레이저 캡처 이외에 Microdissection - 개별 도파민 신경 세포의 분리 및 전체 복부 피개 영역의 데모

Neuroscience
 

Summary

개별 도파민 뉴런의 단리 또는 직접 또는 간접 면역과 복측 피개 영역은 레이저 미세 절제를 캡처하여 설명된다. 적외선 레이저를 이용하여 유리 슬라이드 조직으로부터 단리 및 적외선 및 자외선 레이저의 조합을 이용하여 막 slide에서 파라미터 논의된다.

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Kummari, E., Guo-Ross, S. X., Eells, J. B. Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area. J. Vis. Exp. (96), e52336, doi:10.3791/52336 (2015).

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Abstract

레이저 캡처 미세 절제 (LCM)을 현미경 슬라이드 상에 각각의 세포 또는 조직 절편에서 조직의 정확한 해부학 적 영역의 농축 집단을 분리하는 데 사용된다. 면역 조직과 결합 할 때, LCM은 특정 단백질 마커에 기초하여 각각의 세포 유형을 분리하기 위해 사용될 수있다. 여기서, LCM 기법은 직접 티로신 수산화 효소 면역와 LCM에 사용되는 인접 부에 간접적 티로신 수산화 효소 면역 조직 화학 법을 사용 복측 피개 영역의 영역을 포함하는 도파민 신경 세포의 분리를 위해 표지 된 도파민 성 신경 세포의 특정 집단을 수집하기 위해 설명된다. 적외선 (IR​​) 레이저 캡처 양쪽에 사용되는 개별 뉴런뿐만 아니라 유리 슬라이드 및 분석 용 LCM 캡 상 복측 피개 영역 오프 해부. 100 % 에탄올, 크실렌과 조직의 완전한 탈수 중요합니다. IR 캡처 레이저의 조합 및 자외선 (UV) 금속 절삭NG 레이저는 PEN 막 슬라이드 사용시 개개 도파민 뉴런 또는 복측 피개 영역을 격리하는 데 사용된다. PEN 막 슬라이드는 빠르게 조직의 큰 조각을 수집하고 세포를 수집하고 수집하는 더 일관성을 제공으로, 유리 슬라이드에 비해 상당한 장점을 갖는다 슬라이드로부터 조직을 완전히 제거하는 탈수 및 결과에 덜 의존적이다. 유리 슬라이드에서 조직의 넓은 영역의 제거가 가능하지만, 그것은 훨씬 더 많은 시간을 소비하고 자주 뒤에 일부 잔여 조직을 떠난다. 여기에 도시 된 데이터는 충분한 양 및 품질 RNA의 정량적 PCR 측정을위한 이러한 절차를 이용하여 획득 될 수 있음을 보여준다. RNA 및 DNA도 강화 해부학 및 세포 해상도 혜택을 누릴 수 있습니다 마이크로 RNA, 단백질과 DNA의 후생 유전 학적 변화의 LCM, 분리 및 측정과 수집 된 가장 일반적으로 고립 조직에서 분자와 세포가 있지만 LCM을 사용하여 얻을.

Introduction

모든 조직은 세포의 이형 인구로 구성되어 있습니다. 이것은 신경 교세포 (올리고 덴드로 사이트, 성상 세포 및 미세 아교 세포)의 다양한 종류에 의해 둘러싸여 다양한 형태 학적 및 / 또는 별개의 뉴런 neurochemically 이루어진 뇌 조직에 특히 적합하다. 또한, 이러한 피질 또는 뇌간 핵의 영역으로 뇌의 특정 영역은 특정 기능을 가지고있다. 분석 기술 (예, Q-PCR 마이크로 어레이, RNA 시퀀싱 및 프로테오믹스)와 결합 따라서 능력은 현저 다양한 생물학적 과정에 대한 이해를 향상시킬 수있는, 세포 또는 매우 작은 해부학 별개 영역의 특정 개체군을 분리. LCM은 RNA, 마이크로 RNA, DNA 및 단백질과 같은 다양한 분자의 추가 분석을 위해 훨씬 더 균일 한 소스를 제공 현미경 슬라이드에 조직으로부터 매우 이산 해부 영역 또는 특정 세포를 분리하는 기능을 제공하는 기술이다.

t "> LCM 처음 도입 된 이래, 여러 가지 방법이 조직은 1-3 세포를 microdissect하는데 사용되어왔다. 초기 접근은 적외선 (IR) 레이저 및 열가소성 필름과 비를 사용하는 슬라이드 조직의 직접 연결을 포함 튜브에 세포 또는 조직과 모음을 분리, 레이저 절단, 자외선 (UV)을 사용하여 콘택트 법.이어서, LCM 성공적 조직 및 세포 유형의 다양한 사용 도시 한 하류 분석을위한 다양한 분자의 분리와 호환 될 효소 활성 1,4-7 포함한 RNA, 마이크로 RNA, DNA, 단백질을 비롯한. 여기서 LCM은 절삭 UV 레이저 및 세포 나 조직 주위 절단에 부착하기위한 캡쳐 IR 레이저를 사용하여 LCM 시스템을 사용하여 설명된다 LCM 캡 각각.이 LCM 시스템은 플라스틱 필름에 세포를 부착하고 t에서 제거 세포 또는 관심 조직 위에 캡에 플라스틱 필름을 용융 IR 캡처 레이저 모두 사용캡의 제거와 그가 조직 (그림 1). 또한, IR 레이저와 함께, UV 레이저 컷 아웃 할 조직 또는 다음 IR 레이저 (그림 2)를 사용하여 LCM 캡에 조직을 부착하여 절연 막과 슬라이드에 장착 조직에서 관심의 세포를 사용할 수 있습니다. 이들 기술에 대한 간단한 개요가도 1 및도 2에서 발견된다.

하나는 직접 면역 형광 및 특정 단백질의 발현에 기초하여 조직 영역의 분리를 위해 사용되는 간접 면역 유도 기술을 이용하여 특정 세포를 분리하기 위해이 기술에 대한 여러 변형들이 설명된다. 구체적으로는, 흑질 그리고 배쪽 피개 영역 및 신선 동결 뇌 조직으로부터 RNA의 분리 이후의 단리에서 도파민 신경 세포의 분리는 도시된다. 측정 RNA 분자의 가장 불안정한 바와 같이, 세인트 (DNA 또는 단백질에 비하여)RNA의 무결성을 유지하기 위해 분기 EPS가 포함 된 데이터를 얻을 RNA의 양과 질에 표시됩니다.

Protocol

참고 : 마우스의 뇌 조직이 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라 사용하고, 연구 프로토콜 미시시피 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

슬라이드 및 조직 1. 준비

  1. 실란 준비 슬라이드 또는 폴리에틸렌 napthalate (PEN) 막 유리 슬라이드를 사용합니다.
  2. RNA의 분리를 위해,의 RNase 염액 딥 슬라이드는, 다음의 RNA 분해 효소가없는 물을 3 회 세척을 30 분 동안의 RNase가없는 에탄올 및 진공 건조의 일련의 경사 탈수.
  3. 저온 유지 장치를 사용하여 10 μm의 두께로 조직 절편을 잘라 준비의 RNase 무료 슬라이드에 탑재합니다. RNA의 품질을 유지하기 위해 단면 동안 냉동 섹션을 유지합니다.
    참고 : 조직이 약 4mm 떨어진 슬라이드의 가장자리에 너무 가까이 조직을 제거 할 수 없습니다 LCM과 슬라이드의 가장자리에서 있는지 확인하십시오. 순으로 하였다r은 PEN 막 슬라이드로부터 조직을 제거 조직 왼쪽, 위쪽과 아래쪽에서 4mm 슬라이드에 부착되지 않은 멤브레인의 치수가 슬라이드의 오른쪽에서 7mm이다되도록.
  4. 실란 준비 슬라이드 또는 PEN 막 슬라이드 중 하나에 직접 면역 조직 화학, 섹션 조직을 사용하여 개별 세포 집단의 분리하십시오. 간접 면역 유도 기술을 사용하여 조직의 영역의 분리를 들어, LCM에 사용되는 PEN 막 슬라이드 및 / 또는 실란 준비 슬라이드 중 하나에 대한 면역 조직 화학 염색 및 대체 섹션에 대한 실란 준비 슬라이드에 섹션 중 하나 세트를 탑재합니다.

레이저 캡처 2. 조직 준비 - 면역 반응성 세포의 직접 레이저 캡처에 대한 신속한 티로신 하이드 록 면역 조직 화학

  1. 소수성 펜으로 조직 개요 건조 할 수 있습니다.
  2. 아세톤 - 메탄올 조직을 고정 (1 : 1) 10 분 동안 -20 ℃에서 용액.
    참고 : 오우R 경험은 아세톤, 메탄올 고정 혼자 아세톤, 메탄올보다 훨씬 더 일관성 면역 조직 화학 염색 결과 것으로 나타났습니다.
  3. 인산 린스 슬라이드 1 % 트리톤 (의 RNase 무료)와 식염수 (PBS)를 버퍼.
  4. 400 U / ㎖ RNasin 100 : 티로신 수산화 항체와 1 % 트리톤과 100 ~ 200 μl의 PBS와 커버 섹션 1을 희석. 5 ~ 10 분 동안 품어.
  5. 짧게 두번 PBS에 세척하여 PBS-1 % 트리톤.
  6. 100 PBS-1 % 트리톤 400 U / ㎖ RNasin 50 NG / ㎖ DAPI와 : 1 희석 알렉사 플 루어 488로 표지 염소 항 - 토끼 IgG에의 100 ~ 200 μL로 조직을 커버. 5 분 동안 품어.
  7. PBS로 2 회 씻어 것은 다음의 RNase 무료 에탄올의 등급 시리즈 30의 탈수 (75 % -75 % -95 % -95 % -100 % -100 %).
  8. 다음 1 분 5 분 동안 크실렌의 두 세척에 품어.
  9. 직전이 LCM에 사용하는 공기 건조되도록 크실렌에서 슬라이드를 제거합니다.

레이저 캡처 3. 조직 준비 - 티로신면역 반응성 지역의 간접 레이저 캡처를위한 수산화 면역 조직 화학

  1. 섹션에 인접한 섹션이 처리 한 슬라이드 실란 - 준비 및 / 또는 면역 조직 화학 염색에 대한 PEN 막 슬라이드에 장착.
    참고 : 여기에 사용 된 절차 이전에 5를보고 유사하다. 시범 이미지의 경우, 디아 미노 벤지딘 (DAB) 크로마 반응 관심 티로신 수산화 뉴런를 시각화하는데 사용되었다.
  2. LCM에 사용되는 슬라이드를 들어, 4 ° C에서 100 % 아세톤 5 분 동안 고정한다.
  3. 의 RNase 무료 에탄올의 등급 시리즈에서 조직을 탈수 (75 % -75 % -95 % -95 % -100 % -100 %)을 각각 1 분합니다.
  4. 다음 1 분 5 분 동안 크실렌의 두 세척에 품어.
  5. 직전이 LCM에 사용하는 공기 건조되도록 크실렌에서 슬라이드를 제거합니다.

4. 레이저 캡처 이외에 Microdissection 시스템 사용

참고 : LCM 응용 프로그램은 10 도구 바을 제어하는​​ 2 창문이미세 절제 절차. 도구 모음 : 1. 현미경, 2. 캡처 레이저, 3 절단 레이저, 4. 연구, 5. 탐색, 6. 재료, 7. 캡처 그룹, 8 이외에 Microdissection, 9 글꼴, 10 주석. 윈도우 : 1. 라이브 비디오 및 2 도로지도.

  1. LCM 시스템 소프트웨어의 재료 도구 모음에서 "문을 열고"탭을 선택하여 문을 엽니 다.
  2. 세 가지 사용 가능한 슬롯에로드 슬라이드. 이 데모를 들어, 티로신 수산화 효소 면역 조직 화학 염색과 부하 하나의 슬라이드는 DAB, 하나 실란 준비 슬라이드 한 PEN 막 슬라이드 빠른 형광 티로신 수산화 효소 면역 표지 각각 시각. 전형적인 실험에서, 직접 레이저 캡처를위한 형광 티로신 수산화 효소로 표지 티로신 DAB를 사용하여 수산화 또는 슬라이드 표지 참조 슬라이드 중 하나 레이블이없는 아세톤 고정 섹션을 사용합니다.
  3. 사용 가능한 슬롯에 LCM 캡을로드합니다.
    참고 : 매크로 및 HS LCM 모자가 사용할 수 있습니다. LCM 캡의 형태는 데 사용하는세포 나 조직의 양의 수에 따라 좌우된다 수집한다. 매크로 슬라이드 HS 캡 수백를 수집 할 수 있습니다 동안 수천 개의 셀을 수집 나열되어 있습니다. 매크로 슬라이드는 더 조직 수집을 허용하지만, 용해 버퍼의 50 μl를 필요로한다. 어댑터와 함께 사용할 경우 HS 캡, RNA의 큰 비례 ​​복구 할 수 있습니다 용해 버퍼의 10 μl를 필요로한다.
  4. 문을 닫습니다.
  5. 전체 슬라이드의 작업 뷰를 제공하는 도로지도 창을 활성화 할 수있는 슬라이드를로드,이 (그림 3) 관심의 영역을 선택할 수 있습니다. 관심 영역으로 이동 라이브 비디오 창에 도로지도를 볼 수 있습니다.
  6. 재료 도구 모음에서 슬라이드 슬롯 위의 상자를 선택하여 PEN 막 슬라이드를 식별합니다. 캡 속성을 제공하려면, 오른쪽 재료 도구 막대에서 모자를 클릭하고 "캡 공급 속성"을 선택합니다. 캡의 위치를​​ 나타내는 상자를 확인하고 어느 엄마 선택CRO 또는 HS 모자.
  7. 형광 램프를 켜고 형광 램프가 예열 ​​수 있도록 현미경 도구 모음에서 "형광"탭을 선택합니다. 각각 알렉스 형석 488 및 DAPI를 시각화하기 위해 블루와 UV 필터를 사용합니다. 형광 표지 된 세포를보기 위해 이미지의 감도를 높이기 위해 "카메라 설정"탭을 사용하십시오.
  8. 재료 도구 모음에서 마우스 오른쪽 캡을 클릭하고 원하는 슬라이드로 이동합니다. 라이브 비디오 창에 표시되는 영역을 선택할 수있는 도로지도에 위치를 더블 클릭합니다. 도로지도 영역 (더블 마우스 왼쪽 버튼을 클릭) 다음은 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 선택을 선택하여 슬라이드에 주위 뚜껑을 이동 "중앙 지역에 배치 캡을."
  9. IR 캡처 레이저를 사용하기 전에 목표로 강도를 조절합니다. 멀리 조직에서 슬라이드의 영역에서 뚜껑을 놓습니다. 캡처 레이저 도구 모음에서 "사용"을 선택합니다. 전원 (3-100 MW), 펄스를 조정 (100-1000000 μ; 초) 레이저의 # 조회수. 캡 조직없이 슬라이드의 일부 위에있을 때 IR 레이저를 발사 레이저 충분히 LCM 캡 막 녹아 있는지 확인합니다.
    참고 : 캡에 고분자막 녹는이라고 습윤에 접촉 유리 슬라이드 있도록. 어두운 반지 명확 링 (충분하고 부족 용해의 예를 그림 4 참조)의 중심에 슬라이드 융합으로 충분한 습윤 볼 수 있습니다. 습윤성이 충분하지 않으면이 달성 될 때까지, 다시 전력 및 펄스 및 테스트 화재를 조정. 또한, 레이저의 다수의 화재가 또한 사용될 수있다.
  10. IR 레이저 강도를 조절하면 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 레이저를 목표로 "캡처 레이저가 여기에있다"를 선택합니다.
    참고 :이 단계는 IR 캡처 레이저가 조직을 대상으로 컴퓨터를 알려줍니다. 레이저 조준이 단계는 매우 중요하며, 캡이 이동 될 때마다 반복 될 필요 또는 목적은 변경된다.
  11. 실란 준비 슬라이드 오프 개별 도파민 뉴런의 5. 레이저 캡처 이외에 Microdissection

    1. 세포를 캡처하는 관심 영역으로 이동합니다.
      참고 : 분리 도파민 신경 세포의 예는 여기에 표시됩니다.
    2. 실란 준비 슬라이드 오프 개별 셀을 캡처하려면, 이외에 Microdissection 도구 모음에서 다음 "단일 지점"아이콘 "LCM"탭을 선택합니다.
    3. 현미경 도구 모음에서 해당 필터를 선택하는 형광 필터 탭이있는 형광 밝은 필드 사이를 전환 할 "셔터"탭을 사용하여 배율을 변경하려면 목표 탭을 사용합니다. 관심 셀 라이브 비디오 윈도우에 표시되면, 셀의 대략적인 크기를 관심 세포를 표시하는 데 사용 스폿 크기를 조정한다. 다음 반대쪽을 클릭하여 다음에 스테인드 셀의 한면을 클릭 캡처 레이저 도구 모음에서 스팟 탭을 클릭하여이 작업을 수행합니다.
      참고 :이를 계산현장의 직경은 값을 표시합니다.
    4. "단일 지점"아이콘을 선택한 상태에서 그들을 클릭하여 관심의 세포를 표시합니다. 각 셀에 자리 마커를 배치하는이 작업을 수행합니다. 여기에, 블루 필터와 10 배의 목적은 도파민 신경 세포를 시각화하는 데 사용됩니다. 다시 테스트 및 단계 4.9과 4.10에 설명 된대로 그 아래에는 조직이없는 경우 캡에 IR 레이저를 목표로하고 있습니다.
    5. 자동으로 선택되는 모든 표시 셀을 발광하는 이외에 Microdissection 도구 모음 및 IR 레이저에 탭 - 세포가 표시되면, "컷 캡처 이동"을 선택합니다. 필요한 경우 또한, 관심의 포인트 (그림 5D)에서 수동으로 IR 레이저를 발사.
    6. 세포가 LCM 캡에 캡처 된 경우 확인하기 위해 멀리 섹션에서 슬라이드의 개방 영역 위에 캡을 이동합니다. 관심의 세포가 슬라이드 (그림 5B, E)에서 제거되고 LCM 캡 (그림 5C, F)에 제대로 연결되어 있는지 확인하십시오. 문서 일현미경 도구 모음에서 "캡처 이미지"탭을 클릭하여 과정이다.
    7. 조직을 수집이 완료되면, 캡을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 캡을 제거하고 "로 이동"을 선택 "언로드."

    PEN 막 슬라이드 오프 개별 도파민 뉴런의 6 레이저 캡처

    1. IR 및 UV 레이저를 모두 사용하여 PEN 막 슬라이드 오프 개별 셀을 캡처하려면 "잘라 캡처"이외에 Microdissection 도구 모음에서 탭을 선택합니다. 관심의 세포를 표시하는 "단일 지점"탭을 선택합니다. 각 셀의 윤곽을 "컷 라인"탭을 사용합니다. 단계 4.9과 4.10에 설명 된대로 IR 레이저를 테스트해야하고 생각 잘라 필요한 최소한의 강도 PEN 막 및 조직 결정하기 위해 UV 레이저를 테스트 (그림 4, 5)
    2. 이외에 Microdissection 도구 모음에 "캡처 및 절단"탭을 선택합니다. 이 기술을 사용하여 개별 세포를 수집 할 때,이 될그들은 LCM 캡에 부착되기 전에 잘라 경우 먼저이 작은 조각으로 UV 레이저 뒤에 IR 레이저를 발사 할 수 있는지가 손실 될 수 있습니다.
      주 :이 프로세스는 또한 관심의 지점에서 IR 레이저를 발사하여 수동으로 수행 될 수 있고, 세포가 개별적 UV 레이저로 설명했다.
    3. 세포를 제거하고 캡 (그림 6)에 부착되었는지 확인하는 단계 5.7에서 상술 한 바와 같이 관심있는 세포를 수집 한 후, LCM 캡을 이동합니다.
    4. 조직을 수집이 완료되면, 오른쪽 캡을 클릭하고 선택하여 캡을 제거하고 "로 이동" "언로드."

    7. 실란 준비 슬라이드에서 복부 피개 영역 캡처

    1. 관심 영역을 식별하기 위해 면역 조직 화학 염색을 위해 처리 슬라이드를 사용합니다.
      참고 : 복부 피개 영역이 격리 된이 데모 (그림 7A)를 참조하십시오.
    2. LCM 뚜껑을로드하고 단계에서와 같이 레이저를 테스트4.9 및 4.10에요.
      주 : 일반적으로, 매크로 LCM 캡이 사용되지만, HS 캡도 (도 8 참조)를 사용할 수있다.
    3. 이외에 Microdissection 도구 모음에서 "LCM"탭을 선택, 실란 준비 슬라이드에서 조직의 영역 (즉, 복부 피개 영역)을 분리하려면 다음 "다각형 외부"탭을 선택합니다. 라이브 비디오 창에서 관심 영역을 설명합니다. 수집을위한 영역의 크기의 따라, 낮은 배율 (배 목표)에서 관심 영역을 설명합니다. 컬렉션을 위해, 그러나, 장비는 10 배 목표는 그래서 조정하고 촬영에 10 배 목표 아래 IR 레이저를 이전을 목표로 사용합니다.
    4. 이외에 Microdissection 도구 모음에서 - "캡처 및 절단 이동"탭을 선택합니다.
      참고 : 컴퓨터가 자동으로 전체 선택 영역 (그림 7 층, I)를 통해 IR 레이저를 발사합니다. LCM 막을 영역에 걸쳐 충분히 용융되어 있지 않은 경우, 레이저는 사람을 소성 될 수있다단계적 또는 전체 과정을 반복.
    5. 조직이 수집 얼마나 잘 결정하기 위해 조직의 오프 LCM 캡을 이동합니다.
      참고 :이 방법을 사용하여 하나의 패스는 일반적으로 슬라이드 (Figure7G 참조)에 뒤 일부 조직을 떠난다. 이 경우, 상기 선택을 반복하고 상기 단계를 캡처. 이 단계를 반복하면 (도 7J) 수집 된 조직의 양을 증가시킬 수있다.
    6. 조직을 수집이 완료되면, 오른쪽 캡을 클릭하고 선택하여 캡을 언로드하고 "로 이동" "언로드."

    8. PEN 막 슬라이드에서 복부 피개 영역 캡처

    1. 상기와 PEN 막 슬라이드에 조직에서 관심 영역을 선택하는 가이드로 면역 조직 화학 염색을 위해 처리 슬라이드를 사용합니다.
    2. 이외에 Microdissection 도구 모음에서 "잘라 캡처"탭을 선택합니다. "컷 라인"탭을 선택하고 immunohistoche를 사용하여 관심 영역 개요Mistry의 지침으로 슬라이드를 표시.
      참고 :이 프로그램은 자동으로 뚜껑에 조직을 첨부 할 IR 레이저에 대한 지점을 추가합니다. 더 나은 상한에 조직을 확보하기 위해 추가로 지점을 추가하려면 "단일 지점"탭을 사용합니다.
    3. 10X 목적, 시험 화재에서 4.9과 4.10에 설명 된대로 IR 및 UV 레이저를 목표로하고 있습니다. UV 레이저 슬라이드 컷이 컴퓨터 화면상의 위치에 대응하는 것을 막을 수 있다는 침투 테스트한다. 막과 조직을 잘라 단지 충분하지만, 조직 (그림 5)에 손상을주지 않는 UV 레이저 강도를 사용합니다.
    4. 이외에 Microdissection 도구 모음에서 - "캡처 및 절단 이동"탭을 선택합니다.
      참고 : 컴퓨터가 자동으로 다음 뚜껑에 부착 슬라이드 PEN 막 조직 (그림 7C)를 절단하는 UV 레이저를 발사 조직 내의 모든 표시된 지점에서 IR 레이저를 발사합니다. 추가 IR 용융 점이 충분히 아시고을 첨부 할 필요가있다또한 수동으로 추가 할 수있는 LCM 캡에 소송을 제기.
    5. 조직 섹션 (그림 7C)에서 제거하고 캡 (그림 7C)에 부착 된 경우 결정하기 위해 조직의 오프 LCM 캡을 이동합니다.
    6. 조직을 수집이 완료되면, 오른쪽 캡을 클릭하고 "로 이동"을 선택, 캡을 제거하는 방법 "을 언로드."

    RNA 9. 분리

    1. 캡처 된 세포 또는 조직으로부터 RNA를 수집하기 위해, 37 ° C에서 30 분 동안 RNA 용해 완충액 LCM 캡 막을 배양한다.
      주 : HS 캡용, 어댑터 뚜껑에 용해 완충액 10 μL의 사용을 허용하고, 0.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에 부착이 가능하다. 매크로 캡은 용해 완충 용액 50 μL을 필요로하고, 0.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에 직접 부착.
    2. 배양 후, 0.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브로 다운 용해 버퍼 스핀.
    3. O 모든 세포의 완전한 용해를 보장하기연구 조직, 용해 버퍼의 캡과 장소의 LCM 캡 막 떼어.
    4. RNA 무결성을 테스트하기 위해 사용 RNA는 LCM은 RNA의 무결성을 측정 한 후 슬라이드에 남아있는 조직에서 분리.
      참고 : LCM 얻어진 제한된 샘플 RNA하기 위해서는 LCM 절연 RNA에서 RNA의 무결성을 테스트하는 통상적 실용적이지 인해 그러나 나머지 조직으로부터 RNA 인해 동안 고정, 면역 조직 화학 및 시간에 임의 RNA 분해의 좋은 지표를 제공한다 LCM 절차.

Representative Results

도 6 및도 7의 현미경 사진은 개별적 도파민 뉴런의 절연을위한 능력을 입증한다. 일관 LCM에 제조 할 수있는 최소 스폿 사이즈가 셀을 분리 캡으로 전류 해부학 분해능은 약 5 ~ 10 ㎛,이다. 특정 세포 유형의 분리를위한 유일한 제한 세포를 시각화 할 수있는 능력이다. LCM 개별 도파민 신경 세포를 분리 할 수​​ 있지만, 인접 레이블이없는 세포의 일부의 오염은 대부분 발생합니다. 따라서, 최종 샘플은 도파민 뉴런의 농축 수집하지 도파민 뉴런의 순수한 인구이다. 또한이 기술 복측 피개 영역의 분리와 같이 같은 뇌 내의 이산 또는 핵 영역으로서 조직의 작은 영역을 분리 할 수​​있다. 이전 출판물은 뇌 조직이 사용을 시연뿐만 아니라 정상 조직 5,11에서 병적 인 조직을 분리.

(도 9)와 비교 하였다. RNA 품질은 뇌 전체 RNA에 비해 아세톤 고정 (RIN 2.6) 다음 면역 조직 화학 염색 후 낮은 무결성 LCM에 사용되는 조직에서 RNA 샘플 (RIN 사용할 수 없음)에서 감소의 상대적 감소에 의해 알 수있는 바와 같이 (RIN 8.2) S18 피크에 비해 S28 rRNA의 피크의 높이. 그러나, RNA는 18S 및 28S 밴드를 유지 유전자 발현은 Q-PCR을 이용하여 측정 될 수있다.

(도 10a)로부터 단리 하였다. Q-PCR, 역전사 된 도파민 뉴런에서 뇌 전체 RNA 및 RNA의 농도 범위 및 이전에 기술 된 바와 같이 5 Q-PCR을 이용하여 측정 하였다 β 액틴 유전자 RNA의 양을 측정 하였다. 이러한 측정에 기초하여, 3.55, 6.82 및 20.58 PG / μL의 농도를 50, 100, 200, 도파민 뉴런 각각 (도 10b)으로부터 계산 하였다.

도파민 신경 세포의 분리는 전체 V의 절연에 비교하는 방법을 설명하기 위해entral LCM과 피개 영역, 도파민 신경 세포의 특정 유전자 (Nurr1, 티로신 수산화, 도파민 수송은) 샘플의 이러한 두 가지 유형의 Q-PCR로 측정 β - 굴지의 표현 (그림 11)에 비교 하였다. 낮은 C의 t 값이 목적 유전자의 높은 농도로 생성되기 때문에, ΔC t의 감소는 β 액틴을 기준으로 한 ​​도파민 신경 세포의 유전자 발현 증가를 나타낸다. 이것은 개별 도파민 뉴런의 격리 도파민 뉴런 특이 유전자의 발현을 농축 방법을 설명한다. 복부 피개 영역 샘플에서 도파민 신경 세포의 특정 유전자는 β-액틴을 표현하지만 도파민 신경 세포의 유전자를 발현하지 않는도 수집됩니다 다른 세포 (비 도파민 성 신경 세포와 신경 교세포)로서 희석된다.

그림 1

그림 2
적외선 (IR) 캡처 레이저 및 자외선 (UV) 레이저 절삭을 사용하여도 2 레이저 캡처. 조직의 큰 영역을 취득 또는 UV 레이저를 사용하여 세포의 복구를 용이하게하기 위해, 조직은 멤브레인 슬라이드에 장착된다 외측 모서리 (PEN 막 슬라이드)을 따라 슬라이드 접속. LCM 캡 t에 위치그 조직 및 IR 캡처 레이저 캡 막을 용융 LCM 캡에 조직을 연결하는 데 사용된다 (단계 1 및 2). UV 절단 레이저이어서 슬라이드 막 및 캡 조직 슬라이드에서 제거 LCM 캡 (단계 5)에 잔류되어 제거되면되도록 조직 (단계 3 및 4)을 절단하는 데 사용된다.

그림 3
레이저 캡처 이외에 Microdissection 시스템 로드맵 3. 그림.이 레이저 캡처 이외에 Microdissection 시스템은 한 번에 3 슬라이드를위한 공간이 마련되어 있습니다. 슬라이드가 현미경에로드 할 때, 각각의 슬라이드에 대한 낮은 배율 도로지도 이미지가 생성됩니다. 로드맵 이미지 영역을 선택하면 해당 지역에 라이브 이미지 창을 이동합니다. 데모 용으로, 마우스 중뇌 3 슬라이드에 10 μm의 섹션으로 구분되었다. 첫 번째 슬라이드는 티로신 수산화 immunoreactivi 표지되었다TY는 크로마 (A)로서 사용하는 디아 미노 벤지딘. 절편을 준비 실란 슬라이드 (B) 또는 PEN 막 슬라이드 (C) 중 하나에 장착 하였다. 이 슬라이드는 모두 빠른 형광 티로신 수산화 효소 면역 조직 화학 염색을 사용하여 표시 하였다. (C)의 화살표는 유리 슬라이드에 PEN 멤브레인의 첨부 파일을 나타냅니다. 이 경계 밖에있는 조직 LCM으로 수집 할 수 없습니다.

그림 4
도 4 캡처 IR 레이저를 사용. IR 캡처 레이저 LCM 캡에 부착하고 조직을 조직의 나머지 부분에서 제거 LCM 캡 막을 용융하기 위해 사용된다. IR 캡처 레이저는 기본 조직과 유리 슬라이드에 문의 충분히 LCM 캡 막 녹기 충분한 강도에 있어야합니다. 레이저 막을 용융 불충분 할 때 위의 그림은 보여슬라이드 (두 지점을 왼쪽). 용융 막을 유리 슬라이드를 터치하면, 두꺼운 검은 윤곽 (오른쪽 자리)를 관찰 할 수있다. 레이저의 강도는 전력 (3-100 MW), 펄스 (100-1,000,000 μ 초) 및 레이저 # 적중 변경하여 조정할 수있다. 또한, 또한 더 막 녹아 수의 같은 지점에 IR 레이저의 발사 반복했다. IR 레이저의 목적은 언제 LCM 캡 이동하거나 조정할 목적이 변경 될 때 필요하다. 스케일 바 = 100 μm의.

그림 5
그림 5. 레이저 절단 UV를 사용. UV 절단 레이저 펜 막과 조직을 절단하는 데 사용됩니다. 막을 통해 잘라내어 UV 레이저가 조직 손상 될 수 조직 결정해야하는 데 필요한 최소한의 강도를 사용하기 전에. 위의, 다른 UV 레이저 강도의 세 지점 (화살표)을 함께 나타낸다 10 μm의 섹션 두꺼운 부분의 중간 지점과 너무 높은 UV 레이저 강도를 보여주는 정확한 지점에 대한 충분한 왼쪽 자리 크기입니다. 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
그림 IR 레이저를 사용하여 티로신 수산화 효소 면역 반응 신경 세포의 6. 직접 분리. 도파민 뉴런 티로신 수산화 (A)에 대한 빠른 형광 표지 한 후 표시됩니다. IR 레이저 이들 뉴런 (D)를 통해 LCM 캡 막을 용융 실행될 때, 캡 제거하여 슬라이드 (B, E)이 떨어져 세포 픽업. LCM 캡 (C, F)에 부착 이러한 신경 세포는 시각화 할 수 있습니다. 스케일 바 = 250 μm의.= "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig6large.jpg"대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7
그림 IR 및 UV 레이저를 사용하여 PEN 막 슬라이드에서 티로신 수산화 효소 면역 반응 신경 세포의 7. 직접 분리. 티로신 수산화 레이블 뉴런이 (가) 표시됩니다. 이들 뉴런은 IR 레이저를 사용하여 LCM 캡에 부착되고, UV 레이저 (B)를 사용하여 PEN 막 슬라이드로부터 절단 될 수있다. 스케일 바 = 250 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8
간접 그림 8. 티로신 수산화 효소를 사용하여 면역 복측 피개 영역의 아이솔레이션. 복측 피개 영역에서 도파민 뉴런의 위치는 표준 면역 조직 화학 기술 (A 및 E)를 사용하여 섹션으로 시각화 하였다. 이 섹션은 면역 표지 흠 인접한 섹션 (B 및 F)의 복측 피개 영역을 찾기 위해 주형으로 사용 하였다. UV 레이저를 사용하여, 복측 피개 영역은 IR 레이저와 LCM 캡에 부착되고, UV 레이저 (C 및 D)과 함께 슬라이드로부터 절단 및 HS LCM 캡 (D)에 부착 된 것으로 도시되어 있었다. 단지 IR 레이저를 사용하는 실란 대비 슬라이드에서 분리 배쪽 피개 영역은 매크로 캡 (FK)에 부착되어 도시된다. 두 개 이상의 시도가이 지역 (G와 J 비교)에서 조직의 대부분을 수집하기 위해 필요하다고합니다. 스케일 바 = 500 μm의.PLOAD / 52336 / 52336fig8large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9
그림 9. RNA 품질. 대표 electropherograms 시판 뇌 전체 RNA (A)와 RNA 아세톤 고정 및 LCM (B) 이후 섹션에서 격리 또는 빠른 형광 티로신 수산화 효소 면역 조직 화학 및 LCM (C)의 관련 젤 이미지. RNA의 질이 뇌 전체 RNA에 비해 면역을 위해 처리 섹션에서 감소 하였지만, electropherograms는 rRNA의 S18 및 S28의 피크의 존재에 기초하여 대부분 그대로 RNA를 보여준다. 전체 뇌 RNA 농도는 8.2의 RIN과 6.487 페이지 / μL였다. 아세톤 고정 조직의 RNA 농도는 2.6 RIN과 5.036 페이지 / μL였다. RNA는 면역 조직 화학 시간 후 획득 광고 4.474 PG / μL 및 RIN의 농도는 사용할 수 없습니다.

그림 10
도 10 RNA 량이. LCM 얻은 신경 세포 RNA의 양을 결정하기 위해, RNA 농도를 표준 곡선과 fluorospectrometer Q-PCR을 사용하여 제조 하였다. fluorospectrometer 측정 (A)의 경우, 큰 그래프는 RNA의 양의 더 높은 범위를 표시하고 작은 그래프는 10 페이지 / μL에 이르기까지이 분석의 감도를 보여줍니다. 50, 100, 200 도파민 신경 세포에서 얻은 RNA의 농도는 각각 17.3, 24.8 및 50.9 페이지 / μL였다. RNA 량 (B)을 측정하는 Q-PCR을 사용하여, RNA의 농도는 50, 100, 200, 도파민 뉴런에서 얻은 각각 3.55, 6.82 및 20.58 PG / μL이었다.

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개별 도파민 신경 세포의 분리와 도파민 신경 세포의 특정 유전자의 그림 11. 농도. 도파민 신경 세포의 샘플에서 도파민 신경 세포의 특정 유전자 (Nurr1, 티로신 수산화, 도파민 수송) 및 β - 굴지 사이의 C t (ΔC의 t)의 차이 LCM 절연 복측 피개 영역에 표시되는 전체 복측 피개 영역의 해부에서의 발현에 비해. 낮은 C의 t 값이 목적 유전자의 높은 농도로 생성되기 때문에, ΔC의 t의 저하 것 β 액틴 다른 세포 (비 도파민 성 뉴런 및 신경 교세포)와 같은 상대적으로 도파민 신경 세포의 유전자 발현 증가를 나타낸다 β - 굴지을 표현하지만 도파민 신경 세포의 유전자를 발현하지 않는 복부 피개 영역 샘플에서 수집 될 수있다.

Discussion

LCM은 현미경 슬라이드와 RNA, 마이크로 RNA, DNA와 단백질의 후속 분리에 세포 또는 조직 섹션에서 조직의 영역의 분리 된 인구의 해부를위한 강력한 기술이다. 이러한 기법의 감도가 향상하고 필요한 출발 물질의 양이 감소됨에 따라 이러한 마이크로 어레이, 차세대 RNA 서열 분석, DNA 및 단백질 체학의 후생 유전 학적 분석 높은 처리량의 기술을 사용하여 분석과 조합 LCM의 사용은 더 많은 공통 있다는 8-12. LCM으로 해부학 나은 해상도 샘플에 대해 달성되고, 이들 샘플에서 측정 하류 이해가 크게 향상된다. 하나주의와 LCM은 관심 셀 필수적이지는 않지만 세포의 순수 인구 농축 샘플을 제공한다는 것이다. 정밀도의 한계는 인접 조직에서 일부 오염이있을 것이다 것을 의미한다. 그러나,이 방법은 관심있는 세포를 농축하지조직 및 주변 세포와 관련된 영향을 최소화하고 관심 세포 실험 효과를 극대화한다.

간접 면역 대 직접

LCM은 그대로 유지 RNA, RNA 분리 및 측정을 위해 주로 이용되기 때문에 매우 중요한 기준이다. RNA의 무결성을 유지하는 것은 (그림 10) RNA를 분해 할 수있는 직접 조직을 얼룩의 필요성을 제거 조직 절제술을 안내하는 간접 면역 조직 화학 염색의 사용 뒤에 주요 근거이다. 실험 문제는, 그러나, 도파민 신경 세포와 같은 세포의 특정 인구의 격리를 필요로하는 경우, 직접 형광 면역 조직 화학 염색이 필요합니다. 신속한 면역 라벨링 프로토콜을 사용하는 과정 중에 RNA의 분해를 최소화 할 수있다. 짧은 배양 시간은 일차 및 이차 항 고농도의 사용에 기인몸은 약 10 ~ 20이다 농도는 2 시간 배양와 기존의 면역 조직 화학 염색에 필요한 것보다 더 높은 배. 그러나, 더 긴 인큐베이션 시간이 필요한 경우, 갈색 및 스미스 RNA 분해를 억제하고 긴 배양 시간 (20 시간까지) 13 양질 RNA를 수득 고염 완충제를 사용했다. 이 방법은 또한 시스템에 LCM 조직의 라벨링 및 점점 접근 사이에 필요한 상당한 시간이 있으면 이용할 수있다.

PEN 막, 실란 준비 및 코팅 유리 슬라이드 - 슬라이드의 선택

LCM 용 코팅 유리 슬라이드의 사용은 14보고되었다. 이 코팅은 충분히 조직의 손실없이 면역 조직 화학 염색에 대한 슬라이드로 조직을 첨부 여전히 슬라이드에서 LCM 캡에 조직의 부착 및 제거 할 수 있습니다 우리의 실험실에서, 실란 준비 슬라이드, 최적의 선택이 발견되었습니다 . 비 코팅 유리 슬라이드는이면역 절차와 몇몇 조직 손실을 보였다. 간접 면역 조직 화학에 사용하는 경우, 그러나, 조직 유지율은 이하의 문제가된다. 실란 준비 슬라이드 오프 적절한 탈수, 캡처 세포 나 조직에 문제가되지 않았습니다. 이 문서에 설명 된 분리 뉴런이나 뇌 영역에 대한 다양한 접근 방법 각각의 장점과 단점이 있습니다. 개별 도파민 뉴런의 분리를 위해, 슬라이드 준비 실란의 사용은 더 나은 광학의 장점을 가지고 있으며, PEN 막 슬라이드보다 저렴하다. 이 부족 탈수 (아래 참조) 일부 조직을 슬라이드에 남아있을 수 있습니다 경우 단점은 때때로 캡처 세포가 어려울 수 있다는 것입니다. PEN 막 슬라이드의 장점은 IR 레이저 및 UV 레이저의 조합을 사용하는 도파민 신경 세포가 수집되는 것을 보장한다는 것이다. 는 유리 슬라이드에 비해 탈수에 덜 의존으로 PEN 막 슬라이드에서 세포를 수거하지 않으면 거의 결코 발생하지 않습니다. 추가적인 장점은 IR 레이저 유리 슬라이드 오프 뉴런 캡처 원에 비해 UV 레이저, 더 밀접 뉴런 관심의 형상을 근사화하는데 사용될 수 있다는 것이다. 조직의 분리를위한 영역, PEN 막 슬라이드는 훨씬 우수하며, 추가 비용을 정당화. 막에 잘라 모든 조직의 완전한 제거에서 이러한 접근 결과, 단독 IR 레이저를 사용하여 두꺼운 조직 절편이 수집 될 수 조직의 큰 영역을 캡처보다 훨씬 빠르다. 단지 IR 레이저를 사용하여 LCM 캡 막을 완전히 조직 전체 영역에 걸쳐서 용융해야. 또한, 조직의 불완전한 컬렉션 전형적인이며 일반적으로 여러 시도가 필요합니다. 이 PEN 막 슬라이드로부터 조직을 단리 이상 소요되지만 가능한 티슈 유리 슬라이드 또는 UV 레이저 켜져있는 경우에는, 조직의 대부분이 (도 8J) 수집 될 수 있으므로이 가능한 옵션이고, 사용할 수 없습니다.

ove_content "> 중요한 단계

100 % 에탄올 인큐베이션 가장 중요한 단계 중 하나이다. 실란을 준비 슬라이드으로부터 세포를 수집하기 위해 조직의 완전한 탈수가 필요하다. 따라서, 100 % 에탄올 배양과 주로 관련이 제거되지 않은 물, 슬라이드에서 세포를 픽업 할 수있는 능력에 영향을 미칠 것입니다. 이 문제를 해결하기 위하여, 자주 탈수에 영향을 미칠 수있는 이전 세정 단계로부터의 공기 또는 전사에서 물의 흡수로서 100 % 에탄올 용액을 변경. 또한, 분 자체는 수질 오염을 흡수하는데 사용된다. LCM 시스템은 이상적으로 낮은 습도 조건을 유지하기위한 제습기와 작은 방에 위치되어야한다.

좋은 저온 유지 섹션은 적절한 LCM을 위해 중요하다. 섹션 최소화 조직에 주름 평평해야합니다. LCM 캡 사이의 거리를 증가시키고 t 접촉되는 것을 방지 할 조직 폴드그는 조직. 그러므로 충분히 조직 상 막 캡을 용융하는 것이 곤란해진다. 유리 슬라이드의 경우, 일반적으로 부분 두께 6 ~ 12 μm의 사이에 있어야합니다. 두꺼운 섹션은 PEN 막 슬라이드로 캡처 할 수 있습니다.

LCM은 현미경 슬라이드에서 매우 정확한 조직의 해부 및 세포를 만들 수있는 기술 능력을 제공합니다. 조직 조각의 총 해부에 비해 극적으로 더 이것은 분석의 해상도를 증가시킨다. LCM 시간과 노동 집약적 일 수 있지만, 광범위한 교육이나 전문 지식을 필요로하지 않으며, 다른 높은 처리량의 기술과 결합 할 때 개별 세포 또는 해부학 적 영역이 사용되는 경우, 크게 생물학적 과정에 대한 이해를 향상시킬 수있다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Veritas Laser Capture Microdissection System Life Technologies, Grand Island, NY Newer model is now sold
CapSure Macro LCM Caps Life Technologies, Grand Island, NY LCM0211
CapSure HS LCM Caps Life Technologies, Grand Island, NY LCM0213
PEN Membrane slides Life Technologies, Grand Island, NY s4651
Silane prep-slides Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S4651
95% Ethanol-RNase Free Sigma-Aldrich, St. Louis, MO E7148
100% Ethanol-RNase Free Sigma-Aldrich, St. Louis, MO E7023
Rnase Free Triton Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T8787
Molecular Sieve EDM Millipore, Billerica, MA MX1583D
Anti-Tyrosine hydroxyase antibody EDM Millipore, Billerica, MA Ab152
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Life Technologies, Grand Island, NY A-11008
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies, Santa Clara, CA G2939AA
Stratagene MX 3005P Agilent Technologies, Santa Clara, CA 401513
Nanodrop 3300 fluorospectrometer Thermo Scientific
Quant-iT RiboGreen Life Technologies, Grand Island, NY R11490
RNaseZap Life Technologies, Grand Island, NY AM9780

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References

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