लेजर कैद Microdissection - व्यक्तिगत डोपामिन न्यूरॉन्स के अलगाव और पूरे उदर tegmental क्षेत्र के एक प्रदर्शन

Neuroscience
 

Summary

व्यक्तिगत डोपामाइन न्यूरॉन्स के अलगाव या प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष immunohistochemistry के साथ उदर tegmental क्षेत्र लेजर कब्जा microdissection का उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया है। एक अवरक्त लेजर का उपयोग कर एक गिलास स्लाइड से ऊतक के अलगाव के लिए और एक अवरक्त और पराबैंगनी लेजर के संयोजन का उपयोग कर झिल्ली स्लाइड से मापदंडों पर विचार-विमर्श कर रहे हैं।

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Kummari, E., Guo-Ross, S. X., Eells, J. B. Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area. J. Vis. Exp. (96), e52336, doi:10.3791/52336 (2015).

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Abstract

लेजर कब्जा microdissection (एलसीएम) एक खुर्दबीन स्लाइड पर व्यक्ति की कोशिकाओं या ऊतक वर्गों से ऊतक की सटीक संरचनात्मक क्षेत्रों में से एक केंद्रित आबादी को अलग-थलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है। Immunohistochemistry के साथ संयुक्त, एलसीएम एक विशिष्ट प्रोटीन मार्कर के आधार पर व्यक्ति की कोशिकाओं प्रकार अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इधर, एलसीएम तकनीक सीधे tyrosine hydroxylase immunohistochemistry के साथ और एलसीएम के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों से सटे एक खंड पर अप्रत्यक्ष tyrosine hydroxylase immunohistochemistry का उपयोग कर उदर tegmental क्षेत्र के क्षेत्र युक्त डोपामाइन न्यूरॉन के अलगाव के लिए लेबल डोपामाइन न्यूरॉन्स की एक विशिष्ट जनसंख्या इकट्ठा करने के लिए वर्णित है। एक अवरक्त (आईआर) पर कब्जा लेजर दोनों के लिए प्रयोग किया जाता है व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के रूप में अच्छी तरह से कांच स्लाइड और विश्लेषण के लिए एक एलसीएम टोपी पर उदर tegmental क्षेत्र बंद काटना। 100% इथेनॉल और xylene साथ ऊतक का पूरा निर्जलीकरण महत्वपूर्ण है। आईआर कब्जा लेजर के संयोजन और पराबैंगनी (यूवी) cuttiएनजी लेजर पेन झिल्ली स्लाइड्स का उपयोग करते समय व्यक्ति डोपामाइन न्यूरॉन्स या उदर टेगमेंटल क्षेत्र को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है। एक पेन झिल्ली स्लाइड यह तेजी से ऊतक के बड़े टुकड़े एकत्रित कर रहा है कोशिकाओं पर कब्जा करने और एकत्र करने में बेहतर स्थिरता प्रदान करता है, के रूप में एक गिलास स्लाइड से अधिक महत्वपूर्ण लाभ है स्लाइड से ऊतक का पूरी तरह हटाने में निर्जलीकरण और परिणामों पर कम निर्भर है। एक गिलास स्लाइड से ऊतक के बड़े क्षेत्रों को हटाने के संभव है, यह काफी अधिक समय लगता है और अक्सर पीछे कुछ अवशिष्ट ऊतक छोड़ देता है। यहाँ दिखाया गया डेटा पर्याप्त मात्रा और गुणवत्ता की शाही सेना मात्रात्मक पीसीआर मापन के लिए इन प्रक्रियाओं का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है कि प्रदर्शित करता है। आरएनए और डीएनए भी बढ़ाया संरचनात्मक और सेलुलर संकल्प से लाभ उठा सकते microRNA, प्रोटीन और डीएनए में epigenetic परिवर्तन का एलसीएम, अलगाव और माप के साथ एकत्र सबसे आम तौर पर अलग-थलग ऊतक से अणुओं और कोशिकाओं रहे हैं हालांकि एलसीएम का उपयोग कर प्राप्त की।

Introduction

सभी ऊतक कोशिकाओं के एक विषमयुग्मजी आबादी के होते हैं। इस glial कोशिकाओं (oligodendrocytes, microglia और astrocytes) के विभिन्न प्रकार से घिरे विभिन्न आकृति विज्ञान और / या neurochemically अलग न्यूरॉन्स से मिलकर, मस्तिष्क के ऊतकों के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है। साथ ही, इस तरह के कोर्टेक्स या ब्रेन स्टेम नाभिक के क्षेत्रों के रूप में मस्तिष्क में अलग क्षेत्रों, विशेष कार्य किया है। विश्लेषणात्मक तकनीकों (यानी, क्यू पीसीआर, प्रोटीन, आरएनए अनुक्रमण, और प्रोटिओमिक्स) के साथ संयुक्त इसलिए, जब क्षमता स्पष्ट रूप से विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं की समझ को बढ़ा सकते हैं, कोशिकाओं या बहुत छोटे anatomically अलग क्षेत्रों की विशिष्ट आबादी को अलग करने के लिए। एलसीएम ऐसे शाही सेना, माइक्रो RNA, डीएनए और प्रोटीन के रूप में विभिन्न अणुओं के आगे के विश्लेषण के लिए एक और अधिक सजातीय स्रोत उपलब्ध कराने के एक खुर्दबीन स्लाइड पर ऊतक से बहुत असतत संरचनात्मक क्षेत्रों या विशिष्ट कोशिकाओं को अलग करने की क्षमता प्रदान करता है कि एक तकनीक है।

टी "> एलसीएम पहली बार पेश किया गया था, कई अलग अलग दृष्टिकोण ऊतक 1-3 से कोशिकाओं microdissect करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। जल्द से जल्द दृष्टिकोण एक अवरक्त (आईआर) लेजर और एक थर्माप्लास्टिक फिल्म और एक गैर का उपयोग कर एक स्लाइड पर ऊतक का सीधा लगाव शामिल एक ट्यूब में एक सेल या ऊतक और संग्रह को अलग करने के लिए लेजर काटने एक पराबैंगनी (यूवी) का उपयोग कर संपर्क विधि। बाद में, एलसीएम सफलतापूर्वक ऊतकों और सेल प्रकार की एक किस्म पर इस्तेमाल किया और दिखाया गया है बहाव के विश्लेषण के लिए विभिन्न अणुओं के अलगाव के साथ संगत होना करने के लिए enzymatic गतिविधि 1,4-7 सहित शाही सेना, माइक्रो RNA, डीएनए और प्रोटीन, भी शामिल है। यहाँ एलसीएम एक काटने यूवी लेजर और कोशिकाओं या ऊतकों के आसपास काटने और एक करने के लिए इसे संलग्न करने के लिए एक पर कब्जा आईआर लेजर का उपयोग करता है जो एक एलसीएम प्रणाली का उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया है एलसीएम टोपी, क्रमशः। इस एलसीएम प्रणाली प्लास्टिक की फिल्म के लिए कोशिकाओं देता है और टी से इसे हटा कि सेल या ब्याज के ऊतकों पर एक टोपी पर एक प्लास्टिक की फिल्म पिघला करने के लिए आईआर कब्जा लेजर दोनों का उपयोग करता हैटोपी को हटाने के साथ वह ऊतक (चित्रा 1)। इसके अतिरिक्त, आईआर लेजर के साथ संयोजन में, एक यूवी लेजर कट-आउट करने के लिए ऊतक या तो आईआर लेजर (चित्रा 2) का उपयोग एलसीएम टोपी के लिए ऊतक संलग्न द्वारा पृथक एक झिल्ली के साथ स्लाइड्स पर घुड़सवार ऊतक से ब्याज की कोशिकाओं उपलब्ध है। इन तकनीकों का एक संक्षिप्त सिंहावलोकन आंकड़े 1 और 2 में पाया जाता है।

या तो प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट immunohistochemistry और एक विशिष्ट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के आधार पर ऊतक के एक क्षेत्र के अलगाव के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक अप्रत्यक्ष immunohistochemistry के निर्देशित तकनीक का उपयोग कर विशिष्ट कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस तकनीक पर कई रूपों में वर्णित हैं। विशेष रूप से, सब्सटेंशिया निग्रा और उदर tegmental क्षेत्र और ताजा जमे हुए मस्तिष्क के ऊतकों से शाही सेना के बाद अलगाव के अलगाव से डोपामाइन न्यूरॉन्स के अलगाव दिखाए जाते हैं। शाही सेना मापा अणुओं के सबसे अस्थिर है, सेंट (डीएनए या प्रोटीन की तुलना में)शाही सेना अखंडता की रक्षा में मदद करने के लिए ईपीएस शामिल है और डेटा प्राप्त शाही सेना की मात्रा और गुणवत्ता पर दिखाए जाते हैं।

Protocol

नोट: चूहों से मस्तिष्क के ऊतकों प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थान के अनुसार इस्तेमाल किया गया था, और अध्ययन प्रोटोकॉल मिसिसिपी स्टेट यूनिवर्सिटी में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

स्लाइड और ऊतकों की 1. तैयारी

  1. Silane-प्रस्तुत करने का स्लाइड या पॉलीथीन napthalate (पेन) झिल्ली गिलास स्लाइड या तो उपयोग करें।
  2. शाही सेना के अलगाव के लिए, RNase परिशोधन समाधान में डुबकी स्लाइड, तो RNase मुक्त पानी के साथ 3 बार धोने के 30 मिनट के लिए RNase मुक्त इथेनॉल और वैक्यूम सूखी की एक वर्गीकृत श्रृंखला के साथ निर्जलीकरण।
  3. एक cryostat का उपयोग कर 10 माइक्रोन मोटाई में ऊतक वर्गों में कटौती और तैयार RNase मुक्त स्लाइड पर माउंट। शाही सेना गुणवत्ता बनाए रखने के सेक्शनिंग दौरान जमे हुए वर्गों रखें।
    नोट: ऊतक लगभग 4 मिमी दूर स्लाइड के किनारों को भी करीब है कि ऊतक नहीं निकाल सकते एलसीएम के रूप में स्लाइड के किनारों से है कि सुनिश्चित करें। Orde मेंआर, एक पेन झिल्ली स्लाइड से ऊतकों को हटाने के ऊतक बाएं, ऊपर और नीचे से 4 मिमी और स्लाइड के साथ संलग्न नहीं है कि झिल्ली के आयाम हैं जो स्लाइड के दाईं ओर से 7 मिमी है कि यह सुनिश्चित करने के लिए।
  4. Silane-प्रस्तुत करने का स्लाइड या कलम झिल्ली स्लाइड या तो पर प्रत्यक्ष immunohistochemistry, खंड ऊतक का उपयोग अलग-अलग सेल आबादी के अलगाव के लिए। अप्रत्यक्ष immunohistochemistry के निर्देशित तकनीक का उपयोग कर ऊतक के क्षेत्रों के अलगाव के लिए, एलसीएम के लिए प्रयोग की जाने वाली एक कलम झिल्ली स्लाइड और / या एक silane-प्रस्तुत करने का स्लाइड पर या तो immunohistochemistry और वैकल्पिक वर्गों के लिए एक silane-प्रस्तुत करने का स्लाइड पर वर्गों में से एक सेट माउंट।

लेजर कब्जा करने के लिए 2. ऊतक तैयारी - immunoreactive कोशिकाओं के प्रत्यक्ष लेजर कब्जा करने के लिए रैपिड tyrosine hydroxylase Immunohistochemistry

  1. एक हाइड्रोफोबिक कलम के साथ ऊतक रूपरेखा और शुष्क करने की अनुमति देते हैं।
  2. एसीटोन मेथनॉल में ऊतक फिक्स (1: 1) 10 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर समाधान।
    नोट: कहांआर अनुभव एसीटोन मेथनॉल निर्धारण अकेले एसीटोन या मेथनॉल की तुलना में बहुत अधिक सुसंगत immunohistochemistry के परिणामस्वरूप में दिखाया गया है कि।
  3. फॉस्फेट में कुल्ला स्लाइड 1% ट्राइटन (RNase मुक्त) के साथ खारा (पीबीएस) buffered।
  4. 400 यू / एमएल RNasin साथ 100: tyrosine hydroxylase एंटीबॉडी के साथ 1% ट्राइटन के साथ 100-200 μl पीबीएस के साथ कवर वर्गों एक पतला। 5-10 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. दो बार संक्षिप्त पीबीएस में कुल्ला और पीबीएस 1% ट्राइटन।
  6. 100 पीबीएस 1% ट्राइटन में 400 यू / एमएल RNasin और 50 एनजी / एमएल DAPI के साथ: एक पतला एलेक्सा Fluor 488 के साथ लेबल बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी के 100-200 μl के साथ ऊतक कवर। 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  7. पीबीएस में दो बार कुल्ला तो RNase मुक्त इथेनॉल के एक वर्गीकृत श्रृंखला में 30 एस निर्जलीकरण (75% -75% -95% -95% -100% -100%)।
  8. तो एक मिनट के 5 मिनट के लिए Xylene के दो washes में सेते हैं।
  9. तुरंत पहले एलसीएम के लिए इस्तेमाल करते हैं और शुष्क हवा की अनुमति देने के लिए Xylene से स्लाइड्स निकालें।

लेजर कब्जा करने के लिए 3. ऊतक तैयारी - TyrosineImmunoreactive क्षेत्र के अप्रत्यक्ष लेजर कब्जा के लिए hydroxylase Immunohistochemistry

  1. वर्गों के निकट वर्गों के साथ प्रक्रिया एक स्लाइड Silane-प्रस्तुत करने का और / या immunohistochemistry के लिए पेन झिल्ली स्लाइड्स पर मुहिम शुरू की।
    नोट: यहां इस्तेमाल प्रक्रियाएं पहले से पाँच रिपोर्ट में उन लोगों के लिए समान हैं। प्रदर्शन छवियों के लिए, diaminobenzidine (थपका) क्रोमाजेन प्रतिक्रिया ब्याज की tyrosine hydroxylase न्यूरॉन्स कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।
  2. एलसीएम के लिए इस्तेमाल किया स्लाइड्स के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर 100% एसीटोन में 5 मिनट के लिए तय कर लो।
  3. RNase मुक्त इथेनॉल के एक वर्गीकृत श्रृंखला में ऊतक निर्जलीकरण (75% -75% -95% -95% -100% -100%) 1 मिनट प्रत्येक के लिए।
  4. तो एक मिनट के 5 मिनट के लिए Xylene के दो washes में सेते हैं।
  5. तुरंत पहले एलसीएम के लिए इस्तेमाल करते हैं और शुष्क हवा की अनुमति देने के लिए Xylene से स्लाइड्स निकालें।

4. लेजर कैद Microdissection प्रणाली का प्रयोग

नोट: एलसीएम आवेदन कार्यक्रम 10 टूल बार और नियंत्रित करने के लिए दो खिड़कियां हैmicrodissection प्रक्रिया। सलाखों के उपकरण: 1. माइक्रोस्कोप, 2. कब्जा लेजर, 3. काटना लेजर, 4. अध्ययन, 5. नेविगेशन, 6. सामग्री, 7. कैद समूह, 8. Microdissection, 9. फ़ॉन्ट, 10 एनोटेशन। विंडोज: 1. लाइव वीडियो और 2. रोड मैप।

  1. एलसीएम सिस्टम सॉफ्टवेयर में माल टूल बार में 'ओपन डोर "टैब का चयन करके दरवाजा खोलो।
  2. तीन उपलब्ध स्लॉट्स पर लोड स्लाइड। इस प्रदर्शन के लिए, tyrosine hydroxylase immunohistochemistry के साथ लोड एक स्लाइड थपका, एक Silane-प्रस्तुत करने का स्लाइड और एक पेन झिल्ली स्लाइड तेजी फ्लोरोसेंट tyrosine hydroxylase immunohistochemistry के लिए लेबल प्रत्येक के साथ कल्पना। एक ठेठ प्रयोग में, सीधे लेजर कब्जा करने के लिए फ्लोरोसेंट tyrosine hydroxylase के साथ लेबल टाइरोसीन थपका का उपयोग कर hydroxylase या स्लाइड के लिए लेबल एक संदर्भ स्लाइड के साथ या तो लेबल हटाया गया एसीटोन तय वर्गों का उपयोग करें।
  3. उपलब्ध स्लॉट में एलसीएम टोपियां लोड करें।
    नोट: मैक्रो और एच एस एलसीएम टोपियां उपयोग के लिए उपलब्ध हैं। एलसीएम टोपी के प्रकार डे उपयोग करने के लिएकोशिकाओं या ऊतकों की राशि की संख्या पर pends एकत्र हो। मैक्रो स्लाइड एचएस टोपियां कई सौ जमा कर सकते हैं, जबकि कई हजार कोशिकाओं अप करने के लिए इकट्ठा करने के लिए सूचीबद्ध हैं। मैक्रो स्लाइड्स अधिक ऊतक संग्रह के लिए अनुमति देते हैं लेकिन lysis बफर के 50 μl की आवश्यकता होती है। एडाप्टर के साथ प्रयोग किया जाता है जब एच एस टोपी, आरएनए का अधिक से अधिक आनुपातिक वसूली के लिए अनुमति देता है जो lysis बफर का केवल 10 μl की आवश्यकता है।
  4. दरवाजे को बंद करना।
  5. पूरे स्लाइड का काम कर रहे एक दृश्य प्रदान करता है, जो रोड मैप खिड़की सक्रिय करने के लिए स्लाइड लोड, यह (चित्रा 3) ब्याज के क्षेत्र के चयन के लिए अनुमति देता है। रुचि के क्षेत्र के लिए नेविगेट करने के लिए लाइव वीडियो खिड़की पर रोड मैप देखें।
  6. माल टूल बार में, स्लाइड स्लॉट के ऊपर बॉक्स को चेक करके पेन झिल्ली स्लाइड्स की पहचान। टोपी संपत्तियों की आपूर्ति करने के लिए, सही सामग्री उपकरण पट्टी में टोपियां पर क्लिक करें और "कैप आपूर्ति गुण" का चयन करें। टोपी की स्थिति का संकेत बक्से की जाँच करें और या तो मा का चयनसीआरओ या एच एस टोपियां।
  7. फ्लोरोसेंट लैंप पर बारी और फ्लोरोसेंट लैंप गर्म करने के लिए अनुमति देने के लिए माइक्रोस्कोप टूल बार में 'प्रतिदीप्ति "टैब का चयन करें। क्रमशः, एलेक्स 488 Fluor और DAPI कल्पना करने के लिए ब्लू और यूवी फिल्टर का प्रयोग करें। Fluorescently लेबल कोशिकाओं को देखने के लिए छवि की संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए "कैमरे को समायोजित" टैब का उपयोग करें।
  8. माल टूल बार में, सही एक टोपी पर क्लिक करें और ब्याज की स्लाइड करने के लिए यह कदम। लाइव वीडियो विंडो में प्रकट होता है कि क्षेत्र का चयन करने के लिए रोड मैप में एक स्थान पर डबल क्लिक करें। एक रोड मैप पर क्षेत्र (डबल क्लिक करें छोड़ दिया है) और फिर ठीक क्लिक और चयन का चयन करके स्लाइड पर चारों ओर टोपी ले जाएँ "केंद्र क्षेत्र में जगह टोपी।"
  9. आईआर कब्जा लेजर का उपयोग करने से पहले, उद्देश्य और शक्ति के लिए इसे समायोजित। दूर ऊतक से स्लाइड के एक क्षेत्र में टोपी रखें। कैद लेजर उपकरण पट्टी पर, "सक्षम चयन करें।" पावर (3-100 मेगावाट), पल्स समायोजित (100-1000000 μ; एसईसी) और लेजर की # हिट्स। टोपी ऊतक के बिना स्लाइड के एक हिस्से को खत्म हो गया है जब आईआर लेजर आग और लेजर पर्याप्त एलसीएम टोपी झिल्ली पिघला देता है देखने के लिए जाँच करें।
    नोट: टोपी पर बहुलक झिल्ली पिघल रही है जो यह कहा जाता है गीला यह संपर्कों गिलास स्लाइड इतना है कि। एक अंधेरे अंगूठी स्पष्ट अंगूठी (पर्याप्त और अपर्याप्त पिघलने के उदाहरण के लिए चित्रा 4 देखें) के केंद्र के साथ स्लाइड के लिए जुड़े हुए के रूप में पर्याप्त गीला दिख रहा है। गीला पर्याप्त नहीं है, तो इस हासिल की है, जब तक फिर से बिजली और नाड़ी, और परीक्षण आग समायोजित करें। इसके अतिरिक्त, लेजर के कई आग का भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
  10. आईआर लेजर तीव्रता समायोजित किया जाता है, ठीक क्लिक करें और लेजर उद्देश्य के लिए "कब्जा लेजर यहाँ है" का चयन करें।
    नोट: इस कदम आईआर कब्जा लेजर ऊतक के उद्देश्य से है जहां कंप्यूटर बताता है। लेजर लक्ष्य का यह कदम महत्वपूर्ण है और टोपी ले जाया जाता है हर बार दोहराया जाना चाहिए या उद्देश्य बदल गया है।
  11. Silane-प्रस्तुत करने का स्लाइड के बंद व्यक्तिगत डोपामिन न्यूरॉन्स की 5. लेजर कैद Microdissection

    1. कोशिकाओं पर कब्जा करने के लिए ब्याज के क्षेत्र में ले जाएँ।
      नोट: अलग-थलग डोपामाइन न्यूरॉन्स के उदाहरण यहाँ दिखाया गया है।
    2. एक silane-प्रस्तुत करने का स्लाइड के बंद व्यक्ति की कोशिकाओं पर कब्जा करने के लिए, Microdissection टूल बार में तो "एकल बिंदु" आइकन "एलसीएम" टैब का चयन करें।
    3. माइक्रोस्कोप टूल बार में, उपयुक्त फिल्टर का चयन करने के लिए फ्लोरोसेंट फिल्टर टैब के साथ प्रतिदीप्ति और उज्ज्वल क्षेत्र के बीच स्विच करने के लिए "शटर" टैब का उपयोग करें और बढ़ाई बदलने के लिए उद्देश्यों टैब का उपयोग करें। ब्याज की कोशिकाओं लाइव वीडियो विंडो में दिखाई दे रहे हैं एक बार, कोशिकाओं की अनुमानित आकार के लिए ब्याज की कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया स्थान आकार को समायोजित। तो दूसरे पक्ष पर क्लिक करने के बाद एक दाग सेल, के एक तरफ, पर क्लिक करके कब्जा लेजर उपकरण पट्टी पर हाजिर टैब पर क्लिक करके यह मत करो।
      नोट: इस गणना करता हैइस स्थान का व्यास और मूल्य प्रदर्शित करता है।
    4. "एकल बिंदु" आइकन चुना जाता है, जबकि उन पर क्लिक करके ब्याज की कोशिकाओं के निशान। प्रत्येक कोशिका पर एक जगह मार्कर स्थान के लिए यह मत करो। इधर, नीला फिल्टर और 10X उद्देश्य डोपामाइन न्यूरॉन्स कल्पना करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। जांचना और कदम 4.9 और 4.10 में वर्णित के रूप में यह नीचे कोई ऊतक है, जहां टोपी पर आईआर लेजर लक्ष्य।
    5. स्वचालित रूप से चयनित सभी में चिह्नित कोशिकाओं आग जाएगा Microdissection टूल बार और आईआर लेजर पर टैब - कोशिकाओं के रूप में चिह्नित कर रहे हैं एक बार, "कट और कब्जा जाओ" का चयन करें। यदि आवश्यक हो तो इसके साथ ही, ब्याज के किसी भी बिंदु (चित्रा 5D) पर स्वयं आईआर लेजर आग।
    6. कोशिकाओं एलसीएम कैप पर कब्जा कर लिया गया है की जाँच करने के लिए दूर अनुभाग से और स्लाइड के एक खुले क्षेत्र पर टोपी ले जाएँ। ब्याज की कोशिकाओं स्लाइड (चित्रा 5 ब, ई) से हटा दिया है और एलसीएम टोपी (चित्रा 5C, एफ) से जुड़े होते हैं कि सुनिश्चित करें। दस्तावेज वेंमाइक्रोस्कोप टूल बार में 'कैद छवि "टैब पर क्लिक करके प्रक्रिया है।
    7. ऊतक एकत्रित कर समाप्त हो, टोपी पर राइट क्लिक करके टोपी को हटा दें और फिर "करने के लिए ले जाएँ" चुनें "उतारना।"

    पेन झिल्ली स्लाइड्स के बंद व्यक्तिगत डोपामिन न्यूरॉन्स की 6. लेजर कैद

    1. आईआर और यूवी लेजर दोनों का उपयोग कर कलम झिल्ली स्लाइड के बंद व्यक्ति की कोशिकाओं पर कब्जा करने के लिए, चयन "कट और कब्जा" Microdissection टूल बार में टैब। ब्याज की कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए "एकल बिंदु" टैब का चयन करें। प्रत्येक कोशिका की रूपरेखा तैयार करने के लिए "कट लाइन" टैब का उपयोग करें। कदम 4.9 और 4.10 के रूप में वर्णित आईआर लेजर परीक्षण करने के लिए और यकीन है कि सोचा था कि कटौती करने के लिए आवश्यक न्यूनतम तीव्रता कलम झिल्ली और ऊतकों को निर्धारित करने के लिए यूवी लेजर परीक्षण (चित्रा 4 और 5)
    2. Microdissection उपकरण पट्टी पर "कब्जा और कट" टैब का चयन करें। इस तकनीक का उपयोग कर व्यक्ति की कोशिकाओं का संग्रह करते हैं, तो हो सकता हैवे एलसीएम टोपी चिपका जा रहा करने के लिए पहले बाहर काट रहे हैं, तो पहले इन छोटे-छोटे टुकड़ों के रूप में यूवी लेजर द्वारा पीछा आईआर लेजर आग करने के लिए यकीन खो दिया जा सकता है।
      नोट: इस प्रक्रिया को भी ब्याज की एक बिंदु पर आईआर लेजर फायरिंग से मैन्युअल रूप से किया जा सकता है और कोशिकाओं को अलग-अलग यूवी लेजर के साथ रेखांकित किया।
    3. कोशिकाओं को हटा दिया और टोपी (चित्रा 6) से जुड़े थे, तो यह निर्धारित करने के लिए कदम 5.7 में ऊपर वर्णित के रूप में ब्याज की कोशिकाओं को इकट्ठा करने के बाद, एलसीएम टोपी चाल है।
    4. ऊतक एकत्रित कर समाप्त होने पर, सही टोपी पर क्लिक करके और चयन करके टोपी को हटा दें तो "करने के लिए ले जाएँ" "उतारना।"

    7. Silane-प्रस्तुत करने का स्लाइड से उदर tegmental क्षेत्र पर कब्जा

    1. ब्याज के क्षेत्र की पहचान करने के लिए, immunohistochemistry के लिए संसाधित स्लाइड का उपयोग करें।
      नोट: उदर tegmental क्षेत्र अलग है इस प्रदर्शन (चित्रा 7A) के लिए।
    2. एक एलसीएम टोपी लोड और कदम के रूप में पराबैंगनीकिरण का परीक्षण4.9 और 4.10 है।
      नोट: आमतौर पर, एक मेक्रो एलसीएम टोपी प्रयोग किया जाता है, लेकिन एक एचएस कैप भी (8 चित्रा देखें) का इस्तेमाल किया जा सकता है।
    3. Microdissection टूल बार में 'एलसीएम "टैब का चयन करें, silane-प्रस्तुत करने का स्लाइड से ऊतक के एक क्षेत्र (यानी, उदर tegmental क्षेत्र) को अलग-थलग करने के लिए, तो" बहुभुज-बाहरी "टैब का चयन करें। लाइव वीडियो विंडो में ब्याज के क्षेत्र को रेखांकित करें। संग्रह के लिए क्षेत्र के आकार के आधार पर, कम बढ़ाई (2X उद्देश्य) पर ब्याज के क्षेत्र रूपरेखा। संग्रह के लिए, हालांकि, साधन 10X उद्देश्य ताकि समायोजित करने और कब्जा करने के लिए 10X उद्देश्य के तहत आईआर लेजर से पहले उद्देश्य का उपयोग करता है।
    4. Microdissection टूल बार में - "पकड़ने और कटौती जाओ" टैब का चयन करें।
      नोट: कंप्यूटर स्वतः ही पूरे चयनित क्षेत्र (चित्रा 7F, मैं) भर में आईआर लेजर आग जाएगा। एलसीएम झिल्ली क्षेत्र भर में पर्याप्त रूप से पिघल नहीं किया गया है, लेजर आदमी निकाल दिया जा सकता हैually या पूरी प्रक्रिया को दोहराया।
    5. ऊतक एकत्र किया गया था कि कैसे अच्छी तरह से निर्धारित करने के लिए ऊतक के बंद एलसीएम टोपी ले जाएँ।
      नोट: इस विधि का उपयोग कर एक पास आम तौर पर स्लाइड (Figure7G देखें) पर पीछे कुछ ऊतक छोड़ देता है। यदि ऐसा होता है, चयन दोहराने और ऊपर चरण पर कब्जा। इस कदम को दोहरा (चित्रा 7J) एकत्र ऊतक की राशि में वृद्धि कर सकते हैं।
    6. ऊतक एकत्रित कर समाप्त होने पर, सही टोपी पर क्लिक करके और चयन करके टोपी उतारना तो "करने के लिए ले जाएँ" "उतारना।"

    8. कलम झिल्ली स्लाइड्स से उदर tegmental क्षेत्र पर कब्जा

    1. इसके बाद के संस्करण के रूप में कलम झिल्ली स्लाइड पर ऊतक से ब्याज के क्षेत्र का चयन करने के लिए एक गाइड के रूप में immunohistochemistry के लिए संसाधित स्लाइड का प्रयोग करें।
    2. Microdissection टूल बार में 'कट और कब्जा "टैब का चयन करें। "कटौती लाइन" टैब का चयन करें और immunohistoche का उपयोग कर ब्याज के क्षेत्र की रूपरेखा तैयारमिस्त्री एक गाइड के रूप में स्लाइड लेबल।
      नोट: कार्यक्रम स्वचालित रूप से टोपी के लिए ऊतक संलग्न करने के लिए आईआर लेजर के लिए स्पॉट जोड़ देगा। बेहतर टोपी के लिए ऊतक को सुरक्षित करने के लिए अतिरिक्त स्पॉट जोड़ने के लिए 'एकल बिंदु "टैब का उपयोग करें।
    3. 10X उद्देश्य, परीक्षण आग के तहत और 4.9 और 4.10 के रूप में वर्णित आईआर और यूवी लेजर लक्ष्य। यूवी लेजर स्लाइड पर और इस कटौती कंप्यूटर स्क्रीन पर स्थान से मेल खाती है कि झिल्ली घुसना कर सकते हैं कि परीक्षण। झिल्ली और ऊतक में कटौती करने के लिए बस के लिए पर्याप्त है, लेकिन ऊतक (चित्रा 5) को नुकसान नहीं करता है कि एक यूवी लेजर शक्ति का प्रयोग करें।
    4. Microdissection टूल बार में - "पकड़ने और कटौती जाओ" टैब का चयन करें।
      नोट: कंप्यूटर स्वतः तो टोपी को देते स्लाइड पेन झिल्ली और ऊतक (चित्रा 7C) में कटौती करने के लिए यूवी लेजर आग करने के लिए ऊतक के भीतर सभी लेबल वाले स्थानों पर आईआर लेजर आग जाएगा। अतिरिक्त आईआर पिघल स्पॉट पर्याप्त रूप से आज़ादी संलग्न करने के लिए आवश्यक हो सकता हैमैन्युअल रूप से भी जोड़ा जा सकता है जो एलसीएम टोपी, के लिए मुकदमा।
    5. ऊतक खंड (चित्रा 7C) से हटा दिया है और टोपी (चित्रा 7C) से जुड़ा था, तो यह निर्धारित करने के लिए ऊतक के बंद एलसीएम टोपी ले जाएँ।
    6. ऊतक एकत्रित कर समाप्त होने पर, सही टोपी पर क्लिक करें और फिर "करने के लिए ले जाएँ" का चयन करें, टोपी को दूर करने के लिए "उतारना।"

    शाही सेना के 9. अलगाव

    1. पर कब्जा कर लिया कोशिकाओं या ऊतकों से शाही सेना को इकट्ठा करने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए शाही सेना lysis बफर में एलसीएम टोपी झिल्ली सेते हैं।
      नोट: एच एस टोपियां के लिए, एक एडाप्टर टोपी पर lysis बफर का केवल 10 μl के उपयोग के लिए अनुमति देता है और एक 0.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब करने के लिए देता है कि उपलब्ध है। मैक्रो टोपियां lysis बफर के 50 μl की आवश्यकता होती है और एक 0.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब सीधे देता है।
    2. ऊष्मायन के बाद, 0.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में नीचे lysis बफर स्पिन।
    3. हे सभी कोशिकाओं का पूरा सेल सुनिश्चित करने के लिएआर ऊतक, lysis बफर में टोपी और जगह का एलसीएम टोपी झिल्ली दूर छील।
    4. शाही सेना अखंडता के लिए परीक्षण करने के लिए, उपयोग आरएनए एलसीएम आरएनए अखंडता को मापने के लिए के बाद स्लाइड पर शेष ऊतक से अलग।
      नोट: एलसीएम प्राप्त के साथ सीमित नमूना शाही सेना के लिए, यह एलसीएम पृथक शाही सेना पर शाही सेना अखंडता का परीक्षण करने के लिए आम तौर पर व्यावहारिक नहीं है कारण है, तथापि, शेष ऊतक से शाही सेना के कारण दौरान निर्धारण, immunohistochemistry और समय के लिए किसी भी आरएनए गिरावट का एक अच्छा संकेत प्रदान करता है एलसीएम प्रक्रिया।

Representative Results

आंकड़े 6 और 7 में माइक्रोग्राफ व्यक्ति डोपामाइन न्यूरॉन्स के अलगाव के लिए क्षमताओं को प्रदर्शित करता है। लगातार एलसीएम पर उत्पादन किया जा सकता है कि छोटी से छोटी स्थान आकार एक सेल को अलग-थलग करने के लिए टोपी के रूप में वर्तमान संरचनात्मक संकल्प के आसपास 5-10 माइक्रोन है। विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के अलगाव के लिए केवल सीमा कोशिकाओं कल्पना करने की क्षमता है। एलसीएम व्यक्ति डोपामाइन न्यूरॉन्स को अलग-थलग करने में सक्षम है, आसन्न unlabeled कोशिकाओं के कुछ हिस्सों के संदूषण की संभावना सबसे अधिक होती है। इसलिए, अंतिम नमूना डोपामाइन न्यूरॉन्स की एक केंद्रित संग्रह, नहीं डोपामाइन न्यूरॉन्स की एक शुद्ध आबादी है। यह तकनीक भी उदर tegmental क्षेत्र के अलगाव के साथ दिखाया गया के रूप में इस तरह के मस्तिष्क के भीतर असतत नाभिक या क्षेत्रों के रूप में ऊतक के छोटे क्षेत्रों को अलग-थलग करने में सक्षम है। पिछले प्रकाशनों मस्तिष्क के ऊतकों में इस प्रयोग का प्रदर्शन किया है और साथ ही सामान्य ऊतक 5,11 से रोग ऊतक अलग करने के लिए।

(9 चित्रा) की तुलना में किया गया था। शाही सेना गुणवत्ता पूरे मस्तिष्क शाही सेना की तुलना में एसीटोन निर्धारण (Rin 2.6) द्वारा पीछा immunohistochemistry के बाद कम अखंडता के साथ एलसीएम के लिए इस्तेमाल किया ऊतक से शाही सेना के नमूने (Rin उपलब्ध नहीं) में कम हो गया था में एक रिश्तेदार कमी से देखा जा सकता है (Rin 8.2) S18 शिखर की तुलना में rRNA S28 चोटी की ऊंचाई। हालांकि, आरएनए 18S और 28S बैंड बनाए रखा और जीन अभिव्यक्ति क्यू पीसीआर का उपयोग करके मापा जा सकता है।

(चित्रा 10A) से पृथक किया गया। क्यू पीसीआर, रिवर्स लिखित गया डोपामाइन न्यूरॉन्स से पूरे मस्तिष्क शाही सेना और आरएनए की सांद्रता की एक सीमा है और पहले 5 के रूप में वर्णित क्यू पीसीआर का उपयोग मापा गया था β-actin के जीन के साथ शाही सेना मात्रा मापने के लिए। इन मापों के आधार पर, 3.55, 6.82 और 20.58 स्नातकोत्तर / μl के एक एकाग्रता के 50, 100 और 200 डोपामाइन न्यूरॉन्स, क्रमशः (चित्रा 10B) से गणना की गई।

डोपामाइन न्यूरॉन्स के अलगाव पूरे वी के अलगाव की तुलना करने के लिए प्रदर्शन कैसेentral एलसीएम साथ टेगमेंटल क्षेत्र, डोपामाइन न्यूरॉन विशिष्ट जीन (Nurr1, tyrosine hydroxylase, और डोपामाइन ट्रांसपोर्टर) नमूने के इन दो अलग अलग प्रकार में क्यू पीसीआर से मापा और β-actin की अभिव्यक्ति (चित्रा 11) की तुलना में थे। कम सी टी मूल्यों ब्याज की जीन के एक उच्च एकाग्रता के साथ उत्पन्न कर रहे हैं, ΔC टी में कमी β-actin के सापेक्ष डोपामाइन न्यूरॉन जीन की एक वृद्धि की अभिव्यक्ति को इंगित करता है। इस व्यक्ति डोपामाइन न्यूरॉन्स के अलगाव डोपामाइन न्यूरॉन विशिष्ट जीनों की अभिव्यक्ति ध्यान केंद्रित दर्शाता है कि कैसे। उदर tegmental क्षेत्र नमूनों में डोपामाइन न्यूरॉन विशिष्ट जीन β-actin व्यक्त लेकिन डोपामाइन न्यूरॉन जीन व्यक्त नहीं करते कि यह भी एकत्र किया जाएगा अन्य कोशिकाओं (गैर डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं) के रूप में बाहर पतला कर रहे हैं।

चित्र 1

चित्र 2
अवरक्त (आईआर) पर कब्जा लेजर और पराबैंगनी (यूवी) लेजर काटने का उपयोग कर चित्रा 2. लेजर कब्जा। ऊतक के बड़े क्षेत्रों के अधिग्रहण या यूवी लेजर का उपयोग कोशिकाओं की वसूली की सुविधा के लिए आदेश में, ऊतक एक झिल्ली के साथ एक स्लाइड पर मुहिम शुरू की है बाहर कोने (पेन झिल्ली स्लाइड) के साथ स्लाइड से जुड़ा। एलसीएम कैप टी पर रखा गया हैवह ऊतक और आईआर कब्जा लेजर टोपी झिल्ली पिघल और एलसीएम टोपी के लिए ऊतक संलग्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है (चरण 1 और 2)। यूवी काटने लेजर फिर स्लाइड झिल्ली और टोपी ऊतक स्लाइड से हटा दिया है और एलसीएम टोपी (5.) पर रहता है हटा दिया जाता है ताकि जब ऊतक (चरण 3 और 4) के माध्यम से कटौती करने के लिए प्रयोग किया जाता है।

चित्र तीन
लेजर कैद Microdissection प्रणाली रोड मैप 3. चित्रा। इस लेजर कैद Microdissection सिस्टम एक समय में तीन स्लाइड्स के लिए स्थान है। स्लाइड माइक्रोस्कोप में लोड कर रहे हैं, प्रत्येक स्लाइड के लिए कम बढ़ाई रोड मैप छवियों उत्पन्न कर रहे हैं। रोडमैप छवि पर एक क्षेत्र का चयन उस क्षेत्र में लाइव छवि खिड़की बढ़ता रहता है। प्रदर्शन प्रयोजनों के लिए, माउस mesencephalon 3 स्लाइड पर 10 माइक्रोन अनुभाग में sectioned किया गया था। पहली स्लाइड tyrosine hydroxylase immunoreactivi के लिए चिह्नित किया गयाTy एक क्रोमाजेन (ए) के रूप में diaminobenzidine इस्तेमाल करते हैं। धारा Silane-प्रस्तुत करने का स्लाइड (बी) या कलम झिल्ली स्लाइड (सी) या तो पर बढ़ रहे थे। इन स्लाइड्स के दोनों तेजी से फ्लोरोसेंट tyrosine hydroxylase immunohistochemistry का उपयोग कर लेबल थे। (सी) में तीर गिलास स्लाइड पर कलम झिल्ली की कुर्की का संकेत मिलता है। इस सीमा के बाहर कोई ऊतक एलसीएम साथ एकत्र किया जा सकता है।

चित्रा 4
चित्रा 4. आईआर कब्जा लेजर का उपयोग करना। आईआर कब्जा लेजर एलसीएम टोपी के लिए ऊतक देते हैं और ऊतक के बाकी हिस्सों से इसे हटाने के लिए एलसीएम टोपी झिल्ली पिघला करने के लिए प्रयोग किया जाता है। आईआर कब्जा लेजर अंतर्निहित ऊतक और गिलास स्लाइड संपर्क करने के लिए पर्याप्त रूप से एलसीएम टोपी झिल्ली पिघला करने के लिए पर्याप्त शक्ति पर होना चाहिए। लेजर झिल्ली पिघला करने के लिए अपर्याप्त था जब ऊपर की छवि को दर्शाता हैस्लाइड करने के लिए (दो धब्बे छोड़ दिया)। पिघल झिल्ली गिलास स्लाइड छू लेती है, एक मोटी काली रूपरेखा (सही जगह) मनाया जा सकता है। लेजर की तीव्रता पावर (3-100 मेगावाट), पल्स (100-1,000,000 μsec) और लेजर की # हिट्स बदलकर समायोजित किया जा सकता है। साथ ही, यह भी आगे झिल्ली पिघला कर सकते हैं एक ही स्थान पर आईआर लेजर की फायरिंग दोहराया। आईआर लेजर का उद्देश्य कभी भी एलसीएम टोपी ले जाया जाता है समायोजित किया जा करने के लिए या उद्देश्य बदल गया है जब की जरूरत है। स्केल बार = 100 माइक्रोन।

चित्रा 5
चित्रा 5. लेजर काटने यूवी का उपयोग करना। यूवी काटने लेजर पेन झिल्ली और ऊतकों के माध्यम से कटौती करने के लिए प्रयोग किया जाता है। झिल्ली के माध्यम से कट और यूवी लेजर ऊतकों को नुकसान पहुंचा सकता है के बाद से ऊतक का निर्धारण करने की आवश्यकता है के लिए आवश्यक न्यूनतम तीव्रता का उपयोग करने से पहले। ऊपर, अलग यूवी लेजर तीव्रता के तीन स्थानों (तीर) के साथ दिखाया जाता है 10 माइक्रोन वर्गों, मोटा वर्गों के लिए बीच हाजिर और बहुत अधिक है कि एक यूवी लेजर तीव्रता का प्रदर्शन सही जगह के लिए पर्याप्त बाईं स्थान आकार। स्केल बार = 100 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा आईआर लेजर का उपयोग tyrosine hydroxylase immunoreactive न्यूरॉन्स की 6. प्रत्यक्ष अलगाव। डोपामिन न्यूरॉन्स tyrosine hydroxylase (ए) के लिए एक तेजी से फ्लोरोसेंट लेबलिंग के बाद दिखाए जाते हैं। आईआर लेजर इन न्यूरॉन्स (डी) से अधिक एलसीएम टोपी झिल्ली पिघलने निकाल दिया जाता है, तो टोपी को हटाने की स्लाइड (बी, ई) के बंद इन कोशिकाओं को उठाता है। एलसीएम कैप (सी, एफ) के साथ संलग्न के रूप में इन न्यूरॉन्स तो देखे जा सकते हैं। स्केल बार = 250 माइक्रोन।= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig6large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा आईआर और यूवी लेसरों का उपयोग कलम झिल्ली स्लाइड से tyrosine hydroxylase immunoreactive न्यूरॉन्स की 7. प्रत्यक्ष अलगाव। Tyrosine hydroxylase लेबल न्यूरॉन्स से ऊपर (ए) दिखाए जाते हैं। इन न्यूरॉन्स आईआर लेजर का उपयोग एलसीएम टोपी से जुड़ी है और यूवी लेजर (बी) का उपयोग कर कलम झिल्ली स्लाइड से काटा जा सकता है। स्केल बार = 250 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंकड़ा 8
अप्रत्यक्ष 8 चित्रा tyrosine hydroxylase immunoreactivity का उपयोग कर उदर tegmental क्षेत्र के अलगाव। उदर tegmental क्षेत्र में डोपामाइन न्यूरॉन्स के स्थान मानक immunohistochemistry तकनीक (ए और ई) का उपयोग कर एक खंड में कल्पना की गई थी। इस immunohistochemistry नामक खंड बेदाग आसन्न वर्गों (बी और एफ) में उदर tegmental क्षेत्र का पता लगाने के लिए एक टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया गया था। यूवी लेजर का उपयोग करना, उदर tegmental क्षेत्र आईआर लेजर के साथ एलसीएम टोपी से जुड़ी है और यूवी लेजर (सी और डी) के साथ स्लाइड से काटा जाता है और एक एचएस एलसीएम कैप (डी) से जुड़ा हुआ दिखाया गया है किया गया था। केवल आईआर लेजर का उपयोग Silane-प्रस्तुत करने का स्लाइड से अलग उदर टेगमेंटल क्षेत्र में भी एक मेक्रो टोपी (FK) से जुड़ा हुआ दिखाया गया है। एक से अधिक प्रयास करने के लिए इस क्षेत्र (जी और जम्मू तुलना) से ऊतक के सबसे इकट्ठा करने की जरूरत थी कि ध्यान दें। स्केल बार = 500 माइक्रोन।pload / 52,336 / 52336fig8large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

9 चित्रा
चित्रा 9. शाही सेना गुणवत्ता। प्रतिनिधि electropherograms और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पूरे मस्तिष्क शाही सेना (ए) और आरएनए एसीटोन निर्धारण और एलसीएम (बी) के बाद वर्गों से अलग या तेजी से फ्लोरोसेंट tyrosine hydroxylase immunohistochemistry और एलसीएम (सी) के जुड़े जेल छवियों। शाही सेना गुणवत्ता पूरे मस्तिष्क शाही सेना की तुलना में, immunohistochemistry के लिए संसाधित वर्गों में कम हो गया था हालांकि, electropherograms rRNA S18 और S28 चोटियों की उपस्थिति के आधार पर ज्यादातर बरकरार शाही सेना प्रदर्शित करता है। पूरे मस्तिष्क शाही सेना एकाग्रता 8.2 की एक Rin के साथ 6.487 स्नातकोत्तर / μl था। एसीटोन तय ऊतक आरएनए एकाग्रता 2.6 की एक Rin के साथ 5.036 स्नातकोत्तर / μl था। शाही सेना immunohistochemistry के एच के बाद प्राप्त विज्ञापन 4.474 स्नातकोत्तर / μl और RIN के एक एकाग्रता के लिए उपलब्ध नहीं था।

10 चित्रा
10 चित्रा आरएनए मात्रा। एलसीएम के साथ प्राप्त न्यूरॉन्स में शाही सेना की मात्रा निर्धारित करने के लिए, शाही सेना सांद्रता का एक मानक वक्र एक fluorospectrometer और क्यू पीसीआर का उपयोग कर उत्पादन किया गया था। Fluorospectrometer माप (ए) के लिए, बड़े ग्राफ आरएनए मात्रा के उच्च सीमा से पता चलता है और छोटे ग्राफ 10 स्नातकोत्तर / μl करने के लिए नीचे इस परख की संवेदनशीलता को दर्शाता है। 50, 100 और 200 डोपामाइन न्यूरॉन्स से प्राप्त आरएनए की सांद्रता में क्रमश: 17.3, 24.8 और 50.9 स्नातकोत्तर / μl था। शाही सेना मात्रा में (बी) को मापने के लिए क्यू पीसीआर का प्रयोग, शाही सेना की सांद्रता 50, 100 और 200 डोपामाइन न्यूरॉन्स से प्राप्त क्रमश: 3.55, 6.82 और 20.58 स्नातकोत्तर / μl था।

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व्यक्तिगत डोपामाइन न्यूरॉन्स के अलगाव के साथ डोपामाइन न्यूरॉन विशिष्ट जीन की चित्रा 11. एकाग्रता। डोपामाइन न्यूरॉन्स के नमूनों में डोपामाइन न्यूरॉन विशिष्ट जीन (Nurr1, tyrosine hydroxylase, और डोपामाइन ट्रांसपोर्टर) और β-actin के बीच सी टी (ΔC टी) में अंतर एलसीएम के साथ अलग उदर tegmental क्षेत्र में दिखाए जाते हैं पूरे उदर टेगमेंटल क्षेत्र के dissections में अभिव्यक्ति की तुलना में। कम सी टी मूल्यों ब्याज की जीन के एक उच्च एकाग्रता के साथ उत्पन्न कर रहे हैं, ΔC टी में एक कमी होगी β-actin के लिए अन्य कोशिकाओं (गैर डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं) के रूप में रिश्तेदार डोपामाइन न्यूरॉन जीन की एक वृद्धि की अभिव्यक्ति को इंगित करता है β-actin व्यक्त लेकिन डोपामाइन न्यूरॉन जीन व्यक्त नहीं करते कि उदर tegmental क्षेत्र नमूनों में एकत्र किया।

Discussion

एलसीएम एक खुर्दबीन स्लाइड और आरएनए, माइक्रो RNA, डीएनए और प्रोटीन के बाद के अलगाव पर कोशिकाओं या ऊतक वर्गों से ऊतक के क्षेत्रों के असतत आबादी के विच्छेदन के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। इन तकनीकों की संवेदनशीलता को बेहतर बनाता है और जरूरत के शुरू सामग्री की राशि कम हो जाता है के रूप में इस तरह के माइक्रोएरे, अगली पीढ़ी के शाही सेना अनुक्रमण, डीएनए और प्रोटिओमिक्स की epigenetic विश्लेषण के रूप में उच्च throughput प्रौद्योगिकी का उपयोग कर विश्लेषण के साथ संयोजन में एलसीएम का उपयोग अधिक से अधिक आम होता जा रहा है 8-12। एलसीएम के साथ, एक बेहतर संरचनात्मक संकल्प एक नमूना के लिए हासिल की है, और इन नमूनों के बहाव के उपायों से समझ बहुत बढ़ाया है। एलसीएम के साथ एक चेतावनी है कि यह ब्याज की कोशिकाओं, लेकिन जरूरी नहीं कि कोशिकाओं का एक शुद्ध आबादी का एक नमूना केंद्रित प्रदान करता है। परिशुद्धता की सीमा से सटे ऊतक से कुछ संदूषण कि वहाँ होगा मतलब है। हालांकि, इस तकनीक के ब्याज की कोशिकाओं ध्यान केंद्रित करता हैऊतकों और कोशिकाओं के आसपास के साथ जुड़े प्रभाव को कम करने और ब्याज की कोशिकाओं पर प्रयोगात्मक प्रभाव को अधिकतम करने के लिए।

अप्रत्यक्ष Immunohistochemistry बनाम प्रत्यक्ष

एलसीएम वर्तमान में शाही सेना बरकरार रखते हुए, अलगाव और शाही सेना की माप के लिए मुख्य रूप से उपयोग किया जाता है के बाद से एक बहुत ही महत्वपूर्ण कसौटी है। शाही सेना अखंडता को बनाए रखने (चित्रा 10) शाही सेना नीचा कर सकते हैं, जो सीधे ऊतक दाग आवश्यकता को हटा जो ऊतक विच्छेदन मार्गदर्शन करने के लिए अप्रत्यक्ष immunohistochemistry के उपयोग के पीछे मुख्य तर्क है। प्रयोगात्मक सवाल है, हालांकि, इस तरह डोपामिन न्यूरॉन्स के रूप में कोशिकाओं की एक विशिष्ट आबादी के अलगाव की आवश्यकता है, तो प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट immunohistochemistry के लिए आवश्यक है। एक तेजी से immunohistochemistry के लेबलिंग प्रोटोकॉल का प्रयोग प्रक्रिया के दौरान शाही सेना की गिरावट को कम कर सकते हैं। कम ऊष्मायन बार प्राथमिक और माध्यमिक विरोधी के उच्च सांद्रता के उपयोग की वजह से कर रहे हैंनिकायों, चारों ओर 10-20 हैं कि सांद्रता एक 2 घंटे ऊष्मायन के साथ पारंपरिक immunohistochemistry के लिए क्या आवश्यक है की तुलना में अधिक गुना। हालांकि, अब ऊष्मायन बार आवश्यक हैं, ब्राउन और स्मिथ आरएनए गिरावट को रोकना और लंबी ऊष्मायन बार (20 ​​एच तक) 13 के साथ अच्छी गुणवत्ता आरएनए प्राप्त करने के लिए उच्च नमक बफ़र्स का इस्तेमाल किया। यह दृष्टिकोण भी एक एलसीएम व्यवस्था करने के लिए ऊतक की लेबलिंग हो रही है और पहुँच के बीच आवश्यक पर्याप्त समय है, अगर वहाँ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

पेन झिल्ली, silane प्रस्तुत करने और uncoated गिलास स्लाइड - स्लाइड्स की च्वाइस

एलसीएम के लिए uncoated गिलास स्लाइड का उपयोग 14 सूचित किया गया है। यह कोटिंग पर्याप्त ऊतक के नुकसान के बिना immunohistochemistry के लिए स्लाइड करने के लिए ऊतक देता है, लेकिन अभी भी स्लाइड से एलसीएम टोपियां के लिए ऊतक के लगाव और हटाने के लिए अनुमति देता है के रूप में हमारी प्रयोगशाला में, silane-प्रस्तुत करने का स्लाइड, एक इष्टतम विकल्प होना पाया गया है । Uncoated कांच स्लाइड हैimmunohistochemistry प्रक्रिया के साथ कुछ ऊतकों को नुकसान दिखाया। अप्रत्यक्ष immunohistochemistry प्रयोग किया जाता है, तथापि, ऊतक प्रतिधारण एक मुद्दे के कम हो जाता है। Silane-प्रस्तुत करने का स्लाइड के बंद उचित निर्जलीकरण, कैप्चरिंग कोशिकाओं या ऊतकों के साथ एक मुद्दा नहीं किया गया है। इस पत्र में वर्णित को अलग न्यूरॉन्स या मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए विभिन्न तरीकों में से प्रत्येक के फायदे और नुकसान है। व्यक्तिगत डोपामाइन न्यूरॉन्स के अलगाव के लिए, silane-प्रस्तुत करने का स्लाइड के उपयोग के बेहतर प्रकाशिकी का लाभ दिया है और कलम झिल्ली स्लाइड से कम खर्चीला है। वहाँ अपर्याप्त निर्जलीकरण (देखें नीचे) है और कुछ ऊतक स्लाइड पर छोड़ा जा सकता है, तो नुकसान कभी कभी कब्जा करने की कोशिकाओं के लिए मुश्किल हो सकता है। पेन झिल्ली स्लाइड्स का लाभ आईआर लेजर और यूवी लेजर के संयोजन का उपयोग कर डोपामाइन न्यूरॉन्स एकत्र किया जाएगा कि यह सुनिश्चित करता है कि है। यह गिलास स्लाइड से निर्जलीकरण पर कम निर्भर है के रूप में एक पेन झिल्ली स्लाइड से कोशिकाओं को इकट्ठा करने में विफलता लगभग कभी नहीं होता है। एक अतिरिक्त लाभ आईआर लेजर के साथ गिलास स्लाइड के बंद न्यूरॉन्स पर कब्जा करने के लिए एक चक्र की तुलना में यूवी लेजर, और अधिक बारीकी से ब्याज की न्यूरॉन्स के आकार का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ऊतक के क्षेत्रों के अलगाव के लिए, पेन झिल्ली स्लाइड कहीं बेहतर रहे हैं और कहा कि लागत का औचित्य साबित। झिल्ली पर बाहर कटौती सभी ऊतक के पूरी तरह हटाने में इस दृष्टिकोण का परिणाम है, अकेले आईआर लेजर का उपयोग कर और मोटा ऊतक वर्गों एकत्र किया जा सकता ऊतक के एक बड़े क्षेत्र पर कब्जा करने की तुलना में बहुत तेजी से होता है। केवल आईआर लेजर का उपयोग एलसीएम टोपी झिल्ली पूरी तरह से पूरे ऊतक क्षेत्र से अधिक पिघल रहा है कि आवश्यकता है। इसके अतिरिक्त, ऊतक का अधूरा संग्रह विशिष्ट है और आम तौर पर अधिक प्रयास की आवश्यकता है। इस कलम झिल्ली स्लाइड से ऊतक को अलग से अधिक समय लेता है हालांकि उपलब्ध ऊतक एक गिलास स्लाइड या एक यूवी लेजर पर पहले से ही है, तो ऊतक के सबसे (चित्रा 8J) एकत्र किया जा सकता है के रूप में यह एक व्यवहार्य विकल्प है, उपलब्ध नहीं है।

ove_content "> महत्वपूर्ण कदम

100% इथेनॉल incubations के सबसे महत्वपूर्ण कदमों में से एक हैं। Silane-प्रस्तुत करने का स्लाइड से कोशिकाओं को इकट्ठा करने के क्रम में ऊतक का पूरा निर्जलीकरण की आवश्यकता है। इसलिए, 100% इथेनॉल ऊष्मायन के साथ ज्यादातर जुड़ा हुआ है, जो हटाया नहीं किसी भी पानी, स्लाइड से कोशिकाओं को लेने के लिए क्षमता को प्रभावित करेगा। इस मुद्दे के समाधान के लिए आदेश में, अक्सर निर्जलीकरण को प्रभावित कर सकते पिछले धोने कदम से हवा या हस्तांतरण से पानी के अवशोषण के रूप में 100% इथेनॉल समाधान बदल जाते हैं। साथ ही, आणविक चलनी किसी भी पानी के प्रदूषण को अवशोषित करने के लिए उपयोग किया जाता है। एलसीएम प्रणाली आदर्श रूप से कम नमी की स्थिति बनाए रखने के लिए एक dehumidifier के साथ एक छोटे से कमरे में स्थित होना चाहिए।

गुड cryostat वर्गों उचित एलसीएम के लिए महत्वपूर्ण हैं। धारा को कम से कम ऊतक में परतों के साथ फ्लैट होने की जरूरत है। एलसीएम टोपी के बीच दूरी बढ़ाने के लिए और टी से संपर्क करने से रोकने जाएगा ऊतक में परतोंवह ऊतक। यह तो पर्याप्त ऊतक पर झिल्ली टोपी पिघला करने के लिए मुश्किल हो जाता है। गिलास स्लाइड के लिए, आम तौर पर खंड मोटाई 6 और 12 माइक्रोन के बीच होने की जरूरत है। मोटा वर्गों कलम झिल्ली स्लाइड के साथ कब्जा कर लिया जा सकता है।

एलसीएम खुर्दबीन स्लाइड से बहुत ही सटीक ऊतक के dissections और कोशिकाओं को बनाने के लिए एक तकनीकी क्षमता प्रदान करता है। ऊतक के टुकड़े के सकल विच्छेदन की तुलना में यह नाटकीय रूप से आगे के विश्लेषण का संकल्प बढ़ जाती है। एलसीएम समय और श्रम गहन हो सकता है, हालांकि, यह व्यापक प्रशिक्षण या विशेषज्ञता और की आवश्यकता नहीं है, अन्य उच्च throughput प्रौद्योगिकियों के साथ युग्मित जब असतत कोशिकाओं या शारीरिक क्षेत्रों में इस्तेमाल किया जाता है, जब बहुत एक जैविक प्रक्रिया की समझ बढ़ा सकते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Veritas Laser Capture Microdissection System Life Technologies, Grand Island, NY Newer model is now sold
CapSure Macro LCM Caps Life Technologies, Grand Island, NY LCM0211
CapSure HS LCM Caps Life Technologies, Grand Island, NY LCM0213
PEN Membrane slides Life Technologies, Grand Island, NY s4651
Silane prep-slides Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S4651
95% Ethanol-RNase Free Sigma-Aldrich, St. Louis, MO E7148
100% Ethanol-RNase Free Sigma-Aldrich, St. Louis, MO E7023
Rnase Free Triton Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T8787
Molecular Sieve EDM Millipore, Billerica, MA MX1583D
Anti-Tyrosine hydroxyase antibody EDM Millipore, Billerica, MA Ab152
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Life Technologies, Grand Island, NY A-11008
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies, Santa Clara, CA G2939AA
Stratagene MX 3005P Agilent Technologies, Santa Clara, CA 401513
Nanodrop 3300 fluorospectrometer Thermo Scientific
Quant-iT RiboGreen Life Technologies, Grand Island, NY R11490
RNaseZap Life Technologies, Grand Island, NY AM9780

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References

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