ポリソームプロファイリングによる哺乳動物細胞における選択的mRNAの翻訳の評価

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Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling. J. Vis. Exp. (92), e52295, doi:10.3791/52295 (2014).

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Abstract

タンパク質合成の調節は、ストレスに対する細胞応答の重要な制御点を表す。具体的には、控えめなRNA調節エレメントは通常、特定のストレス応答に必要なタンパク質をコードする特定のmRNAの選択的翻訳を可能にすることが示された。これらのmRNAの同定だけでなく、選択的な翻訳のために責任を調節メカニズムの特徴付けは、しばらくの間、分子生物学の最前線に立ってきました。ソームプロファイリングは、これらの研究における礎石方法です。ポリソームプロファイリングの目標は、異なる転写に積極的に翻訳するリボソームを固定化することによってmRNAの翻訳をキャプチャし、これにより、高度に翻訳された転写物および不完全に翻訳されたものとの区別を可能にする、スクロース勾配上の超遠心分離によって生じたポリリボソームを分離することである。次いで、これらは、さらに伝統的な生化学的および分子生物学的方法によって特徴付けることができる。重要なことは、組み合わせのpハイスループットゲノムアプローチとolysom​​eプロファイリングは翻訳制御の大規模解析を可能にします。

Introduction

タンパク質合成(翻訳)の調節は、密接に細胞生存にリンクされている重要な細胞プロセスです。翻訳が細胞のエネルギーの50%以上を消費することを考慮すると、変換が厳密に調節されていること、および翻訳の摂動が十分に許容されていないことは驚くべきことではない。逆に、多くの異常な細胞プロセスは、翻訳機構と翻訳出力( すなわちプロテオーム)を修正しなければならないことを要求している。これは、しばしば、様々なストレス応答および疾患状態における場合であり、おそらく最も癌に例示されている。翻訳制御の重要な利点は、迅速に、様々な外部及び内部トリガー、先端細胞生存および死亡1のバランスそれによって微調整機構に応じて、タンパク質の出力を再プログラムする細胞の能力である。

翻訳制御には2つの側面は、特に興味深いものです。規制MECの性質の理解hanism(単数または複数)と特定の変換を可能にする制御エレメントは、特定のmRNAおよび最初の場所で選択的翻訳を誘発し、特定のトリガに対する細胞応答に関与するそれらのタンパク質産物の同定。ソームプロファイリングは、両方のプロセスの効果的な研究を可能にする技術である。

ポリソームプロファイリング技術の全体的な目標は、異なる細胞条件下で特定のmRNAの翻訳状態を研究し、定量化することである。技術の原理は、「異なる転写産物上で「積極的に翻訳するリボソームを「凍結」することによってmRNAの翻訳を取り込むため、(数リボソームによって結合された)高度に翻訳された転写産物の区別を考慮して、ショ糖勾配上で遠心分離によって生じたポリリボソームを分離することで、不十分(1つまたは2つのリボソームによって結合された)ものを翻訳した。この特定のプロトコルに結合する抗生物質シクロヘキシミド中60SリボソームサブユニットとブロックリボソームのEサイト2からの脱アセチル化されたtRNAのリリースは、リボソームの転位を阻害し、mRNAの翻訳にリボソームを停止するために使用されます。しかし、このようなエメチンもブロック翻訳伸長3などの他のブロッキング剤を使用することができる。

翻訳プロセスの最終的な出力を測定し、ウェスタンブロッティングおよび35 Sメチオニン標識技術とは異なり、ポリソームプロファイリングは、このように異なる条件下で変換メカニズムのより詳細な研究を可能にし、積極的に翻訳mRNAとリボソームとの関連を測定するという利点を有する。したがって、この技術は、容易に翻訳調節7-9、タンパク質合成1,10,11、又はIRESの上流またはmRNA構造の効果に影響を与えるストレス状態に関与するタンパク質因子は、特異的に翻訳4-6の異なるモードを研究するために適合させることができるタンパク質シンセ上のオープンリーディングフレームESIS 12-14。今日では、ポリソームプロファイリングアプリケーションがさらに広いポリソーム関連するmRNAを分析するためのDNAマイクロアレイ15または次世代シーケンス16,17を用いている。

Protocol

:RNAで作業上の注意:RNaseによるRNAの分解から保護するために、標準的な予防措置を講じてください。プロトコルのすべての段階で手袋、バリアピペットチップ、RNaseフリープラスチック容器や薬品を使用してください。すべてのソリューションのために超高純度またはDEPC処理水を使用してください。製造業者のプロトコルに従ってのRNase不活化溶液による疑わしい表面を除染。

ソリューションの調製。

  1. 塩基性溶液を500mlの準備(0.3 MのNaCl、15ミリモルのMgCl 2·6H 2 O、15mMのトリス-HCl、pH7.4)。溶液が透明になるまで撹拌棒を用いて混合し、0.45μmのフィルターを通過する。室温で保管してください。
  2. 以下のように10〜50%スクロース溶液と60%のチェイス溶液を調製:
    1. 10%ショ糖液は、(w / v)の50ml遠心チューブ中で5gのスクロースを追加し、塩基性溶液で50mlにフィル。 50ml遠心管広告を50%ショ糖溶液(w / v)になるためのD 25gのスクロースおよび塩基性溶液50ミリリットルに記入してください。
    2. 60%(w / v)のチェイス·ソリューションを50ml遠心管に30gのスクロースを追加し、塩基性溶液で50mlにフィル。 60%のチェイス溶液に、(未溶解の粉末をペレット化遠心分離機を超えないが、溶解するまで水にブロモフェノールブルーを追加)飽和ブロモフェノールブルー溶液100μlを加える。ボルテックスを用いて混合し、完全な溶解を確認します。
    3. 4℃で保存するソリューションが必要になるまで。
  3. RNA溶解バッファーを準備します。実験の日に新鮮なこのバッファを準備します。各サンプルについてのRNA溶解バッファー500μlのを準備します。基本ソリューションの1ミリリットルに10μlのトリトンX-100(1%[V / V]最終)、DMSO(CHX、0​​.1ファイナルmg / ml)で、3.5μlのRNasinを(140 U、100 mg / mlのシクロヘキシミドの1μlを添加する/ mlで)。ボルテックスを用いて混合します。氷の上に保管してください。
    注:シクロヘキシミドは非常に有毒であり、突然変異を引き起こすことがある。皮膚接触や吸入を避ける。あまりにも頻繁に粉末状の取り扱いを避けるために、予備校DMSO、アリコート中に100mg / mlストックの大きい量であり、長期保存のために-80℃で維持する。 -20℃での在庫を働き続ける。
  4. 実験の日には、所望の10%の体積と50%ショ糖溶液(勾配当たりの各溶液を〜7ml)溶液にCHX(0.1mg / mlの最終濃度)を添加することにより、ショ糖+ CHX溶液を調製。

自動化されたグラデーションメーカーを使用してスクロース勾配の調製

  1. (!criticalstep)勾配メーカー '' ON ''とレベル勾配が保持するプレートを回し板が平準化されたとき '' '完了Done」をクリックします。
  2. メニュー上で実行されるべき勾配プログラムを選択します。
    1. プレス '' GRAD ''メニューと '' LIST ''を選択します。
    2. 「SW41」を選択します。
    3. リストをスクロールし、選択キーを押しによる 'プログラム' '10 - 11のステップ - 50%の勾配を」'' RUN ''ボタンをる。
  3. マーカーブロックに円錐形の超遠心管(SW-41チューブ、14×89ミリメートル)を配置し、マーカーブロックの上段に沿ってチューブ上のマークをトレースするために提供細管マーカーを使用しています。安定した表面上のフィッティングラックにチューブを置きます。
    注:このマークは、10および50%ショ糖ソリューションを重ねるための充填ガイドになります。
  4. 2 10ミリリットルの注射器に提供されている2つのカニューレを取り付けおよびRNaseの不活性化溶液を含む温かい蒸留水で上下にピペッティングによって洗う。その後の水の痕跡をすべて削除してください。
  5. 10%ショ糖+ CHXでの注射器のいずれかを記入し、超遠心管の底にカニューレを挿入します。それだけで、チューブで行わマークを過ぎて行くまで、慎重に10%ショ糖溶液を分注する。
    注:泡を作ることは避けてください。気泡が形成した場合、優しく、それらを変位させるチューブをタップします。
  6. 余分な液体を拭き取る、50%ショ糖+ CHXと他の注射器を埋めるで拭き、軽く超遠心管の底にカニューレを挿入します。それが正確にマークに達するまで穏やかに50%スクロース溶液を分注する。迅速かつスムーズにカニューレを取り外します。
    注:10%ショ糖がチューブ内に上昇し、上部のメニスカスを形成すべきである。そうでない場合、表面での10%スクロース溶液を加える。
  7. 少し超遠心管を傾け、すべての気泡を変位させることによって提供キャップを挿入します。マイクロピペットキャップのリザーバ内に過剰な液体を除去。
  8. 管壁に沿って余分な液体を拭き取ると、勾配メーカープレート上に置きます。
  9. '' RUN ''ボタンを押してください。
    注:プレートは、指定された角度で傾けて5秒間一時停止し、勾配を形成するための回転が開始されますでしょう。
  10. 勾配形成が完了すると(約2分、機械音がします)、静かに、超遠心機(複数可)を削除するラック上に配置し、迅速gradieを乱すことを避けるために上向きの動きにキャップを外しNT。
  11. 氷の上に勾配(複数可)を保管してください。邪魔しないで!別の方法として、勾配は4℃で一晩保管してください。
  12. または、次のようにグラデーションを作るために2室勾配メーカーを使用します。
    1. RNアーゼ不活性化溶液とRNaseフリー水で洗い流しチューブおよび勾配メーカー。
    2. グラデーションメーカーの近位チャンバに50%ショ糖+ CHXの5ミリリットルを加え、2つのチャンバ間に空気が除去されることを確認してください。
    3. グラデーションメーカーの遠位チャンバに10%ショ糖+ CHXの5ミリリットルを追加します。
    4. チューブホルダー内コニカル遠心管(SW-41チューブ、14×89ミリメートル)と場所の底に50%ショ糖+ CHXの0.5ミリリットルを追加します。
    5. 「3」(約1ミリリットル/分)に設定された速度で近室に入れ、攪拌機、オープンストップコックおよび預金勾配をオンにします。
    6. 氷の上に置いて勾配(複数可)。邪魔しないでください。
      NOTE:勾配を4℃で一晩保持することができる。

3.細胞溶解および超遠心分離。

    4℃にSW-41ローターと4℃でのバケツとセット遠心分離機を置きます。
    注:細胞溶解手順の二つの150mmサブコンフルエント(〜70-80%コンフルエント)勾配当たりのHEK293細胞のプレート用に最適化され、使用されるボリュームは、異なる細胞株のために調整する必要があるかもしれない。
  1. 溶解前に少なくとも24時間、増殖培地中で適切な細胞密度で細胞をプレート。
  2. 0.1 mg / mlのCHXを含む増殖培地のアリコート(150 mmのプレートあたり20ミリリットル)を準備します。
  3. 逮捕およびポリソームを安定化させるために37℃/ 5%CO 2で3分間(150mmのプレートあたり20ml)でCHX +培地中の細胞をインキュベートする。
  4. 迅速に作業、プレートから吸引メディア氷上場所プレートおよび10 mlの氷冷リン酸緩衝生理食塩水で細胞を1回洗浄(PBS:137のNaCl、2.7mMのKClを、10mMののNa 2 HPO 4、1.8mMのKH 2 PO 4)を補充しCHX(0.1mg / mlの最終濃度)をsidの下をゆっくりピペットに注意しながらと細胞単層の浮き上がりを最小限にするディッシュの側壁の電子。
  5. 吸引しPBSおよび各プレートに追加の10mlのPBS + CHXを追加するには、セルリフターを用いて細胞をこすり、氷上に50ミリリットルの遠心管に両方のプレートから、全量を移す。下流タンパク質分析のために氷上で微量遠心管に細胞懸濁液1mlを保持する。
  6. 遠心機で10分間4℃で300×gで細胞を50mlチューブ。
  7. すべてのPBSを削除し、氷冷RNA溶解バッファー500μlにペレットを再懸濁します。
  8. 2ミリリットルのマイクロチューブに細胞懸濁液を転送します。
  9. ピペットアップおよび溶解細胞へのダウンと時折ボルテックスしながら10分間氷上でインキュベートする。
  10. ペレット核に5分間4℃で2000×gで遠心。
  11. 新しい2 mlのマイクロ遠心チューブに上清を移し。
  12. 5分間、4℃で17000×gで遠心分離し、細胞破片をペレット化する。
  13. 新しい2 mlのマイクロ遠心チューブに上清を移し、測定するために2μlの使用260nmでの光学密度(ブランクとして溶解緩衝液を使用)。
  14. 全RNAの解析のために各サンプルから50μlを(全体の10%)を取り外します。必要になるまで溶解物は-80℃で保存することができます。
  15. 静かにそれぞれのショ糖勾配上に等しいA260ユニットをロードします(。500μLの最大音量で10分OD、25 OD最適;必要に応じて追加の溶解緩衝液で集中溶解液を希釈)。
  16. 確保勾配は互いに前に超遠心0.1gの範囲内である。
  17. 4℃で1.5時間39000 rpmで(260343 XG)での遠心分離勾配。
  18. スピンダウン中にオンローターブレーキを保持し、それが1,000回転に達したときに減速時にそれをオフにする。
    注:このステップは、ブラシヘッドは制動時にローターを接点として、加速度の急激な変化によって引き起こさ勾配のあらゆる妨害を最小限に抑えます。

4.グラデーション分別システムトゥルセットアップ。

  1. セットアップ楽器とブランクS次のように水でpectrophotometer:
    1. コンポーネントの電源を入れ、ランプが少なくとも15分間ウォームアップすることができます。
    2. 確認し、フラクションコレクターは「ポリソーム 'メソッド(;ホーム画面に戻るには二度の矢印を返す回押しフォルダアイコン)に設定されています。
    3. フラクションコレクターにバルブを確保するには、(ゴミ箱アイコンに矢印)無駄に設定されています。廃棄物収集チューブ下に蒸留水を入れた250ミリリットルの三角フラスコを置きます。
    4. チャートレコーダー上で、以下の設定を選択します。Set感度が「SETランプとオプティクス」にダイヤルする。 「1.5」にノイズフィルタスイッチを設定します。 「OFF」にピークセパレーターダイヤルを設定します。 '30センチ/ hrで '(5センチメートル/ 10分)に設定しチャ​​ートスピードダイヤル。ベースラインが「MAX OPEN」に(分光光度計ユニットの上に)ダイヤルを調整して設定する。
      注:オプション:デジタルレコーダーソフトウェアではなく、チャートレコーダーを使用することもできる。コンピュータ上で、「開始」をクリックしてください。取得ウィンドウが開きます:番目の下でE [オプション]メニュー、チェックを外してポーズグラフィック。スケーリングの下で​​は、(実行中にオンザフライで変更可能)-10と100にグラフの制限を設定する。新しいファイルを作成し、実行を記録するために[保存]ボタンをクリックしてください。
    5. ポンプにシリンジバレルを置き、場所(使用付属のネジと六角レンチ)に締めます。
      注:締めすぎないようにしてください。
    6. RAPID速度で '' REV ''コマンドを使って、チェイスSolutionで注射器を埋める。直立した状態でポンプを置き、 '' FORWARD ''コマンドを使用して、チューブを通して空気を追いかける。これだけの機能と洗浄のための迅速なを使用しています。
    7. RNaseフリー水で満たされた超遠心管を取り付けます。
    8. ピアースは、2つの黒のマークまで、カニューレとの超遠心管は表示されます(小出し穴がこれら二つのマークの間に位置している)、および6.0ミリリットル/分で '' 'マニュアル'上シリンジポンプを起動します。
    9. 水がフローセルを通過する際に、(Cとき長谷ソリューションは、変数に、)スイッチの速度をチューブの1/3を満たし、1.0ミリリットル/ minに設定してください。
    10. 1.0ml /分の流速で、ベースラインをチャート上の電圧がゼロ(+/- 0.5単位)になるまで、分光光度計で調整ダイヤルの調整。
      注:三角フラスコに廃液チューブから水出口を観察します。
    11. 「0.5 'または' 1.0 'のAUへの所望の感度を設定します。
      注:1.0 AUが10ミリリットルの勾配で10 ODユニットに最適です。 ODが10未満である場合には、「0.5」感度は、シグナルを増強するために使用することができる。
    12. 自動ベースラインボタンを押して、(デジタルレコーダーを使用している場合はオプション)レコーダーオフセットダイヤルを回すことで、チャートレコーダーの10%のマークに設定するベースラインを調整します。
    13. 安定したベースラインが達成されるとデジタルレコーダーを使用している場合、アナログチャートレコーダまたは 'off'を使用した場合、60センチメートル/時に「OFF」とチャートスピードダイヤルにポンプスイッチをオンにします。
    14. RE 'にポンプを切り替えることにより、チェイス·ソリューションを回復それは、穿刺カニューレ上の最初のマークに到達するまで(いずれかがRAPIDを使用しないでください...バック6.0ミリリットル/分の流量を増やすことができ、必要であれば)V 'の位置。
    15. 遠心管を取り外し、それを介してチェイスソリューションの少しを実行することにより、カニューレ内に気泡を追いかける。きれいなピアス段を拭きます。
      注:一部の残留水がフローセルから漏れることができる。

5.グラデーション画とサンプルの収集。

  1. インストールし、スクロース勾配を含む遠心管に穴を開ける。
  2. キャップが上向きに突出しないようにフラクションコレクタートレイ位置1-11 11 2ミリリットルマイクロチューブを置きます。採集管に残った液体を収集するために ''廃液チューブ ''と今は ''チューブ#1 ''を交換してください。
  3. 「手動」にポンプ制御ダイヤルを設定し、「6.0ミリリットル/分 'にシリンジポンプで流速フラクションコレクター上の「再生」アイコンを押してください。とすぐに腕が第一の管に到達すると、 ''ポーズ ''ボタンを押してください(これは腕を置き、分数分配バルブが開きます)。
  4. '' FORWARD ''コマンドを使用してポンプを起動し、チャートレコーダーペンを監視します。それが上向きに偏向起動すると、すぐに 'を'廃液チューブ '' ''チューブ#1 ''を交換する(そのサンプルは、分光光度計のフローセルを通過していることを示す)。
  5. 最初のドロップが収集される場合には、速やかに「リモートスタート/ストップ '、' '変数(1.0ミリリットル/分)' 'を押して' 'プレイ' 'のアイコンにコマンドを切り替えます。
    注:ポンプは今フラクションコレクター·インターフェースによって制御され、1mlの画分毎分を収集することができる。
  6. この時点から、A260の読みはデジタルレコーダーインタフェース(またはアナログチャートrecordeに表示されますr)を。ソフトウェア上の ''録音 ''ボタンが押されたことを確認してください!
  7. 青いチェイスSolutionは捕集管または最後のチューブ(通常はチューブ11)を入力した後、「停止」アイコンを押してください。
    注:ディスペンスバルブは廃棄バルブに切り替えてください。
  8. すべての勾配は分画してきたまで氷上画分を保管してください。日画分の終わりに先立って、タンパク質またはRNAの単離に-80℃で保存することができる。タンパク質およびRNA分析が必要な場合は、半分の各画分(タンパク質およびRNA分析のために500μlのそれぞれ)を分割する。

6.ウォッシュ

注:(これは、複数の勾配を収集する場合にのみ行われるべきオプションのステップです)。

  1. 超純水の約50 mlを入れた三角フラスコに廃液チューブを沈め6 ml /分の流速を用いてポンプを逆転。
  2. チェイスSolutionは最初のマークOを達したときにポンプを停止穿刺カニューレがn。
  3. 、遠心管を取り外し、カニューレの外に空気を追いかけるとピアス段を清掃してください。
    注:一部の残留水がフローセルから漏れることができる。
  4. ステップ5.1から始まる分画手順を繰り返します。

7.最終的なクリーンアップ。

  1. ピアサの底からポンプチューブを外し、急速な流量設定を使用して、50ミリリットルの遠心分離管にチェイスソリューションを送り出す。それが再利用できるように、4℃でチェイスソリューションに保管してください。
  2. 3ウェイチューブシステムにポンプチューブを接続し、シリンジにつながるバルブを閉じてください。ピアサのベースに蒸留水や他のチューブで満たされた50ミリリットルの注射器に1のチューブを接続します。
  3. ブランキング工程のために使用超遠心管を取り付け、 ''スターをクリックすることにより、インターフェイス上でコレクションメニューに分光光度計とコレクションチューブ(スイッチを介して蒸留水の少なくとも50ミリリットルを渡すT /一時停止 ''アイコン)。
  4. チューブ、注射器(ネジを外すアレンキーを使用します)、他のすべてのリムーバブルコンポーネントを削除し、暖かい水道水を使って徹底的に洗浄した後、超純水ですすいでください。
    注:プランジャー、バレル、チューブを洗浄し、カニューレを貫通するとき、特別な注意を払ってください。
    注:注意してガラスシリンジバレルをハンドル!ほこりからすべてのコンポーネントを格納する。
  5. 蒸留水で湿らせた柔らかいティッシュでフローセルの底を拭いてください。フラクションコレクタートレイとショ糖がこぼれてきた可能性のある他の領域を拭う。

ショ糖画分からのRNAの8離。

  1. すべての蔗糖画分の1ミリリットル(37.5μlの10%SDS、7.5​​μlの0.5M EDTA、1μlのグリコブルー、20 mg / mlのプロテ​​イナーゼKの4μl)を用プロテイナーゼK溶液50μlを準備します。
  2. 2ミリリットル平底チューブ中、55℃でプロテイナーゼK溶液50μlで1mlのショ糖画分をインキュベート1時間(500μlの画分を使用する場合はそれに応じて、プロテイナーゼK溶液の体積を調整する)。
  3. クロロホルム:等量のフェノールを追加3-メチル-1-ブタノール、ショ糖画分から(125:24 1、好ましくは酸性(pHは4.5)DNAの混入を最小限にするため)。
    注:彼らは重く、位相が反転し始める可能性があるため、フラクション7-10にクロロホルムを余分に200μlのを追加します。
    注:フェノール/クロロホルムは、接触および吸入に火傷を引き起こす可能性があります。白衣を着用し、安全ゴーグル、および換気フードを使用しています。
  4. 室温で5分間、最大速度でボルテックス〜30秒遠心操作する。
  5. 〜水相の80〜90%を除去新しいチューブ内と場所(ゲノムDNAが含まれている可能性がある相間触れないでください)​​。
  6. 等量のクロロホルムを追加し、ステップ8.4を繰り返します。
  7. 相間を避けるために注意しながら水相を除去します。
  8. 、3 M酢酸ナトリウムの1:10ボリュームを追加pHが5.2(または5 M酢酸アンモニウムを使用することができる)。
  9. チルド、absoluの1.5ボリュームを追加15秒間TEエタノールと渦。
  10. -20℃(または-80℃で1時間のラッシュである場合)で一晩沈殿させる。
    注:サンプルは、-20のままにしておくことができます 必要に応じてより長いのためのC°。
  11. 4℃で30分間、最高速度で遠心。
  12. チルドRNaseフリーの70%エタノール1mlでペレットを洗浄。
  13. 空気はRNaseフリー水20μlにペレットを再懸濁を乾燥。
  14. (A260 / 280の比率に基づいて)十分な収率および純度を確保し、各画分の等量と目的のmRNA(単数または複数)に特異的なPCRプライマーを使用して、標準的なRT-qPCR分析14に進んで分光光度計によって、総RNAを定量化する。

ショ糖画分からのタンパク質の9離。

  1. RNAに加えて、タンパク質は、同様に、個々のポリソーム画分中に単離され、同定され得る。タンパク質の分離、 例えば 18に利用可能な多くの優れたプロトコルのいずれかを使用してください。

Representative Results

我々は最近、アポトーシス阻害剤XIAPおよびBcl-xLの12をコードするIRES-保有するmRNAの選択的な翻訳阻害剤として腫瘍抑制PDCD4のための新規の役割を説明した。ソームプロファイリングはIRES媒介翻訳PDCD4の具体的な関与を実証するための重要な技術だった。 HEK293細胞を一過性にPDCD4( 図1A)の内因性レベルを枯渇させるトランスフェクトし、その後、プロファイル分析をポリソームに供した。我々は、比較siCTRLとsiPDCD4細胞( 図1B)で処理ソームプロフィールの変化の欠如によって判断されるようにPDCD4のレベルを減らすことが、グローバル細胞翻訳を損なわなかったことを観察した。同様に、XIAP 19の非IRES変異型のポリソーム分布は、処理および未処理細胞( 図1C)との間で変化しなかった。対照的に、2つのIRES-保有するmRNAのポリソーム分布は、XIAPおよびBcl-xLのは、有意に変化した。 Pの非存在下でDCD4これら2つのmRNAの分布は重いribopolysomes( 図1D、E)にシフトされます。これはXIAPおよびBcl-xLのmRNAは( 図1F)の定常状態レベルの変化を伴わないので、これらの結果は、ウェスタンブロッティング( によって確認された減少PDCD4のレベルの細胞におけるXIAPおよびBcl-xLのの翻訳の増強を実証1G)。

図1
図1:ポリソームプロファイリングがXIAPおよびBcl-xLの翻訳の選択的阻害剤としてPDCD4を識別し、(A)HEK293細胞を、PDCD4 siRNAまたはコントロール(CTRL)で処理し、抗PDCD4で溶解し、ウェスタンブロット分析に供したsiRNAを、非標的およびPDCD4の程度を確認するために、抗ヌクレオリン抗体がノックダウン(B)PDCD4(A)のようにノックダウンしたと細胞溶解物をプロファイリングポリソームに供した。代表ポリソームプロファイルは、トップパネルに示されている。 XIAP非IRES(C)の分布は、GAPDHのそれと比較したBcl-xLの(D)、およびXIAP IRES(E)のmRNAが各画分中の全mRNAのパーセント(%mRNA)のように示されている。(F)で点灯-state mRNAレベルはPDCD4 siRNAまたはコントロール(CTRL)siRNA処理細胞におけるRT-qPCRにより測定した。(G)からの溶解物(A)抗XIAP、抗-Bcl-xLの、及び用いたウエスタンブロット分析に供した抗ヌクレオリン抗体。 (NB。データが元々 12に掲載された図1に示した) この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

ポリソームプロファイリングは、異なる処置条件下での特異的転写物の翻訳の状態の定量化を可能にする強力な技術である。それはまだそれが良いソームプロファイルを生成するために重要であるそのうちのいくつかは、実行のいくつかのステップを必要とし、原則として、非常に単純な手法である。これらの重要なステップは次のとおりです。1)RNaseフリー化学物質やプラスチック製品を使用して、2)優れたショ糖勾配を(我々の経験では10-50%スクロース勾配が効率的にバインドされたリボソームを持つ40 / 60SサブユニットとmRNAを解決するための最善の仕事)を​​製造し、3 )指数関数的に翻訳の最高速度を捕捉するために成長し、80%以下のコンフルエントされた細胞を使用。そのような遺伝子ノックダウンまたは過剰発現する限り、細胞治療を行う際にめっきする細胞の量は、細胞は、エンドポイントでコンフルエントにどれだけの関数になるように、この後者のステップは、考慮されるべきである。

結果にPRESENテッドはここで、ポリソームプロファイル分析は、IRES-保有するmRNA XIAPおよびBcl-xLの12の翻訳調節にPDCD4の役割を評価するための重要なツールでした。我々はPDCD4ノックダウン( 図1B)の際に、一般的なポリソームプロファイルの変化を観察しなかったという事実は、私たちはPDCD4、実験の条件の下でグローバルセルラー翻訳を損なわなかったと結論することができました。我々は次に、PDCD4または対照siRNAで処理した細胞におけるXIAPおよびBcl-xLのmRNAの分布を決定するために、RT-qPCR分析を使用した。それはmRNAの分布を定量的にではなく、半定量的分析のために、および処置の間の翻訳効率の微妙なシフトの検出を可能にするため、定量PCRは、標準的なRT-PCRまたはノーザンブロット法とは対照的に、ポリソームプロファイルを分析するために選択される方法である。この技術を用いて、XIAPおよびBcl-xLのmRNAの分布は、(グラムでの合計は、標的mRNAのパーセントとして表されていることを示すことができたadient)PDCD4がノックダウン後に有意したがって、これらのmRNAの翻訳の増加を示している( 図1D、E)重いポリリボソーム(それらに関連するリボソームの数が多いのmRNA)にシフトした。これをさらにXIAPおよびBcl-xLのタンパク質レベルではなく、それらの定常状態のRNAレベル( 図1F、G)の増加によって確認された。重要なことは、XIAPの非IRES変異体のポリソーム分布は、処理および未処理細胞( 図1C)の間で変化しなかった。代わりに、翻訳効率は14(通常2〜4を留分)モノソーム対ポリソーム中のmRNA量の比率(通常は5から10分画)として提示することができた。

254nmでの吸光度測定から観察されたピークが自分でリボソームRNA(洗剤に起因することができないようなプロトコルを通じてコン​​トロールの使用は、結果プロファイリング任意のポリソームを検証する上で重要であるトリトンX-100のようなsは、強く)スペクトルのこの領域で吸収し、勾配の最上部40 / 60Sピークを不明瞭にすることができる。溶解物なしで、および/または溶解物緩衝液ブランク勾配は、254nmにおける吸光度のバッファの相対的な寄与を決定するために実行される必要がある。人為的な高次構造も事実なしで( 例えば 「擬似ポリソーム」20)があるポリソームの誤った解釈につながることができます。 EDTAが溶解物への勾配緩衝液(15分間の20mM)に加え、二価カチオンキレート剤は、その成分の小さい(40S)にリボソームの分離を引き起こし、大きな(60Sになると(80Sリボソームを安定化するための手順を通して使用される)、マグネシウムを封鎖)サブユニット。 260nmで記録された吸光度ピークがポリソーム確かであればこのように、EDTA処理は、単一の最大値は、mRNAとリボソームユニットを解放するために対応する勾配の最上部付近に観察されるように、プロファイルを崩壊する(データは示さず)。一致するプロファイルのEDTA誘発性崩壊で、定量PCRによって分析具体的な目標のすべてが今、勾配の上部に見つかるはずです。

mRNAと関連したリボソームの数は、常に特定のmRNAが翻訳されていることをどのように効率的にするものではありません。実際、ポリソーム上のアクティブな変換は、読者が知っておくべき21,22失速となるような特定のコンテキストがあります。転写物は積極的にEDTAとは異なり、「流出」を積極的mRNAを横切って転位されたリボソームを引き起こすピューロマイシンで試料を処理すること)により行うことができる翻訳機構に係合し、またはb)試料を処理しているか否かを判定する再び、任意の下流の転位リボソームの「流出」を引き起こし、開始コドンでのみ最初のリボソームの転位を抑制するホモハリングトニンと。

qPCR分析のための制御転写物の使用も重要である。セレクXIAP IRESの非IRES変種など、いくつかのハウスキーピング遺伝子(GAPDH、アクチン、チューブリン、ヌクレオリン)、リボソームのmRNA(18S、RPL13A)などの異なる処理条件によって、またはこの場合には影響を受けません転写物るが、中には重要である翻訳に対する治療の効果は、特定または一般化されている場合を検証。 XIAPおよびBcl-xLのmRNAはGAPDH mRNAに対して標準化し、すべての画分中のmRNA含有量の和で表される全mRNA含量の百分率として表し(ここで行ったように、これらの制御転写産物は、分析のmRNAの分布を正規化するために使用することができ)、又は代替的に、標的および対照mRNAは、絶対値として表され、別々に表示することができる。入力された溶解物(総体積の通常10%)のqPCR分析は、特定のmRNAの分布のた​​めに制御するもう一つのステップである。理想的には、入力された溶解物中の特定の転写物のmRNA含有量を分析し、すべての10の画分中のmRNA量の合計に匹敵する必要があります。最終的にフェノールのために制御するための任意のステップ:クロロホルム抽出工程(たとえばCAT、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼなど) のin vitro転写レポーターmRNAと各ポリソーム画分をスパイクすることで、その後、qPCRにより定量化され、さらに正規化するために使用することができるデータ14。

任意の技術と同様に、ポリソームプロファイリングは、いくつかの制限を提示します。通常、10画分の最小(変換効率のより微妙なシフトが20以上を必要とするかもしれない)素晴らしいポリソーム分布を有するために収集する必要があるという事実は、4つのサンプルのみを最大とすることができるという意味で、このステップは制限させる快適に一度に40個のサンプルと4の入力コントロールのRNA抽出およびqPCR分析を扱うことができるように時間に分析した。サンプルサイズは、容易に定量PCRを行うためにレプリケートする方法の多くの転写物解析されるべきであり、何を追加することができ、これはコストがかかる。プロファイリング定量PCRベースのポリソームの別の制限nalysisはそれだけで(分析される転写物が予め分かっている)は、候補ベースの手法で行うことができ、翻訳のゲノムワイドな解析のために適用することができないことである。しかし、21 世紀の初めに、研究者らは、DNAを用いてゲノムレベルでのそれらのポリソームRNAを調べるために開始した次世代シーケンス16,17とより最近15とをマイクロアレイ。むしろ個々の画分の定量PCR解析を行うよりも、ことを除いて、このプロトコルで説明したように、この強力なアプローチでは、ポリソームプロファイリングが行われ、グローバルな翻訳にフラクション(通常分2-4)およびポリソーム画分(通常留分)を一緒にプールされ、バリエーションを分析したモノソームDNAマイクロアレイまたは全ゲノムRNA配列決定によって。したがって、このアプローチでは、特定の治療の際に、その分布のシフトポリソームからモノソームに(翻訳の減少)またはその逆(翻訳の増加)全てのmRNAを評価することが可能であるメント。特定のmRNAのポリソーム分布の検証および定量化は、その後qPCRにより行うことができる。ポリソームプロファイリング原理のさらに強力な使用はリボソームプロファイリングです。この技術のさらなる高スループット拡張がポリソーム画分23の何百もの同時モニタリングが可能になることが最近報告された。変異体のコレクションや大規模RNAiスクリーニングの並進効率をプロービングするときに明確な利点を提供する。リボソームプロファイリングは、タンパク質合成24,25に従事リボソーム(リボソームフットプリント)によって保護RNA断片をマッピングするために、次世代シークエンシングを利用している技術である。この技術では、リボソームの転位は、リボソーム足跡の集団を得るために細胞溶解およびRNase消化に続いて(可逆)、シクロヘキシミドまたはエメチン(不可逆的)を抑制することができる。リボソームは、濃縮された全RNAを単離し、夾雑リボソームおよびミトコンドリアリボソームRNAを除去する。約26〜28ヌクレオチドのRNA足跡を単離し、逆転写、cDNAライブラリーに変換され、26を配列決定した。標準ポリソームプロファイリングとは異なり、このアプローチは、翻訳制御されている特定のmRNAを識別するだけでなく、そのような特定の転写物に沿ってリボソームの正確な占有密度などコドン解像度でのmRNAに固有の情報が得られる。それは転写物上リボソームの募集が行われている場所の詳細な情報を与えることができるので、これは、そのようなIRES-保有するmRNAの翻訳などの特定のモードを持つmRNAをするために特に重要である。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gradient Master 108 automated gradient maker BIOCOMP 107-201M
Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker LABCONCO 4517000
Beckman Ultracentrifuge  Beckman Coulter Model # L-100-XP
Density gradient fractionator TELEDYNE ISCO 69-3873-246 Composed of: tube piercing system,  peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280 nm filters and Foxy R1 Fraction Collector
WinDaq data acquisition software DATAQ INSTRUMENTS WINDAQ/LITE http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm
Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14 x 89 mm) Beckman Coulter 331372
Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose) DiaMed PRE1900-N
Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom) SafeSeal 12000
Sucrose (nucleases-free) Calbiochem 573113 MW = 342.3 g/mol
Cycloheximide SIGMA C7698 MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing.
Sodium chloride (nucleases-free) OmniPur 7710 MW = 58.44 g/mol
MgCl2.6H2O (nucleases-free) OmniPur 5980 MW = 203.3 g/mol
Tris Base (nucleases-free) J.T. Baker 4109-01 MW = 121.14 g/mol
Triton X-100 OmniPur 9400 Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation
Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2515
RNaseZap Rnase inactivation solution Ambion, Life Technologies AM9780
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml) Invitrogen, Life Technologies AM9516
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) Ambion, Life Technologies AM9722 Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion

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References

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