH 2 ओ (DEPC इलाज) 1.3 μl
AMV के आरटी बफर (10x) 1.0μl
dNTPs (10 मिमी, RNase मुक्त) 1.0 μl
RNase अवरोध करनेवाला 0.2 μl
AMV रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (आरटी) (20-25 यू / μl) 0.5 μl

जरूरत प्रतिक्रियाओं की संख्या के लिए पैमाने पर.

सारणी 4: 10x TBE नुस्खा.

पदार्थ मात्रा
Tris बेस 107.8 जी
बोरिक एसिड 55.0 जी
EDTA 7.4 जी
धूल और एक प्रकार का वृक्ष हटाने के लिए ultrapure DDH 2 हे और फिल्टर के साथ 1000 मिलीलीटर मात्रा ऊपर लाओ

4 डिग्री पर धूल और एक प्रकार का वृक्ष और दुकान को हटाने के लिए फ़िल्टरसी

तालिका 5: अनुक्रमण जेल नुस्खा.

यौगिक मात्रा
यूरिया 10.5 जी
DDH 2 ओ (MilliQ) 13.0 मिलीलीटर
10x TBE 2.5 मिलीलीटर
एक्स्ट्रा लार्ज रैपिड जेल समाधान 5.0 मिलीलीटर
TEMED (एन, एन, एन, N'-Tetramethylethane-1,2-Diamine) 25 μl
ए पी एस (अमोनियम persulfate, 10%) 175 μl

जल्दी TEMED और ए पी एस के अलावा के बाद प्रोसेस जेल समाधान.

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Discussion

फ्लोरोसेंट प्राइमर विस्तार TSP- या माध्यमिक शाही सेना प्रसंस्करण पहचान के लिए, या तो RNAs के 5 'सिरों को निर्धारित करने के लिए एक सरल और तेजी से विधि है. कारण फ्लोरोसेंट प्राइमर का उपयोग करने के लिए, प्रतिक्रियाओं को सेट किया जा सकता है और (radioactively लेबल प्राइमरों के मामले में) के विपरीत अतिरिक्त सुरक्षा सावधानियों के बिना चलाते हैं. नमूने प्रतिदीप्ति द्वारा पता चला रहे हैं वैद्युतकणसंचलन एक्स-रे फिल्मों में आमतौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं जहां रेडियोधर्मी तरीकों की तुलना में तेजी से विश्लेषण की अनुमति देता है जो कार्य प्रगति पर है, जबकि वे imaged किया जा सकता है.

सामान्य में, प्राइमर विस्तार प्रतिक्रिया की गुणवत्ता ग्रेड और प्राइमर के बंधन क्षमताओं पर दृढ़ता से निर्भर है. बाध्यकारी साइट हित के क्षेत्र के करीब चुना है, प्राइमर स्मीयरों संकेत मुखौटा हो सकता है, एक बाध्यकारी साइट जबकि बहुत दूर (> 300 बीपी) 5 'अंत से एक गरीब संकेत हो सकता है.

फ्लोरोसेंट डाई covalently से जोड़ा जाना चाहिएसंश्लेषण और oligonucleotide दौरान कस्टम डीएनए oligonucleotide के 5 'अंत अवशिष्ट लवण से रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के साथ हस्तक्षेप को रोकने के लिए एचपीएलसी द्वारा शुद्ध किया जाना चाहिए. उचित डाई संशोधन (संगत रंगों पर अधिक जानकारी के लिए अभिकर्मकों सूची तालिका देखें) के साथ oligonucleotides के सबसे oligonucleotide संश्लेषण कंपनियों से आदेश दिया जा सकता है और अंधेरे में संग्रहित किया जाना चाहिए. Radiolabelled न्यूक्लियोटाइड के साथ संभव है के रूप में दुर्भाग्य से, हम पहले से मौजूदा oligonucleotides के लिए डाई संलग्न करने के लिए किसी भी एंजाइमी तकनीक से अनजान हैं.

यहाँ वर्णित अनुक्रमण प्रणाली में, दो अलग फ्लोरोसेंट रंगों उनकी उत्तेजना के रूप में, एक साथ दो नमूने का पता लगाने के लिए (लगभग 700 और 800 एनएम) का इस्तेमाल किया और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा अलग किया जा सकता है. इसके अलावा मूल निर्माता रंगों से, ऐसे अभिकर्मकों सूची में संकेत के रूप में अन्य रंगों उत्कृष्ट परिणाम का उत्पादन किया जा सकता है.

जनसंपर्क के लिए एक अन्य महत्वपूर्ण कारकImer विस्तार प्रतिक्रियाओं शाही सेना की गुणवत्ता और मात्रा है. केयर ऐसे AMV के आर टी के रूप में रिवर्स transcriptases एक टेम्पलेट के रूप में 18 डीएनए का उपयोग कर सकते हैं, जैसा कि डीएनए को दूर करने के लिए लिया जाना चाहिए.

चित्रा 7 में दिखाया गया है, जेल समय में बैंड का पता लगाया संकेत ताकत रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में इस्तेमाल किया आरएनए राशि पर निर्भर है. यह नमूने में ब्याज वर्तमान की शाही सेना के आनुपातिक राशि पर निर्भर करता है, कुल शाही सेना की राशि को समायोजित करने के लिए इसलिए जरूरी है. कम व्यक्त RNAs पता लगाने के लिए मुश्किल हो सकता है के रूप में इस विधि से कम संवेदनशीलता, भी अपने नुकसान में से एक है. कोई संकेत बिल्कुल भी पता लगाया जा सकता है, तो कुल शाही सेना की राशि बढ़ा जा सकता है या ब्याज की शाही सेना कृत्रिम रूप से एक प्लाज्मिड से overexpressed किया जा सकता है.

प्राइमर विस्तार आधारित प्रतिदीप्ति के लिए जेल पता लगाने संवेदनशीलता प्राइमर विस्तार 19 आधारित 32 पी या 33 पी रेडियो आइसोटोप की तुलना में कम कारक दस के बारे में है. हालांकि, इस नुकसान जेल के लिए या रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में इस्तेमाल किया शाही सेना टेम्पलेट की राशि बढ़ाने के द्वारा पर लोड सीडीएनए की राशि का समायोजन करके मुआवजा दिया जा सकता है. ज्यादातर मामलों में, संवेदनशीलता संतोषजनक परिणाम 4,5 के लिए काफी अधिक है. कम जोखिम बार के लाभ के साथ, एक केशिका Sequencer 3 के साथ संयोजन में फ्लोरोसेंट प्राइमर का उपयोग करते समय रेडियोधर्मी प्राइमर एक्सटेंशन के समान संवेदनशीलता सूचना दी गई है.

वे इस तरह के उपलब्ध मशीनों, प्राइमरों, सीढ़ी प्रतिक्रियाओं, उपलब्धता और रेडियोधर्मी पदार्थों, रेडियोधर्मी कचरे, प्रशिक्षण और व्यक्तिगत स्वास्थ्य जोखिम के निपटान के साथ काम करने के लिए एक प्रयोगशाला के रखरखाव के रूप में कई कारकों पर निर्भर के रूप में प्राइमर एक्सटेंशन आधारित प्रतिदीप्ति और रेडियोधर्मिता के बीच तुलना, मुश्किल हैं लागत . फ्लोरोसेंट प्राइमरों गैर लेबल मानक प्राइमरों (20 बीपी) से लगभग पांच से दस गुना अधिक महंगे हैं. हालांकि इन प्राइमरों कम से कम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैएक साल एक बहुत कम आधा जीवन है जो 32 पी लेबल प्राइमरों, की तुलना में (अधिक होने की संभावना कई वर्ष). पुनः लेबलिंग प्राइमरों के कारण लगातार अंतराल में नई रेडियोधर्मी सामग्री के लिए जरूरत के लिए, समय लेने वाली और महंगा है. प्राइमर का एक ही सेट एक लंबे समय अवधि के दौरान प्रयोग किया जाता है, फ्लोरोसेंट प्राइमरों नियमित, radioactively लेबल प्राइमरों से सस्ता है. मुख्य लागत बिंदु हालांकि फ्लोरोसेंट Sequencer या इमेजर और लागत प्रभावी नहीं हो सकता है प्राइमर एक्सटेंशन का उद्देश्य केवल यह उपकरण क्रय किया जाएगा. यहाँ वर्णित विधि के कब्जे में हैं या एक ऐसी मशीन का उपयोग किया है जो समूहों के लिए बल्कि दिलचस्प है.

एक स्वचालित जेल Sequencer उपलब्ध नहीं है, प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए अन्य तरीकों के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है. इस मामले में, जेल आवश्यक हो तो सूखे और फिर एक फ्लोरोसेंट इमेजर को हस्तांतरित, एक मानक वैद्युतकणसंचलन तंत्र में चलाया जा सकता है (मॉडल में एक लचीला के समान हैं जो उपलब्ध हैंatbed स्कैनर). चलाने के दौरान जेल visualizing का लाभ खो जाता है, रेडियोधर्मी आइसोटोप का उपयोग प्रयोगकर्ता के लिए इस तरह, एक महत्वपूर्ण लाभ से बचा जा सकता है. इसके अलावा, यदि उपलब्ध हो तो, एक केशिका Sequencer संवेदनशीलता को बढ़ाने में मदद कर सकते हैं जो जुदाई और वास्तविक समय का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

विभिन्न तरीकों हालांकि इन तरीकों अक्सर 19 (दोष और निकालने के लिए) नमूना ध्यान केंद्रित करने के लिए एक सीडीएनए वर्षा कदम की आवश्यकता होती है, स्वचालित जेल अनुक्रमण मशीनों या केशिका sequencers साथ फ्लोरोसेंट प्राइमर एक्सटेंशन का उपयोग करने के बारे में प्रकाशित किया गया है. यहाँ प्रस्तुत विधि में, डीएनए वर्षा इस प्रकार तैयारी के समय को कम करने के लिए आवश्यक नहीं है. वर्षा प्रक्रिया की विसंगतियां समाप्त किया जा सकता है के रूप में अर्द्ध मात्रात्मक नमूने में शाही सेना अणु की राशि का निर्धारण करने के लिए इससे भी महत्वपूर्ण बात हालांकि, इस कदम को छोड़ते हुए यह संभव बनाता है.

यह उल्लेखनीय है कि हालांकि जाना चाहिएआरएनए अणुओं के 5 'समाप्त होता है, प्राइमर विस्तार प्रतिक्रियाओं में मैप संसाधित और प्राथमिक सिरों (ट्रांस्क्रिप्शनल शुरू अंक) आसानी से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है किया जा सकता है. इन प्रतिबंधों को दरकिनार करने के लिए, उचित नियंत्रण के साथ प्रयोगों की सावधानीपूर्वक योजना आवश्यक है. स्पष्ट प्रमोटर दृश्यों एक ट्रांस्क्रिप्शनल प्रारंभिक बिंदु की उपस्थिति का संकेत कर सकते हैं और परिवर्तनशील या हटाने प्रमोटर तत्वों तो सीडीएनए बैंड समाप्त करना चाहिए. ऐसे दृश्यों को याद कर रहे हैं या विशिष्ट सर्वसम्मति दृश्यों मौजूद हैं दूसरी ओर, बैंड शाही सेना के प्रसंस्करण के कारण हो सकता है. प्रसंस्करण एंजाइम जाना जाता है और शुद्ध किया जा सकता है, तो इन विट्रो प्राइमर एक्सटेंशन प्रतिलेखन के रूप में, स्पष्टीकरण ला सकता है और प्रसंस्करण अलग किया जा सकता. इसके अलावा, (असंसाधित आरएनए अणुओं के enzymatic संवर्धन सहित) अन्य तरीकों जैसे 5 'रेस आरएनए प्रसंस्करण से ट्रांस्क्रिप्शनल शुरुआत के साइटों भेद करने के लिए प्राइमर एक्सटेंशन पूरक कर सकते हैं.

गुई प्राइमर विस्तार विधि अक्सर ऐसे 5 'रेस और एस 1 nuclease संरक्षण assays और इस प्रकार इसकी उपयोगिता कभी कभी पूछताछ की है के रूप में अन्य तरीकों की तुलना में है. उदाहरण के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के साथ संयोजन में RNAseq तकनीक हालांकि आवश्यक वित्तीय बोझ और bioinformatical काम ब्याज की एकल RNAs के लिए यह जगह अलाभकर बनाने TSPs और समानांतर में RNAs के कई के प्रसंस्करण साइटों, यह निर्धारित करने में मदद कर सकते हैं. दूसरी ओर 5'-दौड़ सस्ता है और परिणामों का विश्लेषण करने के लिए आसान कर रहे हैं, लेकिन RNAs के कई तरीके या कई ट्रांस्क्रिप्शनल शुरू अंक में मौजूद हैं संसाधित कर रहे हैं, उत्पाद क्लोन किया जाना चाहिए और उम्मीदवारों की एक बड़ी राशि के अनुक्रम करने की आवश्यकता ब्याज की RNAs के एक प्रतिनिधि दृश्य प्राप्त करते हैं.

नए तरीकों के बावजूद पिछले कुछ वर्षों में पैदा हुई होने में इसलिए, आज भी प्राइमर एक्सटेंशन के कारण विशेष रूप से सच है जो उपयोग, कम लागत और कम प्रतिवर्तन समय में आसानी, को उनके किशमिश हैयहाँ प्रस्तुत प्रतिदीप्ति आधारित पद्धति के लिए.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
AMV Reverse Transcriptase (20-25 U/µl) NEB / Roche NEB: M0277-T / Roche: 10109118001
DNase I (RNase free) Ambion (life technologies) AM2222
FastPrep-24 Instrument  MPBio 116004500
Fluorescently labeled primers Biomers n/a 5’ DY-681 modification of “ordinary” DNA oligonucleotides. Compatible dyes such as the LICOR IRDye 700/800 are also available from other suppliers such as IDTdna.
Li-Cor 4200 Sequencer incl. ImagIR Data collection software Li-Cor Product discontinued
NanoDrop 2000 Thermo Scientific
Nuclease free water Ambion (life technologies) AM9915G
Plasmid mini preparation kit QIAGEN 12125
RapidGel-XL-40% Concentrate USB US75863
RNA STORAGE BUFFER Ambion (life technologies) AM7000
Roti-Aqua-P/C/I Carl Roth X985.3 Alternative: “Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)” from Ambion (AM9720)
SUPERase•In RNase Inhibitor Ambion (life technologies) AM2696
Thermo Sequenase fluorescently labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP GE Healthcare RPN2538
TRIzol reagent life technologies 15596-026
Zirconia/Silica Beads 0.1 mm BioSpec 11079101z

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References

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