चूहे में स्थिर उच्च स्तर अस्थि मज्जा काइमेरावाद पैदा करने के लिए एक Myelosuppressive एजेंट के रूप में Busulfan

Medicine

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Peake, K., Manning, J., Lewis, C. A., Barr, C., Rossi, F., Krieger, C. Busulfan as a Myelosuppressive Agent for Generating Stable High-level Bone Marrow Chimerism in Mice. J. Vis. Exp. (98), e52553, doi:10.3791/52553 (2015).

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Abstract

Protocol

नोट: आचार कथन: इस प्रोटोकॉल की समीक्षा की और साइमन फ्रेजर विश्वविद्यालय के पशु की देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है (UACC; की अनुमति संख्या 1037K-12 और 1060K-03) और पशु की देखभाल, एनआईएच गाइड के लिए पर कनाडा परिषद के अनुपालन में है देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग, और EEC परिषद निर्देशक।

1. विशेष ध्यान

नोट: Busulfan साइटोटोक्सिक है। संभाल और सामग्री सुरक्षा डाटा शीट और संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार निपटाने।

  1. एक लामिना का प्रवाह हुड में aseptically सभी तकनीकों का प्रदर्शन।
  2. इस तरह के एक छील पैकेज, और वाष्पदावी के रूप में, एक उपयुक्त पैकेजिंग सामग्री में लपेटकर द्वारा उपयोग करने से पहले उपकरणों जीवाणुरहित।
  3. संक्रमण के जोखिम विकिरण की तुलना में busulfan कंडीशनिंग के साथ कम होती है, वहीं केवल प्रत्यारोपण के बाद पहले दो हफ्तों के लिए एक लामिना का प्रवाह हुड में पशुओं को संभाल।

2. कंडीशनिंगप्राप्तकर्ता चूहों

  1. बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ मिलीलीटर 3 मिलीग्राम / करने busulfan पतला।
    नोट: यह इंजेक्शन से हर दिन का उपयोग करने के लिए सिर्फ पूर्व busulfan की एक ताजा कमजोर पड़ने बनाने के लिए महत्वपूर्ण है।
  2. दैनिक आईपी इंजेक्शन के माध्यम से प्राप्तकर्ता चूहों को पतला busulfan के 20 मिलीग्राम / किग्रा प्रशासन।
  3. 60-100 मिलीग्राम की कुल खुराक तक 20 मिलीग्राम / किग्रा busulfan के दैनिक आईपी इंजेक्शन दोहराएँ / किग्रा (यानी, एक 80 मिलीग्राम / किग्रा कुल खुराक के लिए, लगातार 4 दिनों के लिए busulfan के 20 मिलीग्राम / किग्रा प्रशासन) दिया गया है।

दाता अस्थि मज्जा की कोशिकाओं 3. अलगाव

नोट: इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक 5 दाता चूहों को ऊपर से बी.एम. कोशिकाओं को अलग-थलग करने और तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। आमतौर पर माउस प्रति सेल उपज 12-16 प्राप्तकर्ता चूहों प्रत्यारोपण के लिए पर्याप्त है, जो लगभग 30-40 करोड़ BMDCs है। अधिक दाता चूहों की जरूरत है, तो प्रोटोकॉल के अनुसार समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।

  1. Busulfan कंडीशनिंग euth के अंतिम दिन के बादसीओ 2 का उपयोग (1-6 महीने पुरानी है) एक GFP दाता माउस anize (या संस्था में स्वीकार अन्य इच्छामृत्यु प्रक्रिया द्वारा)। भ्रष्टाचार जटिलताओं प्राप्तकर्ताओं के रूप में ही सेक्स कर रहे हैं कि syngeneic दाताओं उपयोग से बचने के लिए।
  2. 70% इथेनॉल के साथ माउस स्प्रे। पेट का उपयोग करने और शल्य कैंची में लिफ्ट त्वचा को उदर गुहा टखने की ओर पैर से त्वचा के माध्यम से एक चीरा बनाते हैं। पैर पकड़े, मजबूती से पैर ऊतक उजागर कूल्हे की ओर टखने से त्वचा खींच।
  3. संयुक्त कूल्हे का पर्दाफाश करने फीमर से मांसपेशियों और वसा ऊतकों को दूर ट्रिम।
  4. धीरे पैर का विस्तार करने के लिए पैर पर खींच, वहीं संयुक्त कूल्हे के खिलाफ कैंची दबाएँ। बस फीमर में ही कटौती करने के लिए नहीं फीमर देखभाल के सिर के ऊपर कट।
  5. , बाँझपन बनाए रखने के पैर से पैर पकड़ और autoclaved ऊतकों के साथ हड्डी सतह रगड़ से हड्डियों से किसी भी शेष ऊतक साफ करने में मदद करने के लिए।
  6. संयुक्त घुटने के माध्यम से काटने से फीमर और टिबिया अलग औरबाँझ पीबीएस युक्त एक संस्कृति डिश में फीमर जगह है। बर्फ पर सेते हैं।
  7. निकालें और fibula टिबिया को जोड़ता है, जहां बिंदुओं पर काटने से बहिर्जंघिका त्यागें। फीमर के साथ संस्कृति डिश में टिबिया प्लेस और बर्फ पर सेते हैं।
  8. दोहराएँ दूसरे पैर के लिए 3.2-3.7 कदम है, और यदि आवश्यक हो, अतिरिक्त दाता चूहों। हड्डियों को हटाने के बाद, एक गर्म मनका अजीवाणु साथ सर्जिकल उपकरण जीवाणुरहित या बाद के चरणों के लिए बाँझ उपकरणों का एक नया सेट का उपयोग करें।
  9. Femurs के लिए, संदंश के साथ फीमर पकड़ और ध्यान से 'दाढ़ी' शल्य कैंची का उपयोग कर बाहर का हड्डी बंद समाप्त होता है। बी.एम. गुहा का पर्दाफाश करने के लिए आवश्यक के रूप में हड्डी के रूप में छोटे निकालें।
  10. बाँझ पीबीएस के 3 मिलीलीटर के साथ एक सिरिंज भरें और एक 23 जी सुई देते हैं। ध्यान से बी.एम. गुहा में सुई बोर और एक बाँझ संस्कृति डिश में बी.एम. फ्लश। सभी वांछित कोशिकाओं को हटाने के लिए सुनिश्चित करने के लिए सुई बिंदु के साथ मस्तिष्क गुहा परिमार्जन करने के लिए सुनिश्चित करें। निकासी के बाद,लाल बी.एम. अब नहीं दिख रहा है और हड्डी अब सफेद प्रतीत होता है कि सुनिश्चित करते हैं।
  11. दोहराएँ एक ही संस्कृति डिश में बी.एम. के सभी पूलिंग, बाद में femurs के लिए 3.9-3.10 कदम।
  12. Tibiae के लिए, ध्यान से संदंश के साथ टिबिया और 'दाढ़ी' टिबिया बी.एम. गुहा का पर्दाफाश करने के लिए घुटने से जुड़ा था, जहां अंत पकड़ो। दिखाई लाल बी.एम. समाप्त होता है जहां हड्डी के साथ एक दूसरे कटौती करें।
  13. बाँझ पीबीएस के 3 मिलीलीटर के साथ एक सिरिंज भरें और एक 25 जी सुई देते हैं। धीरे (घुटने से जुड़ा था कि अंत से) बीएम गुहा में सुई डालने और femurs से बी.एम. युक्त संस्कृति डिश में बी.एम. फ्लश। सभी कोशिकाओं को निकालने के लिए सुई के साथ बी.एम. गुहा की दीवारों परिमार्जन। निकासी के बाद, लाल बी.एम. अब नहीं दिख रहा है और हड्डी अब सफेद प्रतीत होता है कि सुनिश्चित करते हैं।
  14. दोहराएँ एक ही संस्कृति डिश में बी.एम. के सभी पूलिंग, बाद में tibiae के लिए 3.12-3.13 कदम।
  15. धीरे सी अलग कर देना करने के लिए एक 1 मिलीलीटर विंदुक टिप के साथ बी.एम. triturateएल।
  16. एक बाँझ 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक 40 माइक्रोन टोकरी फिल्टर के माध्यम से सेल निलंबन से गुजरती हैं। किसी भी शेष कोशिकाओं पाने के लिए और अपकेंद्रित्र ट्यूब में फिल्टर के माध्यम से इस हस्तांतरण करने के लिए पीबीएस के साथ पकवान कुल्ला।
  17. 4 डिग्री सेल्सियस पर 450 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  18. एरिथ्रोसाइट lysing बफर के 3 मिलीलीटर में गोली फिर से निलंबित। 8.5 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
  19. Lysing बफर बुझाने के लिए बाँझ पीबीएस के ~ 30 मिलीलीटर जोड़ें।
  20. 4 डिग्री सेल्सियस पर 450 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  21. बाँझ पीबीएस के 1 मिलीलीटर में गोली फिर से निलंबित। बर्फ पर रखें।
  22. सेल homogenate के एक छोटे से विभाज्य लो और पीबीएस के साथ पतला (1: 100 एक माउस के लिए, 1: 200 2 चूहों के लिए, आदि) एक रुधिरकोशिकामापी का उपयोग करते हुए सेल नंबर यों की।
  23. 8 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल सेल निलंबन पतला और इंजेक्शन जब तक बर्फ पर सेते हैं।

4. अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण

  1. फाईडालूँगा प्रत्येक माउस के लिए पतला सेल निलंबन के 300 μl के साथ (28 जी इंसुलिन की सुई के साथ) एक 0.5 मिलीलीटर सिरिंज इंजेक्शन जा। सिरिंज में मौजूद किसी भी हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए सुनिश्चित करें।
  2. एक हीटिंग पैड पर वातानुकूलित प्राप्तकर्ता चूहों युक्त माउस पिंजरे प्लेस और पूंछ नसों को चौड़ा करने के लिए अनुमति देते हैं।
  3. निरोधक डिवाइस में एक प्राप्तकर्ता माउस और जगह ले लो। 70% इथेनॉल के साथ भिगो शल्य धुंध के साथ पूंछ साफ कर लें।
  4. मजबूती से पूंछ पकड़ और उठाव अप के साथ, धीरे पार्श्व पूंछ नसों में से एक में सुई डालने और सेल निलंबन इंजेक्षन।
  5. खून बह रहा है एक नया स्वच्छ पिंजरे में माउस को शुरू करने से पहले बंद हो जाता है जब तक इंजेक्शन साइट पर शल्य धुंध पकड़ो।

5. बी.एम. काइमेरावाद की सीमा का आकलन

नोट: काइमेरावाद स्तरों एक सप्ताह के बाद BMT पर परिधीय रक्त में आम तौर पर चर रहे हैं, और इस तरह के काइमेरावाद का स्तर सामान्य रूप से कम से कम दो सप्ताह के बाद BMT का अनुमान कर रहे हैं। चिम का स्तरerism के बाद BMT 3-4 हफ्तों के भीतर परिधीय रक्त में> 80% + GFP कोशिकाओं तक पहुँचना चाहिए।

  1. FACS बफर (पीबीएस में 2 मिमी EDTA + 2% भ्रूण गोजातीय सीरम) तैयार करें।
    नोट: FACS बफर कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है।
  2. एक निरोधक ट्यूब में माउस प्लेस और पार्श्व saphenous नस को बेनकाब करने के पीछे पैर पर फर दाढ़ी।
  3. बारीकी कोट पेट्रोलियम जेली और पियर्स एक 25 जी सुई के साथ saphenous नस के साथ पैर।
  4. एक हेपरिन लेपित केशिका ट्यूब के साथ रक्त के लगभग 50 μl ले लीजिए। FACS बफर के 1 मिलीलीटर युक्त एक माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब रक्त जोड़ें। उलटा द्वारा ट्यूब मिश्रण और बर्फ पर दुकान।
  5. वापस पिंजरे में माउस लौटने से पहले बंद हो जाता है खून बह रहा है जब तक इंजेक्शन साइट पर शल्य धुंध पकड़ो।
  6. एक्स जी 900 पर 5 मिनट के लिए रक्त के नमूने अपकेंद्रित्र। निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  7. एरिथ्रोसाइट lysing बफर के 500 μl में गोली फिर से निलंबित। 8.5 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
  8. Lysing बफर बुझाने के लिए FACS बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  9. जी एक्स 900 पर 5 मिनट के लिए नमूने अपकेंद्रित्र। निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  10. एरिथ्रोसाइट lysing बफर के 500 μl में एक दूसरे सेल कदम प्रदर्शन करते हैं। 8.5 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
  11. Lysing बफर बुझाने के लिए FACS बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  12. जी एक्स 900 पर 5 मिनट के लिए नमूने अपकेंद्रित्र। निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। गोली अब सफेद है कि जाँच करें।
    नोट: गोली अभी भी लाल दिखाई देता है, एक अतिरिक्त सेल कदम अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले आवश्यक हो सकता है।
  13. FACS बफर के 1 मिलीलीटर में गोली फिर से निलंबित। जी एक्स 900 पर 5 मिनट के लिए नमूने अपकेंद्रित्र। निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  14. FACS बफर के 300 μl में गोली पुनः निलंबित और फ्लो का उपयोग कर GFP + कोशिकाओं यों (नोट: इस बिंदु पर कोशिकाओं के किसी भी वांछित immunostaining के मानक तकनीक का उपयोग कर, किया जा सकता है, पूर्व cytometric विश्लेषण प्रवाह करने के लिए)।

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Representative Results

60-100 मिलीग्राम के प्रशासन / busulfan किलो आम तौर पर अच्छी तरह से चूहों द्वारा सहन किया है। हालांकि, जानवरों आम तौर पर इस तरह के खाने को प्रोत्साहित करने के लिए किरणित सूरजमुखी के बीज के रूप में व्यवहार करता है के साथ पूरक होना पड़ सकता है कंडीशनिंग चरण (~ 5-10%) और इस प्रकार भोजन के दौरान वजन कम। परिधीय रक्त में> 80% + GFP कोशिकाओं के काइमेरावाद और बीएम के स्तर 60-100 मिलीग्राम / किग्रा busulfan 7 का उपयोग लगातार प्राप्त होना चाहिए। हमारी प्रयोगशाला सफलतापूर्वक परिधीय रक्त और बीएम में> 80% + GFP कोशिकाओं के साथ 100 से अधिक काइमेरिक चूहों उत्पन्न करने के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया गया है, और syngeneic दानदाताओं और प्राप्तकर्ताओं का उपयोग करते समय हमारे BMTs के लगभग सभी सफल रहे हैं। एक चित्रा काइमेरावाद के स्तर साप्ताहिक मात्रा निर्धारित से पता चलता है एक सफल syngeneic BMT प्राप्त 100 मिलीग्राम / किग्रा busulfan साथ वातानुकूलित चूहों के परिधीय रक्त में (एन = 3) और एक असफल अल्लोजीनिक BMT प्राप्त 80 मिलीग्राम / किग्रा busulfan साथ वातानुकूलित चूहों (एन = 3)। > 80% काइमेरावाद स्तरों typicall हैंY 3-4 सप्ताह के द्वारा स्थापित के बाद BMT। चित्रा 2 परिधीय रक्त एक सफल और असफल BMT दिखाने का प्रतिनिधि FACS के डेटा है। 3 इस काइमेरावाद बी.एम. में कम से कम एक साल के लिए स्थापित रहता है कि पता चलता है (एन = 3), और चित्रा वाहन के साथ कि कंडीशनिंग बी.एम. काइमेरावाद प्रेरित करने के लिए पर्याप्त नहीं है (एन = 3)। जबकि वहाँ बी.एम. काइमेरावाद के स्तर में कोई महत्वपूर्ण मतभेद 60-100 मिलीग्राम / किग्रा busulfan, GFP + कोशिकाओं एक खुराक पर निर्भर तरीके से सीएनएस के भीतर जमा की खुराक का उपयोग कर हासिल की। इसके अलावा, इस संचय नाटकीय रूप से इस तरह के ए एल एस 7 के रूप में neurodegenerative विकारों में वृद्धि हुई है। चार एक जंगली प्रकार (एन> 20) और ए एल एस माउस मॉडल (N> 20) में रीढ़ की हड्डी की काठ क्षेत्र के भीतर + GFP सेल संचय दिखाता है चित्रा।

चित्र 1
चित्रा 1. प्राप्तकर्ता चूहों वातानुकूलितbusulfan के साथ और एक syngeneic दाता से + GFP अस्थि मज्जा कोशिकाओं के साथ प्रतिरोपित रक्त में निरंतर काइमेरावाद के एक उच्च स्तर को प्राप्त करने। syngeneic द्वारा पीछा busulfan की 100 मिलीग्राम / किलो के साथ वातानुकूलित सफलतापूर्वक प्रतिरोपित चूहों के परिधीय रक्त में + GFP काइमेरावाद दिखा साप्ताहिक प्रवाह cytometric डेटा अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण (काला) और असफल प्रतिरोपित चूहों अल्लोजीनिक अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण (ग्रे) द्वारा पीछा busulfan के 80 मिलीग्राम / किलो के साथ वातानुकूलित। परिणाम एन = 3 चूहों / समूह से साधन हैं, त्रुटि सलाखों SEM प्रतिनिधित्व करते हैं।

चित्र 2
चित्रा 100 मिलीग्राम / busulfan की किग्रा। (ए) scatterplot दिखा gating रणनीति, (बी) के एक असफल allogen साथ वातानुकूलित चूहों में 3 सप्ताह के अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के बाद परिधीय रक्त में GFP + कोशिकाओं दिखा 2. प्रतिनिधि प्रवाह cytometric डेटाईआईसी अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण, और (सी) एक सफल syngeneic अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण। परिणाम N> 3 चूहों से प्रतिनिधि हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा अस्थि मज्जा एक वर्ष के बाद अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण में GFP + कोशिकाओं दिखा 3. प्रतिनिधि प्रवाह cytometric डेटा। (ए) scatterplot (बी) के वाहन वातानुकूलित चूहे, रणनीति gating दिखा रहा है, और (सी) 100 मिलीग्राम / किग्रा busulfan वातानुकूलित चूहों। परिणाम एन = 3 चूहों से प्रतिनिधि हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 4. अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं को एक अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण दिया busulfan वातानुकूलित चूहों के सीएनएस में संचित। (ए, सी) जंगली प्रकार चूहों और देर से (बी, डी) से पृथक रीढ़ की हड्डी की काठ का क्षेत्र के वर्गों के immunohistochemical विश्लेषण रोग चरण ए एल एस चूहों। GFP + कोशिकाओं हरे रंग में दिखाया गया है। परिणाम एक मॉडल के लिए N> 20 चूहों से प्रतिनिधि छवियाँ हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

Busulfan कंडीशनिंग आसानी से detectable हैं कि hematopoietic कोशिकाओं के साथ चूहों में उच्च स्तर के बीएम काइमेरावाद की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है। यह कंडीशनिंग विकिरण सुविधाओं के लिए आवश्यकता के बिना किया जा सकता है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित busulfan की खुराक के साथ myelosuppression अच्छी तरह से विकिरण के myeloablative खुराक की वजह से विषाक्त दुष्प्रभाव को कम करने, सहन किया है, और इस प्रकार अधिक कर रहे हैं, जवान, बूढ़े, या रोगग्रस्त चूहों में बी.एम. काइमेरावाद उत्पन्न करने के लिए एक अधिक उपयुक्त तकनीक हो सकता है विकिरण myeloablative के लिए अतिसंवेदनशील। Busulfan के साथ प्राप्त उन लोगों की तुलना में कम कर रहे हैं कि काइमेरावाद के स्तर में हो सकता है, कुछ रिक प्रोटोकॉल प्रतिकूल दुष्प्रभावों को कम से कम करने के लिए कुल शरीर विकिरण का कम, गैर myleoablative खुराक का उपयोग करें, लेकिन इन प्रोटोकॉल अभी भी विकिरण की खुराक पर निर्भर करता है, विकिरण सुविधाओं की आवश्यकता होती है और कंडीशनिंग 13। हाल ही में, treosulfan बी.एम. कंडीशनिंग 8,14 के लिए इस्तेमाल किया गया है। Busulfan तरह, treosulfan conditioning और BMT बी.एम. 14 में काइमेरावाद के एक उच्च डिग्री के साथ चूहों पैदा करने में सक्षम है। हालांकि, treosulfan उत्तरी अमेरिका में आसानी से प्राप्य नहीं है, और busulfan कंडीशनिंग के लिए काइमेरावाद के तुलनीय स्तर को प्राप्त करने के लिए आवश्यक treosulfan की खुराक busulfan (~ 5-10 गुना) 14 की तुलना में काफी अधिक है। इसके अलावा, busulfan की तुलना में चूहों में अधिक विषाक्त दुष्प्रभाव (लालकृष्ण Peake, जे मैनिंग, और सी क्रीगर, अप्रकाशित टिप्पणियों) हो गया लगता है treosulfan इन प्रभावी खुराक पर। परिधीय रक्त काइमेरावाद भी शल्य चिकित्सा द्वारा एक दाता माउस के लिए एक प्राप्तकर्ता माउस के संचलन को जोड़ने शामिल है जो parabiotic चूहों की पीढ़ी के माध्यम से स्थापित किया जा सकता है। Parabiosis केवल पेरी में 50% दाता कोशिकाओं ~ में यह परिणाम है कि एक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण प्रक्रिया है, हालांकि पूरे बी.एम. प्रत्यारोपण के विपरीत, parabiosis, संचलन में बी.एम. प्रतिबंधित पूर्वज कोशिकाओं को शुरू करने के बिना एक अधिक शारीरिक ढंग से स्थापित करने के लिए परिधीय रक्त काइमेरावाद के लिए अनुमति देता हैप्राप्तकर्ता चूहों 15 के pheral खून।

यहाँ उल्लिखित प्रोटोकॉल प्रत्यारोपण अस्वीकृति की संभावना को कम करने के लिए, एक ही सेक्स कर रहे हैं कि प्राप्तकर्ता और दाता चूहों का उपयोग, साथ ही syngeneic प्राप्तकर्ता और दाता माउस उपभेदों का उपयोग करने पर निर्भर करता है। कई उपयुक्त दाता और प्राप्तकर्ता उपभेदों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, बेमेल अल्लोजीनिक चूहों में काइमेरावाद स्थापित करने (यानी, एमएचसी haplotype में काफी अलग) समस्याग्रस्त हो सकता है। अल्लोजीनिक चूहों ही उपयुक्त चूहों उपलब्ध हैं, जहां इस तरह के मामलों में, एक प्रारंभिक अध्ययन पहली busulfan कंडीशनिंग स्थिर काइमेरावाद के एक उच्च डिग्री के लिए अग्रणी में सक्षम है, तो यह निर्धारित करने के लिए चूहों के एक छोटे समूह पर बाहर किया जाना चाहिए। नहीं सभी प्रतिरोपित चूहों निरंतर काइमेरावाद (~ 30%) की स्थापना की है, हालांकि SJL प्राप्तकर्ताओं, हम C57BL 6 / में C57BL 6 /-GFP चूहों से अलग दाता BMDCs रोपाई कुछ सफलता मिली है। साइक्लोफॉस्फेमाईड के अलावा, अक्सर एक मजबूत प्रतिरक्षादमनकारी एजेंट यू केbusulfan चिकित्सकीय 16 के साथ संयोजन के रूप में sed, अल्लोजीनिक प्रत्यारोपण की सफलता की दर में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। C57BL 6 /-GFP कोशिकाओं को एक मिश्रित C57BL 6 / पर अल्जाइमर रोग के एक ट्रिपल ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में प्रत्यारोपित किया गया हालांकि, जब; 129 आनुवंशिक पृष्ठभूमि, busulfan और साइक्लोफॉस्फेमाईड कंडीशनिंग स्थिर engraftment, जबकि स्थिर बी.एम. काइमेरा (चित्रा 2B) पैदा करने के लिए अपर्याप्त थे घातक विकिरण निम्नलिखित संभव हो गया था। इस प्रकार, अल्लोजीनिक प्रत्यारोपण की आवश्यकता होती है जहां स्थितियों में, विकिरण की वजह से होता है कि पूरा myeloablation और गंभीर प्रतिरक्षादमन के लिए एक अधिक उपयुक्त कंडीशनिंग आहार हो सकता है।

कई अतिरिक्त उपाय इस प्रोटोकॉल के काइमेरावाद और स्थिरता को अधिकतम करने के क्रम में लिया जाना चाहिए। यह busulfan की शक्ति लंबी अवधि के साथ कम किया जा करने के लिए प्रकट होता है के रूप में busulfan की ताजा dilutions के आदर्श से ठीक पहले busulfan प्रशासन के लिए, इंजेक्शन के लिए तैयार कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण हैभंडारण। कोशिकाओं को अलग कर देना बी.एम. triturating ही, जब यह बी.एम. कोशिकाओं को नुकसान के रूप में नहीं तो धीरे ऐसा करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह पूरी तरह से बेहतर होगा फलस्वरूप अलग कोशिकाओं के एक से थोड़ा कम उपज, समग्र स्वास्थ्य और गुणवत्ता अलग है, और नहीं कर रहे हैं कि ऊतक के कुछ clumps में परिणाम हो सकता है। इसी तरह, गोली की फिर से निलंबन की आवश्यकता है कि किसी भी कदम भी धीरे से किया जाना चाहिए।

काइमेरावाद के उच्च स्तर पर लगातार साथ प्राप्त किया जा सकता है 60, 80 और 100 मिलीग्राम / busulfan 7 किलो खुराक (आंकड़े 1-3)। इसके अलावा, जंगली प्रकार 8,9 और ए एल एस चूहों 7 की सीएनएस में GFP + कोशिकाओं के संचय में एक खुराक पर निर्भर वृद्धि हुई है। हम और दूसरों को भी जंगली प्रकार चूहों 7,8,10 की तुलना में neurodegeneration के माउस मॉडल की सीएनएस के भीतर GFP + कोशिकाओं जमते की संख्या में वृद्धि मनाया है। + GFP बी.एम. का एक भी अधिक से अधिक संख्या में घातक विकिरण परिणामDCs 60-100 मिलीग्राम / किग्रा खुराक busulfan 7 के एक ताजा अध्ययन के अनुसार मस्तिष्क में GFP + कोशिकाओं के एक उच्च संख्या में busulfan (125 मिलीग्राम / किग्रा) के परिणामों के एक myeloablative खुराक शरीर के कुल विकिरण 9 की तुलना में पता चलता है कि यद्यपि की तुलना में। साक्ष्य घातक विकिरणित चूहों के सीएनएस में BMDC प्रविष्टि रक्त मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) के विघटन के लिए, कम से कम हिस्से में होने के कारण हो सकता है कि पता चलता है। Busulfan सीएनएस 11 भीतर सीरम प्रोटीन (एल्बुमिन) की अनुपस्थिति पर आधारित बीबीबी को बाधित करने के लिए प्रकट नहीं होता है, वहीं busulfan आसानी से बीबीबी 17,18 पार करने में सक्षम है और इस तरह यह busulfan कंडीशनिंग भीतर आला खुला स्थान हो सकता है कि सुझाव दिया गया है बाद में BMDCs 8 से भर जाता है कि सीएनएस। दिलचस्प है, विल्किनसन एट अल। के निष्कर्षों घातक विकिरणित चूहों में + GFP सेल संचय inflammator की वजह से प्रतीत होता है, जबकि GFP + कोशिकाओं के कारण एक केमोकाइन भर्ती तंत्र को busulfan वातानुकूलित चूहों के सीएनएस में जमा सुझाव है किविकिरण से ही 9 द्वारा उत्पन्न Y तंत्र। Treosulfan सीएनएस हालत को प्रकट नहीं होता है और फलस्वरूप कुछ GFP + कोशिकाओं treosulfan वातानुकूलित चूहों 8 की सीएनएस के भीतर पाए गए। Busulfan यकृत, फेफड़े, और गुर्दे 6 लक्षित करने के लिए जाना जाता है, हालांकि यह सीएनएस के अलावा अन्य ऊतकों पर पड़ सकता है busulfan का प्रभाव अलग खुराक निर्धारित किया जाना बना रहता है। नए प्रयोगों के लिए busulfan की एक खुराक का चयन करते समय अन्य ऊतकों हालत हो सकता है कि busulfan को ध्यान में रखा जाना चाहिए।

इस busulfan कंडीशनिंग प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है, वहीं चिमेरिक बी.एम. के साथ चूहों की पीढ़ी hematopoietic कोशिकाओं की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक शक्तिशाली उपकरण है। आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों और BMDCs करने की क्षमता के साथ-साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ट्रांसजेनिक चूहों की व्यापक रेंज, नाटकीय रूप से इस प्रोटोकॉल की क्षमता बढ़ जाती है। उदाहरण के लिए, विभिन्न माउस मॉडल GFP अभिव्यक्ति के लिए प्रतिबंधित है, जहां मौजूदmyelomonocytic वंश कोशिकाओं 19 में मुख्य रूप से व्यक्त GFP कि इस तरह के CX3CR1-GFP के चूहों के रूप में विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं और प्रजातियों। इन चूहों विवो में विशिष्ट hematopoietic सेल आबादी की जांच के लिए अनुमति दाताओं के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। अलग fluorophores की संख्या भी, प्रतियोगिता assays के 20 के लिए नियोजित किया जा सकता है कि एक तकनीक प्रत्यारोपण और दो ​​(या अधिक) अलग दाताओं से BMDCs पर नजर रखने के क्रम में इस्तेमाल किया जा सकता है, जो GFP के लिए इसके अलावा, में मौजूद हैं। इसके अलावा, इस रोग के विभिन्न ट्रांसजेनिक माउस मॉडल की एक संख्या है कि विकारों की एक किस्म में BMDCs की भूमिका की जांच करने के लिए प्राप्तकर्ता के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता मौजूद हैं। प्रत्यारोपण के बाद, दाता कोशिकाओं immunohistochemistry के उपयोग विश्लेषण किया जा सकता है, या FACS द्वारा पृथक और जैव रासायनिक तकनीक की एक सीमा का उपयोग कर जांच की। इसके अलावा, इस तरह के दो photon माइक्रोस्कोपी के रूप में उन्नत इमेजिंग तकनीक ऐसी GFP के 21 के रूप में fluorophores के विवो का पता लगाने में जीने के लिए लागू किया जा सकता है। अंत में, यहBMDCs अनुवांशिक इंजीनियर और busulfan वातानुकूलित प्राप्तकर्ताओं में इस तरह के सीएनएस के रूप में ऊतकों को लक्षित करने के लिए चिकित्सकीय अणुओं देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कल्पना की है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Busulfex Otsuka Canada Pharmaceutical Inc. DIN 02240602 Dilute busulfan to 3 mg/mL with sterile PBS just prior to use. Busulfan is cytotoxic. Handle and dispose according to the MSDS and institutional guidelines.
ACK Lysing Buffer Life Technologies A10492-01 Other lysis buffer could be substituted but incubation times may need to be adjusted accordingly
Fetal Bovine Serum Life Technologies 12483-020

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