Memeli Hücreleri içinde fonksiyonel Bakteriyel Efektör elektroporasyonu

1Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, 2Environmental Molecular Science Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 3Structural Proteomics Group, Ontario Center for Structural Proteomics, University of Toronto, 4Center for Bioproducts and Bioenergy, Washington State University
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sontag, R. L., Mihai, C., Orr, G., Savchenko, A., Skarina, T., Cui, H., et al. Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (95), e52296, doi:10.3791/52296 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

canlı hücrelerin bağlamında protein etkileşimleri çalışma lokalizasyonu, dinamikleri ve etkileşim ortakları hakkında kritik bilgiler üretebilir. Bu bilgiler, evsahibi-patojen etkileşimlerinin bağlamında özellikle değerlidir. Birçok patojen proteinleri, hücre içi bir ortam içinde konak bağışıklık sistemi ve hayatta kalma kaçırma sağlayan, bu gibi bir şekilde çeşitli konak hücreleri içinde çalışır. Bu patojenin protein konukçu hücre etkileşimini incelemek için çeşitli yaklaşımlar sık dahil olmak üzere kullanılır: in vivo enfeksiyon transfeksiyon ya da transdüksiyon ile etiketli veya mutant protein ya da patojen genlerin katılması eksprese eden bir suşu ile. Bu yaklaşımların her biri avantajları ve dezavantajları vardır. Bu direkt olarak hücrelere ekzojen proteinleri katılması için bir araç çalıştı. Elektroporasyon yaygın hücrelere nükleik asitlerin dahil edilmesi için kullanılabilir, ancak biyo-fiziksel temeli tam olarak aynı olmasına rağmen daha nadir proteinlere uygulanmıştır.Standart bir Electroporator memeli hücrelerine afinite etiketli bakteriyel efektör tatbik etmek için kullanılmıştır. İnsan epiteliyal ve fare makrofaj hücreleri, geleneksel metodlarla kültürlenmek sureti ile ayrılır ve ilgi dahilindeki bir eksojen bakteriyel patojenin proteini (örneğin, Salmonella Typhimurium GtgE) ile 0.4 cm boşluk elektroporasyon küvetler içine yerleştirilmiştir. Elektroporasyon (0.3 kV) ve kısa (4 saat) geri kazanım süresinden sonra, hücre içi protein, flüoresan olarak afinite etiketi ile protein etiketleme ve konfokal mikroskopi ile mekansal ve zamansal dağılımının incelenmesi ile doğrulanmıştır. Elektroporasyona protein aynı zamanda hücre içinde işlevsel ve doğru hücre içi ticareti ve protein-protein etkileşimi yeteneğine sahip olduğu gösterilmiştir. Ekzojen proteinler hücrelerin yüzeyi üzerinde birikme eğiliminde iken, elektroporasyona örnekler sadece kuluçkalama için hücre içi efektör konsantrasyonda büyük artışlar vardı. protokol ap yapılacak basit ve yeterince hızlıhücre içi hedefleme ve hastalık oluşturma proteinlerin işlevine de dahil olmak üzere, konakçı hücrelerde patojen proteinlerinin yüksek verimli bir karakterizasyon için izin arallel moda.

Introduction

Bir çok Gram-negatif bakteriler, doğrudan konakçı hücreler 1-5 içerisine (efektör olarak anılacaktır) hastalık oluşturma ilişkili proteinler enjekte özel salgılama sistemleri kullanılmaktadır. Ev sahibi dokunulmazlık baskılanması, hücre iskeleti değişiklikler, hücre içi ticareti ve sinyalizasyon, transkripsiyon değişikliklerin modifikasyonu ve ev sahibi proteasome değişiklikler 6-9: Bu efektörleri dahil olmak üzere biyolojik fonksiyonları geniş bir yelpazesi var. Bazı efektörlerinin işlevleri ancak ev sahibi hedefleri ve diğerleri biyokimyasal eylem (ler) belirlenecek kalır bilinmektedir. Vahşi tip ve yeniden birleştirici bakteriyel enfeksiyonların karşılaştırılması hücre içi efektör hastalık oluşturma mekanizmaları incelemek için geçerli bir yaklaşım olsa da, konakçı hücre içerisine bağımsız bir efektör tanıtmak için sıklıkla yararlıdır. Böylece, konakçı hücreler bağlamında bakteriyel efektör proteinler katma ve karakterize edilmesi için basit bir yöntem arzu edilmektedir.

Deneysel analiz wi BasitleştirmeTek bir efektör kritik inci diğer efektörler karşı ya da gereksiz işlevlere sahip olabilir. Bu basitleştirme gerçekleştirmek için, araştırmacılar, daha önce kazıma 12,13 yükleme viral transdüksiyon 10, mikroenjeksiyon 11 de dahil olmak üzere birçok farklı yöntemler ile hücrelere makromolekülleri getirmiştir, kimyasal olarak teşvik mikroenjeksiyon 14, özel bir protein "transfeksiyon", reaktif 15, kalsiyum fosfat çöktürme ile hücre füzyonu 16 ve elektroporasyon 17-20. kişiye moleküller, hücre içi hedefleri 21,22 protein, hücre-geçirgen olmayan boyalar ve antikorlar, DNA, RNA ve RNAi türler dahil olmak üzere nükleik asitler arasında değişir. Bazı yöntemler dahil edilebilir makromolekül Çeşidi dahil kısıtlamaları vardır ve özellikle alt-analizler, yüksek hücresel toksisite, etki zarar mekanizmaları, düşük etkililik ve giriş verimliliği ile sınırlı olabilir. Transfeksiyon, bir ofteaynı zamanda makrofajlar ve birincil hücre gibi uygun bir ev sahibi hücre tipi, transfeksiyon karşı özellikle dirençlidir sınırlama uğrar, memeli hücrelerinde bakteri genleri ifade etmek için bir yöntem, n-kullanılmıştır. Bunun ötesinde, yabancı DNA'nın sokulması üzerine üretilen bakteriyel protein seviyelerini kontrol etmek zordur.

Çok iş bilinen bir laboratuvar tekniği olarak bakteriyel ve memeli yaratıkların hücrelerine nükleik asit elektroporasyon kurdu; Bununla birlikte, fizyolojik koşullar altında, hücre içine proteinlerin verilmesi için en iyi yöntem devam etmekte olan bir araştırma vardır. Protein transfeksiyon üzerindeki raporlar umut vericidir, ama pahalı reaktifler ve optimizasyon gerektirir. minimum maliyet ile hücre hedefleri çeşitli içine potansiyel toksik bakteri efektörler tanıtmak arzusu in vivo bu proteinleri eğitim için bir yöntem olarak elektroporasyon dikkate götürdü.

Protein elektroporasyon 23-25 ​​bir araya geldi iseAyrıca elektro-transfeksiyon veya elektro-enjeksiyon 26 olarak bilinen electropermeabilization üzerinden canlı hücreler içine proteinleri tanıtmak hod. Bu teknik, hücre zarlarında gözenekleri oluşturmak için yüksek yoğunluklu elektrik darbeleri kullanır. Bu geri dönüşümlü gözenekler normal hücre içi alandan dışlanan makromoleküllerin hücreye girmesine izin. Dış elektrik alanının çıkarılması üzerine, zar, hücre gözenekler 27,28 geçirilir molekülleri korumak için izin kapatın olabilir.

Standart bir Electroporator sürekli fare makrofaj-benzeri hücreleri ve insan epitel hücreleri hem de içine bakteri efektör tanıtmak için bu çalışmada kullanılmıştır. yöntem hücresel canlılığı hiçbir kayda değer azalma ile, hızlı, verimli ve ucuz. kişiye proteinler immünofloresan mikroskopi ile görüntülenmiştir veya fonksiyonel deneyleri için de kullanılabilir. Bu aynı zamanda, bir toksik-olmayan, standart olarak yeşil floresan proteini (GFP) ile gösterilmiştirİki Salmonella efektör proteinler, SspH1 ve GtgE. Bu ökaryotik konakçı hücrelerde bu bakteriyel hastalık oluşturma proteinleri ve işlevlerin çalışması için repertuarında ek bir araç olarak, protein elektroporasyon önerilmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Advance hazırlayın

  1. 37 ° C sıcak bir steril fosfat tamponlu tuz (PBS).
  2. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş Eagle Medium (DMEM) ve Minimal Essential Medium (MEM) Sıcak Dulbecco modifikasyonu, 100 lU / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin, 37 ° C arasındadır. Not: Bunlar sırasıyla RAW ve HeLa hücreleri için normal Büyüme Medya (NGM) temsil eder.

Hücreler 2. Hazırlık

  1. NGM içinde% 70-90 confluency RAW 264.7 hücreleri büyümek.
    1. Nemlendirilmiş% 95 hava /% 5 CO2 atmosferinde, 37 ° C'de hücreler muhafaza edin.
  2. NGM içinde% 70-90 confluency HeLa hücreleri büyür.
    1. Nemlendirilmiş% 95 hava /% 5 CO2 atmosferinde, 37 ° C'de hücreler muhafaza edin.
  3. Toplanmadan önce steril PBS ile bir kez, hücre tekli tabakası yıkayın.
  4. Steril konik bir tüp içinde önceden konfluent hücreler toplanır.
    1. Yavaşça RAW hücreleri kazıyınPBS içinde, bir lastik policeman ile tekrar pipetleme hücre toplamalardan dağıtmak için.
    2. Görsel muayene kültür yüzeyinden ayrışma gösterene kadar% 0.25 tripsin solüsyonu ile HeLa hücreleri ayırmak. Örneğin, T-75 balonuna için 2-3 ml kullanılır. Tripsin çözüm tüm büyüme yüzeyini kaplayan sağlamak için buna göre ses seviyesini ayarlayın.
      1. NGM,% 10 FBS içeren ayrılma reaksiyonu söndürün.
      2. Hücre toplamalardan dağıtmak için tekrar pipetleme ile, tripsin için NGM en az iki hacim kullanın.
  5. Hafif 4 dakika boyunca 900 x g'de santrifüj ile pelet hücreleri.
  6. Steril PBS kullanarak tripsin / söndürme çözüm olarak aynı hacimde süspanse.
  7. Hemasitometre veya parçacık sayacı kullanarak hücreleri saymak.
  8. Hafif 4 dakika boyunca 900 x g'de santrifüj ile pelet hücreleri.
  9. 5,5 x 10 6 6 10 x 6.0 hücre / ml PBS yeterli hacimde süspanse. Not: Örneğin, bir T-75 şişe approxim verecektirulaştırılması 7.5 x 10 6 hücre 29.
  10. Elektroporasyon kadar buz üzerinde hücre süspansiyonu tutun.

Elektroporasyon 3. Hazırlık

  1. Buz Öncesi soğuk elektroporasyon küvetler (0.4 cm boşluk).
  2. Elektroporasyon aparatı açın ve 0,3 kV gerilim ayarlayın.
    NOT: Kapasite ve direnç (üretici tarafından 10 iF ve 600 Ω ayarlı) bizim elektroporatörü ayarlanabilir ayarları değildi.
  3. NGM ile geri kazanım plakaları, doldurun ve 37 ° C de, nemlendirilmiş bir% 95 hava /% 5 CO2 atmosferinde dengeye

4. Elektroporasyon

  1. Önceden soğutulmuş küvet içinde hücre süspansiyonu 400 ul koyun ve küvetin (ug / ml 50 ug) seçilen proteinin 20 ug ekleyin.
  2. Flick küvet hafifçe ~ 10 kez hücrelere zarar vermeden karıştırın. Not: küvet de iyice karıştırın birkaç kez ters olabilir, ancak yukarı pipetlemeyin yok ve aşağı ya da vorteks hücreleri zarar vermemek için.
  3. 1.5-1.7 msn 0.3 kV electroporate örnek. Not: Bu, bu çalışma için tipik oldu.
  4. Hemen elektroporasyon fiske küveti sonra yavaşça ~ 10 kat iyice karıştırın.

Hücreler 5. Kaplama

  1. Hazır olana kadar buz üzerinde Electroporated hücreleri ile mağaza küvet kurtarma plakalarda yer.
  2. En mansap analizler için, yabancı efektör protein kaldırmak için önceden ısıtılmış NGM ile hücreler 1x yıkayın.
    1. Analiz için hücreleri kaldırmak ve NGM 3-5 ml askıya.
    2. 4 dakika boyunca 900 x g'de santrifüj ile pelet hücreleri.
    3. Istenen plaka boyutuna (örneğin 35 mm tabak için 2 mi) için NGM yeterli hacmi içinde süspanse.
  3. Mansap analizi için hücrelerin uygun miktarda çıkarın.
    1. Örnek 1: mikroskopi analizi için cam alt yemekleri içine plaka.
    2. Örnek 2: levha intBöyle afinite saflaştırma gibi protein analizi için o hücre kültürü plastik.
  4. Hücrelerin en az 4 saat 37 ° C'de nemlendirilmiş% 95 hava /% 5 CO2 atmosferde dengelenmiş plakalarda kurtarmak için izin verin.

6. Mikroskopi Analizi

6.1) Sabitleme / İmmünofloresan Boyama

  1. Yıkama hücreleri 4 saat iyileşme döneminden sonra steril PBS ile 1x.
  2. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca% 100 metanol hücreleri saptamak. Tamamen hücreleri (örneğin 2 ml 35 mm çanak için) karşılamak için yeterli metanol kullanın.
  3. Steril PBS ile yıkayın 3x.
  4. 15 dakika boyunca PBS içinde% 0.4 Triton X-100 ile hücrelerin geçirgenliği. Örneğin, bir 35 mm çaplı levha 1 ml kullanılır.
    1. Epitop ile hedef proteinin konumuna göre, Triton X-100 geçirgenliği ve gücü uzunluğunu ayarlayın. Not: En iyi sonuçları ancak yukarıdaki koşullar çoğu c yeterli olmalıdır, ampirik her hedef için belirlenen gerekecektirytosolic hedefler.
  5. Oda sıcaklığında 1 saat için PBS içinde% 5 sığır serum Albumin (BSA) ile bloke edin. Örneğin, bir 35 mm çaplı levha 1 ml kullanılır.
  6. PBS ile yıkayın 3x.
  7. 4 ° C'de bir gece boyunca antikor bağlayıcı çözelti içinde birincil antikor (PBS içinde% 0.1 Triton X-100 ve% 1 BSA) inkübe   Hafifçe çalkalanarak ° C. Örneğin, bir 35 mm çaplı levha için 0,5 ml kullanılır.
    1. Antikor seyreltme için üreticinin tavsiyelerini uygulayın. Not: 200 seyreltme: PKN1 antikoru 1 kullanıldı olurken, 1000 seyreltme Örneğin, streptavidin bağlayıcı peptit etiketi (SBP-etiket) antikoru 1 kullanılmıştır.
  8. PBS ile yıkayın 4x.
  9. Işıksız bir ortamda oda sıcaklığında 1 saat süre ile antikor bağlama çözeltisi içinde uygun floresan konjuge sekonder antikor ile inkübe edin.
    1. Örneğin, oda sıcaklığında 1 saat süre ile Alexa 488 veya Alexa 647 kullanır.
      1. Karıncanın üreticinin önerilerini izleyinibody seyreltme. (Örneğin, yaklaşık 1: 1000, bu çalışma için).
    2. Örneğin, gerekli olan diğer lekeler ekleme, 5 uM Buğday agglutinnin (WGA) ile oda sıcaklığında 1 saat süre ile, üreticinin tavsiyesine göre Alexa 647 veya DAPI birleştirilir.
  10. Görüntü hazır olana kadar ışıktan korundu PBS ile 4 ° C 'de deposu ile yıkayın 5x.

6.2) Konfokal Mikroskopi ve Görüntü Analizi

  1. 63x immersiyon yağı hedefi kullanarak bir ters konfokal mikroskop görüntü örnekleri.
    1. 492-542 nm arasındaki bant genişliği emisyonu ile argon lazer 488nm hattını kullanarak görüntü yeşil kanal.
    2. 640-718 nm arasındaki bant genişliği emisyonu ile 633 nm diyot lazer kullanarak görüntü kırmızı kanalı.
    3. 407-453 nm arasındaki bant genişliği emisyonu ile 405 nm diyot lazer kullanarak görüntü mavi kanal.
    4. Z-yığınları hücresel hacmi bütününü kapsayan çoklu kanal emin olun.
  2. Uygun görüntü işleme yazılımı ile Süreç görüntüleri.

7. Affinity Arıtma

  1. 4 saat iyileşme süresinden sonra 4 ° C'de iki kez PBS ile elektroporasyona hücreleri yıkayın.
  2. Ile lizleyin ~ liziz tamponu buz üzerinde (PBS içinde proteaz inhibitör kokteyli ve fosfataz inhibitörü ile% 1 Triton X-100) ve 1.0 mi. Üretici talimatlarına göre inhibitörleri kullanın. Not: Örneğin, her ikisi de bu çalışmada kullanılan fosfataz ve proteaz inhibitörleri 100x de temin edilmiştir, ancak diğer formülasyonlar eşit derecede iyi çalışmasıdır.
  3. Derhal lastik polis hücreleri kazıyın ve konik tüpler içine toplamak.
  4. Güçlü döndürülerek ve sonikasyon ile lizleyin. Not: Diğer lizis yöntemleri eşit olarak iyi çalışabilir, ancak verimlilik ampirik tahlil gereksinimleri uygunluğu tespit edilecek gerekecektir.
    1. Aralıklı vorteks 3 x 30 sn sonikasyon.
  5. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüjleyin toplamakHücresel enkaz ve çözünmeyen agrega; süpernatant kaydedin.
  6. Sonu aşırı uç rotasyon ile bir gece boyunca 4 ° C 'de Streptavidin agaroz reçinesi süspansiyonuna 50 ul ile elektropore edildi hücre lizatının eşit hacimleri (~ 1.0 mi) birleştirin. Not: Bu reçine olan streptavidin bağlama peptidi afinite etiketi ile elektropore protein (ve ilişkili kompleksler) yakalar.
  7. 2 dakika için 2.500 xg'de Santrifüj ve süpernatant atın.
  8. 40 yatak hacmi (~ 1 mi) iki kez PBS ile yıkayın.
  9. 30 ul 4x LDS yükleme tamponu (141 mM Tris baz,% 2 LDS,% 10 gliserol, 0.51 mM EDTA, 0.22 mM SERVA Mavi G kırmızı 0.175 mM fenol, pH 8.5), 20 ul diH 2 O ve 1 ul ekle bir hacim sağlayan, 0.5 M tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP); boncuk içinde kalması beklenir.
  10. 10 dakika boyunca 95 ° C de ısı ve buz üzerinde soğutulur.
  11. Sıkma 5 dakika boyunca 4 ° C 'de> 10,000 xg.
  12. Süpernatant toplayın.
  13. Uygun antikorlar Not kullanarak batı leke gerçekleştirin: OYeniden anti-PKN1 birincil antikor kullanılır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kavramının bir ilk kanıtı olarak, saflaştırılmış yeşil flüoresan proteini başarıyla elektroporasyon ile memeli hücrelerine dahil edilmiştir. GFP, yaklaşık 27 kD molekül ağırlığına sahip protein özel genellikle önemli hücresel toksisite olmaksızın moleküler biyoloji aracı olarak (normal olarak plasmid DNA ifade edilen), memeli hücreleri içine dahil edilir. HeLa hücreleri (Şekil 1A) kuluçkalanmıştır veya floresan GFP sinyali kontrol etmek için imüno-konfokal mikroskopi ile, ardından 25 ug / ml GFP ile (Şekil 1B) elektroporasyona tabi tutulmuştur. GFP hücresel sitozol içinde olduğunu göstermek için, hücreler de çekirdeği belirtmek için buğday tohumu aglutinin (WGA) sitosolik sınır (kırmızı) tanımlamak için aynı zamanda bir nükleik asit leke, DAPI (mavi) ile boyanmıştır. Hiç bir hücre içi protein, GFP ile inkübe edilen hücrelerde görülmüştür ise hücre içi GFP sinyali sadece elektroporasyon üzerine gözlenmiştir. Benzer sonuçlar, RAW264.7 fare ile gözlendimakrofaj benzeri hücreler (Şekil 1C ve 1D). WGA tercihen kuluçka süresine bağlı olarak noktalı boyanma sergileme olabilir ve böylece plazma membranında kalıntılarına bağlanır ve lektin olduğuna dikkat edin. Şekil 2A, Şekil 1 A daha uzun bir süre için kuluçkalanmıştır Şekil 1A ve Şekil 2A, karşılaştırın.

Elektroporasyon sonra etiketli, saflaştırılmış Salmonella efektör, GtgE genişletilmiştir. GtgE bilinen bir hastalık oluşturma faktörü 30, grubumuz tarafından keşfedilen konakçı hücreler 31 salgılanmak üzere, ve yakın zamanda, bir sistein proteazı 32 olduğu gösterilmiştir. HeLa hücreleri, kuluçkalanmış ve 50 ug / ml GtgE ile elektroporasyona tabi tutulmuştur. Immünofloresan analizi için, hücreler GtgE üzerinde streptavidin bağlama peptidi afinite etiketi karşı bir antikor ile boyandı. Hücreler ayrıca, WGA ve DAPI ile boyanmıştır. Fig (inkübe HeLa hücrelerinde) 2A yeniden, yeşil flüoresan odaklarının eksikliği ile gösterildiği gibi hiç bir hücre içi GtgE yoktur. Bunun aksine, elektroporasyona HeLa hücreleri (Şekil 2B) önemli flüoresan hücre içi sinyal gösteren efektör protein özellikle elektroporasyon işlemine hücreleri giren göstermektedir. RAW hücreleri, kuluçkalama (Şekil 2C) sırasında, hücre yüzeyinde proteini birikmesine hafif bir artış eğilimi gösterdi, ama hücre içi sinyal, sadece, elektroporasyon (Şekil 2D) üzerine görülmüştür.

Konfokal mikroskobu ile alt-hücresel lokalizasyonu görselleştirmek için algılama sınırlarını belirleme potansiyel toksik bakteri efektörlerle hücreyi aşırı yükleme kaçınarak yeterli protein, hücreye girdi sağlamak için önemliydi. Şekil 3'te, GtgE 2.5, 25 RAW makrofaj benzeri hücrelerine elektroporasyon ve 50 ug / ml oldu. Hücreler daha sonra sabit ve GtgE etiketinin karşı bir antikor ile boyandı. Çnly odaklarının çok az sayıda 25 ug / ml (Şekil 3B), en belirgin odak sayısının artması ile, 2.5 ug / ml GtgE (Şekil 3A) gözlendi, fakat farklı odakların fazla sayıda yüksek protein görüldü konsantrasyonu test, 50 ug / ml (Şekil 3C). Benzer boyama desenleri hücre içi protein kolayca konfokal mikroskopi tarafından doğrulanmadı olabilir bu protein konsantrasyonlarında gösteren örnekler arasında gözlenmiştir. 50 ug / ml'nin üzerinde protein konsantrasyonları, böylece hücre yüzeyine adsorbe olma hedef protein için eğilimini mi, hem daha fazla protein konsantrasyonu olarak test edilmemiştir. Membran ilişkili protein bu agrega önlemek için, bir western blot (Şekil 6, sağında şerit) üzerinde görselleştirmek için protein etkileşim yeterli ana elde etmek için iki elektroporasyon küvetler havuz için gerekli oldu.

Ayrıca int olduğunu göstermek içinroduced proteini sadece hücrenin yüzeyine adsorbe değil birbirini takip eden optik kesitler her 0,35-0,43 mikrometre (Z yığınları) konfokal mikroskopi kullanılarak odak düzlemlerinde görüntülendi. RAW hücreleri, 50 ug / ml GtgE ile elektropore ve (Şekil 4, A ve B), yukarıda tarif edildiği gibi boyanmıştır. Z-yığınlar GtgE içi gerçekten olduğunu gösterdi ve odaklar hücrenin (Şekil 4B, uçak 36 26) üstüne alt (Şekil 4A, düzlem 36 6) uzanır. Benzer sonuçlar, tüm Electroporated proteinler için elde edilmiştir. efektör protein ya da elektroporasyon olan ve olmayan kontrol hücre popülasyonlarının iç floresan profili floresan konfokal mikroskopla incelenmiş, ve ihmal edilebilir olduğu görülmüştür.

Ayrıca, Electroporated proteini endositik yollar vasıtasıyla bozulmaya için hedeflenen olup olmadığını görmek için incelenmiştir. Hücreler, bir Ras-ilişkili protein 5A (Rab5) için boyandı,Erken endozomlarda (Şekil 4C), ya da Lizozom ilişkili zar proteini 1 (LAMP1), geç endozomlar ve lizozomlar (Şekil 4D) için bir marker için markör. Electroporated protein ve bu hücresel belirteçler arasındaki Eş-lokalizasyonu (Electroporated protein endozomlar / lizozomlarda içinde oldu yani) aralarında bir yakın fiziksel etkileşim işaret eder. Mikroskopisi Electroporated protein (GFP veya GtgE) LAMP1 veya Rab5 ile birlikte lokalize olmadığını gösterdi. Bu, doğrudan hücre içine endocytosed veya tedavi dört saat içinde endositoksik yoluna hedeflenmiş değil proteinin tanıtılan bu olayla edildi.

Dışsal proteini giriş birkaç saat ya da gün boyunca hücresel etkilere sahip olabilir ve bu nedenle ortaya proteinlerin kalıcılığını incelemek için çoğunlukla yararlıdır. Bir Electroporated protein elektroporasyon sonra bozulma olmadan devam ediyorum ne kadar belirlemek için. Tabanlı obağlanması ve hücre n görselleştirme, 4 saat elektroporate edilmiş hücrelerde için yaklaşık en az iyileşme süresi olarak belirlenmiştir yayılması. Zamansal Protein kalıcılığı gözlemlemek için bir zaman ders deney hücreleri 4, 24, veya elektroporasyon sonra 96 ​​saat boyanması, yapıldı. Hücre morfolojisi kurtarma önerdi 4 saat (Şekil 5A) sonra, hücre içi protein kayda değer bir miktarda olmuştur. 24 saat (Şekil 5B) sonra, hücreler içinde büyük Electroporated proteini hala yoktur. Elektroporasyon sonra zaman tespit ve boyama (Şekil 5C) ilk tedaviden sonra protein kalıcılık gün gösteren bir azalma görünür bolluk de olsa gözlemlenebilir odaklar vardı önce 96 saat uzatıldı bile.

İki önemli noktalar bu deneyler sırasında not edildi. RAW hücreleri, hücre yüzeyi Irre eksojen protein birikmesine HeLa hücrelerinde daha büyük bir eğilim sergilediinkübasyon prospektif (Şekil 6A) ya da elektroporasyon (Şekil 6B). Buna rağmen, her elektroporasyona örnekler iç protein (Şekil 1, 2, 5B) artmıştır. Buna ek olarak, zara bağlı proteinin zamanla yok oldu. İkinci uyarı küçük oluşan bir fenotip gösteren hücrelerin küçük bir nüfusu iki kontrol ekzojen proteinlerin yüksek miktarlarda yüklü hücreler yuvarlak (inkübe) ve işlenmiş (elektroporasyona) hücreleri (Şekil 6, C ve D, inkübasyon örnekleri gösterilmiştir). Bu hücrelerin çekirdekleri DAPI boyama dayalı yoğunlaşmış kromatin gösterdi ve apoptoz düşündüren hücresel hacmi tamamını dolu. Bu (hasat / tedavi, hücre döngüsünün normal bir parçası olarak veya bağlı ortaya çıkan) apoptotik hücreler tampon proteini emmek için bir eğilime sahip olduğunu, bu nedenle mümkündür.

Electroporated proteinler fonksiyonel ve karşılık gelerek lokalize olabilir göstermek içinctly Salmonella efektör protein SspH1 ve bilinen ana hedefi, protein kinaz N1 (PKN1) 33 gördü arasında konakçı hücre, eş-lokalizasyonu ve protein-protein etkileşimi içinde. Elektroporasyondan sonra, SspH1 ve PKN1 arası fiziksel etkileşimler bu western blot (Şekil 7A) ve ardından bir afinite bazlı immünopresipitasyon ile doğrulanmıştır. Eş-lokalizasyonu da flüoroforlar mekansal 34 üst üste yeterince yakın gösterir konfokal mikroskopi tarafından gözlenmiştir. 50 ug / ml SspH1 ile Elektroporasyon işleminden sonra, HeLa hücreleri (Şekil 7B), sabit ve SspH1 (yeşil) ve PKN1 (kırmızı) için boyandı. Düşük lazer güç odakları farklı (sarı) at SspH1 belirten çekirdekte gözlenen ve PKN1 etkileşim için yeterli fiziksel yakın idi. Bu etkileşim literatürde kurulmuştur; Ancak bu çalışma çekirdeğinde co-lokalizasyon gösteren ilk.

= "Always"> Şekil 1,
Şekil 1: GFP Elektroporasyon - HeLa veya RAW 264.7 hücreleri Hücreler, anti-GFP antikoru (yeşil), DAPI, nükleer spesifik prob ile inkübe edilmiş ya da saflaştırılmış, yeşil floresan proteini (GFP), 25 ug / ml ile elektropore edildi ve boyanmıştır (mavi. ), ve WGA (Kırmızı) sitozolik Frouin. Kuluçkaya (A) HeLa hücreleri GFP içselleştirme eksikliği gösteren yeşil floresan yokluğunu göstermektedir. (B) electroporated GFP temsili fotomikrografiğini gösterir. GFP hücreleri giren gösteren hücre içi odaklar görünümünü not edin. (C) ve (D) saf yeşil flüoresan protein için 25 ug / ml RAW inkübe edilen hücrelere (C) 'nin temsili görüntü veya elektroporasyona (D)' dir.

es / ftp_upload / 52296 / 52296fig2highres.jpg "/>
Şekil 2:., Salmonella efektör GtgE Elektroporasyon - Salmonella efektör, GtgE, ve bir anti-efektör etiket antikoru (yeşil) ile boyanmıştır etiketli HeLa hücrelerinde hücreler bir afinite 50 ug / ml (A) ya da elektroporasyona (B) inkübe edildi, DAPI, bir nükleer maske (Mavi), ve WGA (Kırmızı) sitozolik Frouin. (A) 'da. HeLa hücreleri GtgE içselleştirme eksikliği gösteren yeşil floresan bir olmadığını göstermektedir kuluçkalanmıştır (B), hücre içi elektroporasyona efektör protein gösteren elektroporasyona GtgE temsili bir fotomikrografiğini gösterir. (C) ve (D) için temsili görüntüler ya da Salmonella GtgE 50 ug / ml ile aynı şekilde, sırasıyla, inkübe veya elektroporatlanmıştır RAW hücreleri. Açık mavi WGA kırmızı floresan kombinasyonu, ya da bindirme, vesekonder antikor yeşil floresan.

Şekil 3,
Şekil 3: elektroporasyona protein titrasyon - RAW makrofaj benzeri hücre Hücreler, 2.5 ug / ml (A) 25 ug / ml (B) ya da 50 ug / ml (C), Salmonella efektör GtgE ile elektropore ve için eski hallerine gelmeye bırakılmıştır. 4 saat. Hücreler, sabit bir anti-SBP-etiket antikoru (yeşil) ve çekirdek maskesi, DAPI (mavi) ile boyanmıştır. Bu protein, daha yüksek başlangıç ​​miktarı, kullanıldığı zaman daha iyi sonuçlar elde edilmiştir, ancak, eş odaklı küçük kopya ile 2.5 ug / ml'de, hücre içi GtgE gösteren floresan odakları, görselleştirmek için mümkündür. (Kolayca aşırı membran bağlantılı olmayan agrega konfokal mikroskopi ile gözlemlenmiştir hücre içi protein de dahil olmak üzere), tatmin edici sonuçlar, böylece N GtgE için 50 ug / ml'de elde edildi veO yüksek konsantrasyonlar test edilmiştir.

Şekil 4,
Şekil 4:. Electroporated protein iç olsaydı Protein içselleştirme ve endozom belirteçleri ile birlikte lokalizasyon eksikliği konfokal mikroskobu ile elde edilen ardışık optik dilim (z-yığınları) görselleştirmek için. RAW hücreleri, 50 ug / ml GtgE ile elektroporasyona tabi tutulmuştur. (A), 6 36 optik dilim gösterir, çanağın tabanı üzerinde z yığın (2.1 mikrometre). Ve (b) göre değil de dilim 26 aynı alan gösterir 36. hücre odakları proteinin gerçekten hücre-içi ve hücre yüzeyi üzerinde toplanan olmadığını gösteren hücre boyunca uzanır. Açık mavi, kırmızı WGA, yeşil ikincil antikor, ve mavi DAPI birleşimidir. Endozomlar / lizozomların, Rab5, (C) veya bir lizozom işaretleyici, LAMP1 belirteçleri ile Co-lokalizasyon deneyi

Şekil 5,
Şekil 5: elektroporasyon sonra Protein sebat zamanla electroporated GtgE kalıcılığını gösteren Konfokal mikrograf.. 50 ug / ml GtgE HeLa hücrelerine elektroporasyona tabi tutulmuştur. Hücreler daha sonra, sabit bir anti-SBP-etiket antikoru (yeşil) ve çekirdek maskesi, DAPI (mavi) ile boyanmıştır. 4 saat (A) hücreler geri izin zaman en az miktarda olduğu belirlenmiştir ve beklendiği gibi en fazla hücre içi proteini göstermektedir. Hücre içi ve cel hem 24 saat (B) ve 96 saat (Cı), yeşil odaklar, sonralular yüzey, gösteri efektör sebat proteini bozulmuş gün ilk tedaviden sonra olmadığını göstermektedir. Bu resimde açık mavi renk mavi ve yeşil DAPI antikor boyama bindirme olduğunu.

Şekil 6,
Şekil 6:. Hücre yüzeyi protein birikimini ve bir elektroporasyon fenotip RAW makrofaj benzeri hücreler ya Kırmızı (50 ug / ml GtgE ile (A) ya da elektroporasyona (B) kuluçkalanmıştır ve anti-SBP-etiket antikoru (yeşil), WGA ile boyandı ), ve DAPI (mavi) ile. Hem 264.7 RAW ve daha az bir dereceye kadar HeLa hücreleri, hücre yüzeyi üzerindeki efektör araya eğiliminde; Tüm Elektroporasyona tabi tutulan hücreler, iç protein artış olduğu gösterildi (HeLal gösterilmemiştir). Sarı hedef protein WGA gelen kırmızı bindirme ve yeşil. Showin HAM (C) ve HeLa (D) hücreler,g GtgE ile inkübasyondan sonra değiştirilmiş bir fenotip (gösterilmemiştir). Çeşitli deneyler diferansiyel DAPI lekelemesi ve sitoplazmanın kaybı ile daha küçük hücrelerden oluşan bir fenotip gösterdi. Açık mavi, kırmızı WGA, yeşil ikincil antikor, ve mavi DAPI gelen bindirme olduğunu. Konfokal mikroskopi çekirdeğinde biriken hedef proteini göstermek için kullanılmıştır. Eksojen protein yüklü hücrelerin bu fenotip inkübasyon ve elektroporasyon hem sonra ortaya beri, bir apoptoz düşündüren olmak için bu fenotip hipotez olabilir.

Şekil 7,
Şekil 7:. Elektroporasyona Salmonella SspH1 Host protein etkileşimleri - western blot (A), ardından modifiye afinite saflaştırma yapmadan önce, 4 saat için eski hallerine gelmeye bırakılmıştır Hücreler SspH1 listelenen konsantrasyonlarda elektropore edildi HeLa hücreleri için zenginleştirmek vebilinen ökariyotik etkileşim eşleri tespit: serin / threonin protein kinaz N1 (PKN1). Bir küvetten gelen sinyal arka harmanlanmış, ama PKN1 hala yemli kontrol görülen bağlanma eksikliği üzerinde zenginleştirilmiş gibi sağ şerit (2x İH), 2 havuza küvetleri içerdiğini unutmayın. Western blot, yerli HeLa lisatı ile gerçekleştirilir SspH1 saflaştınldı ve daha önce afinite saflaştırma örnekleri PKN1 için monoklonal bir antikor ile problanmıştır ediliyordu. Hedef tespiti birincil antikor izotip karşı tepkisi olan bir yaban turbu peroksidaz konjuge sekonder antikor ile elde edilmiştir. HeLa hücreleri 50 ug / ml SspH1 elektroporasyon sonra konfokal mikroskopi ile ile PKN1 (kırmızı) ve SspH1 (yeşil) arasında eş-lokalizasyonu (sarı) gösteren (B) gerçekleştirildi. Bu optik örtüşme efektör ve ev sahibi proteini fiziksel etkileşim yeterince yakın olduğunu gösterir. etkileşim ilk kez çekirdeği gösterilmiştir olması, ek destek sunarProtein ev sahibi tarafından doğru insan ticareti edildi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Patojen bakterilerin salgılanan efektörleri konak hücre ortamında çalışabilmesi için geliştiğini ve böylece konak içinde in situ bunları incelemek yararlı olacaktır. Konakçı hücrelere özel ilgi efektörlerinin giriş ilgili patojen-konakçı etkileşimleri bakteriyel proteinlerden müdahalesi olmaksızın tek başına ele sağlar. amaç, böylece transfeksiyon ya da transdüksiyon ile bağlantılı bazı zorluklar kaçınarak ökaryotik konakçı hücrelere bakteriyel efektör proteinler katılması için bir araç olarak elektroporasyon incelemektir. Yeşil floresan proteini, bir kontrol olarak kullanıldı ve Salmonella efektör proteinler test edildi. Çünkü epitel hücreleri gibi immün hücrelerinin hedef bakteriyel patojenlere ilgi, bir insan epitel benzeri bir hücre soyu (HeLal) ve fare makrofaj-benzeri hücreler (264.7 HAM) kullanılmıştır. Elektroporasyon hücre viabili kayda değer bir azalma ile konakçı hücrelere ekzojen proteinleri sağlayabilirTy teslim proteinler dört gün hücreler tespit edilebilmiştir.

Elektroporasyona proteinin etkilerini izole etmek için, saf bir protein gereklidir. Bu çalışmada, proteinler E. ifade edildi N-terminal polihistidin ve streptavidin bağlayıcı peptid etiketleri ile coli BL21. Proteinler konsantrasyonda (genellikle arasında 5-25 mg / ml) ve saflık açısından tahlil, Ni-NTA reçinesi ile saflaştırıldı ve elektroporasyon kadar -80 ° C'de saklandı. Bunlar, yüksek saflıkta ve iyi karakterize edilmiş olması eğilimi Ticari olarak üretilen proteinler, aynı zamanda, elektroporasyon için kabul edilebilir olacaktır.

Bu protokolde anahtar adım tamamen yıkanarak hücre kültürü ortamının uzaklaştırılmasını ve proteinsiz tampon içinde süspansiyona dahil. Bu gözlenen herhangi bir alt-fenotip, ilgi dahilindeki eksojen protein olup, kültür ortamı içinde mevcut olan proteinlerin bağlı olmasını sağlar. Hücre yoğunluğu olduğunda elektroporasyon daha iyi verim gözlenmiştirEn iyi hücre sayısı, hücre boyutu ve türü ile değişir ama, (örneğin 6 x 10 6 vs 1 x 10 6 hücre) yüksek. Deneyde bir başka kritik adım hücreleri zaman kurtarmak ve yemekleri yeniden bağlanması için izin vardı; yapışmayan hücreler bu çalışmada kullanılmıştır, çünkü bu gerekli oldu. Bu amaçlanan çalışma doğasına bağlı olarak, uygun bir hücre içi trafiği, protein-protein etkileşimleri, ya da enzimatik aktivitesi için proteinlerin zaman vermek için gerekli olabilir, ancak iyileşme süresi, süspansiyon hücreleri için daha az önemli olabilir. Teslim proteinler 96 saat kadar için hücrelerin içinde gözlenmiştir beri, görselleştirme ya da hücresel tahlil mikroskop önce kuluçka dönemi uyum için çok oda var.

Bu protokolde çeşitli nedenler farklı hücre tipleri, protein hedefleri ya da alt akış analiz programları için optimize edilebilir. protein miktarı istenen hücre içi konsantrasyonu için ince ayarlanmış olabilir electroporated edilecek. FoProtein lokalizasyonu r görselleştirme, 1 kadar küçük ug kullanılabilir. Fonksiyonel çalışmalar için, proteinlerin yüksek başlangıç ​​miktarları gerekli olabilir. Buna ek olarak, post-elektroporasyon hücre kurtarma için süre kısa veya uzatılabilir. Kararsız protein hedefleri veya hızlı mansap işlemleri daha kısa inkübasyon süresi gerektirir. Aynı zamanda, kaplama hücrelerin miktarı, burada görüş ötesinde ayarlanabilir. Sunulan protein mikroskobu ile gözlenebilir, ve elektroporasyona protein, Western lekeleme gibi uygulamalar için, elde edilecek olan ise daha yoğun kaplanacak ise, hücreler daha seyrek kaplama olabilir.

Elektroporasyon canlı hücre proteinleri verilmesi için basit ve kolay bir yöntem olmasına rağmen, tekniğin bazı sınırlamalar vardır. yöntem, mikrogram miktarlarda son derece saf protein gerekmektedir. 1 kadar az ug elektropore ve konfokal mikroskopi ile görüntülenmiştir, ancak, proteinin, daha yüksek başlangıç ​​miktarları Bett verdigörsel sonuçlar er. Eğer protein işlevi elektroporasyon sonra bütün konsantrasyonlarda değerlendirildi değil iken, eşit ya da daha büyük 50 ug / ml protein konsantrasyonları western blot için yeterli sinyal için gerekli idi. Ayrıca, elektroporasyon küvetler boyutu kısıtlamaları nedeniyle, ölçeklendirme hücrelerin birden küvetler işleme gerektirebilir. Ancak, hücre hazırlanır kez elektroporasyon işlemi sadece saniye sürer düşünüyor, paralel işlem biraz fazladan zaman ve çaba gerektirir.

Sunulan protein Western blot, mikroskopi ile görünür ya da afinite temizliği için kullanılacak ise, proteinin afinite temizliği ya da tespit edilmesi için uygun bir antikor için bir etiket 35 olması gerekir. Bununla birlikte, bilinmeyen nedenlerle, literatürde veya başka biyokimyasal yöntemlerle (veriler gösterilmemiştir) bilinen bir etkileşimi elektroporasyon sonra değinmeyecek edilmesi mümkün değildi. Bu konak f gibi bazı Electroporated proteinleri tanıdığı olabilirhızlı oreign ve proteazom indirgenmesi için işaretler.

Elektroporasyon protein temini için diğer mevcut yöntemlere göre bazı avantajları tutar. Mikroenjeksiyon ile karşılaştırıldığında, elektroporasyon çok daha hızlı ve daha basit olan ve hücreler, çok sayıda test koşulları için yaklaşık yüzde 100 canlılığı ile aynı anda muamele edilebilir. Elektroporasyon ayrıca ticari olarak temin edilebilen reaktifler ile proteini, transfeksiyon daha ucuzdur. DNA transfeksiyon genellikle konakçı hücreler bakteriyel efektör proteinler incelemek için kullanılır; Bununla birlikte, bu bakteriyel proteinler ana bilgisayar tarafından olmayan ideal sentezlenebilir neden olur. Öte yandan, bakteriyel proteinlerden elektroporasyon efektör proteinlerin hücreler tarafından ifade edilen bulaşıcı işleminin daha iyi bir temsili için izin memeli protein sentezleme makineleri bağımlılığı ortadan kaldırır.

Çeşitli uygulamalar bakteriyel-konak INTERA çalışmada bir yöntem olarak protein elektroporasyon kullanabilirsinizseksiyonlar. İlk olarak, çoğunlukla transfekte etmek zordur birincil hücreler protein temini için elektroporasyon daha uygun olabilir. Bu daha çok biyolojik olarak uygun hücre tiplerinde efektör fonksiyonlarının araştırılmasında sağlayacaktır. Elektroporasyon ayrıca çoğullama proteinler ve / veya tedavi seçeneği sunar. Örneğin, birden çok proteinleri aynı anda ilave edilebilir veya ilaç ve diğer küçük moleküller, proteinler ile birlikte temin edilebilir. Hücre içi belirlemek için, protein, elektroporasyon gibi afinite temizliği bilinen hedefleri, tam-hücre ekspresyon analizinin karşı western blot ve mikroskopi gibi protein fonksiyonunun ve etkileşimler için tahliller ile bağlanmış olabilir kişiye proteinlerin etkisinin fonksiyonel bir anlayış elde etmek için en önemli tanıtılan protein lokalizasyonu. Bu nedenle, bu yöntem, diğer hücresel ve moleküler biyoloji teknikleri ile birlikte bakteriyel patojenin biyolojisi ortaya çıkması için bir araç olarak büyük bir potansiyele sahiptir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Solution Cellgro 25-050-Cl
0.4 cm Gap-disposable electroporation cuvettes Bio-Rad 165-2088
100% Methanol Any N/A Flammable, Toxic
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4919
Cell Counting Apparatus - Hemocytometer or Coulter Counter Beckman Coulter Model Z1
Cell Culture Incubator Any N/A Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C 
Cell Culture Plastic Any N/A Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman
Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM) Cellgro 10-013 Warm to 37 °C 
Electroporator Bio-Rad E. coli Pulser
Fetal Bovine Serum (FBS) Cellgro 35-016-CV
Fluorescent confocal microscope  Ziess Model  LSM 710 
Glass Bottom Dishes for Microscopy Wilco Wells HBSt-3522
HALT Protease Inhibitor Cocktail Pierce 78430 Corrosive, Toxic
HeLa Cell Line ATCC ATCC CCL-2
LDS 4X Loading Buffer Invitrogen NP0007
Minimal Essential Medium (MEM)  Cellgro 10-010 Warm to 37 °C 
Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent Any N/A
Penicillin/Streptomycin Cellgro 30-002-Cl
RAW 264.7 Cell line ATCC TIB-71
Primary Antibody Against Target of Interest Any N/A
Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore Any N/A
Phosphate Buffered Saline Any N/A Chill to 4 °C 
Sterile Phosphate Buffered Saline Any N/A Warm to 37 °C 
Name Company Catalog Number Comments
Streptavidin Agarose Resin Suspension  Pierce 20353
Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred) Any N/A
TCEP Sigma-Aldrich 646547 Corrosive, Toxic
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8585 Irritant, Toxic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mota, L. J., Cornelis, G. R. The bacterial injection kit: type III secretion systems. Annals of Medicine. 37, 234-249 (2005).
  2. Galan, J. E., Collmer, A. Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells. Science. 284, 1322-1328 (1999).
  3. Hueck, C. J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 62, 379-433 (1998).
  4. Cornelis, G. R., Van Gijsegem, F. Assembly and function of type III secretory systems. Annual Review of Microbiology. 54, 735-774 (2000).
  5. He, S. Y. Type III protein secretion systems in plant and animal pathogenic bacteria. Annual Review of Phytopathology. 36, 363-392 (1998).
  6. Dean, P. Functional domains and motifs of bacterial type III effector proteins and their roles in infection. FEMS Microbiology Reviews. 35, 1100-1125 (2011).
  7. Espinosa, A., Alfano, J. R. Disabling surveillance: bacterial type III secretion system effectors that suppress innate immunity. Cellular Microbiology. 6, 1027-1040 (2004).
  8. Orchard, R. C., Alto, N. M. Mimicking GEFs: a common theme for bacterial pathogens. Cellular Microbiology. 14, 10-18 (2012).
  9. Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5, 571-579 (2009).
  10. Ellis, B. L., et al. A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype. Virology Journal. 10, 74 (2013).
  11. Sreelatha, A., et al. Vibrio effector protein, VopQ, forms a lysosomal gated channel that disrupts host ion homeostasis and autophagic flux. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 11559-11564 (2013).
  12. McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. A method for incorporating macromolecules into adherent cells. The Journal of Cell Biology. 98, 1556-1564 (1984).
  13. Lafon, M., Lafage, M. Antiviral activity of monoclonal antibodies specific for the internal proteins N and NS of rabies virus. The Journal of General Virology. 68, (Pt. 12), 3113-3123 (1987).
  14. Kriegler, M. P., Livingston, D. M. Chemically facilitated microinjection of proteins into intact monolayers of tissue culture cells). Somatic Cell Genetics. 3, 603-610 (1977).
  15. Nossa, C. W., et al. Activation of the abundant nuclear factor poly(ADP-ribose) polymerase-1 by Helicobacter pylori. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19998-20003 (2009).
  16. Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: Optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Research. 24, 596-601 (1996).
  17. Winegar, R. A., Phillips, J. W., Youngblom, J. H., Morgan, W. F. Cell Electroporation Is a Highly Efficient Method for Introducing Restriction Endonucleases into Cells. Mutation Research. 225, 49-53 (1989).
  18. Cortes, F., Ortiz, T. Chromosome damage induced by restriction endonucleases recognizing thymine-rich DNA sequences in electroporated CHO cells. International Journal of Radiation Biology. 61, 323-328 (1992).
  19. Cortes, F., Ortiz, T. Induction of chromosomal aberrations in the CHO mutant EM9 and its parental line AA8 by EcoRI restriction endonuclease: electroporation experiments. Mutation Research. 246, 221-226 (1991).
  20. Baron, S., Poast, J., Rizzo, D., McFarland, E., Kieff, E. Electroporation of antibodies, DNA, and other macromolecules into cells: a highly efficient method. Journal of Immunological Methods. 242, 115-126 (2000).
  21. Lewis, R. Electroporation edges toward clinic for both gene therapy and drug delivery. Genetic Engineering and Biotechnology News. 17, (1997).
  22. Kotzamanis, G., et al. CFTR expression from a BAC carrying the complete human gene and associated regulatory elements. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13, 2938-2948 (2009).
  23. Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation. The Journal of Biological Chemistry. 264, 15494-15500 (1989).
  24. Graziadei, L., Burfeind, P., Bar-Sagi, D. Introduction of unlabeled proteins into living cells by electroporation and isolation of viable protein-loaded cells using dextran-fluorescein isothiocyanate as a marker for protein uptake. Analytical Biochemistry. 194, 198-203 (1991).
  25. Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells. The American Journal of Physiology. 260, C355-C363 (1991).
  26. Prasanna, G. L., Panda, T. Electroporation: Basic principles, practical considerations and applications in molecular biology. Bioprocess Engineering. 16, 261-264 (1997).
  27. Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. Theory of electroporation: A review. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41, 135-160 (1996).
  28. Weaver, J. C. Electroporation theory. Concepts and mechanisms. Methods in Molecular Biology. 55, 3-28 (1995).
  29. McAteer, J. A., Douglas, W. H. Monolayer culture techniques. Methods in Enzymology. 58, 132-140 (1979).
  30. Ho, T. D., et al. Identification of GtgE, a novel virulence factor encoded on the Gifsy-2 bacteriophage of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Journal of Bacteriology. 184, 5234-5239 (2002).
  31. Niemann, G. S., et al. Discovery of novel secreted virulence factors from Salmonella enterica serovar Typhimurium by proteomic analysis of culture supernatants. Infection and Immunity. 79, 33-43 (2011).
  32. Spano, S., Liu, X., Galan, J. E. Proteolytic targeting of Rab29 by an effector protein distinguishes the intracellular compartments of human-adapted and broad-host Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 18418-18423 (2011).
  33. Haraga, A., Miller, S. I. A Salmonella type III secretion effector interacts with the mammalian serine/threonine protein kinase PKN1. Cellular Microbiology. 8, 837-846 (2006).
  34. Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O., et al. Quantitative colocalization analysis of confocal fluorescence microscopy images. Current Protocols in Cell Biology / Editorial Board, Juan S. Bonifacino ... [et al]. 4, (Unit 4.19), (2011).
  35. Kimple, M. E., Sondek, J., et al. Overview of affinity tags for protein purification. Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan ... [et al]. 9, (Unit 9.9), (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics