Évaluation de la sélective ARNm traduction dans les cellules de mammifères par polysome profilage

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Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling. J. Vis. Exp. (92), e52295, doi:10.3791/52295 (2014).

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Abstract

Régulation de la synthèse des protéines représente un point de contrôle clé dans la réponse cellulaire au stress. En particulier, des éléments de régulation de l'ARN discret ont été montrés pour permettre à la traduction sélective des ARNm spécifiques, qui codent pour des protéines généralement nécessaires pour une réaction de stress particulier. L'identification de ces ARNm, ainsi que la caractérisation des mécanismes de régulation chargées de la traduction sélective a été à la pointe de la biologie moléculaire pour un certain temps. Profilage polysome est une méthode pierre angulaire dans ces études. Le but de polysome profilage est de capturer traduction de l'ARNm en immobilisant ribosomes traduisant activement sur différents transcrits et séparer les polyribosomes résultant par ultracentrifugation sur un gradient de saccharose, ce qui permet d'établir une distinction entre les transcriptions très traduits et les mal traduits. Ceux-ci peuvent ensuite être en outre caractérisés par des méthodes de biologie moléculaire et de biochimie classiques. Surtout, p combinantolysome profilage haut débit avec des approches de génomique permet une analyse à grande échelle de régulation de la traduction.

Introduction

Régulation de la synthèse protéique (traduction) est un processus cellulaire clé qui est intimement liée à la survie cellulaire. Étant donné que la traduction consomme plus de 50% de l'énergie de la cellule, il est peu surprenant que la traduction est strictement réglementée et que les perturbations dans la traduction ne sont pas bien toléré. En revanche, de nombreux processus cellulaires aberrantes exiger que la machinerie de traduction et de sortie de traduction (par exemple du protéome) doivent être modifiés. Cela est souvent le cas dans divers états d'intervention et de stress, les maladies et est probablement le meilleur exemple dans le cancer. Un avantage clé de contrôle de la traduction est la capacité des cellules à reprogrammer rapidement la production de la protéine en réponse à différents déclencheurs externes et internes, le mécanisme de réglage fin ainsi que pencher la balance entre la survie et la mort cellulaire 1.

Deux aspects de contrôle de la traduction sont particulièrement intéressants; la compréhension de la nature de la régulation mechanism (s) et de contrôle des éléments qui permettent de traduction spécifique, et l'identification des ARNm spécifiques et de leurs produits de protéines qui participent à la réponse cellulaire à la gâchette particulier qui a suscité traduction sélective en premier lieu. Polysomes profilage est une technique qui permet d'étudier efficace des deux processus.

L'objectif global de la technique polysome de profilage est d'étudier et de quantifier l'état de la traduction des ARNm spécifiques dans des conditions cellulaires. Le principe de la technique est de capturer traduction de l'ARNm par '' geler '' ribosomes traduisant activement sur différents transcrits et séparer les polyribosomes résultant par ultracentrifugation sur un gradient de saccharose, ce qui permet d'établir une distinction entre les transcriptions très traduits (liée par plusieurs ribosomes) et les mal traduit (lié par un ou deux ribosomes). Dans ce protocole particulier, le cycloheximide antibiotique qui se lie à la60S de la sous-unité ribosomique et bloque la libération de déacétylé ARNt du site E ribosome 2, est utilisée pour inhiber la translocation du ribosome et caler ribosomes sur les ARNm de traduction. Cependant, d'autres agents de blocage, tels que l'émétine cette traduction aussi des blocs allongement 3, peut être utilisé.

Contrairement à la Western blot et 35 S-méthionine techniques de marquage qui mesurent le résultat final du processus de traduction, polysome profilage a l'avantage de mesurer les ribosomes association avec des ARNm activement traduits, ce qui permet une étude plus détaillée des mécanismes de traduction dans différentes conditions. Par conséquent, la technique peut être facilement adapté pour étudier spécifiquement les différents modes de traduction 4-6, facteurs de protéines impliquées dans la régulation de la traduction 7-9, les conditions de stress affectant la synthèse des protéines 1,10,11 ou les effets des structures d'ARNm tels que IRES ou en amont cadres de lecture ouverts sur la protéine synthéSIAE 12-14. Aujourd'hui, polysome Profilage des applications sont encore plus large avec l'utilisation de puces à ADN 15 ou séquençage de nouvelle génération 16,17 à analyser polysomes associés ARNm.

Protocol

NOTE: Une note sur le travail avec ARN: Prendre les précautions habituelles contre la dégradation de l'ARN par RNases. Utiliser des gants, des conseils barrière de pipettes, vaisselle en plastique sans RNase et les produits chimiques dans toutes les étapes du protocole. Utilisation ultra pure ou de l'eau traitée au DEPC pour toutes les solutions. Décontaminer les surfaces présumés avec une solution d'inactivation RNase suivant le protocole du fabricant.

1. Préparation des solutions.

  1. Préparer 500 ml d'une solution de base (0,3 M NaCl;. 15 mM MgCl 2, 6H 2 O, 15 mM Tris-HCl, pH 7,4). Mélanger à l'aide d'une barre d'agitation jusqu'à ce que la solution est limpide et passer à travers un filtre de 0,45 um. Entreposer à la température ambiante.
  2. Préparer 10 et 50% et les solutions de saccharose à 60% Solution de Chase comme suit:
    1. Pour la solution de saccharose 10% (p / v), dans un tube de 50 ml Centrifugeuse ajouter 5 g de saccharose et de remplir à 50 ml avec la solution de base. Pour 50% de saccharose Solution (p / v), dans un tube de centrifugeuse de 50 ml annonced 25 g de saccharose et de remplir à 50 ml avec la solution de base.
    2. Pour 60% (p / v) de solution de Chase, dans un tube à centrifuger de 50 ml, ajouter 30 g de saccharose et de remplir à 50 ml avec la solution de base. Ajouter 100 ul de solution de bleu de bromophénol saturé (ajouter du bleu de bromophénol à l'eau jusqu'à ce qu'il ne se dissolve plus; centrifugeuse pour sédimenter la poudre non dissoute) à la solution de chasse de 60%. Mélanger à l'aide d'un vortex et vérifier une dissolution complète.
    3. solutions de conserver à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
  3. Préparer du tampon de lyse d'ARN. Préparer ce tampon frais le jour de l'expérience. Préparer 500 ul de tampon de lyse d'ARN de chaque échantillon. A 1 ml de la solution de base ajouter 10 ul de Triton X-100 (1% [v / v] finale), 1 ul de 100 mg / ml dans du DMSO cycloheximide (CHX, 0,1 mg / ml final) et 3,5 ul de RNasin (140 U / ml). Mélanger à l'aide d'un vortex. Garder sur la glace.
    REMARQUE: cycloheximide est hautement toxique et peut causer des mutations. Eviter le contact de la peau et l'inhalation. Pour éviter de manipuler la forme de poudre trop souvent, préparationsont une plus grande quantité de 100 mg / stock ml dans le DMSO, aliquote et garder à -80 ° C pour le stockage à long terme. Gardez stock de travail à -20 ° C.
  4. Le jour de l'expérience, la préparation des solutions de saccharose + CHX CHX par l'ajout (concentration finale de 0,1 mg / ml) au volume désiré de 10% et une solution de saccharose à 50% (~ 7 ml de chaque solution par gradient).

2. Préparation de gradient de saccharose utilisant une machine automatisée Gradient

  1. Tournez le gradient fabricant '' ON '' et le niveau de la plaque qui tiendra les gradients (criticalstep!) Cliquez sur '' Terminé '' lorsque la plaque est nivelé.
  2. Sélectionnez dans le menu le programme gradient à être exécuté:
    1. Appuyez sur '' menu 'GRAD' et sélectionnez '' LISTE ''.
    2. Sélectionnez "SW41".
    3. Faites défiler la liste et sélectionnez l'option ''10 - 50% de dénivelé - 11 étapes "programme" par la pressesur le bouton '' RUN ''.
  3. Placez un tube conique d'ultracentrifugation (SW-41 tube 14 x 89 mm) dans le bloc Marker et utiliser le marqueur du tube amende prévue pour tracer une marque sur le tube le long de la marche supérieure de l'édifice du marqueur. Placer les tubes dans un rack de montage sur une surface stable.
    NOTE: Cette marque sera le guide de remplissage pour la superposition des solutions de saccharose 10 et 50%.
  4. Fixez la canule deux fourni à deux seringues de 10 ml et laver par aspiration et refoulement d'eau chaude distillée contenant une solution d'inactivation RNase. Assurez-vous d'enlever toutes les traces de l'eau par la suite.
  5. Remplir une des seringues avec 10% de saccharose + CHX et insérer la canule à l'extrémité inférieure du tube d'ultracentrifugation. Passer doucement solution à 10% de saccharose jusqu'à ce que il va juste passé la marque faite sur le tube.
    REMARQUE: Évitez de faire des bulles. Si des bulles se forment, tapotez doucement le tube pour les déplacer.
  6. Remplir l'autre seringue avec 50% de saccharose + CHX, essuyez le liquide de congé supplémentaireavec une lingette doucement et insérer la canule à l'extrémité inférieure du tube d'ultracentrifugation. Passer doucement la solution de saccharose à 50% jusqu'à ce qu'il atteigne exactement la marque. Éliminer rapidement et en douceur la canule.
    NOTE: Les 10% de saccharose devrait augmenter dans le tube et former un ménisque au sommet. Dans le cas contraire, ajouter plus de solution de saccharose à 10% à la surface.
  7. Insérez le capot de protection fourni par l'inclinaison du tube d'ultracentrifugation légèrement et déplacer toutes les bulles d'air. Retirer l'excès de liquide dans le réservoir de la casquette avec une micropipette.
  8. Essuyez l'excès de liquide le long de la paroi du tube et le placer sur la plaque gradient de fabricant.
  9. Appuyez sur le bouton '' RUN ''.
    REMARQUE: La plaque incliner l'angle spécifié, une pause de 5 secondes et les rotations pour former le gradient va commencer.
  10. Lorsque la formation est terminée gradient (environ 2 min, la machine émet un signal sonore), retirez délicatement le ultracentrifugation (s), Placer sur une grille et retirer rapidement bouchon dans un mouvement vers le haut pour éviter de perturber le Gradient.
  11. Gardez gradient (s) sur la glace. Ne pas déranger! Alternativement, les gradients garder une nuit à 4 ° C.
  12. Sinon, utilisez un gradient fabricant de deux chambre pour faire des dégradés comme suit:
    1. Rincer les tubes et gradient fabricant avec une solution RNase d'inactivation et de l'eau sans RNase.
    2. Ajouter 5 ml de saccharose à 50% + CHX à la chambre proximale du fabricant gradient et veiller à ce que l'air entre les deux chambres est retiré.
    3. Ajouter 5 ml de saccharose à 10% + CHX à la chambre distale du fabricant gradient.
    4. Ajouter 0,5 ml de saccharose à 50% + CHX à fond d'un tube de centrifugeuse conique (SW-41 tube 14 x 89 mm) et mettre dans le porte tube.
    5. Mettez agitateur placé dans la chambre proximale, ouverts robinets d'arrêt et le gradient de dépôt à une vitesse réglée à "3" (environ 1 ml / min).
    6. Lieu gradient (s) sur la glace. Ne pas déranger.
      NOTE: Les dégradés peuvent être conservés une nuit à 4 ° C.

3. lyse cellulaire et ultracentrifugation.

    Placez SW-41 rotor et seaux à 4 ° C et mis en centrifugeuse à 4 ° C.
    NOTE: La procédure de lyse cellulaire est optimisée pour deux 150 mm subconfluente (~ 70-80% de confluence) plaques de cellules HEK293 par gradient et les volumes utilisés peut être nécessaire d'ajuster de différentes lignées cellulaires.
  1. cellules de la plaque à la densité de cellules appropriée dans le milieu de croissance d'au moins 24 heures avant la lyse.
  2. Préparer une partie aliquote (20 ml par plaque de 150 mm) de milieu de croissance contenant 0,1 mg / ml CHX.
  3. Incuber les cellules dans CHX + médias (20 ml par plaque de 150 mm) pour 3 min à 37 ° C / 5% de CO 2 d'arrêter et de stabiliser polysomes.
  4. En travaillant rapidement, les médias aspirer de plaques, placer les plaques sur la glace et laver les cellules une fois avec 10 ml de glace froide phosphate salin (PBS: NaCl 137 mM, 2,7 mM de KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4) complété avec CHX (concentration finale de 0,1 mg / ml) en faisant attention à la pipette lentement le side de la paroi de cuvette afin de minimiser le levage de la monocouche cellulaire.
  5. Aspirer le PBS et ajouter un supplément de 10 ml de PBS + CHX pour chaque plaque, gratter les cellules avec un dispositif de levage de pile et transférer le volume total à partir de deux plaques d'un tube de centrifugeuse de 50 ml sur de la glace. Maintenir 1 ml de suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse sur de la glace pour l'analyse des protéines en aval.
  6. Centrifuger le tube de 50 ml de cellules à 300 xg à 4 ° C pendant 10 min.
  7. Retirez tous PBS et remettre le culot dans 500 pi de tampon de lyse glace d'ARN froid.
  8. Transfert suspension de cellules dans un tube de 2 ml à centrifuger.
  9. Introduire à la pipette de haut en bas afin de lyser les cellules et incuber sur de la glace pendant 10 minutes avec tourbillonnement occasionnel.
  10. Centrifuger à 2000 x g à 4 ° C pendant 5 min pour sédimenter les noyaux.
  11. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 2 ml à centrifuger.
  12. Centrifuger à 17 000 xg à 4 ° C pendant 5 min pour sédimenter les débris cellulaires.
  13. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 2 ml à centrifuger et utiliser 2 pi à mesurerdensité optique à 260 nm (l'utilisation de la mémoire tampon de lyse comme blanc).
  14. Retirer 50 pi (10% du total) de chaque échantillon pour l'analyse de l'ARN total. REMARQUE lysat peut être stocké à -80 ° C jusqu'à utilisation.
  15. Charger doucement unités de A260 égale sur chacun des gradients de saccharose (10 min, OD OD 25 optimales, à un volume maximal de 500 pl;. Lysat concentré dilué avec du tampon de lyse supplémentaire si nécessaire).
  16. Veiller à gradients sont de 0,1 g de l'autre avant l'ultracentrifugation.
  17. gradients de centrifugation à 39 000 rpm (260 343 xg) pendant 1,5 h à 4 ° C.
  18. Pendant spindown garder frein de rotor et sur l'éteindre pendant la décélération quand il atteint 1000 rpm.
    REMARQUE: Cette étape minimise toute perturbation des gradients causés par des changements brusques d'accélération que les têtes de brosse en contact avec le rotor pendant le freinage.

4. Gradient système fractionnement Instrument Set-up.

  1. Mise en place de l'instrument et les vierges spectrophotometer avec de l'eau comme suit:
    1. Allumez les composants et laisser la lampe à chauffer pendant au moins 15 min.
    2. Assurez-collecteur de fractions est réglé sur la méthode «polysome» (Dossier de presse de l'icône deux fois; retour flèche à deux reprises pour revenir à l'écran d'accueil).
    3. Assurer la vanne sur le collecteur de fraction est fixée à perdre (flèche pointant vers poubelle icône). Placer dans un ballon Erlenmeyer de 250 ml contenant de l'eau distillée sous le tube de collecte des déchets.
    4. Sélectionnez les paramètres suivants sur l'enregistreur graphique: régler la sensibilité à composer «LAMP et Optique SET»; mettre filtre commutateur de bruit pour '1.5'; réglez la molette de séparation de pointe sur "OFF"; réglez la molette de la vitesse de défilement '30 cm / h "(5 cm / 10 min); Définir la référence Régler ligne (sur le dessus de l'unité de spectrophotomètre) à «MAX OUVERT».
      NOTE: En option: Un logiciel d'enregistrement numérique peut être utilisé à la place de l'enregistreur. Sur l'ordinateur, cliquez sur «Démarrer». Une fenêtre d'acquisition ouvrir: sous eMenu e Options, décochez graphiques de pause. Sous Échelle, définir les limites du graphique à -10 et 100 (peut être changé sur la volée pendant l'exécution). Cliquez sur le bouton Enregistrer pour créer un nouveau fichier et enregistrer la course.
    5. Placez la seringue et le canon dans la pompe et serrer en place (utilisation des vis fournies et la clé Allen).
      REMARQUE: Ne serrez pas trop.
    6. Remplir la seringue avec Chase Solution en utilisant le '' REV '' commande à vitesse RAPID. Placez la pompe en position verticale et chasser l'air à travers le tuyau à l'aide 'Forward' 'commande'. Seulement une utilisation rapide pour cette fonction et lavages.
    7. Installez un tube d'ultracentrifugation rempli d'eau sans RNase.
    8. Pierce tube d'ultracentrifugation avec la canule jusqu'à ce que les deux marques noires sont visibles (le trou distribution se trouve entre ces deux marques) et démarrer la pompe à seringue sur '' Manuel '' à 6,0 ml / min.
    9. Lorsque l'eau passe à travers la cellule d'écoulement (lorsque csolution hase remplit 1/3 du tube), la vitesse de commutation de variable et fixé à 1,0 ml / min.
    10. À un taux de 1,0 ml / min, régler la base Réglez ensuite sur le spectrophotomètre jusqu'à ce que la tension sur la carte est à zéro (+/- 0,5 unité).
      Remarque: Respecter la sortie de l'eau du tuyau d'évacuation dans l'erlenmeyer.
    11. Réglez la sensibilité à la '0.5' ou '1.0' UA.
      REMARQUE: 1.0 UA fonctionne le mieux pour 10 unités de DO dans une pente de 10 ml. Si OD est inférieure à 10 ", 0,5" sensibilité peut être utilisée pour renforcer le signal.
    12. Appuyez sur le bouton Auto de base et ajuster le réglage de la barre des 10% sur l'enregistreur graphique de base en tournant la molette de l'enregistreur de décalage (en option si vous utilisez un enregistreur numérique).
    13. Une fois une ligne de base stable est atteint, mettre l'interrupteur de la pompe sur "OFF" et le sélecteur de vitesse de défilement de 60 cm / h si vous utilisez enregistreur graphique analogique ou "OFF" si vous utilisez un enregistreur numérique.
    14. Récupérer la solution Chase en passant pompe à 'REPosition V '(si nécessaire on peut augmenter le taux de reflux à 6,0 ml / min ... NE PAS UTILISER RAPID) jusqu'à ce qu'il atteigne la première marque sur la canule de perçage.
    15. Retirer le tube de la centrifugeuse et chasser les bulles d'air au sein de la canule en exécutant un peu de la solution Chase à travers elle. Essuyez le propre de l'étage de perçage.
      NOTE: Certains eau résiduelle pourrait fuir de la cellule d'écoulement.

5. fractionnement en gradient et la collecte des échantillons.

  1. Installation et percer le tube de centrifugeuse contenant le gradient de saccharose.
  2. Placez onze 2 ml microtubes dans la fraction collecteur positions de plateau 1-11 tels que les bouchons ne dépassent pas vers le haut. Remplacer '' le tube N ° 1 '' pour l'instant avec un '' tube de déchets '' pour recueillir tout liquide restant dans la tubulure de collecteur.
  3. Réglez la molette de commande de la pompe à «Manuel» et le débit de la pompe à seringue à '6,0 ml / min' Appuyez sur l'icône «Play» sur le collecteur de fraction. Dès que le bras atteint le premier tube, appuyez sur le bouton '' pause '' (ce sera positionner le bras et ouvrir la vanne de fraction-distribution).
  4. Démarrer la pompe en utilisant la commande '' 'de l'avant »et surveiller graphique stylo enregistreur. Quand il commence à dévier vers le haut (en indiquant que l'échantillon passe à travers la cellule d'écoulement du spectrophotomètre), remplacer rapidement '' tube de déchets '' à '' tube n ° 1 ''.
  5. Lorsque la première goutte est recueillie, passer rapidement les commandes à 'Remote Start / Stop', '' variable (1,0 ml / min) '' et appuyez sur '' Play '' icône.
    NOTE: La pompe est maintenant contrôlé par l'interface fraction de collecteur et fractions de 1 ml seront recueillis tous min.
  6. De ce point sur, lectures A260 apparaîtront sur l'interface de l'enregistreur numérique (ou la carte analogique Recorder). Assurez-vous que le '' Enregistrer '' bouton sur le logiciel est pressé!
  7. Après que la solution Chase bleu pénètre dans le tube collecteur ou le dernier tube (généralement tube 11), appuyez sur l'icône "Stop".
    REMARQUE: La valve de distribution doit basculer sur la vanne de déchets.
  8. Gardez fractions sur la glace jusqu'à ce que tous les gradients ont été fractionnés. A la fin des fractions de jour peut être stocké à -80 ° C avant l'isolement de la protéine ou de l'ARN. Si la protéine et ARN analyse est nécessaire, coupez chaque fraction de moitié (500 pi chacun pour les protéines et l'analyse de l'ARN).

6. Laver

NOTE: (cette étape est facultative doivent être effectuées que si plusieurs gradients doivent être collectés).

  1. Plonger le tuyau d'évacuation dans l'erlenmeyer contenant environ 50 ml d'eau ultra-pure et inverser la pompe en utilisant un débit de 6 ml / min.
  2. Arrêter la pompe lorsque la solution Chase atteint la première marque on la canule de perçage.
  3. Retirer le tube de la centrifugeuse, chasser l'air de la canule et nettoyer la scène de piercing.
    NOTE: Certains eau résiduelle pourrait fuir de la cellule d'écoulement.
  4. Répétez la procédure de fractionnement à partir de l'étape 5.1.

7. nettoyage final.

  1. Déconnecter le tuyau de pompe à partir de la partie inférieure de l'organe de perçage et de pomper la solution de Chase dans un tube à centrifuger de 50 ml en utilisant le réglage de l'écoulement rapide. Conserver la solution Chase à 4 ° C comme il peut être réutilisé.
  2. Relier le tuyau de la pompe à un système de tuyauterie à 3 voies et fermer la soupape conduisant à la seringue. Se connecter un tuyau à une seringue de 50 ml rempli d'eau distillée et l'autre tube à la base de l'organe de perçage.
  3. Installez le tube d'ultracentrifugation utilisé pour l'étape de découpage et de passer au moins 50 ml d'eau distillée à travers le spectrophotomètre et le tube collecteur (commutateur au menu de collection sur l'interface en cliquant sur le '' Start / Pause '' icône).
  4. Retirer le tube, seringue (utilisation clé Allen pour retirer les vis) et tous les autres composants amovibles et laver abondamment à l'eau chaude du robinet, puis rincer avec de l'eau ultra-pure.
    REMARQUE: Faites attention lors du lavage du piston, cylindre, tube et percer canule.
    REMARQUE: Manipulez le corps de la seringue en verre avec précaution! Conservez tous les composants de la poussière.
  5. Essuyez fond de la cellule d'écoulement avec un tissu doux imbibé d'eau distillée. Essuyez le plateau fraction de collecteur et d'autres zones où le saccharose peut avoir été renversé.

8. Isolation d'ARN à partir de fractions de saccharose.

  1. Préparer 50 ul de solution à la protéinase K pour 1 ml de la fraction de saccharose (37,5 ul de 10% de SDS, 7,5 pi d'EDTA 0,5 M, 1 ul Glycoblue, 4 pl de 20 mg / ml de protéinase K).
  2. Dans 2 ml de tube à fond plat, incuber une fraction ml de saccharose à 50 ul de solution proteinase K à 55 ° Cpendant 1 heure (si vous utilisez fractions de 500 pi régler le volume de solution protéinase K en conséquence).
  3. Ajouter un volume égal de phénol: chloroforme: alcool isoamylique (125: 24: 1, de préférence d'acide (pH 4,5) afin de minimiser la contamination de l'ADN) pour les fractions de saccharose.
    NOTE: Ajouter un supplément de 200 pi de chloroforme à des fractions 7-10, car ils sont plus lourds et phases pourraient se inversé.
    REMARQUE: phénol / chloroforme peut provoquer des brûlures en cas de contact et l'inhalation. Porter une blouse de laboratoire, lunettes de sécurité, et utiliser une hotte.
  4. Vortex ~ 30 sec et centrifuger à la vitesse maximale pendant 5 minutes à température ambiante.
  5. Retirez ~ 80-90% de phase aqueuse (ne pas toucher interphase qui pourrait contenir de l'ADN génomique) et à New tube.
  6. Ajouter un volume égal de chloroforme et répétez l'étape 8.4.
  7. Retirer phase aqueuse en prenant soin d'éviter interphase.
  8. Ajouter 01:10 volume de 3 M d'acétate de sodium, pH 5,2 (en variante, 5 M d'acétate d'ammonium peut être utilisé).
  9. Ajouter 1,5 volumes de frais, absolute éthanol et vortex pendant 15 secondes.
  10. Précipiter la nuit à -20 ° C (ou 1 heure à -80 ° C si pressé).
    REMARQUE: Les échantillons peuvent être laissés à -20 ° C pendant plus longtemps si nécessaire.
  11. Centrifuger à vitesse maximale pendant 30 minutes à 4 ° C.
  12. Laver le culot avec 1 ml d'éthanol glacé à 70% sans RNase.
  13. Air sécher le culot et remettre en suspension dans 20 pi d'eau sans RNase.
  14. Quantification de l'ARN total par spectrophotométrie afin d'assurer le rendement et la pureté (sur la base A260 / rapport 280) adéquate et procéder à une analyse par RT-PCR quantitative en utilisant la norme 14 volumes égaux de chaque fraction et les amorces de PCR spécifiques pour l'ARNm (s) d'intérêt.

9. L'isolement de protéines à partir de saccharose fractions.

  1. En plus de l'ARN, les protéines peuvent être isolées et identifiées dans les fractions de polysomes individuels. Utilisez l'un des nombreux excellents protocoles disponibles pour l'isolement des protéines, par exemple 18.

Representative Results

Nous avons récemment décrit un nouveau rôle pour le suppresseur de tumeur PDCD4 comme un inhibiteur sélectif de la traduction des ARNm codant pour des inhibiteurs apoptotiques XIAP et Bcl-xL 12 IRES-hébergement. Profilage polysome était une technique clé pour démontrer l'implication spécifique de PDCD4 dans la traduction IRES-médiation. Les cellules HEK293 ont été transfectées de manière transitoire pour épuiser les niveaux endogènes de PDCD4 (figure 1A) et ensuite soumis à une analyse polysomes profil. Nous avons observé que la réduction des niveaux de PDCD4 ne portent pas atteinte à la traduction cellulaire mondial, à en juger par l'absence de changements dans le profil de polysome lorsque l'on compare siCTRL et siPDCD4 cellules traitées (figure 1B). De même, la distribution de polysomes IRES non-XIAP variant de 19 est resté inchangé entre les cellules traitées et non traitées (Figure 1C). En revanche, polysome distribution des ARNm deux IRES-hébergeant, XIAP et Bcl-xL, a été modifiée de façon significative. En l'absence de PDCD4 la distribution de ces deux ARNm est décalé dans ribopolysomes lourds (figure 1D, E). Depuis ce ne soit pas accompagnée de changements dans les niveaux de XIAP et Bcl-xL ARNm (figure 1F) ces résultats à l'état stationnaire démontrent une amélioration de la traduction de la protéine XIAP et Bcl-xL dans les cellules avec des niveaux réduits PDCD4, qui a été confirmée par Western blot (Figure 1G).

Figure 1
Figure 1:. Polysomes profilage identifie PDCD4 comme inhibiteur sélectif de la traduction XIAP et Bcl-xL (A) des cellules HEK293 ont été traitées avec ou PDCD4 siRNA contrôle (CTRL), le siRNA ciblant non, lysées et soumises à une analyse Western blot avec des anticorps anti-PDCD4 et des anticorps anti-nucléoline de vérifier l'étendue de PDCD4 knock-down. (B) PDCD4 a été renversé comme dans (A) etLes lysats cellulaires ont été soumis à des polysomes profilage. Profil de polysome représentatif est montré dans le panneau supérieur; la distribution de l'IRES de XIAP non (C), Bcl-xL (D), et d'IRES de XIAP (E) par rapport à celui des ARNm de GAPDH est représenté comme le pour cent de l'ARNm total (% de l'ARNm) dans chaque fraction. (F) Steady les niveaux d'ARNm -state ont été mesurés par RT-PCR quantitative en PDCD4 siRNA ou de contrôle (CTRL) siRNA cellules traitées. (G) Les lysats provenant de (A) ont également été soumis à une analyse Western blot avec des anticorps anti-XIAP, anti-Bcl-xL, et anticorps anti-nucléoline. (NB. Les données présentées dans la figure 1 ont été à l'origine publié en 12) Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Profilage polysomique est une technique puissante qui permet la quantification de l'état de la traduction des transcrits spécifiques dans différentes conditions de traitement. Il est une technique très simple dans son principe mais il nécessite plusieurs étapes d'exécution, dont certains sont essentiels pour produire de bons profils de polysomes. Ces étapes clés sont les suivants: 1) utilisation de produits chimiques sans RNase et en plastique, 2) la préparation de bons gradients de saccharose (dans mon expérience, un 10-50% des gradients de saccharose qui fonctionnent le mieux pour résoudre efficacement 40 / 60S sous-unités et ARNm aux ribosomes liés), et 3 ) en utilisant des cellules qui sont en croissance exponentielle et pas plus de 80% de confluence afin de capturer les taux de conversion les plus élevés. Cette dernière étape doit être pris en considération lors de faire des traitements de cellules longs, tels que effet de choc ou de surexpression de gène, de sorte que la quantité de cellules à plaque sera une fonction de la quantité de cellules confluentes sont en fin d'étude.

Dans les résultats présenTed ici, polysome analyse de profil était un outil important pour évaluer rôle PDCD4 dans la régulation de la traduction de l'IRES hébergeant les ARNm de XIAP et Bcl-xL 12. Le fait que nous ne voyons aucun changement dans les profils généraux de polysome sur PDCD4 knock-down (figure 1B) nous a permis de conclure que PDCD4 n'a pas altéré la traduction cellulaire global dans les conditions de l'expérience. Nous avons ensuite utilisé l'analyse par RT-PCR quantitative pour déterminer la distribution de la protéine XIAP et Bcl-xL ARNm dans les cellules traitées avec les siRNA PDCD4 ou de contrôle. qPCR est une méthode de choix pour l'analyse des profils de polysomes, par opposition à la norme RT-PCR ou transfert de Northern, car elle permet une plus quantitative que l'analyse semi-quantitative de la distribution de l'ARNm et pour la détection de changements subtils dans l'efficacité de translation entre les traitements. Grâce à cette technique, nous avons pu montrer que la distribution des XIAP et Bcl-XL ARNm (exprimé en pour cent de l'ARNm cible totale à travers le gradient) est significativement décalée dans polyribosomes lourds (ARNm avec un grand nombre de ribosomes qui leur sont associés) après PDCD4 knock-down (figure 1D, E), ce qui indique une augmentation de la traduction de ces ARNm. Cela a été confirmé en outre par une augmentation des niveaux de protéine XIAP et Bcl-xL, mais pas dans les niveaux d'ARN à l'état stationnaire (figure 1F, G). Fait important, la distribution de polysomes de la variante non-IRES de XIAP est restée inchangée entre les cellules traitées et non traitées (Figure 1C). En variante, l'efficacité de translation peut être présenté comme un rapport de la teneur en ARNm de polysomes (habituellement des fractions 5 à 10) par rapport à monosomes (habituellement des fractions 2 à 4) 14.

L'utilisation de contrôles tout au long du protocole est important dans la validation de toute polysome profilage résultat, comme des pics observés à partir de lectures d'absorbance à 254 nm ne peuvent pas eux-mêmes être attribuées à l'ARN ribosomal (détergents, tels que le Triton X-100 absorbent fortement dans cette région du spectre et peut obscurcir 40 / 60S sommets au sommet du gradient). Gradients vierges sans lysat et / ou avec un tampon de lysat doivent être exécutés pour déterminer la contribution relative des tampons à l'absorbance à 254 nm. Artefactual structures d'ordre supérieur peuvent également conduire à des interprétations erronées de polysomes où il n'y a en fait aucun (par exemple «pseudo-polysomes" 20). Séquestrant magnésium (utilisé tout au long de la procédure de stabiliser les ribosomes 80S) avec l'EDTA cation divalent chélateur ajoutée à lysats et à la mémoire tampon de gradient (20 mM pendant 15 min) provoque une séparation du ribosome en ses composantes de petite taille (40S) et de grande taille (60S des sous-unités). Ainsi, si les pics d'absorbance enregistrées à 260 nm sont en effet polysomes, le traitement de l'EDTA sera replier le profilé de telle sorte qu'un seul maximum est observé à proximité de la partie supérieure du gradient correspondant à libérer l'ARNm et des unités ribosomiques (données non présentées). Coïncidentavec l'effondrement induit EDTA-du profil, tous les objectifs spécifiques analysés par qPCR devrait maintenant être trouvé au sommet de la pente.

Le nombre de ribosomes associés à un ARNm est pas toujours un indicateur de l'efficacité avec notamment l'ARNm qui est en cours de traduction. En effet, il existe des contextes spécifiques dans lesquels traduction active sur polysomes devient au point mort 21,22 laquelle le lecteur doit être conscient de. Déterminer si oui ou non les transcriptions sont activement engagés avec la machinerie de traduction qui peut être fait par un) traitement de l'échantillon avec la puromycine, qui, contrairement à l'EDTA, provoque «run-off» des ribosomes qui sont activement translocation à travers un ARNm, ou b) le traitement de l'échantillon avec homoharringtonine qui inhibe la translocation de seulement la première ribosome au niveau du codon de démarrage, provoquant de nouveau "run-off" de toutes les ribosomes de translocation en aval.

L'utilisation de transcriptions de contrôle pour l'analyse qPCR est également critique. La Selection des transcriptions qui ne sont pas affectés par des conditions de traitement telles que certains gènes de ménage (GAPDH, actine, tubuline, la nucléoline), ARNm ribosomique (18S, Rpl13a) ou dans ce cas, la variante non-IRES du IRES de XIAP, est important dans vérifier si l'effet du traitement sur la traduction est spécifique ou généralisée. Ces transcrits de commande peuvent être utilisés pour normaliser la distribution des ARNm analysés comme cela a été fait ici (XIAP et Bcl-xL ARNm ont été normalisées par rapport à l'ARNm GAPDH et exprimé en pourcentage de la teneur en ARNm total représenté par la somme de la teneur en ARNm de chaque fraction ) ou encore, cibles et de contrôle ARNm peuvent être exprimées en valeurs absolues et présentés séparément. analyse qPCR des lysats d'entrée (généralement de 10% du volume total) est une autre étape qui permettra de contrôler la distribution des ARNm spécifiques. Idéalement, la teneur en ARNm de transcription spécifique dans le lysat d'entrée doit être comparable à la somme de la teneur en ARNm de l'ensemble des 10 fractions analysées. Enfin, Une étape facultative pour contrôler pour le phénol: étape d'extraction de chloroforme est à pic chaque fraction de polysome avec un transcrit in vitro ARNm rapporteur (comme CAT, le chloramphénicol acétyl-transférase) qui seront ensuite quantifié par qPCR et peut même être utilisé pour normaliser la données 14.

Comme toute technique, le profilage polysome présente certaines limites. Le fait que généralement un minimum de 10 fractions (changements plus subtils dans l'efficacité de traduction peut nécessiter 20 ou plus) doivent être collectées dans le but d'avoir de belles distributions de polysome rend cette étape limitante, en ce sens que seul un maximum de 4 échantillons peut être analyse à la fois pour pouvoir manipuler aisément l'extraction d'ARN et l'analyse par qPCR de 40 échantillons et les contrôles d'entrée 4 à la fois. La taille de l'échantillon peut facilement ajouter avec combien de transcriptions doivent être analysées et combien de qPCR réplique à faire, et cela peut être coûteux. Une autre limitation d'un polysomal base-qPCR profilage unenalyse est qu'il ne peut être fait sur une approche fondée sur les candidat (où les transcriptions pour analyser sont connus à l'avance) et ne peuvent pas être appliquées pour l'analyse du génome entier de traduction. Cependant, au début du 21 e siècle, les enquêteurs ont commencé à interroger leur ARN polysomal à un niveau génomique en utilisant puces à ADN 15 et, plus récemment, avec le séquençage de prochaine génération 16,17. Dans cette approche puissante, profilage polysomal est effectuée comme décrit dans ce protocole, sauf que plutôt que d'effectuer des analyses qPCR de fractions individuelles, monosomes fractions (généralement fraction 2-4) et polysomes fractions (en général) des fractions sont regroupées et les variations dans la traduction globale analysés par puces à ADN ou du génome entier séquençage de l'ARN. Ainsi avec cette approche, il est possible d'évaluer l'ensemble des ARNm dont la distribution des changements de polysomes à monosomes (diminution de traduction) ou vice-versa (augmentation de la traduction) à un traitement spécifiquement. Validation et quantification de la distribution des polysomes d'ARNm spécifique peuvent être effectuées par qPCR. Une utilisation encore plus puissant du principe polysomal de profilage est profilage ribosome. Une nouvelle extension haut débit de cette technique a été signalé récemment que permet la surveillance simultanée de centaines de polysomes 23 fractions. Cela donne un avantage certain lorsque sondage efficacité traductionnelles des collections de mutants ou dans un des écrans ARNi à grande échelle. Profilage ribosome est une technique qui tire parti de séquençage de prochaine génération à la carte des fragments d'ARN protégés par les ribosomes (empreintes des ribosomes) engagés dans la synthèse des protéines 24,25. Dans cette technique, la translocation des ribosomes peut être inhibée par le cycloheximide (réversible) ou émétine (irréversible), suivie par la lyse des cellules et la RNase digestion pour obtenir une population d'empreintes ribosome. Les ribosomes sont enrichis, l'ARN total est isolé, et de contaminer ribosomal et ARN ribosomique mitochondrial est retiré.empreintes d'ARN de 26-28 nucléotides environ sont isolés, transcription inverse, transformée en une banque d'ADNc et séquençage 26. Contrairement au profilage de polysome standard, cette approche identifie non seulement les ARNm spécifiques qui sont réglementés en translation mais donne également des informations ARNm spécifique à la résolution de codon comme la profession exacte et la densité des ribosomes le long d'une transcription spécifique. Ceci est particulièrement intéressant pour les ARNm de certains modes de traduction tels que les ARNm IRES-hébergeant, car elle pourrait donner plus d'informations sur où sur le ribosome-recrutement de transcription qui se passe.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gradient Master 108 automated gradient maker BIOCOMP 107-201M
Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker LABCONCO 4517000
Beckman Ultracentrifuge  Beckman Coulter Model # L-100-XP
Density gradient fractionator TELEDYNE ISCO 69-3873-246 Composed of: tube piercing system,  peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280 nm filters and Foxy R1 Fraction Collector
WinDaq data acquisition software DATAQ INSTRUMENTS WINDAQ/LITE http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm
Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14 x 89 mm) Beckman Coulter 331372
Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose) DiaMed PRE1900-N
Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom) SafeSeal 12000
Sucrose (nucleases-free) Calbiochem 573113 MW = 342.3 g/mol
Cycloheximide SIGMA C7698 MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing.
Sodium chloride (nucleases-free) OmniPur 7710 MW = 58.44 g/mol
MgCl2.6H2O (nucleases-free) OmniPur 5980 MW = 203.3 g/mol
Tris Base (nucleases-free) J.T. Baker 4109-01 MW = 121.14 g/mol
Triton X-100 OmniPur 9400 Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation
Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2515
RNaseZap Rnase inactivation solution Ambion, Life Technologies AM9780
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml) Invitrogen, Life Technologies AM9516
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) Ambion, Life Technologies AM9722 Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion

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References

  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, (4), 318-327 (2005).
  2. Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246, (1), 174-181 (1971).
  3. Tscherne, J. S., Pestka, S. Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells. Antimicrob Agents Chemother. 8, (4), 479-487 (1975).
  4. Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. Translational coregulation of 5'TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR. Genes Dev. 25, (19), 2057-2068 (2011).
  5. Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40, (2), 541-552 (2012).
  6. McKinney, C., et al. Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication. Cell Rep. 6, (1), 9-17 (2014).
  7. Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast. Mol Cell Biol. 26, (4), 1355-1372 (2006).
  8. Gross, J. D., et al. Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E. Cell. 115, (6), 739-750 (2003).
  9. Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response. Cell Death Differ. 17, (4), 719-729 (2010).
  10. Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. E. Re-programming of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate. Biol Cell. 100, (1), 27-38 (2008).
  11. Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486, (7401), 126-129 (2012).
  12. Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32, (10), 1818-1829 (2012).
  13. Occhi, G., et al. A novel mutation in the upstream open reading frame of the CDKN1B gene causes a MEN4 phenotype. PLoS Genet. 9, (3), (2013).
  14. Faye, M. D., et al. Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon. Mol Cell Biol. 33, (2), 307-318 (2013).
  15. Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (19), 10632-10636 (1999).
  16. Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biol. 14, (11), (2013).
  17. Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (24), 9818-9823 (2013).
  18. Corbin, F., et al. The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes. Hum Mol Genet. 6, (9), 1465-1472 (1997).
  19. Riley, A., Jordan, L. E., Holcik, M. Distinct 5' UTRs regulate XIAP expression under normal growth conditions and during cellular stress. Nucleic Acids Res. 38, (14), 4665-4674 (2010).
  20. Thermann, R., Hentze, M. W. Drosophila miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation. Nature. 447, (7146), 875-878 (2007).
  21. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146, (2), 247-261 (2011).
  22. Graber, T. E., et al. Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (40), 16205-16210 (2013).
  23. Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J. High-throughput polyribosome fractionation. Nucleic Acids Res. 32, (10), (2004).
  24. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324, (5924), 218-223 (2009).
  25. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15, (3), 205-213 (2014).
  26. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7, (8), 1534-1550 (2012).

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