거대 분자 3D 재건을위한 샘플 준비에 프라이머 높은 품질 데이터 수집 : 곳을 알아내는 - 전자 현미경의 것과하지 말아야를 수행

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Cabra, V., Samsó, M. Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction. J. Vis. Exp. (95), e52311, doi:10.3791/52311 (2015).

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Abstract

Introduction

cryoEM의 목적은 그 나라의 수화 상태에서 고분자의 전자 현미경 이미지를 얻는 것이다. 유리화 물 고분자 매립 덕분에, 냉동 수화 샘플은 직접 도입 할 수 있고, TEM 기기 시각화. 유리화는 동결 플래시 (10,000 O를 C / 초)에 의해 달성, 물 결정화하지 않고 샘플을 동결하고 동결 동안 분자 재 배열이 미미 보장합니다. 주위의 버퍼에 대하여 샘플의 전자 산란의 과잉 스테인은 하나의 부재를 볼 수있는 고분자 작지만 충분한 콘트라스트를 제공한다. 전산화 된 화상 처리 후 고분자의 3 차원 구조를 다시 사용할 수있다. ~ 500 kDa- 멀티 MDA 범위에서 큰 거대 분자 (전자 현미경 데이터 뱅크 (EMDB) 항목에 걸쳐 80 %를 나타내는) cryoEM에 이상적 샘플입니다; 이들 단백질은, 단백질 복합체, 단백질 - 핵산 C를 포함omplexes 및 막 단백질은 이중층에 매립. 이러한 거대 분자 (PDB 데이터베이스에 2 % 미만의 엔트리를 포함한) 결정화 될 가능성이 적습니다 아직은 X 선 결정학 또는 NMR에 의해 해결 작은 조각 cryoEM 의해 생성 된 3D 봉투에 고정 될 수 있음을 종종 경우이다. 한편, cryoEM 의해 해결 큰 구조물의 일부가 얇은 단면 TEM (2)에 의한 전체 셀 내에서 식별된다. 따라서, cryoEM 효과적으로 세포 내 원자 구조의 크기와 해상도 차이를 다리.

CryoEM는 얼룩 배제의 영역이 강하게 대조 "부정적"이미지 셋을 생성함으로써, 고분자 탈수 및 중금속 오염의 층으로 둘러싸인 부정적인 염색의 더 고전적인 방법 (NS)보다 더 거대 분자의 기본 구조를 반영한다. 두 경우 전자빔 거대 분자의 2 차원 투영 화상 불리는 입자 S를 생산HAPE는 전자빔에 대한 고분자의 배향에 의존한다. 다수의 입자는, 적어도 ~ 1,000없고 상한, 잡음비 (SNR) 평균화 비록에 신호를 증가시키기 위해, 및 입자의 공간적 배향 파라미터를 찾기 위해 '단일 입자 분석'(SPA) 소프트웨어가 컴퓨터에 분석 될 수있다 다시 투영 4-7으로 거대 분자의 3 차원 구조를 다시 할 필요가 있었다. 높은 SNR을 가진 NS는 예비 샘플 특성화에 사용되며 드 노보 3D 재구성을 생성하는 단계; 그 해상도는 거의 중금속 입자의 탈수 및 크기에 의해 부과되는 20을 초과하지 않습니다. 일반적 cryoEM 3D 구조 결정을 위해, 저해상도 3D 재구성은 처음 NS로부터 획득 한 후 cryoEM 더욱 그 내부 구조를 확인하기 위해 네이티브 수화 상태에서 고분자를 연구이 저해상도 초기지도를 구체화하는데 사용된다 그 해상도를 증가시킵니다. 아니테 그 NS 모델은 왜곡 된 (가장 일반적인 예는 탈수 8 인한 평탄화한다) 및 cryoEM 입자는 낮은 SNR, 그 왜곡이 낮은 SNR에서 일반적입니다 cryoEM 모델 (모델 바이어스 이슈로 수행 할 수 있던 경우에 셋 9). 구조적 왜곡 및 NS cryoEM 원료 입자 사이에 원료 cryoEM 입자 및 전연 방향에 직교하는 3D 모델의 대응하는 돌출부 사이의 불일치가 발생할 것이다. 3D 모델 연속 정련 사이클이 일어나 모델 자체 바이어스는 해결할 수있다. 즉, 3D 모델 원시 cryoEM 입자와 대응하는 돌출부 사이의 대응 관계의 부족으로 검출 될 것이다 발생 안되며, 다음 드 노보 cryoEM 모델 데이터로 구성되어야한다. 좋은 방법은 최상의 cryoEM 모델을 선택하는 여러 가지 가능한 3 차원 볼륨을 산출 할 수 각도 재구성 알고리즘 (10)을 사용하고 NS 차원 모형을 사용하는 것일 수도그 11 더 세련 될 것입니다. 더 좋은 전략은 (토론에 전용 섹션 참조) cryoEM 데이터 세트의 SNR을 증가시키는 것이다.

정제 된 거대 분자의 생화학 적 품질은 최종 결과에 최대한 영향을 미친다. 거대 분자, 시스템에서 이종 조직으로부터 정제되거나 발현, 순도 높은도는 구조적 손상 할 필요가있다. 그것은 둘 다 응집체를 형성해서는 안 않으며 해리하는 것이다. 특정 형태를 정의하기 위해 제조 조건은 균일 한 구조적 상태를 촉진한다. 복합체를 연구, 그렇지 않으면 고정 제 성공적 저급 화성 상호 작용 12,13 안정화하는데 사용되어왔다 그들의 유전율이 D nm의 범위 인 것이 최적이다.

처리되지 않은 cryoEM 이미지는 치수에 대한 가치있는 정보, 일반 개요, 집계 / multimerization, 동질성의 상태 및 macromolecu의 내부 구조를 산출르. 그럼에도 불구하고 기술의 전위가 크게 화상 처리로 향상된다. 3D 구조는 고분자의 전체 아키텍처, 리간드와 서브 유닛, 구조 변화의 3 차원 위치를 계시하고, X 선 결정학이나 NMR에 의해 결정 원자 구조의 도킹을 할 수 있습니다. 해상도가 증가함에 3D 재구성의 정보량을 단계적으로 증가한다 : 일반 15-20 Å 해상도 9-10 Å 알파 나선에서, 원자 구조 모호 도킹 허용 5 (A)에서이 식별 할 수 있고, 봉으로서 표시되는 베타 시트, 및 3.5 Å의 더 나은 해상도에서 그 원자 모형 (14)을 구축 할 수있다.

가능성은 적어도 0.05 mg을 3-5로 μL / ㎖ 한 TEM 그리드를 제조하기에 충분한, 유익한 이미지 cryoEM 매력적인 기술하게 시료의 비교적 소량의 SPA를 이용하여 3 차원 재구성을 얻었다. 최소 쓸모있는 요구 사항cryoEM위한 홈 메이드 또는 상업적 극저온 플런저, 초고 진공, 화상 기록 매체 및 저용량 키트, 그 역 펌핑 글로우 방전 처리 장치와 크라이 홀더, 및 증발기와 전자 현미경이다. TEM에 비 필수이지만 더 바람직한 특징은 (모든 현대있는 TEM에 존재) CCD 카메라 또는 직접적인 전자 검출기, 전계 방출 총 (FEG), 에너지 필터링 및 높은 처리량 데이터 수집 소프트웨어이다. 원칙적 그러나이 소프트웨어는 증가 된 데이터 스토리지 요구 감시 및 후속 후 처리 필요한 시간을 고려하기 위해, 단일 세션 cryoEM 15 수만 수천 입자를 수집 가능하게한다. 콘트라스트 전달 함수 (CTF) 보정과 조합 FEG 알파 나선을 시각화하기에 충분한 해상도를 도달 가장 기초가 3D 재구성. 그 시점에서, 해상도 레벨은 샘플에 의존 : 10 Å 해상도에 도달하면 막 단백질에 대해 일반적이지 않으면 반면대칭의 높은 순서는 원자 해상도는 더 달성 한 후 존재한다. 직접 전자 검출기의 최근의 발전은 cryoEM 전자 밀도지도의 품질이 이러한 X- 선 회절 데이터 (16, 17)로부터 유도 일치 (4X)이 낮거나없는 대칭, 심지어 거대 분자에 대한 원자 분해능을 가능하게했다.

기술의 기능을 설명하는 실제 예는 cryoEM 자신의 구조 결정에 계속 수석 역할을 거대 분자의 네 가지 중요한 유형 여기에 제공됩니다. 60 배와 충실하고 재현 정렬을 허용 그들의 큰 크기로 데이터 집합을 증가 그들의 면체 대칭으로 (i)는, 여러 면체 바이러스의 구조는 SPA (18)에 의해 다음 cryoEM 근처에 원자 해상도로 해결되었습니다. 우리는 면체 바이러스, 아데노 관련 바이러스 (AAVs)의 클래스의 예를 보여주고있는 대한 cryoEM에 의해 cryoEM / X 선 HY 근처에 원자 구조BRID 방법 19,20 존재한다. (II) 나선 구조와 거대 분자 미세 소관, 필라멘트 및 바이러스를 포함한다. 나선 축을 따라 그들의 반복 단위는 나선 형상으로 구성된 21 SPA의보다 복잡한 버전으로 분석 될 수있다. 예에서는 담배 모자이크 바이러스 (TMV), cryoEM 22 원자 해상도 해결 된 RNA 바이러스를 나타낸다. (III) 수용성 단백질은 큰 충분히 연구되고있다. 이들 중에서, 대칭 다중 체를 형성하는 고분자 실린더들은 나노 미터 이하 해상도 (23, 24)에서 해결 반복 구조를 구성한다. 여기에서 우리는 하이브리드 분자 모델이 cryoEM / X 선 결정학 하이브리드 방법 (25)에서 생성 된 KLH, 무척추 산소 캐리어의 이미지를 보여줍니다. (ⅳ) 막 단백질은 단백질의 중요한 클래스이고; 이들은 인간 게놈에 의해 코딩 된 단백질의 약 1/3 구성이면서 그들 의한 TR과 연관된 복잡성 구조적 특성화하기 어려운조합 된 구조적 기술에 의해 해결 구조의 1.5 % 미만을 구성하는 도메인 ansmembrane 안정화 26. 구조적 결정에 cryoEM 및 3D 재건의 역할은 ryanodine 수용체 (RyR), 근육의 수축과 뇌 신호에 중요한 큰 진핵 세포 내 칼슘 이온 채널을들 수있다. 현재까지 가장 높은 해상도 cryoEM 구조는, 10 Å 해상도, 이차 구조 (27)를 알 수있다.

Protocol

1. 알아내는 홀더 제조 및 유지 보수

주 : 건조 역 펌핑 터보 펌핑 스테이션과, 하나 이상의 냉 스테이지 컨트롤러로 구성은 주로 세 가지 목적으로 사용된다 : a) 그것은가 사용되지 않을 때 크라이 홀더를 저장하는 안전한 장소이다. 홀더를 저장하는 적절한 방법은 진공 상태에서 역 중 (안)입니다. b) 액체 질소 듀어 노출됨 크라이 홀더의 선단으로부터 제거 할 때 발생하는 리와 습도 상승을 증발시켜; 이것은 난기 사이클 달성된다. c) 제올라이트 흡착제를 재생하고, cryoholder의 dewars에서 고진공을 달성했다. 이는 극저온 전자 현미경을 수행 할 때 온도를 일정하게 유지하는 것이 필요하다.

  1. 예열주기.
    1. 펌핑 스테이션의 펌핑 포트 중 하나에 크라이 홀더를 삽입한다. 홀더의 진공 밸브 아래에 금속 출구로 배기 튜브 중 하나를 연결. 확인역 (V1, V2 및 V3)에와 크라이 홀더에 밸브가 모두 닫혀 있는지 확인하십시오.
    2. 추위 단계 컨트롤러의 전원을 켜고 제어 코드를 홀더에 연결합니다. 터보 펌프 스테이션의 전원 스위치를 켭니다.
    3. 추위 단계 컨트롤러에서 워밍업 사이클 옵션을 시작합니다. 터보 펌프 스테이션의 진공 10-3 Torr의 이상을 읽을 때, 버터 플라이 밸브 (V2)를 열고 진공이 안정 될 때까지 기다린 후 버터 플라이 밸브 (V1)를 엽니 다.
    4. 홀더의 온도가 20 ° C를 초과 안정 될 때까지 약 30 분 동안 워밍업 사이클을 실행합니다. 근접 V1은 다음 사이클을 멈춘다.
  2. 제올라이트주기. 4 시간과 O 사이 제올라이트주기를 실행 / N CryoEM 세션 전에, 그리고 일주일에 한 번하는 경우 사용하지 않을.
    1. 제올라이트주기 옵션을 시작하고 1-2 × 10 -4 토르의 범위, 좋은 진공을 달성하는 데 필요한 시간을 선택하고, 따라서 긴 대기 시간. 때는 진공 열 도달 -3토르는 V3를 듀어 배출 밸브를 엽니 다. 펌핑 스테이션은 홀더 라인을 철수 할 것이다; 진공이 안정 될 때까지 기다립니다.
    2. 크라이 홀더에 밸브를 엽니 다. 사이클이 완료되면, 그들이 열려 있던되는 역순으로 밸브를 닫기 : 밸브 홀더 후, V3, V2, V1에 최종적. 터보 펌프 스테이션과 차가운 무대 컨트롤러를 끄고 차가운 무대 컨트롤러와 터보 펌프 스테이션에서 냉동 홀더를 분리합니다.

2. 그리드 준비

  1. 청소.
    주 :이 구멍 상용 그리드를 사용하는 경우, 이는 제조 공정에서 사용 된 임의의 잔류 중합체를 제거하기 위해 사용하기 전에 세척 할 것을 권장한다. 바닥에 누워 여과지의 5 층 유리 페트리 접시에서이 작업을 수행합니다.
    1. 구멍 투성이의 탄소면이 위를 향하도록하여 필터 종이에 그리드를 배치합니다.
    2. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여, O를 몇 방울과 종이를 적시그리드 주위 F 클로로포름 그들은 단지 부동 시작할 때까지.
    3. 흄 후드 O의 / n에서 약간 오픈 뚜껑을 페트리 접시를 커버.
  2. 주의 : 얼음 레이어 직접 구멍 투성이 탄소 격자 작은 구멍을 가로 질러 형성 될 수있는 얇은 탄소 지지체는 (단계 2.2-2.3)을 생략 할 수있다.
    1. 핀셋을 사용하여, 두 개의 새로운 표면을 노출 운모 조각을 절단. 페트리 접시에 흰색 종이 조각에 운모면이 위로의 새로운 노출 된 표면을 놓습니다.
    2. 탄소 증발기의 벨 항아리에 페트리 접시를 놓습니다. 진공 아래 2 × 10-6 Torr의 때까지 펌프 아래로 순서를 시작합니다. 탄소 막대의 표면에 불순물을 증발시켜, 피복 페트리 접시 프리 증착을 수행한다. 그런 다음 벨 항아리를 공기와 페트리 접시에서 덮개를 제거합니다.
    3. 진공 탄소의 얇은 층 (~ 5 ㎚)와 운모가 10-6 토르와 코트 아래까지 펌프 아래 순서를 수행합니다. 탄소 동안 눈 보호를 사용하여증발. 마이카 시트 아래에 배치되었던 종이에 의해 생성 된 어둠 탄소막의 두께를 모니터링.
  3. TEM 그리드에 얇은 탄소를 전송합니다.
    1. 운모의 0.5 × 1cm 조각을 잘라 여과, 탈 이온수의 평평한 표면에 탄소를 떠. 평평한 물 표면을 얻기 위해 광학 렌즈 용지를 사용하십시오. 핀셋을 사용하여, 플로팅 탄소 층의 상부 표면과 접촉하는 격자의 구멍 투성이 탄소 측에 올리고 픽업.
    2. 그리드 충분한 수의 준비 될 때까지 반복 2.3.1와 2.3.2 단계를 반복합니다.
  4. 글로우 방전.
    주 : 글로우 방전은 친수성으로 그리드 자연스럽게 소수성 탄소 코팅층을 변환한다. 이 단계는 선택 사항입니다.
    1. 탄소 측이 파라 필름으로 덮여 7.5 X 2.5 cm 유리 슬라이드에 위를 향하도록 그리드를 배치합니다. 글로우 방전 장비의 챔버로를 놓고 실을 닫습니다.
    2. 펌프25mA에서 20 초, 7 × 10 -2 mbars의 벨 항아리와 글로우 방전입니다.
      참고 : 밝은 자주색 빛이 보일 때이 시간 동안. 그렇지 않으면, 그들은 빛을 다시 배출 될 필요가있을 것이다, 그리드와 유리 슬라이드를 제거하고 1 시간 이내에 사용합니다.

3. 샘플 플 런지 동결

참고 : 액체 질소 및 에탄 (스플래시)을 방지하기 위해이 기기를 사용할 때 안전 안경 및 적절한 신발을 사용합니다.

  1. 플 런지 냉동 장치의 전원을 켭니다. 증류수로 가습기 물통에. 원하는 온도, 상대 습도 및 오점 시간 폭락 조건, 오 힘 흡착 시간 (22 ° C, 95 %, 2 초, 여기에 제시된 예 2, 40 초)을 설정합니다. 새로운 블로 팅 종이 필터를 놓습니다.
  2. 안정성 (약 10 분)에 도달 할 때까지 액체 질소 외부 저장조를 충전함으로써 에탄 컨테이너를 식혀. 액체 질소는 boilin 중지되면g는 내부 챔버에 에탄 탱크로부터 오는 튜브의 선단을 배치하고 매우 느리게 밸브를 연다. 내부 챔버에서 에탄을 액화 및 상단에서 1mm로 입력합니다. 에탄을 동결하지 마십시오. 주의 : 에탄은 매우 인화성 및 폭발성이다.
  3. 확인 핀셋이 플 런지 냉동 장치 내에서 정렬되어 있는지 확인합니다.
  4. 습도를 켭니다. 핀셋에 그리드를로드하고, 구멍 투성이의 그리드의 탄소 표면 (무딘면)에 샘플의 3-5 μl를로드합니다. 샘플이 그리드에 흡착 얇은 액체 층을 달성하기 블랏을 수행하도록 기다린다.
  5. 액체 에탄으로 급락하여 그리드를 플래시 동결. 꾸준히 핀셋을 들고 액체 에탄에서 핀셋 그리드 어셈블리를 제거하고 액체 질소로 외부 챔버로 전송. 액체 질소에 침지 작은 격자 상자에 격자를 전송합니다. 어느 저장 탱크에 전송하는 동안 액체 질소에 모든 시간을 유리화 샘플을 유지하십시오또는 크라이 홀더.
    주 : 그리드 박스는 1 년 이상 대용량 (35-50 L) 액체 질소 듀어에 저장 될 수있다. 편리한 수납 이들은 두 드릴 상단 구멍 듀어의 입으로부터 당겨질 수의 캡 부착 낚싯줄과 50㎖의 팔콘 튜브에 배치 될 수있다.

4. TEM에 알아내는 그리드로 이동

  1. 냉동 전송 워크 스테이션에 크라이 홀더를 삽입합니다. 삽입시 홀더의 끝이 손상되지 않도록주의하십시오. 모든 광학 렌즈 용지를 제거있을 경우,로드와 확대경을 사용하여 냉동 홀더의 O 링의 작은 섬유의 존재와 먼지를 확인합니다.
  2. 크라이 홀더의 듀어 및 액체 질소와 워크 스테이션 용기를 입력합니다. 워크 스테이션과 함께 제공되는 갇혀 깔때기를 사용하여 액체 질소를 유출하지 마십시오.
  3. 온도를 모니터링하고, 액체 질소 및 추가 # 유지 감기 스테이지 제어기에 크라이 홀더를 연결(160), 온도는 약 -194 ° C에서 안정 될 때까지. 액체 질소의 레벨이 워크 스테이션 용기와 크라이 홀더 듀어 모두 진공 밀봉의 수준 아래에 있는지 확인합니다. 그리드 핀셋, 클립 링과 워크 스테이션의 클립 링 도구의 뭉툭한 끝을 사전 냉각. 또한 대형 핀셋 세트와 액체 질소로 채워진 다른 듀어에서 드라이버를 미리 냉각.
  4. 빨리 큰 핀셋을 사용하여 워크 스테이션에서 액체 질소에 냉동 수화 그리드를 포함하는 냉동 격자 상자를 전송합니다. , 드라이버로 크라이 그리드 상자를 열고 냉동 수화 그리드를 가지고 샘플 홀더 슬롯에 넣습니다.
  5. 그리드의 상단에있는 클립 링을 놓고가 완전히 제자리에 장착 될 때까지 클립 링 도구의 뭉툭한 끝을 부드럽게 눌러줍니다. 극저온 셔터를 닫습니다. 워크 스테이션에서 도구 및 냉동 그리드 상자를 제거합니다.
  6. 미니하기 위해 현미경 콘솔 홀더와 격​​자 전체 워크 스테이션을 이동실내 공기의 그리드의 전송 시간을 숙지시키고.
  7. 이전에 채워진 적어도 20 분 동안 냉각되었다 액체 질소와 TEM 방지 contaminator을 최고. -60 °에 현미경 스테이지를 사전 기울입니다.
    참고 : 홀더가 에어 록에 삽입 될 때이 액체 질소의 손실을 최소화합니다.
  8. 현미경에 사전 펌프 에어 록 사이클을 시작합니다. (이 FEG TEM 특히 경우) 전자총에 밸브가 닫혀 있는지 확인합니다. 사전 펌프 에어 록 순서 크라이 홀더를 삽입하기 전에 (약 2 분)이 끝날 때까지 기다립니다.
    참고 :이이 단계가 소멸되는에 붉은 빛으로 표시됩니다.
  9. 에어 록에 홀더를 삽입하고 시계 방향으로 90 ° 회전; 온도를 모니터링하기 위해 냉동 홀더에 감기 단계 컨트롤러 코드를 연결합니다. 붉은 빛이 소멸 될 때까지 다시 기다린 후 TEM의 안녕에 홀더를 삽입하는 단계와 다시 0 ° 위치로 홀더를 모두 회전GH 진공 열입니다.
  10. 온도가 결코 결정 얼음의 형성을 방지하기 위해 -160 ° C 이상으로 간다 있는지 확인합니다.
  11. 크라이 홀더의 듀어 리필. 홀더가 열 평형을하고 TEM 진공 이미지를 촬영하기 전에 복구 될 때까지 45 분 - 15 기다립니다.
  12. 액체 질소의 버블 링이 검출되는 경우, 액체 질소 충전 높이를 변경하거나 부드럽게 면봉 버블 원점을 터치.

5. 저용량 데이터 수집

주 : 저용량 데이터 수집 기법 / 2 내지 20 Å의 전자에 노출을 제한함으로써 시료에 전자선의 손상을 최소화하기 위해 사용된다. 이 세 가지 구성 사이의 교류에 의해 달성된다 : 높은 배율 (~ 150,000X) 볼의 작은 필드와 "노출"로, 낮은 배율 (~ 5000 배)와보기, "초점"의 넓은 필드, "검색" 원하는 최종 그니와문법을 없애는 및 관심 영역을 포함하는 기록한다. 모드 사이에서 빔 빈.

  1. TEM과 저용량 프로그램 설정
    1. 극저온 셔터를 후퇴 및 열 밸브를 엽니 다.
    2. 중앙 무대 ~ 15 ° ± 무대를 바위에 알파 비틀 비틀를 사용하여 eucentric 높이 (Z)을 설정합니다. 스테이지가 락되는 동안 뚜렷한 움직임이 없을 때까지 Z 위치를 조정한다. 저용량 프로그램을 활성화하고 각 모드에 대한 검출기를 선택합니다.
    3. 노광 모드에서, 어떠한 탄소가없는 격자의 영역을 찾아 기록해야 할 영역이 완전하게 조명 될 수 있도록 최적의 조리개와 집광 스폿의 크기를 선택하여 조도를 조절한다. overcondensation 방향으로 빔을 확산해야합니다.
    4. 검색 모드에서는 높은 배율에서 쉽게 식별 할 수 있습니다 작은 기능을 찾을 수 있습니다. 노출 모드에서는 조이스틱 (XY 스테이지 컨트롤러)와이 기능을 중심으로. 묘기 경우 낮은 배율에서 시작URE 시야에 있지.
    5. 탐색 모드에서, 저용량 XY 화상 시프트 컨트롤을 사용하는 필드의 중심이 기능을 가지고. 노출 모드로 이동하고 기록 할 수있는 영역 밖으로 때까지 조이스틱을 사용하여 축 경사를 따라 기능을 이동 (0.5-3 마이크론). 모드로 초점을 이동하여 XY 이미지 시프트 컨트롤을 사용하여 기능을 중심으로. 피쳐가 시야에 있지 않은 경우 저배율 시작한다.
    6. 항상 중심 빔을 유지합니다.
  2. 데이터 수집
    1. 극저온 셔터를 후퇴 및 열 밸브를 엽니 다. 저용량 프로그램을 활성화합니다.
    2. 탐색 모드에서, 얇고 균일 얼음을 그리드 사각형을 식별.
    3. 적당한 구멍을 선택하고 필드의 중앙에 배치합니다. 모드를 집중하고 이미지에 초점을 전환합니다. 4.5 미크론 - 0.5 사이의 이미지 언더 포커스.
    4. 노출 모드로 전환하고 이미지를 기록합니다.
    5. 5.2.3-5.2.4 모드를 검색하고 단계를 반복 전환합니다.피 그리드 광장을 가로 질러 이동 사전 - 노출 좋은 구멍하는 기록합니다.
    6. 그리드 광장을 마치고 또 다른 좋은 하나로 이동합니다.
    7. 높이 (Z)를 다시 조정 및 데이터 수집을 계속합니다.

Representative Results

그림 1에 설명 된 모든 프로토콜 단계를주의 깊게 실행은 냉동 수화, 착색되지 않은 거대 분자의 시각화를 가능하게한다. 다른 구조적 특성을 가진 네 개의 대표 표본에 대한 결과가 표시됩니다. NS 및 cryoEM의 방법으로 얻은 그들의 현미경 이미지 (그림 2)를 비교한다. AAV5의 (ⅰ) NS 이미지는 130 Å 주위 직경의 바이러스 입자를 보여준다. 전체 및 빈 구조의 공존은 각각 구조적 손상 캡시드 (스테인 엔트리를 허용하는지) 브로큰 대응한다. CryoEM 균일 빈 구조를 도시 한 도면 실제로이 바이러스 입자는 유전 물질 (28)를 포함하지 않습니다. cryoEM가 면체 양식을 반영, 대부분 육각형 입자를 보여줍니다 반면 NS 우세 둥근 입자를 보여줍니다. (II) 모두 23 Å 볼 수의 나선형 반복 종종 이상 0.1 μm의 180 Å 직경과 가변 길이의 나선형 TMV 쇼 막대의 이미지,NS 및 cryoEM에. (40) 중앙 채널은 cryoEM 이미지에서 NS 이미지에 얼룩과 빈으로 가득합니다. (ⅲ) 네이티브 KLH 8 MDA의 didecamer 350 Å 직경 400 Å 길이의 특성 배럴 어셈블. NS 및 cryoEM는 KLH의 직사각형 측면보기 원형 전망 말에 공개. 두 기술은 여섯 대칭축에 수직 한 줄무늬 및 각 계층 내에서 똑같이 이격 된 형태소 단위를 보여준다. CryoEM 빈 내부 구조를 알 수있다. (IV) Ryanodine 수용체, 2.26 MDA의 큰 사량 세포 내 채널은 275 X 275 2의 제곱으로 볼 수있다. 이러한 중앙 십자가 NS에 의해 얼룩 축적으로 매니페스트 중앙 우울증과 cryoEM에 의해 밀도가 낮은 지역과 같은 복잡한 표면 특징. NS 4 개의 모든 시료에서 유사한 시험 대조를 나타내지 만, 패널 cryoEM 비교 이로 인해 세포막 단백질을 가용화 세제의 존재 RyR1의 낮은 SNR (명암)을 노출시킨다.

결정 얼음, 얼음 오염, 난시, 웹 같은 구조 (그림 3) : cryoEM 아티팩트의 전형적인 예는 RyR1에 대해 표시됩니다. 그 원인과 예방은 더 토론 섹션에 설명되어 있습니다.

냉동 수화 RyR1의 SPA 및 3D 재건은 단백질의 호모 테트라 머 조직 (그림 4A)를 반영한 네 배 대칭 구조를 보여준다. 세포질 도메인은 3 275 X 275 X 120의 사각형 프리즘을 형성하고 비계와 같은 구조를 형성하는 여러 재현 구상 도메인이 포함되어 있습니다. 횡단 도메인은 115 X 115 X 60 (3) 최대 크기로 작은 테이퍼 광장 프리즘을 형성한다. 10 Å 해상도에서 그 알파 헬릭스 (도 4b)를 시각화 할 수있다. 3D 차분 매핑은,이 경우, 12 kD의 단백질을 conside FKBP12의 3D 차분 맵 리간드의 중요한 위치를 밝힐 수RyR1의 붉은 서브 유닛은, RyR1 (그림 4C) 29에 놓이게됩니다. 마지막으로, 구조 변화는 거대 분자의 동적보기를 제공합니다. 이 경우 RyR1 이전에 열린 상태 (그림 4D) 27 폐에서 대량 전위가 열리거나 닫히기 조건에 계시 안정화.

그림 1
극저온 전자 현미경 기법도 1의 흐름도.도 프로토콜의 주요 단계를 강조한다.

그림 2
샘플의 다양한 NS 및 cryoEM 2. 비교 그림. (A) AAV5, 20 면체 바이러스. 헬리컬 바이러스 (B) TMV. 세트는 23 Å의 나선형 반복을 보여줍니다. (C) 기본 KLH. (D) RyR1; 대표 뷰 (F, 사중의보기 및의, 측면보기)를 강조 표시됩니다. 모든 샘플은 저용량의 조건 하에서, 200 kV의 가속 전압의 하에서 50,000 배의 배율에서 동일한 결상된다. 스케일 바, 10 나노 미터. 모든 NS 샘플 탄소 지원에있는, cryoEM 샘플 A, C, D가 quantifoil 이상 얇은 탄소에 있으며, cryoEM 샘플 B는 quantifoil 구멍 바로 위에있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 RyR1 cryoEM 샘플에 공통 cryoEM 유물의 이미지를 보여주는 3. 갤러리. (A) 결정 성 얼음. (B) 아이스 오염 (화살표). (C) 난시. 난시 이미지 RyR1s 겨우 볼 수 있습니다. 오른쪽에 삽입 된 전원 SPECT를 보여줍니다비대칭 톤 고리와 이미지의 럼. 왼쪽에 삽입 된 참조를 위해 비 난시 이미지의 파워 스펙트럼을 보여줍니다. (D) 웹 같은 구조. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
ryanodine 수용체의 4 CryoEM 및 3D 재건 그림. . (A) 표시있는 isosurface (B)의 원자 좌표와 cryoEM 포락선 사이 잘 일치를 나타내는 RyR1의 N 말단 (30)의 결정 구조의 도킹; 화살표는 구조에서 돌출 두 알파 나선 가리 킵니다. 화살촉은 이온 채널의 기공을 둘러싸고있는 네 개의 나선 중 하나를 나타냅니다. 점선 공막의 경계를 나타낸다. (C) 및 3D RyR1 LOFKBP12 리간드 (오렌지 컬러)의 양이온. (D) 오픈 (블랙 메쉬) 형태로 폐쇄 (오렌지)에서가는 RyR1의 구조 변화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

SPA 하였다 TEM 주어진 고분자 들면 저해상도 3D 구조가 제 상위 - 이어 될 수 NS 데이터로부터 결정되고, 일반적으로 중간 2014 EMDB 2,000 엔트리 가까워 많은 고분자 3D 구조 기여한 해상도 cryoEM 3D 구조. 제 3 차원 재구성을 용이 NS 의해 제공 분자 경계의 높은 콘트라스트, 나중에 그 완전 수화 상태에서 고분자의 내부 구성을 매핑하는 기능, 그리고 더 높은 해상도를 달성 할 가능성 cryoEM 의해 정제된다. cryoEM의 또 다른 장점은 거대 분자의 붕괴를 초래할 수 탈수 스트레스의 제거이다. 또한, 가능한 한 표면 흡수 효과를 제거하고이 고분자 용액에 채택 형태를 도시 탄소 지지체를 생략 할 수있는 가능성이있다. 극저온 네가티브 염색 cryoEM 및 NS의 조합은 완전히 유압에 높은 콘트라스트를 수득표본을 평가하고 얼룩 자체가 고분자 (31)의 무결성을 방해 할 수 있기 때문에 부분적으로, 10 이하 EMDB 항목으로, 그러나 그것은 자주 사용 된, SPA를 사용하여 3 차원 재구성 될 수 있습니다. 3D 재구성에 도움이되는 다른 두 TEM 기법은 2D 전자 결정학 및 전자 단층이다. 2D 전자 결정학은 평면 또는 관 모양의 결정이 필요합니다; 결정의 전자 회절은 잠재적으로 원자 해상도 (32)로 이어지는 3D 재건에 사용됩니다. 유리화 또는 전통적 고정 표본 전자 단층에서 고분자 또는 하위 구성 요소는 셀룰러 단수 개체 재구성 될 수 있다는 장점과 함께, 후속 단층 재 (33)의 내부에 회전 TEM; 그러나, 현재이 기술은 Å 34,35 40-20 범위의 분해능 한계를 갖는다. 모든 분자 TEM 기술 중, NS 및 cryoEM 데이터의 SPA는 가장 널리되었습니다사용. 여기에 예시 된 프로토콜은 SPA 분석에 적합한 cryoEM 이미지를 획득하기 위해 최선을 다하고 있습니다; 그럼에도 불구하고 대부분의 프로토콜은 또한 2D cryoEM 단층의 크리스탈 샘플에 적용 가능하다.

성공적인 cryoEM 세션은 많은 중요한 단계의 결합 된 성공에 따라 달라집니다; 중요한 측면은 염두에 두어야 일반적인 cryoEM 유물의 설명과 그들을 다음 단락에서 설명하는 방지하는 방법입니다. 이 섹션에서는 SPA 방법을 사용하여 높은 품질의 3D 재구성을 얻기 위해 데이터 수집 지침을 설명합니다.

얼음 결정으로 전환하지 마십시오. 중앙 점은 샘플 극저온 폭락 TEM 관찰을 통해 순간부터 유리체 상태를 유지해야한다는 것입니다. 따라서 액체 에탄 샘플 급락 후 모든 후속 단계는 액체 질소 (-196 ° C에서) 또는 액체 헬륨 (-269 ° C) 온도에서 수행된다. -135 ° C 이상에 워밍업에 유리체 물을 변환결정 물; 다음 거대 분자 재 배열이 일어날 수 있으며, 물 결정 이미지 (그림 3A)를 지배; 샘플을 폐기해야합니다. 취급 핀셋 불충분 사전한다면 사고 샘플 워밍업은 극저온 급락은, TEM에 (gridbox에 의해 보호도) 용기, 및 / 또는 냉동 홀더 삽입 사이의 고정 된 그리드의 전송이 너무 느린 경우 발생, 또는 수 냉각. 냉동 전송시 TEM에 중요한 진공 저하 (감기 샘플 트랩 따뜻한 들어오는 공기)도 샘플을 따뜻하게 할 수 있습니다. 마지막으로, 과잉 조사 샘플의 또한 얼음 결정으로 전환 될 수 있습니다.

얼음 오염을 최소화합니다. 작은 샘플 볼륨 (3-5 μL)는 TEM 그리드에 적용 감안할 때, 증발 버퍼 구성 요소 (소금, 세제)을 집중하여 다중 체 상태의 손실을 포함 고분자 무결성에 영향을 미칠 수 있습니다. 높은 상대 습도 (RH) 미세 또는 챔버 회피의이 문제를 해결합니다. 대안 크라이 런징이 충분히 환기 냉장실 환경에서 수행 될 수있다. 극저온 급락 RH 후 자체 냉각 트랩 역할 극저온 격자로서, 얼음 오염, 또는 극저온 그리드 주위 습도의 응축을 방지하기 위해 가능한 한 낮아야한다. 아이스 오염은 고 대비 5 ~ 사이에 나노 미터에 이르기까지 크기와 방해 또는 완전히 이미지를 차단하는 몇 가지 마이크론없이 하부 구조와 입자로 구성되어 있습니다. 공기 전송 중 냉동 그리드 향해 호흡 / 이야기, 공기 초안을하지 않도록하고 주변 RH을 줄일 수 있습니다. (흰색 부유 입자로 표시) 응축수 오픈 액체 질소 용기는 폐기해야합니다.

거대 분자 방향 / 전망을 극대화 할 수 있습니다. 샘플 지원을 위해 할 수있는 선택은 진정한 구멍 투성이의 그리드와 구멍 투성이의 그리드를 통해 얇은 탄소 사이에있다. 이 샘플은 탄소 구멍 대 탄소막을 통해 확산하는 방법 (I), (II) 가능한 샘플에 의존 concentration뿐 베어 구멍 이미지와 유사한 입자 밀도 탄소 지지체보다 더 높은 농도의 100 배를 요구할 수있다 (~ 0.02 μM 내지 2), 및 (iii) 고분자의 배향 방법에 랜덤 분포이다. 탄소 친수성을 만드는 글로우 방전을 참고 세면에서 중요한 효과를 가질 것이며, 이는 샘플 종속 될 것이라고. 더 높은 해상도로 3D 재구성 정제 때 재발보기 랜덤 원추형 재구성하여 초기 구조 결정을위한 바람직한 반면, 거대 분자의 배향에 관해서는, 거대 분자의 랜덤 플레이하는 것이 바람직하다. 우리의 예에서, RyR1이 좋아하는 '사중'보기 (그림 2D)와 탄소와 상호 작용 및 방향의 임의성과 높은 해상도의 36 구멍 투성이의 그리드가 필요합니다.

SNR. SNR을 개선하는 최선의 전략은 배경 잡음의 소스를 줄이기 위해 극대화. 과도한 얼음두께와 필요한 것 이상의 탄소 필름 두께 지원 및 단백질 추가 노이즈를 추가합니다 포함 (있는 경우). 따라서 얼음 두께 블로 팅 시간, 압력, RH, 및 필터 종이의 질을 제어함으로써 필요 최소한으로 감소되어야한다. 탄소 지지체를 들어, 얇은 (~ 5 ㎚) 탄소막 두꺼운 구멍 투성이 탄소막 위에 적층 : 시료 얇은 탄소 덮인 구멍을 통해 이미징된다하면서이 구멍 두꺼운 탄소 기계적 내성을 제공한다. 반면에, 그 매우 얇은 얼음을주의 및 / 또는 탄소는 웹 (그림 3D)으로 설정할 수 있습니다 쉽게 깨지지 지원 될 수 있습니다. SNR을 극대화하기 위해, 불필요한 버퍼 성분 피해야한다. 막 단백질의 경우, 세제 대비에 큰 타격을 (그림 2D, 오른쪽 패널 참조)합니다. 표면 장력을 감소시킴으로써뿐만 아니라 세제 샘플을 지지체 상에 확산되는 방식을 변경한다. 몇몇 막 단백질은 DET 이외에 지질의 존재를 필요상기 콘트라스트를 압축 ergent. 이 샘플을 극복하기 위해 단지 37 냉동이-폭락하기 전에 낮은 세제 농도 및 지질 않고 버퍼에 희석 할 수있다. 새로운 대안 세제 (16)과 막 관통 도메인 구성 요소를 안정화시키는 nanodisks (38)의 사용에 의해 촬상 cryoEM 막 단백질 성공적인 접근 될 듯하다.

고품질의 이미지를 위해 노력하고 CTF 정정을 위해 준비한다. 유리화 시험편되는 어떠한 존재 향하지, CTF, 주파수 강도에 관한 함수는, 여러 제로 전환 컨트라스트를 충분한 화상 (위상)를 생성하기 위해 높은 디 포커스 값이 필요 정보. CTF 보정 저해상도 3D 재구성을위한 필요는 없지만 더 높은 해상도를 목표로 할 때, 3 차원 객체의 정확한 표현을 복구하기 위해, 다른 defoci와 화상 연산 CTF 보정이 수행 될 수 있도록 수집 될 필요가있다.CTF 결정 및 수정은 주요 SPA 소프트웨어 패키지 4-7에 포함되어 있습니다; 세부 사항은 다른 곳에서 39 찾을 수 있습니다. 최적의 CTF 보정, defoci의 범위를 사용합니다. 좋은 전략은 3-4 디 포커스 값 사이에 대체하는 것입니다. 값은, 얼음 / 탄소 두께 (얇게 샘플 디 포커스 덜 필요함), 및 전압 (저전압 디 포커스가 덜 필요함) 고분자 (큰 크기 미만의 디 포커스를 필요)의 크기에 의존한다. 200 kV의 내용 값의 양호한 초기 범위는 2.5, 3, 3.5, 4 μm의 디 포커스이다. CTF는 역 격자 표현, 파워 스펙트럼 (40 톤 링) 고 및 저 강도의 고리를 교대로 나타난다. 해상도에 대한 가능성을 드러내 파워 스펙트럼을 디스플레이하는 단계; 넓은 가시 링 톤의 주파수가 달성 가능한 해상도의 연역적 추정치 가까운. 파워 스펙트럼은 정기적으로 점검하고, 난시 (비 원형) 톤 링해야한다 (그림 3C)는 대물 stigmator으로 수정되어야한다. 톤 링은 적어도 원하는 해상도까지 볼 수 있어야합니다.

이 프로토콜을 이용하여 획득 cryoEM 데이터 세트를 직접 3 차원 재구성을 생성하기 위해 SPA에 의해 처리 될 수있다. 비록 이상적인 샘플, 3 차원의 재구성 품질은 성능 및 TEM 장치의 사양에 의존하고, 화상 처리에 관한 것이다. 이 두 전선에서, 그리고 최근에 개발 된 직접 전자 감지기에 특별한 언급과 지속적인 개선과 함께, 가능성이 더 지속적으로 원자 해상도에서 3D 재구성을 얻을 그 어느 것보다 가까운합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethane Airgas 371745 99.99% purity very important, impurities can lead to high-contrast contaminants on the grid. CAUTION: flammable
Liquid nitrogen Airgas 27135 99% purity. CAUTION: handling liquid nitrogen in a cold room poses a serious asphyxia hazard since nitrogen displaces oxygen without any warning signs.
Dumont no. 5 Antimagnetic tweezers Ted Pella 5326
Mica sheets, 1 x 4 cm Ted Pella 54
Graphite rods, presharpened size 1/8” dia x 2 ¼” long tip 0.039” dia neck type Electron Microscopy Sciences 70220-45
350 ml cryo-dewars Pope 8600
Cu 400 mesh holey grids  Quantifoil Quantifoil Q10525
Cu 400 mesh holey grids C-Flat Protochips CF-1.2/1.3-4C
Glow discharge device Electron Microscopy Sciences Model E7620
Turbo pumping station Gatan Model 655
Carbon evaporator Denton Vaccum Model 502B
Freeze plunger FEI Vitrobot Mark IV
Transmission electron microscope 200 kV FEI Model Tecnai F20
CCD Camera 4k x 4k Gatan UltraScan 4000 UHS
Image Processing software CTFFIND3/CTFTILT http://grigoriefflab.janelia.org/ctf
Image Processing software EMAN http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
Image Processing software Spider http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
Image Processing software Freealign  http://grigoriefflab.janelia.org/frealign
3D visualization software Chimera http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Native Keyhole Limpet Hemocyanin Biosyn

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References

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