Polysome रूपरेखा द्वारा स्तनधारी कोशिकाओं में चयनात्मक mRNA के अनुवाद का आकलन

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Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling. J. Vis. Exp. (92), e52295, doi:10.3791/52295 (2014).

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Abstract

प्रोटीन संश्लेषण के नियमन के तनाव के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण नियंत्रण बिंदु का प्रतिनिधित्व करता है. विशेष रूप से, विचारशील आरएनए नियामक तत्व आम तौर पर एक विशेष तनाव की प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक प्रोटीन के लिए सांकेतिक शब्दों में जो विशिष्ट mRNAs, के चुनिंदा अनुवाद करने के लिए अनुमति देने के लिए दिखाया गया है. इन mRNAs, साथ ही चयनात्मक अनुवाद के लिए जिम्मेदार नियामक तंत्र के लक्षण वर्णन की पहचान कुछ समय के लिए आणविक जीव विज्ञान के मामले में सबसे आगे रहा है. Polysome रूपरेखा इन अध्ययनों में एक आधारशिला विधि है. polysome रूपरेखा का लक्ष्य अलग टेप पर सक्रिय रूप से अनुवाद करने राइबोसोम immobilizing द्वारा mRNA के अनुवाद पर कब्जा है और इस प्रकार अत्यधिक अनुवादित टेप और खराब अनुवादित लोगों के बीच एक भेद की अनुमति के लिए एक sucrose के ढाल पर ultracentrifugation द्वारा परिणामस्वरूप polyribosomes अलग करने के लिए है. ये तो आगे परंपरागत जैव रासायनिक और आणविक जीवविज्ञान के तरीकों के द्वारा होती जा सकता है. महत्वपूर्ण बात है, के संयोजन पीउच्च throughput जीनोमिक दृष्टिकोण के साथ olysome रूपरेखा translational विनियमन के एक बड़े पैमाने पर विश्लेषण के लिए अनुमति देता है.

Introduction

प्रोटीन संश्लेषण (अनुवाद) का नियमन अच्छी सेलुलर अस्तित्व से जुड़ा हुआ है जो एक प्रमुख सेलुलर प्रक्रिया है. अनुवाद सेल की ऊर्जा का 50% से अधिक की खपत को देखते हुए यह अनुवाद कसकर नियंत्रित किया जाता है कि और अनुवाद में perturbations अच्छी तरह सहन नहीं कर रहे हैं कि आश्चर्य की बात नहीं है. इसके विपरीत, कई न्यायपालिका सेलुलर प्रक्रियाओं अनुवाद मशीनरी और अनुवाद निर्गम (यानी proteome) संशोधित करने की आवश्यकता है कि. इस बार विभिन्न तनाव प्रतिक्रिया और बीमारी राज्यों में ऐसा ही मामला है, और शायद सबसे अच्छा कैंसर में उदाहरण है. Translational नियंत्रण की एक प्रमुख लाभ तेजी से विभिन्न बाहरी और आंतरिक चलाता है के जवाब में प्रोटीन उत्पादन reprogram करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता है, जिससे ठीक ट्यूनिंग तंत्र है कि सुझावों सेल अस्तित्व और मृत्यु 1 के बीच संतुलन.

Translational नियंत्रण के दो पहलुओं विशेष रूप से दिलचस्प हैं; नियामक MEC की प्रकृति की समझपहली जगह में चयनात्मक अनुवाद हासिल है कि विशेष ट्रिगर करने के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया में भाग लेने कि hanism (एस) और नियंत्रण विशिष्ट अनुवाद के लिए अनुमति देते हैं कि तत्वों, और विशिष्ट mRNAs का पहचान और उनके प्रोटीन उत्पादों. Polysome रूपरेखा दोनों प्रक्रियाओं के प्रभावी अध्ययन की अनुमति देता है कि एक तकनीक है.

polysome रूपरेखा तकनीक के समग्र लक्ष्य का अध्ययन और विभिन्न सेलुलर शर्तों के तहत विशिष्ट mRNAs का अनुवाद राज्य यों है. तकनीक का सिद्धांत इस प्रकार, एक sucrose के ढाल पर ultracentrifugation द्वारा परिणामस्वरूप polyribosomes '' ठंड 'अलग टेप पर सक्रिय रूप से अनुवाद करने राइबोसोम और अलग' (कई राइबोसोम से बंधे) अत्यधिक अनुवादित टेप के बीच एक अंतर के लिए अनुमति देकर mRNA के अनुवाद पर कब्जा करने के लिए है खराब (एक या दो राइबोसोम से बंधे) लोगों अनुवादित. इस विशेष प्रोटोकॉल में, एंटीबायोटिक cycloheximide को बांधता है कि60 ribosomal सबयूनिट और ब्लॉक राइबोसोम ई साइट 2 से deacetylated tRNA की रिहाई, राइबोसोम स्थानान्तरण रोकना और अनुवाद के mRNAs पर राइबोसोम स्टाल करने के लिए प्रयोग किया जाता है. हालांकि, यह भी ब्लॉक अनुवाद बढ़ाव 3, इस्तेमाल किया जा सकता है कि इस तरह के इमेटिन के रूप में अन्य अवरुद्ध एजेंटों.

पश्चिमी सोख्ता और अनुवाद प्रक्रिया के अंतिम उत्पादन को मापने कि 35 एस Methionine लेबलिंग तकनीक के विपरीत, इस प्रकार विभिन्न परिस्थितियों में अनुवाद तंत्र की एक अधिक विस्तृत अध्ययन के लिए अनुमति देता है, रूपरेखा सक्रिय रूप-अनुवादित mRNAs साथ राइबोसोम एसोसिएशन मापने का लाभ दिया polysome. इसलिए, तकनीक आसानी से विशेष रूप से अनुवाद 4-6 के विभिन्न तरीकों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, प्रोटीन कारकों अनुवाद विनियमन 7-9, प्रोटीन संश्लेषण 1,10,11 या इस तरह के अपस्ट्रीम IRES या के रूप में mRNA के संरचनाओं के प्रभाव को प्रभावित तनाव की स्थिति में शामिल प्रोटीन synth पर खुला पढ़ने फ्रेमesis 12-14. आजकल, polysome रूपरेखा आवेदनों भी व्यापक polysomes जुड़े mRNAs का विश्लेषण करने के लिए डीएनए 15 या अगली पीढ़ी के अनुक्रमण 16,17 के उपयोग के साथ कर रहे हैं.

Protocol

ध्यान दें: एक नोट शाही सेना के साथ काम करने पर: RNases द्वारा आरएनए गिरावट के खिलाफ की रक्षा के लिए मानक सावधानियों ले लो. प्रोटोकॉल के सभी चरणों में दस्ताने, बाधा विंदुक युक्तियाँ, RNase मुक्त plasticware और रसायनों का प्रयोग करें. सभी समाधान के लिए ultrapure या DEPC इलाज पानी का प्रयोग करें. निर्माता प्रोटोकॉल निम्नलिखित RNase निष्क्रियता समाधान के साथ किसी भी संदिग्ध सतहों शुद्ध करना.

समाधान 1. तैयार करना.

  1. बुनियादी समाधान की 500 मिलीलीटर की तैयारी (. 0.3 एम NaCl, 15 मिमी 2 MgCl 2 हे 6H, 15 मिमी Tris-एचसीएल, 7.4 पीएच). समाधान स्पष्ट है जब तक हलचल पट्टी का उपयोग कर मिलाएं और एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से गुजरती हैं. कमरे के तापमान पर स्टोर.
  2. इस प्रकार के रूप में 10 और 50% sucrose समाधान और 60% चेस समाधान तैयार:
    1. 10% sucrose के समाधान के लिए, (वी / डब्ल्यू) एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में 5 ग्राम सूक्रोज जोड़ने के लिए और बुनियादी समाधान के साथ 50 मिलीलीटर को भरें. एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब विज्ञापन में 50% sucrose के समाधान (w / v) के लिएडी 25 ग्राम sucrose और बुनियादी समाधान के साथ 50 मिलीलीटर को भरें.
    2. 60% के लिए (w / वी) चेस समाधान, एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में 30 ग्राम सूक्रोज जोड़ने के लिए और बुनियादी समाधान के साथ 50 मिलीलीटर को भरें. संतृप्त bromophenol नीले समाधान के 100 μl जोड़ें (भंग करेंगे अधिक नहीं जब तक पानी के लिए नीले bromophenol जोड़ने, अपकेंद्रित्र अघुलित पाउडर गोली) 60% पीछा समाधान करने के लिए. एक भंवर का उपयोग मिक्स और पूरा विघटन सत्यापित.
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर समाधान की जरूरत तक.
  3. शाही सेना lysis बफर तैयार करें. प्रयोग के दिन पर ताजा इस बफर तैयार करें. प्रत्येक नमूने के लिए शाही सेना lysis बफर के 500 μl तैयार करें. 1 बुनियादी समाधान के मिलीलीटर जोड़ने 10 μl ट्राइटन X-100 (1% [V / V] अंतिम), 100 मिलीग्राम / मिलीलीटर cycloheximide DMSO में (CHX, 0.1 मिलीग्राम / अंतिम एमएल) और 3.5 μl RNasin की 1 μl (140 यू / एमएल). एक भंवर का उपयोग कर मिलाएं. बर्फ पर रखें.
    नोट: cycloheximide बेहद जहरीला है और परिवर्तन का कारण बन सकता है. त्वचा के संपर्क और साँस लेना बचें. भी अक्सर पाउडर के रूप निपटने से बचने के लिए प्रस्तुत करने काDMSO के, विभाज्य में 100 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक की एक बड़ी मात्रा में कर रहे हैं और लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक से काम कर रखें.
  4. प्रयोग के दिन, वांछित 10% की मात्रा और 50% sucrose के समाधान (ढाल प्रति प्रत्येक समाधान के ~ 7 मिलीलीटर) को CHX (0.1 मिलीग्राम / एमएल के अंतिम एकाग्रता) जोड़कर सुक्रोज + CHX समाधान तैयार करते हैं.

एक स्वचालित ढाल निर्माता का उपयोग sucrose के ढाल के 2. तैयारी

  1. ढाल मेकर '' पर '' मुड़ें और ढ़ाल का आयोजन करेगा कि थाली स्तर (criticalstep!) पर क्लिक करें '' किया '' प्लेट लगाया जाता है.
  2. मेनू पर ढाल कार्यक्रम का चयन चलाने के लिए:
    1. प्रेस '' स्नातक '' मेनू और '' सूची '' का चयन करें.
    2. "SW41" का चयन करें.
    3. सूची के माध्यम से स्क्रॉल और चयन प्रेस द्वारा 'कार्यक्रम' '10 - 11 चरणों - 50% ढाल ''' भागो '' बटन आईएनजी.
  3. मार्कर ब्लॉक में एक शंक्वाकार ultracentrifuge ट्यूब (दप-41 ट्यूब, 14 X 89 मिमी) प्लेस और मार्कर ब्लॉक के ऊपरी कदम के साथ ट्यूब पर एक निशान का पता लगाने के लिए प्रदान की ठीक ट्यूब मार्कर का उपयोग करें. एक स्थिर सतह पर एक उपयुक्त रैक में ट्यूबों रखें.
    नोट: इस मार्क 10 और 50% sucrose के समाधान layering के लिए भरने मार्गदर्शन किया जाएगा.
  4. दो 10 मिलीलीटर सीरिंज को दो प्रदान की प्रवेशनी संलग्न और RNase निष्क्रियता समाधान युक्त गर्म आसुत जल के साथ ऊपर और नीचे pipetting द्वारा धो लो. बाद में पानी के सभी निशान हटाने के लिए सुनिश्चित करें.
  5. 10% sucrose के + CHX साथ सीरिंज से एक भरें और ultracentrifuge ट्यूब के नीचे प्रवेशनी डालें. यह सिर्फ ट्यूब पर बने निशान पिछले जाता है जब तक धीरे 10% sucrose के समाधान बांटना.
    नोट: बुलबुले बनाने से बचें. बुलबुले फार्म हैं, उन्हें धीरे विस्थापित ट्यूब नल.
  6. 50% sucrose के + CHX साथ अन्य सिरिंज भरें, बंद अतिरिक्त तरल पोंछultracentrifuge ट्यूब के नीचे एक डालने धीरे पोंछ और प्रवेशनी के साथ. यह बिल्कुल निशान तक पहुँच जाता है जब तक धीरे 50% sucrose के समाधान बांटना. जल्दी और आसानी से प्रवेशनी हटा दें.
    नोट: 10% sucrose के ट्यूब में वृद्धि और शीर्ष पर एक meniscus फार्म चाहिए. यदि नहीं, तो सतह पर अधिक 10% sucrose के समाधान जोड़ने.
  7. थोड़ा ultracentrifuge ट्यूब झुकने और सभी हवाई बुलबुले विस्थापित द्वारा प्रदान की टोपी डालें. एक micropipet साथ टोपी के जलाशय में अतिरिक्त तरल निकालें.
  8. ढाल निर्माता प्लेट पर ट्यूब दीवार और जगह के साथ अतिरिक्त तरल साफ कर लें.
  9. '' भागो '' बटन दबाएँ.
    नोट: थाली ढाल शुरू हो जाएगा फार्म करने के लिए 5 सेकंड और घुमाव के लिए रोकते हैं, निर्दिष्ट कोण पर झुकाव होगा.
  10. ढाल गठन (लगभग 2 मिनट, मशीन बीप जाएगा) पूर्ण होने पर, धीरे रैक पर ultracentrifuge (ओं), जगह हटाने और तेजी से gradie परेशान से बचने के लिए एक उर्ध्व आंदोलन में टोपी को हटा देंNT.
  11. बर्फ पर ढाल (ओं) रखें. परेशान न करें! वैकल्पिक रूप से, ढ़ाल 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात रखना.
  12. निम्नानुसार वैकल्पिक रूप से, ढ़ाल बनाने के लिए एक दो कक्ष ढाल निर्माता का उपयोग करें:
    1. RNase निष्क्रियता समाधान और RNase मुक्त पानी से कुल्ला ट्यूबिंग और ढाल निर्माता.
    2. ढाल निर्माता के समीपस्थ चैम्बर के लिए 50% sucrose के + CHX के 5 मिलीलीटर जोड़ें और दो कक्षों के बीच किसी भी हवा निकाल दिया जाता है कि यह सुनिश्चित करें.
    3. ढाल निर्माता के बाहर का चैम्बर के लिए 10% sucrose के + CHX के 5 मिलीलीटर जोड़ें.
    4. ट्यूब धारक में एक शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे (दप-41 ट्यूब, 14 X 89 मिमी) और जगह पर 50% sucrose के + CHX की 0.5 मिलीलीटर जोड़ें.
    5. "3" (लगभग 1ml / मिनट) के लिए सेट गति से समीपस्थ कक्ष में रखा दोषी, खुले बंद लंड और जमा ढाल पर मुड़ें.
    6. बर्फ पर जगह ढाल (एस). परेशान न करें.
      नोट: अनुपात में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रखा जा सकता है.

3. सेल और ultracentrifugation.

    4 डिग्री सेल्सियस दप-41 रोटर और 4 डिग्री सेल्सियस पर बाल्टी और सेट अपकेंद्रित्र रखें.
    नोट: सेल प्रक्रिया दो 150 मिमी subconfluent (~ 70-80% मिला हुआ) ढाल प्रति HEK293 कोशिकाओं की प्लेटों के लिए अनुकूलित है और इस्तेमाल किया संस्करणों अलग सेल लाइनों के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है.
  1. कम से कम 24 घंटा पहले सेल को विकास मीडिया में उचित सेल घनत्व में प्लेट कोशिकाओं.
  2. 0.1 मिलीग्राम / एमएल CHX युक्त विकास मीडिया के एक विभाज्य (150 मिमी प्लेट प्रति 20 मिलीलीटर) तैयार करें.
  3. गिरफ्तारी और polysomes स्थिर करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 पर 3 मिनट के लिए (150 मिमी प्लेट प्रति 20 मिलीलीटर) CHX + मीडिया में कोशिकाओं को सेते हैं.
  4. बर्फ पर प्लेटें, जगह प्लेटों से, जल्दी महाप्राण मीडिया कार्य और 10 मिलीलीटर बर्फ ठंड फॉस्फेट बफर खारा के साथ एक बार धोने कोशिकाओं (पीबीएस: 137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, 10 मिमी ना 2 HPO 4, 1.8 मिमी के.एच. 2 पीओ 4) पूरक सिड नीचे धीरे धीरे पिपेट को CHX (0.1 मिलीग्राम / एमएल के अंतिम एकाग्रता) सावधान किया जा रहा साथपकवान दीवार की ई सेल monolayer के उठाने को कम करने के लिए.
  5. महाप्राण पीबीएस और प्रत्येक थाली करने के लिए एक अतिरिक्त 10 मिलीलीटर पीबीएस + CHX जोड़ने के लिए, एक सेल चोर के साथ कोशिकाओं परिमार्जन और बर्फ पर एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब दोनों प्लेटों से कुल मात्रा हस्तांतरण. नीचे की ओर प्रोटीन विश्लेषण के लिए बर्फ पर एक microfuge ट्यूब में सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर रखें.
  6. अपकेंद्रित्र 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 XG पर कोशिकाओं के 50 मिलीलीटर ट्यूब.
  7. बर्फ के ठंडे शाही सेना lysis बफर के 500 μl में सभी पीबीएस और resuspend गोली निकालें.
  8. एक 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब सेल निलंबन स्थानांतरण.
  9. पिपेट ऊपर और Lyse कोशिकाओं को नीचे और सामयिक vortexing के साथ 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
  10. 5 मिनट के नाभिक गोली के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2,000 XG पर अपकेंद्रित्र.
  11. एक नया 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला.
  12. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 17,000 XG पर अपकेंद्रित्र सेल मलबे गोली.
  13. एक नया 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और मापने के लिए 2 μl का उपयोग260 एनएम ऑप्टिकल घनत्व (के रूप में रिक्त उपयोग lysis बफर).
  14. कुल शाही सेना के विश्लेषण के लिए प्रत्येक नमूने से 50 μl (कुल का 10%) निकालें. जब तक जरूरत Lysate डिग्री सेल्सियस -80 में संग्रहित किया जा सकता है ध्यान दें.
  15. (; अगर जरूरत अतिरिक्त lysis बफर के साथ केंद्रित lysate पतला. 500 μl की अधिकतम मात्रा में, आयुध डिपो 25 इष्टतम मिनट 10 आयुध डिपो,) धीरे प्रत्येक सूक्रोज ढ़ाल पर बराबर A260 इकाइयों लोड.
  16. सुनिश्चित करें ढ़ाल एक दूसरे से पहले ultracentrifugation का 0.1 जी भीतर हैं.
  17. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 घंटे के लिए 39,000 आरपीएम (260343 XG) पर अपकेंद्रित्र ढ़ाल.
  18. Spindown दौरान रोटर ब्रेक रखने के लिए और यह 1,000 आरपीएम तक पहुँच जाता है जब मंदी के दौरान इसे बंद.
    नोट: यह कदम ब्रश सिर ब्रेक लगाना के दौरान रोटर संपर्क के रूप में त्वरण में अचानक परिवर्तन के कारण ढ़ाल के किसी भी गड़बड़ी को कम करता है.

4. ढाल Fractionation सिस्टम उपकरण सेट-अप.

  1. सेट-अप साधन और खाली हैनिम्नानुसार पानी के साथ pectrophotometer:
    1. घटकों पर मुड़ें और दीपक वार्म अप करने के लिए कम से कम 15 मिनट के लिए अनुमति देते हैं.
    2. सुनिश्चित करें अंश कलेक्टर polysome 'विधि के लिए निर्धारित है (दो बार प्रेस फ़ोल्डर आइकन, घर लौटने स्क्रीन पर लौटने के लिए दो बार तीर).
    3. अंश कलेक्टर पर वाल्व सुनिश्चित (कचरा बिन आइकन के लिए तीर ओर इशारा करते हुए) बर्बाद करने के लिए निर्धारित है. अपशिष्ट संग्रह ट्यूब के तहत आसुत जल से युक्त 250 मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क रखें.
    4. चार्ट रिकॉर्डर पर निम्न सेटिंग्स का चयन करें: सेट संवेदनशीलता 'सेट दीपक और' प्रकाशिकी के लिए डायल; '1.5' के लिए शोर फिल्टर स्विच सेट; 'बंद' करने के लिए पीक विभाजक डायल सेट; '30 सेमी / घंटा 'के लिए (5 सेमी / 10 मिनट) चार्ट स्पीड डायल सेट; बेसलाइन 'अधिकतम खुली' को (स्पेक्ट्रोफोटोमीटर यूनिट के शीर्ष पर) डायल समायोजित सेट.
      नोट: वैकल्पिक: एक डिजिटल रिकॉर्डर सॉफ्टवेयर बजाय चार्ट रिकॉर्डर का इस्तेमाल किया जा सकता है. कंप्यूटर पर, 'आरंभ' पर क्लिक करें. एक अधिग्रहण खिड़की खुल जाएगा: गु के तहतई विकल्प मेनू, अचयनित रोकें ग्राफिक्स. स्केलिंग के तहत, (चलाने के दौरान मक्खी पर बदला जा सकता है) -10 और 100 को ग्राफ के सीमा तय की. एक नई फ़ाइल बनाने और चलाने के रिकॉर्ड को सहेजें बटन पर क्लिक करें.
    5. पंप में सिरिंज और बैरल प्लेस और जगह (उपयोग प्रदान की शिकंजा और एलन कुंजी) में कस.
      नोट: overtighten न करें.
    6. तीव्र गति से '' REV '' आदेश का उपयोग करके चेस समाधान के साथ सिरिंज भरें. ईमानदार स्थिति में पंप प्लेस और '' आगे '' आदेश का उपयोग ट्यूबिंग के माध्यम से हवा का पीछा. केवल इस समारोह और washes के लिए तेजी का उपयोग करें.
    7. RNase मुक्त पानी से भरा एक ultracentrifuge ट्यूब स्थापित करें.
    8. पियर्स दो काले निशान तक प्रवेशनी साथ ultracentrifuge ट्यूब दिखाई दे रहे हैं (वितरण छेद इन दो अंक के बीच स्थित है) और 6.0 मिलीग्राम / मिनट पर '' 'मैनुअल' पर सिरिंज पंप शुरू करते हैं.
    9. पानी (जब सी प्रवाह सेल के माध्यम से गुजरता हैHASE समाधान चर के लिए,) स्विच गति ट्यूब का 1/3 भरता है और 1.0 मिलीग्राम / मिनट के लिए निर्धारित किया है.
    10. 1.0 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर, चार्ट पर वोल्टेज शून्य (+/- 0.5 यूनिट) में है जब तक आधारभूत स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर डायल समायोजित समायोजित.
      नोट: Erlenmeyer फ्लास्क में बेकार ट्यूब से पानी बाहर निकलने का निरीक्षण करें.
    11. '0.5' या '1.0' Au को वांछित संवेदनशीलता सेट.
      नोट: 1.0 ए.यू. एक 10 मिलीलीटर ढाल में 10 आयुध डिपो इकाइयों के लिए सबसे अच्छा काम करता है. आयुध डिपो में 10 से कम है तो, '0.5' संवेदनशीलता संकेत बढ़ाने के लिए किया जा सकता है.
    12. ऑटो बेसलाइन बटन दबाओ और (डिजिटल रिकॉर्डर का उपयोग अगर वैकल्पिक) रिकॉर्डर ऑफसेट डायल बदल कर चार्ट रिकॉर्डर पर 10% निशान के लिए सेटिंग आधारभूत समायोजित.
    13. एक स्थिर आधारभूत हासिल की है एक बार डिजिटल रिकॉर्डर का उपयोग अगर एनालॉग चार्ट रिकॉर्डर या 'बंद' का उपयोग करते हैं, तो 60 सेमी / घंटा के लिए 'बंद' और चार्ट स्पीड डायल करने के लिए पंप स्विच बारी.
    14. आरई 'के लिए पंप स्विचन द्वारा चेस समाधान पुनर्प्राप्तयह भेदी प्रवेशनी पर पहले निशान तक पहुँच जाता है जब तक (एक त्वरित इस्तेमाल नहीं कर ... वापस 6.0 मिलीग्राम / मिनट के लिए प्रवाह दर को बढ़ा सकते हैं यदि आवश्यक) वी 'की स्थिति.
    15. अपकेंद्रित्र ट्यूब निकालें और इसके माध्यम से चेस समाधान का एक छोटा सा चलाकर प्रवेशनी के भीतर किसी भी हवाई बुलबुले का पीछा. भेदी मंच साफ साफ कर लें.
      नोट: कुछ अवशिष्ट जल प्रवाह सेल से रिसाव हो सकता है.

5. ढाल Fractionation और नमूने का संग्रह.

  1. स्थापित करें और सुक्रोज ढाल युक्त अपकेंद्रित्र ट्यूब पियर्स.
  2. टोपी ऊपर की तरफ फैलाना नहीं है कि इस तरह के अंश कलेक्टर ट्रे पदों 1-11 में ग्यारह 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों रखें. कलेक्टर ट्यूबिंग में छोड़ किसी भी तरल इकट्ठा करने के लिए एक '' बेकार ट्यूब '' के साथ अब के लिए '' ट्यूब # 1 '' बदलें.
  3. 'मैनुअल' के लिए पंप नियंत्रण डायल सेट और '6.0 मिलीग्राम / मिनट' के लिए सिरिंज पंप पर दर प्रवाह अंश कलेक्टर पर 'प्ले' आइकन प्रेस. जैसे ही हाथ पहले ट्यूब पहुँचता है, '' ठहराव '' बटन दबाएँ (इस हाथ की स्थिति और अंश-वितरण वाल्व खुल जाएगा).
  4. '' आगे '' आदेश का उपयोग कर पंप शुरू और चार्ट रिकॉर्डर कलम की निगरानी. यह ऊपर की ओर deflecting शुरू होता है, जल्दी से 'के साथ' बेकार ट्यूब '' '' ट्यूब # 1 '' की जगह (कि नमूना स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का प्रवाह सेल के माध्यम से गुजर रहा है यह दर्शाता है).
  5. पहली बूंद एकत्र किया जाता है, जल्दी से 'दूरस्थ शुरू / बंद करो', '' चर (1.0 मिलीग्राम / मिनट) '' और 'प्रेस' प्ले '' आइकन को आज्ञा स्विच.
    नोट: पंप अब अंश कलेक्टर इंटरफ़ेस द्वारा नियंत्रित किया जाता है और 1 मिलीलीटर भिन्न हर मिनट एकत्र किया जाएगा.
  6. पर इस बिंदु से, A260 रीडिंग डिजिटल रिकॉर्डर इंटरफेस (या अनुरूप चार्ट Recorde पर दिखाई देगाआर). '' रिकार्ड '' सॉफ्टवेयर पर बटन दबाया जाता है सुनिश्चित करें!
  7. नीले चेस समाधान एकत्रित ट्यूब या पिछले ट्यूब (आमतौर पर ट्यूब 11) में प्रवेश करती है के बाद, 'बंद करो' आइकन प्रेस.
    नोट: वितरण वाल्व अपशिष्ट वाल्व के लिए स्विच करना चाहिए.
  8. सभी ढ़ाल fractionated किया गया है जब तक बर्फ पर भिन्न रखें. दिन अंशों के अंत में पूर्व प्रोटीन या शाही सेना अलगाव को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है. प्रोटीन और आरएनए विश्लेषण की आवश्यकता है, आधे में प्रत्येक अंश (प्रोटीन और आरएनए के विश्लेषण के लिए 500 μl प्रत्येक) विभाजित.

6. धो

नोट: (बहुल ढ़ाल एकत्र हो रहे हैं, तो यह केवल प्रदर्शन किया जा करने के लिए एक वैकल्पिक कदम है).

  1. ~ युक्त Erlenmeyer फ्लास्क में ultrapure पानी की 50 मिलीलीटर बेकार ट्यूब डूब और एक 6 मिलीग्राम / मिनट प्रवाह दर का उपयोग पंप रिवर्स.
  2. चेस समाधान पहले मार्क ओ पहुंचता है जब पंप बंद करोएन भेदी प्रवेशनी.
  3. , अपकेंद्रित्र ट्यूब निकालें प्रवेशनी के बाहर किसी भी हवाई पीछा और भेदी मंच साफ.
    नोट: कुछ अवशिष्ट जल प्रवाह सेल से रिसाव हो सकता है.
  4. कदम 5.1 से शुरू विभाजन प्रक्रिया को दोहराएं.

7. अंतिम क्लीन अप.

  1. बेधनेवाला के नीचे से पंप टयूबिंग डिस्कनेक्ट और तेजी से प्रवाह सेटिंग का उपयोग कर एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में चेस समाधान पंप. यह पुन: उपयोग किया जा सकता है के रूप में 4 डिग्री सेल्सियस पर चेस समाधान स्टोर.
  2. एक 3 रास्ता ट्यूबिंग व्यवस्था करने के लिए पंप ट्यूब कनेक्ट और सिरिंज के लिए अग्रणी वाल्व बंद करें. आसुत जल और बेधनेवाला के आधार पर अन्य ट्यूब से भरा एक 50 मिलीलीटर सिरिंज से एक ट्यूब कनेक्ट करें.
  3. Blanking कदम के लिए इस्तेमाल किया ultracentrifuge ट्यूब स्थापित करें और '' स्टार पर क्लिक करके इंटरफेस पर संग्रह मेनू के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और संग्रह ट्यूब (स्विच के माध्यम से आसुत जल के कम से कम 50 मिलीलीटर पारितटी / रोकें '' आइकन).
  4. और अन्य सभी हटाने योग्य घटकों (शिकंजा हटाने के लिए उपयोग एलन कुंजी) और गर्म पानी के नल का उपयोग अच्छी तरह से धो लें और फिर ultrapure पानी से कुल्ला ट्यूब, सिरिंज निकालें.
    नोट: सवार, बैरल, ट्यूबिंग धोने और प्रवेशनी भेदी जब विशेष ध्यान रखना.
    नोट: देखभाल के साथ कांच सिरिंज बैरल संभाल! दूर धूल से सभी घटकों स्टोर.
  5. आसुत जल से सिक्त एक नरम ऊतक के साथ प्रवाह सेल के नीचे साफ कर लें. अंश कलेक्टर ट्रे और सुक्रोज गिरा दिया गया हो सकता है, जहां किसी भी अन्य क्षेत्रों नीचे साफ कर लें.

सुक्रोज भागों से शाही सेना के 8. अलगाव.

  1. (37.5 μl 10% एसडीएस, 7.5 μl 0.5m EDTA, 1 μl Glycoblue, 20 मिलीग्राम की 4 μl / एमएल proteinase कश्मीर) sucrose के अंश का हर 1 मिलीलीटर के लिए proteinase कश्मीर समाधान के 50 μl तैयार करें.
  2. 2 मिलीलीटर फ्लैट नीचे ट्यूब में 55 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर proteinase कश्मीर समाधान के 50 μl के साथ sucrose के अंश सेते1 घंटे के लिए (अगर 500 μl भिन्न तदनुसार proteinase कश्मीर हल की मात्रा समायोजित का उपयोग).
  3. क्लोरोफॉर्म: फिनोल के एक बराबर मात्रा में जोड़ें Isoamyl शराब सूक्रोज भिन्न करने के लिए (125: 24 1, अधिमानतः अम्लीय (पीएच 4.5) डीएनए संदूषण को कम करने के लिए).
    नोट: वे भारी होते हैं और चरणों उलटा हो सकता है क्योंकि भिन्न 7-10 को क्लोरोफॉर्म की एक अतिरिक्त 200 μl जोड़ें.
    नोट: फिनोल / क्लोरोफॉर्म संपर्क और साँस लेना पर जलता पैदा कर सकता है. प्रयोगशाला कोट, सुरक्षा चश्मे पहनें, और एक fumehood का उपयोग करें.
  4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए अधिकतम गति पर भंवर ~ 30 सेकंड और अपकेंद्रित्र.
  5. ~ जलीय चरण के 80-90% निकालें नया ट्यूब में और जगह (जीनोमिक डीएनए को नियंत्रित कर सके जो interphase स्पर्श नहीं करते).
  6. क्लोरोफॉर्म और दोहराने कदम 8.4 के एक बराबर मात्रा में जोड़ें.
  7. Interphase से बचने के लिए सावधान किया जा रहा जलीय चरण निकालें.
  8. 3 एम सोडियम एसीटेट के 01:10 मात्रा, पीएच 5.2 जोड़ें (वैकल्पिक रूप से 5 एम अमोनियम एसीटेट इस्तेमाल किया जा सकता है).
  9. ठंडा, Absolu के 1.5 संस्करणों जोड़ें15 सेकंड के लिए ते इथेनॉल और भंवर.
  10. -20 डिग्री सेल्सियस (या -80 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के एक भीड़ में अगर) में रात भर वेग.
    नोट: नमूने पर छोड़ा जा सकता है -20 अगर जरूरत लंबे समय तक के लिए सी °.
  11. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए अधिकतम गति पर अपकेंद्रित्र.
  12. ठंडा RNase मुक्त 70% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर के साथ गोली धो लें.
  13. एयर RNase मुक्त पानी की 20 μl में गोली और resuspend सूखी.
  14. पर्याप्त उपज और (A260 / 280 के अनुपात के आधार पर) शुद्धता सुनिश्चित करने और ब्याज की mRNA (ओं) के लिए विशिष्ट बराबर प्रत्येक अंश की मात्रा और पीसीआर प्राइमरों का उपयोग कर मानक आरटी-qPCR विश्लेषण 14 पर आगे बढ़ने के स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा कुल शाही सेना यों.

सुक्रोज भागों से प्रोटीन की 9. अलगाव.

  1. शाही सेना के अलावा, प्रोटीन को पृथक किया जा सकता है और साथ ही व्यक्तिगत polysome भागों में पहचान की. 18 जैसे प्रोटीन अलगाव के लिए उपलब्ध कई उत्कृष्ट प्रोटोकॉल, में से एक का उपयोग करें.

Representative Results

हमने हाल ही में apoptotic अवरोधकों XIAP और बीसीएल-एक्सएल 12 एन्कोडिंग mRNAs IRES-शरण देने के एक चयनात्मक अनुवाद अवरोध के रूप में ट्यूमर शमन PDCD4 के लिए एक उपन्यास भूमिका का वर्णन किया है. Polysome रूपरेखा IRES की मध्यस्थता अनुवाद में PDCD4 की विशेष भागीदारी प्रदर्शित करने के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक था. HEK293 कोशिकाओं क्षणिक PDCD4 (चित्रा 1 ए) के अंतर्जात स्तर गिरेगा को ट्रांसफ़ेक्ट और फिर प्रोफाइल विश्लेषण polysome के अधीन थे. हम siCTRL और siPDCD4 इलाज कोशिकाओं (चित्रा 1 बी) की तुलना करते समय polysome प्रोफ़ाइल में परिवर्तन की कमी से न्याय के रूप में PDCD4 के कम करने के स्तर, वैश्विक सेलुलर अनुवाद ख़राब नहीं था कि मनाया. इसी तरह, XIAP 19 की गैर IRES संस्करण की polysome वितरण और इलाज कोशिकाओं (चित्रा 1C) के बीच अपरिवर्तित रहा था. इसके विपरीत, दो IRES-शरण mRNAs का polysome वितरण, XIAP और बीसीएल-एक्सएल, काफी बदल गया था. पी के अभाव मेंDCD4 इन दो mRNAs का वितरण भारी ribopolysomes (चित्रा -1, ई) में स्थानांतरित कर दिया है. इस XIAP और बीसीएल-एक्सएल mRNA (चित्रा 1F) इन परिणामों के स्थिर राज्य स्तर में परिवर्तन के साथ नहीं है, इसलिए आगे पश्चिमी सोख्ता (चित्रा द्वारा पुष्टि की गई है जो कम PDCD4 के स्तर के साथ कोशिकाओं में XIAP और बीसीएल-एक्सएल का अनुवाद बढ़ाया प्रदर्शित 1G).

चित्रा 1
चित्रा 1:. Polysome रूपरेखा XIAP और बीसीएल-एक्सएल अनुवाद के चयनात्मक अवरोध के रूप में PDCD4 पहचानती है (ए) HEK293 कोशिकाओं PDCD4 siRNA या नियंत्रण (Ctrl) के साथ इलाज किया गया, विरोधी PDCD4 साथ lysed और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के अधीन siRNA, गैर-लक्ष्य और विरोधी Nucleolin एंटीबॉडी. PDCD4 तोड़े नीचे की हद तक सत्यापित (बी) PDCD4 (ए) के रूप में नीचे गिरा दिया गया था और करने के लिएसेल lysates रूपरेखा polysome के अधीन थे. प्रतिनिधि polysome प्रोफाइल शीर्ष पैनल में दिखाया गया है; XIAP गैर IRES (सी) के वितरण, GAPDH के सापेक्ष बीसीएल-एक्सएल (डी), और XIAP IRES (ई) mRNAs प्रत्येक अंश में कुल mRNA की प्रतिशत (% mRNA) के रूप में दिखाया गया है. (एफ) संभल -state mRNA स्तर PDCD4 siRNA या नियंत्रण (Ctrl) siRNA इलाज कोशिकाओं में आर टी-qPCR द्वारा मापा गया. (जी) से lysates (ए) के भी विरोधी XIAP, विरोधी बीसीएल-एक्सएल, और साथ पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के अधीन थे विरोधी Nucleolin एंटीबॉडी. (एनबी. डाटा मूल रूप से 12 में प्रकाशित किए गए थे चित्रा 1 में प्रस्तुत) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

Polysomal रूपरेखा अलग उपचार शर्तों के तहत विशिष्ट टेप के अनुवाद की राज्य की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है कि एक शक्तिशाली तकनीक है. यह सिद्धांत रूप में एक बहुत ही सरल तकनीक है फिर भी यह अच्छा polysome प्रोफाइल के उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण हैं, जिनमें से कुछ निष्पादन के कई चरणों की आवश्यकता है. 1) RNase मुक्त रसायन और plasticware का उपयोग, 2) (अच्छा सूक्रोज ढ़ाल तैयारी हमारे अनुभव में एक 10-50% sucrose के ढ़ाल कुशलतापूर्वक बाध्य राइबोसोम के साथ 40/60 सब यूनिटों और mRNAs) को हल करने के लिए सबसे अच्छा काम करते हैं, और 3: इन महत्वपूर्ण कदम हैं ) अनुवाद की दर सबसे अधिक कब्जा करने के क्रम में तेजी से बढ़ रहे हैं कि कोशिकाओं और कोई 80% से अधिक मिला हुआ इस्तेमाल करते हैं. इस तरह के जीन पछाड़ना या overexpression के रूप में लंबे समय सेल उपचार कर जब थाली करने के लिए कोशिकाओं की राशि कोशिकाओं समापन बिंदु पर मिला हुआ हो जाएगा कितना के एक समारोह होगा कि इतना यह बाद कदम, को ध्यान में रखा जाना चाहिए.

परिणामों में presenटेड यहाँ, polysome प्रोफाइल विश्लेषण IRES-शरण mRNAs XIAP और बीसीएल-एक्सएल 12 का अनुवाद विनियमन में PDCD4 भूमिका का आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण था. हम PDCD4 तोड़े नीचे (चित्रा 1 बी) पर सामान्य polysome प्रोफाइल में कोई भी परिवर्तन का पालन नहीं किया तथ्य यह है कि हमें PDCD4 प्रयोग की शर्तों के तहत वैश्विक सेलुलर अनुवाद ख़राब नहीं था कि समाप्त करने के लिए अनुमति दी. हम अगले PDCD4 या नियंत्रण siRNAs के साथ इलाज किया कोशिकाओं में XIAP और बीसीएल-एक्सएल mRNAs का वितरण निर्धारित करने के लिए आर टी-qPCR विश्लेषण का इस्तेमाल किया. यह mRNA के वितरण का एक मात्रात्मक बजाय अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण के लिए और उपचार के बीच translational दक्षता में सूक्ष्म बदलाव का पता लगाने के लिए अनुमति देता है क्योंकि qPCR, मानक आरटी-पीसीआर या उत्तरी सोख्ता के लिए विरोध के रूप में, polysome प्रोफाइल विश्लेषण करने के लिए विकल्प की एक विधि है. इस तकनीक का उपयोग करना, हम XIAP और बीसीएल-एक्सएल mRNAs का वितरण (जीआर भर में कुल लक्ष्य mRNA की एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त कि दिखाने के लिए सक्षम थेadient) काफी इस प्रकार इन mRNAs का अनुवाद में वृद्धि का संकेत है, PDCD4 तोड़े नीचे (चित्रा -1, ई) के बाद उनके साथ जुड़े राइबोसोम की एक बड़ी संख्या) के साथ भारी polyribosomes (mRNAs में स्थानांतरित कर दिया गया था. यह आगे XIAP और बीसीएल-एक्सएल प्रोटीन के स्तर में नहीं बल्कि उनके स्थिर राज्य आरएनए स्तर (चित्रा 1F, जी) में वृद्धि के द्वारा पुष्टि की गई. महत्वपूर्ण बात है, XIAP की गैर IRES संस्करण की polysome वितरण और इलाज कोशिकाओं (चित्रा 1C) के बीच अपरिवर्तित रहा था. वैकल्पिक रूप से, translational दक्षता 14 (आमतौर पर 2 से 4 भिन्न) monosomes बनाम polysomes में mRNA सामग्री के अनुपात (आमतौर पर 5 से 10 भिन्न) के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है.

254 एनएम पर absorbance रीडिंग से मनाया चोटियों अपने दम पर ribosomal शाही सेना (डिटर्जेंट के लिए जिम्मेदार ठहराया नहीं जा सकता है के रूप में प्रोटोकॉल के दौरान नियंत्रण का उपयोग, परिणाम रूपरेखा किसी polysome मान्य में महत्वपूर्ण हैऐसे ट्राइटन X-100 के रूप में है, दृढ़ता से) स्पेक्ट्रम के इस क्षेत्र में अवशोषित और ढाल के शीर्ष पर 40/60 चोटियों अस्पष्ट हो सकता है. Lysate बिना और / या lysate बफर के साथ खाली ढ़ाल 254 एनएम पर absorbance के लिए बफ़र्स के रिश्तेदार योगदान निर्धारित करने के लिए चलाने की जरूरत है. Artefactual उच्च आदेश संरचनाओं भी तथ्य कोई नहीं में (उदाहरण के लिए "छद्म polysomes" 20) हैं जहां polysomes की गलत व्याख्याओं को जन्म दे सकता है. मैग्नीशियम sequestering द्विसंयोजक कटियन chelator EDTA के साथ (80 के दशक राइबोसोम को स्थिर करने के लिए प्रक्रिया के दौरान प्रयुक्त) बड़े (60 अपने घटक छोटे (40s) में राइबोसोम की जुदाई का कारण है और होगा lysates करने और ढाल बफर (15 मिनट के लिए 20 मिमी) में जोड़ा ) सब यूनिटों. 260 एनएम पर दर्ज absorbance के चोटियों polysomes वास्तव में कर रहे हैं इस प्रकार, यदि EDTA के इलाज के लिए एक भी अधिकतम mRNA और राइबोसोमल इकाइयों को मुक्त करने के लिए संगत ढाल के शीर्ष के पास मनाया जाएगा कि इस तरह के प्रोफाइल गिर जाएगा (नहीं दिखाया डेटा). मुनासिबप्रोफ़ाइल के EDTA प्रेरित पतन के साथ, qPCR द्वारा विश्लेषण विशिष्ट लक्ष्य के सभी अब ढाल के शीर्ष पर पाया जाना चाहिए.

एक mRNA के साथ जुड़े राइबोसोम की संख्या हमेशा विशेष mRNA के अनुवाद किया जा रहा है कि कैसे कुशलता का सूचक नहीं है. दरअसल, polysomes पर सक्रिय अनुवाद पाठक के बारे में पता होना चाहिए जो 21,22 ठप हो जाता है जिसमें विशिष्ट संदर्भों रहे हैं. टेप सक्रिय रूप EDTA के विपरीत, 'रन दूर' सक्रिय रूप से एक mRNA के पार translocating रहे हैं कि राइबोसोम के कारण बनता है जो puromycin साथ नमूना, इलाज) एक करके किया जा सकता अनुवाद मशीनरी के साथ लगे हुए हैं, या बी) नमूना इलाज कर रहे हैं या नहीं, निर्धारण फिर किसी भी नीचे की ओर translocating राइबोसोम की 'रन-बंद' के कारण, शुरू कोडोन पर केवल पहले राइबोसोम के स्थानान्तरण को रोकता है जो homoharringtonine साथ.

qPCR के विश्लेषण के लिए नियंत्रण टेप का उपयोग भी महत्वपूर्ण है. selecऐसे XIAP IRES की गैर IRES संस्करण कुछ गृह व्यवस्था जीन (GAPDH, actin, ट्यूबिलिन, Nucleolin), राइबोसोमल mRNAs (18S, RPL13A) के रूप में या इस मामले में अलग-अलग उपचार स्थितियों से प्रभावित नहीं हैं कि टेप के लिए tion, में महत्वपूर्ण है पुष्टि करने के अनुवाद पर उपचार के प्रभाव विशिष्ट या सामान्यीकरण है. ये नियंत्रण टेप यहाँ किया गया था के रूप में विश्लेषण mRNAs का वितरण मानक के अनुसार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (XIAP और बीसीएल-एक्सएल mRNAs GAPDH mRNA के लिए सामान्यीकृत और हर अंश में mRNA सामग्री की राशि के प्रतिनिधित्व वाले कुल mRNA के सामग्री का एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया ) या वैकल्पिक रूप से, लक्ष्य और नियंत्रण mRNAs निरपेक्ष मूल्यों के रूप में व्यक्त किया है और अलग से दिखाया जा सकता है. इनपुट lysates (कुल मात्रा का आमतौर पर 10%) की qPCR विश्लेषण विशिष्ट mRNAs का वितरण के लिए नियंत्रण होगा कि एक और कदम है. आदर्श रूप में, इनपुट lysate में एक विशिष्ट प्रतिलेख के mRNA के सामग्री का विश्लेषण किया सभी 10 भागों में mRNA के सामग्री की राशि के बराबर हो जाना चाहिए. अंत मेंएक वैकल्पिक कदम फिनोल के लिए नियंत्रित करने के लिए: क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण कदम (कैट, chloramphenicol एसिटाइल ट्रांस्फ़्रेज़ जैसे) बाद में qPCR द्वारा मात्रा निर्धारित किया जाएगा और भी इस्तेमाल किया जा सकता है कि मानक के अनुसार इन विट्रो लिखित संवाददाता mRNA के साथ प्रत्येक polysome अंश स्पाइक है डेटा 14.

किसी भी तकनीक के साथ के रूप में, polysome रूपरेखा कुछ सीमाएं प्रस्तुत करता है. आमतौर पर 10 भिन्न की एक न्यूनतम अच्छा polysome वितरण के क्रम में एकत्र होने की जरूरत (अनुवाद दक्षता में और अधिक सूक्ष्म बदलाव 20 या अधिक आवश्यकता हो सकती है) इस तथ्य है कि इस कदम के 4 नमूने का केवल एक अधिकतम हो सकता है कि भावना में, सीमित बनाता है एक समय पर विश्लेषण किया आराम से एक ही बार में शाही सेना निष्कर्षण और 40 नमूने और 4 इनपुट नियंत्रण की qPCR विश्लेषण संभाल करने में सक्षम हो. नमूना आकार आसानी qPCR के पास करने के लिए प्रतिकृति कितने टेप का विश्लेषण किया जा करने के लिए कर रहे हैं और कितने के साथ जोड़ सकते हैं, और यह महंगा हो सकता है. एक qPCR आधारित polysomal रूपरेखा एक की एक और सीमाnalysis यह केवल (टेप पहले से जाना जाता विश्लेषण किया है) और अनुवाद के जीनोम चौड़ा विश्लेषण के लिए लागू नहीं किया जा सकता है एक उम्मीदवार-आधारित दृष्टिकोण पर किया जा सकता है. हालांकि, 21 वीं सदी की शुरुआत में, जांचकर्ताओं डीएनए का उपयोग कर एक जीनोमिक स्तर पर उनके polysomal शाही सेना से पूछताछ करने के लिए शुरू अगली पीढ़ी के अनुक्रमण 16,17 से अधिक हाल ही में 15 और प्रोटीन. बल्कि व्यक्तिगत अंशों की qPCR विश्लेषण प्रदर्शन से सिवाय इसके कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में इस शक्तिशाली दृष्टिकोण में, polysomal रूपरेखा किया जाता है, वैश्विक अनुवाद में भिन्न (आमतौर अंश 2-4) और polysomes भिन्न (आमतौर पर भिन्न) एक साथ जमा कर रहे हैं और विविधताओं विश्लेषण monosomes डीएनए माइक्रोएरे या पूरे जीनोम शाही सेना अनुक्रमण द्वारा. इसलिए इस दृष्टिकोण के साथ, यह आकलन करना संभव है सभी जिसका वितरण बदलाव polysomes से monosomes के लिए (अनुवाद में कमी) या उपाध्यक्ष प्रतिकूल (अनुवाद में वृद्धि) एक विशिष्ट इलाज पर mRNAsबयान. विशिष्ट mRNA के polysomes वितरण के प्रमाणीकरण और मात्रा का ठहराव तो qPCR के द्वारा किया जा सकता है. Polysomal रूपरेखा सिद्धांत का एक और भी अधिक शक्तिशाली उपयोग राइबोसोम की रूपरेखा है. इस तकनीक के आगे उच्च throughput विस्तार polysome भिन्न 23 के सैकड़ों की एक साथ निगरानी के लिए अनुमति देता है कि हाल ही में सूचना मिली थी. उत्परिवर्ती संग्रह की या एक बड़े पैमाने पर आरएनएआई स्क्रीन में translational क्षमता की जांच कर रही है जब यह एक स्पष्ट लाभ प्रदान करता है. राइबोसोम की रूपरेखा प्रोटीन संश्लेषण 24,25 में लगे हुए राइबोसोम (राइबोसोम पैरों के निशान) द्वारा संरक्षित शाही सेना के टुकड़े नक्शा करने के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का लाभ लेता है कि एक तकनीक है. इस तकनीक में, राइबोसोम स्थानान्तरण cycloheximide (प्रतिवर्ती) या इमेटिन (अपरिवर्तनीय) राइबोसोम पैरों के निशान की आबादी उपज के लिए सेल और RNase पाचन द्वारा पीछा साथ हिचकते जा सकता है. राइबोसोम, समृद्ध कुल शाही सेना अलग है, और contaminating राइबोसोमल और mitochondrial ribosomal शाही सेना हटा दिया जाता है.लगभग 26-28 न्यूक्लियोटाइड की शाही सेना पैरों के निशान अलग होते हैं, एक सीडीएनए पुस्तकालय में परिवर्तित, लिखित और 26 अनुक्रम रिवर्स. मानक polysome रूपरेखा के विपरीत, इस दृष्टिकोण से न केवल translationally विनियमित रहे हैं कि विशिष्ट mRNAs को पहचानती है लेकिन यह भी एक विशिष्ट प्रतिलेख साथ सटीक व्यवसाय और राइबोसोम के घनत्व के रूप में कोडोन प्रस्ताव पर mRNA के-विशिष्ट जानकारी पैदावार. यह हो रहा है, जहां प्रतिलिपि राइबोसोम-भर्ती पर पर अधिक जानकारी दे सकता है, क्योंकि यह विशेष रूप से इस तरह के IRES-शरण mRNAs के रूप में अनुवाद के विशेष मोड के साथ mRNAs के लिए ब्याज की है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gradient Master 108 automated gradient maker BIOCOMP 107-201M
Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker LABCONCO 4517000
Beckman Ultracentrifuge  Beckman Coulter Model # L-100-XP
Density gradient fractionator TELEDYNE ISCO 69-3873-246 Composed of: tube piercing system,  peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280 nm filters and Foxy R1 Fraction Collector
WinDaq data acquisition software DATAQ INSTRUMENTS WINDAQ/LITE http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm
Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14 x 89 mm) Beckman Coulter 331372
Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose) DiaMed PRE1900-N
Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom) SafeSeal 12000
Sucrose (nucleases-free) Calbiochem 573113 MW = 342.3 g/mol
Cycloheximide SIGMA C7698 MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing.
Sodium chloride (nucleases-free) OmniPur 7710 MW = 58.44 g/mol
MgCl2.6H2O (nucleases-free) OmniPur 5980 MW = 203.3 g/mol
Tris Base (nucleases-free) J.T. Baker 4109-01 MW = 121.14 g/mol
Triton X-100 OmniPur 9400 Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation
Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2515
RNaseZap Rnase inactivation solution Ambion, Life Technologies AM9780
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml) Invitrogen, Life Technologies AM9516
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) Ambion, Life Technologies AM9722 Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion

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References

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