Busulfan como Agente mielosupressores para a geração estável de alto nível de Medula Óssea quimerismo em Ratos

Medicine

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Peake, K., Manning, J., Lewis, C. A., Barr, C., Rossi, F., Krieger, C. Busulfan as a Myelosuppressive Agent for Generating Stable High-level Bone Marrow Chimerism in Mice. J. Vis. Exp. (98), e52553, doi:10.3791/52553 (2015).

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Abstract

Protocol

NOTA: Ética Declaração: Este protocolo foi revisto e aprovado pelo Comitê de Cuidados Animal da Simon Fraser University (UACC; permitir números 1037K-12 e 1060K-03) e está em conformidade com a Canadian Council on Animal Care, o Guia do NIH para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório, e da Directiva do Conselho CEE.

1. Considerações Especiais

NOTA: O bussulfano é citotóxica. Manusear e eliminar de acordo com a ficha de segurança e diretrizes institucionais.

  1. Executar todas as técnicas de forma asséptica numa campânula de fluxo laminar.
  2. Esterilizar instrumentos antes da sua utilização por envolvimento em um material de embalagem adequado, tal como um pacote de casca, e autoclavagem.
  3. Embora o risco de infecção é baixo comparado com o condicionamento de busulfano a irradiação, apenas tratar os animais numa câmara de fluxo laminar para as primeiras 2 semanas após o transplante.

2. Condicionamento deOs ratinhos receptores

  1. Diluir busulfan, a 3 mg / ml com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS).
    NOTA: É importante fazer uma nova diluição de busulfan imediatamente antes de usar cada dia da injeção.
  2. Administrar 20 mg / kg de busulfano diluída para murganhos receptores por via de injecção IP diariamente.
  3. Repita injecções IP diárias de 20 mg / kg de busulfano até uma dose total de 60-100 mg / kg foi administrada (isto é, para um 80 mg / kg dose total, administrar 20 mg / kg de busulfano durante 4 dias consecutivos).

3. Isolamento de Doadores de Medula Óssea Cells

NOTA: Este protocolo tem sido utilizado com sucesso para isolar e preparar a partir de células de MO até 5 ratinhos dadores. Normalmente, o rendimento das células por rato é de aproximadamente 30-40000000 BMDCs, o que é suficiente para transplantar 16/12 ratos destinatário. Se forem necessários mais ratos doadores o protocolo pode precisar de ser ajustado em conformidade.

  1. Após o último dia de busulfan condicionado euthanize um rato doador GFP (1-6 meses de idade), utilizando CO 2 (ou de qualquer outro procedimento de eutanásia aceitos na instituição). Para evitar complicações de enxerto utilizar doadores singeneicas que são do mesmo sexo, como os destinatários.
  2. Spray de rato com etanol 70%. Elevador pele nas tesouras cirúrgicas abdómen e utilizando-se a incisão através da pele a partir da cavidade abdominal para cima da perna para o tornozelo. Segurando o pé, firmeza da pele a partir do tornozelo para o quadril expondo o tecido perna.
  3. Apare músculo e tecido adiposo do fêmur para expor a articulação do quadril.
  4. Enquanto puxa suavemente no pé para estender a perna, pressione a tesoura contra a articulação do quadril. Corte logo acima da cabeça do fêmur tomando cuidado para não cortar o próprio fêmur.
  5. Para ajudar a manter a esterilidade, segure a perna pelo pé e limpe qualquer tecido restante dos ossos, esfregando a superfície do osso com tecidos autoclavada.
  6. Separe o fêmur e da tíbia, cortando através da articulação do joelho ecoloque o fêmur em uma placa de cultura contendo PBS estéril. Incubar em gelo.
  7. Retire e elimine a fíbula por corte nos pontos em que a fíbula se conecta à tíbia. Coloque a tíbia do prato de cultura com o fémur, e incubar em gelo.
  8. Repita os passos de 3,2-3,7 para a outra perna, e se necessário, dos ratinhos dadores adicionais. Após a remoção dos ossos, esterilizar os instrumentos cirúrgicos com um esterilizador quente talão ou usar um novo conjunto de ferramentas estéreis para as etapas subseqüentes.
  9. Para os fêmures, segure o fêmur com uma pinça e usando uma tesoura cirúrgica cuidadosamente "shave" as extremidades distais da osso. Remover o mínimo do osso como necessário para expor a cavidade BM.
  10. Encha uma seringa com 3 ml de PBS estéril e anexar uma agulha G 23. Suportou cuidadosamente a agulha na cavidade BM e lave o BM em um prato de cultura estéril. Certifique-se de raspar a cavidade medular com a ponta da agulha para assegurar a remoção de todas as células desejadas. Após a extracção,assegurar que o BM vermelho já não é visível e o osso agora parece branca.
  11. Repita os passos 3,9-3,10 para fêmures posteriores, reunindo todo o BM no mesmo prato de cultura.
  12. Para as tíbias, segure a tíbia com uma pinça e cuidadosamente "shave" o final, onde a tíbia foi anexado ao joelho para expor a cavidade BM. Faça um segundo corte ao longo do osso onde o BM vermelho visível termina.
  13. Encha uma seringa com 3 ml de PBS estéril e anexar uma agulha G 25. Inserir a agulha suavemente para dentro da cavidade BM (a partir da extremidade que foi ligado ao joelho) e lave o BM para o prato de cultura contendo o BM a partir dos fémures. Raspe as paredes da cavidade BM com a agulha para remover todas as células. Após a extracção, garantir que o BM vermelho não é mais visível e o osso agora aparece branco.
  14. Repita os passos de 3,12-3,13 para tíbias subsequente, reunindo todo o BM no mesmo prato de cultura.
  15. Delicadamente, triturar o BM com uma ponteira de 1 ml para dissociar a cvaras.
  16. Passar a suspensão de células através de um filtro de carrinho 40 uM em um tubo de centrífuga de 50 mL estéril. Lave o prato com PBS para obter todas as células restantes e transferir este através do filtro no tubo de centrífuga.
  17. Centrifugar durante 5 minutos a 450 xg, a 4 ° C. Retire e elimine o sobrenadante.
  18. Re-suspender o sedimento em 3 ml de tampão de lise de eritrócitos. Incubar em gelo durante 8,5 min.
  19. Adicionar ~ 30 ml de PBS estéril para saciar o tampão de lise.
  20. Centrifugar durante 5 minutos a 450 xg, a 4 ° C. Retire e elimine o sobrenadante.
  21. Re-suspender o sedimento em 1 ml de PBS estéril. Mantenha no gelo.
  22. Tomar uma pequena aliquota do homogeneizado de células e dilui-se com PBS (1: 100 para 1 de ratinho; 1: 200 durante 2 murganhos, etc.) para quantificar o número de células utilizando um hemocitómetro.
  23. Dilui-se a suspensão de células a 8 x 10 6 células / ml e incuba-se em gelo até injecção.

4. Transplante de Medula Óssea

  1. Fill uma seringa de 0,5 ml (com uma agulha de insulina 28 L) com 300 uL de suspensão diluída de células para cada ratinho a ser injectado. Certifique-se de remover todas as bolhas de ar presentes na seringa.
  2. Coloque a gaiola do rato contendo os ratinhos receptores condicionados numa almofada de aquecimento e permita que as veias da cauda para dilatar.
  3. Tome um rato destinatário e lugar no dispositivo de retenção. Limpe a cauda com gaze cirúrgica embebido com álcool 70%.
  4. Segurar firmemente a cauda e com o bisel para cima, inserir a agulha suavemente numa das veias da cauda laterais e injectar a suspensão de células.
  5. Segurar gaze cirúrgica no local da injecção até o sangramento pára antes de introduzir o rato em uma gaiola limpa novo.

5. estimativa da extensão da BM quimerismo

NOTA: Os níveis de quimerismo são tipicamente variável no sangue periférico em uma semana pós-TMO, e, como tal, os níveis de quimerismo são normalmente estimada pelo menos 2 semanas de pós-TMO. Níveis de chimerism deve atingir> 80% GFP + células no sangue periférico dentro de 3-4 semanas pós-TMO.

  1. Preparar tampão de FACS (2 mM de EDTA + 2% de soro fetal de bovino em PBS).
    NOTA: tampão FACS pode ser armazenado a 4 ° C durante várias semanas.
  2. Posicione o mouse em um tubo de restrição e raspar a pele na perna posterior para expor a veia safena lateral.
  3. Coat fina da perna com vaselina e perfuram a veia safena com uma agulha 25 G.
  4. Recolhe aproximadamente 50 ul de sangue num tubo capilar com heparina revestidos. Adicionar o sangue para um tubo de micro-centrifugação contendo 1 ml de tampão de FACS. Misturar por inversão do tubo e armazenar em gelo.
  5. Segure gaze cirúrgica no local da injeção, até o sangramento parar antes de retornar mouse de volta para a jaula.
  6. Centrifuga-se as amostras de sangue durante 5 minutos a 900 x g. Retire e elimine o sobrenadante.
  7. Re-suspender o sedimento em 500 mL de tampão de lise de eritrócitos. Incubar em gelo durante 8,5 min.
  8. Adicionar 1 mL de tampão de FACS para extinguir o tampão de lise.
  9. Centrifuga-se as amostras durante 5 min a 900 x g. Retire e elimine o sobrenadante.
  10. Executar um segundo passo de lise em 500 uL de tampão de lise de eritrócitos. Incubar em gelo durante 8,5 min.
  11. Adicionar 1 mL de tampão de FACS para extinguir o tampão de lise.
  12. Centrifuga-se as amostras durante 5 min a 900 x g. Retire e elimine o sobrenadante. Verifique se o pellet é agora branco.
    NOTA: Se o pellet ainda aparece de vermelho, uma lise adicional pode ser necessária antes de prosseguir para a próxima etapa.
  13. Re-suspender o sedimento em 1 ml de tampão de FACS. Centrifuga-se as amostras durante 5 min a 900 x g. Retire e elimine o sobrenadante.
  14. Re-suspender o sedimento em 300 ul de tampão de FACS e quantificar as células GFP + utilizando citometria de fluxo (NOTA: Nesta altura desejada qualquer imunocoloração das células pode ser realizada, usando técnicas convencionais, antes da análise por citometria de fluxo).

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Representative Results

A administração de 60-100 mg / kg de busulfano é geralmente bem tolerada pelos ratinhos. No entanto, os animais normalmente perdem peso durante a fase de condicionamento (~ 5-10%) e, assim, a dieta pode ter de ser complementada com guloseimas como irradiados sementes de girassol para promover a alimentação. Os níveis de quimerismo de células de> 80% para GFP + no sangue periférico e BM deve ser consistentemente alcançável usando 60-100 mg / kg de busulfano 7. Nosso laboratório tem utilizado com sucesso este protocolo para gerar mais de 100 ratos quiméricos com> 80% GFP + células no sangue periférico e BM, e praticamente todos os nossos BMTs são bem sucedidos quando utilizar doadores sing�icos e destinatários. A Figura 1 mostra os níveis de quimerismo quantificadas semanalmente no sangue periférico dos murganhos condicionados com 100 mg / kg de busulfano receber um singeneicos TMO sucesso (n = 3) e murganhos condicionados com 80 mg / kg de busulfano que recebem um vencida BMT alogénica (n = 3). Níveis de quimerismo> 80% são typically estabelecida por 3-4 semanas pós-BMT. A Figura 2 representa dados representativos de FACS de sangue periférico apresentando um TMO com e sem sucesso. A Figura 3 mostra que este quimerismo permanece estabelecido por pelo menos um ano em BM (n = 3), e que o condicionamento com veículo não é suficiente para induzir quimerismo BM (n = 3). Apesar de não haver diferenças significativas nos níveis de BM quimerismo conseguido usando doses de 60-100 mg / kg de busulfano, para GFP + células se acumular dentro do SNC de uma maneira dependente da dose. Além disso, esta acumulação é dramaticamente aumentada em doenças neurodegenerativas tais como ALS 7. A Figura 4 ilustra GFP + acumulação de células no interior da região lombar da medula espinal em um de tipo selvagem (n> 20) e modelo de ratinho de ALS (n> 20).

Figura 1
Figura 1. Os ratinhos receptores condicionadocom busulfano e transplantados com células GFP + de medula óssea de um dador singénico atingir um elevado nível de quimerismo sustentada no sangue. dados de citometria de fluxo semanais mostrando GFP + quimerismo no sangue periférico de ratos transplantados com sucesso condicionados com 100 mg / kg de busulfano seguido por singeneicos O transplante de medula óssea (negro) e sem sucesso ratinhos transplantados condicionado com 80 mg / kg de busulfano seguido por transplante de medula óssea alogénica (cinzento). Os resultados são médias de n = 3 ratos / grupo, as barras de erro representam SEM.

Figura 2
Figura 2. Os dados de citometria de fluxo que mostram representativos GFP + células no sangue periférico, 3 semanas após o transplante de medula óssea em ratinhos condicionados com 100 mg / kg de busulfano. (A) Dispersão estratégia mostrando gating, (B) um allogen vencidaO transplante de medula óssea eic, e (C) um transplante de medula óssea singeneica bem sucedida. Os resultados são representativos de n> 3 ratos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Os dados de citometria de fluxo que mostram representativos GFP + células na medula óssea após 1 ano de transplante de medula óssea. (A) Scatterplot mostrando gating estratégia, (B) de veículos condicionado ratos e camundongos (C) 100 mg / kg de busulfano condicionado. Os resultados são representativos de n = 3 ratos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


Figura 4. medula óssea células derivadas acumular no SNC de busulfano condicionado ratos que receberam um transplante de medula óssea. A análise imuno-histoquímica de secções da região lombar da medula espinal isolado a partir de (A, C) e os ratinhos do tipo selvagem (B, D) tarde estágio da doença ratos com ELA. GFP + são mostrados em verde. Os resultados são imagens representativas de n> 20 ratos para cada modelo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Busulfano condicionado permite a geração de alto nível BM quimerismo em ratinhos com células hematopoiéticas, que são prontamente detectáveis. Este condicionamento pode ser realizado sem a necessidade de instalações de irradiação. Além disso, a mielossupressão com as doses de bussulfano descrito neste protocolo é bem tolerado, minimizando os efeitos secundários tóxicos causados ​​por doses mieloablativas de irradiação, e, portanto, pode ser uma técnica mais apropriada para gerar BM quimerismo em jovens, idosos, ou doentes ratinhos que são mais susceptíveis a irradiação mieloablativa. Alguns protocolos RIC usar doses baixas, não myleoablative de irradiação total do corpo para minimizar os efeitos secundários adversos, mas estes protocolos requerem ainda instalações de irradiação e, dependendo da dose de irradiação, pode resultar em níveis de quimerismo que são mais baixos do que as realizáveis ​​com busulfano condicionado 13. Recentemente, treosulfan foi usado para BM condicionado 8,14. Como busulfan, conditi treosulfanoning BMT e é capaz de gerar ratos com um elevado grau de quimerismo no BM 14. No entanto, treosulfan não é facilmente atingível na América do Norte, e a dose de treosulfan necessários para atingir níveis comparáveis ​​de quimerismo de condicionamento busulfano é significativamente maior do que o busulfan (~ 5-10 vezes) 14. Além disso, a estas doses eficazes treosulfan parece ter efeitos secundários mais tóxicos em ratos em comparação com bussulfano (K. Peake, J. Manning, e C. Krieger, observações não publicadas). Quimerismo sangue periférico também pode ser estabelecida através de geração de camundongos parabiótico, que envolve a ligação cirurgicamente a circulação de um rato destinatário para um rato doador. Ao contrário de transplantes integrais BM, parabiosis permite quimerismo sangue periférico a ser estabelecida de forma mais fisiológica sem a introdução de células progenitoras BM-restritas para a circulação, embora parabiosis é um procedimento tecnicamente desafiador que só resulta em ~ 50% de células de doadores nas zonas peripheral sangue de camundongos destinatário 15.

O protocolo aqui descrito baseia-se usando ratinhos receptores e doadores, que são do mesmo sexo, assim como a utilização de estirpes receptoras e de murganho singeneicas dador, a fim de minimizar a possibilidade de rejeição do transplante. Embora muitas estirpes dadoras e receptoras adequadas estão disponíveis comercialmente, que estabelece o quimerismo alogénico em ratos sem correspondência (isto é, diferem significativamente no haplotipo MHC) pode ser problemático. Em tais casos onde os ratos alogénicos são os únicos ratinhos adequadas, um estudo preliminar deve primeiro ser realizada num pequeno grupo de ratinhos para determinar se o busulfan condicionado é capaz de conduzir a um elevado grau de quimerismo estável. Temos tido algum sucesso o transplante BMDCs doadores isoladas a partir de ratinhos C57BL / 6-GFP em ratinhos C57BL / 6; SJL receptores, embora nem todos os ratinhos transplantados estabelecido quimerismo sustentada (~ 30%). A adição de ciclofosfamida, um forte agente imunossupressor frequentemente used em conjunto com busulfano clinicamente 16, pode ser usado para melhorar a taxa de sucesso dos transplantes alogénicos. No entanto, quando as células / 6-GFP C57BL foram transplantadas para um modelo de ratinho transgénico triplo da doença de Alzheimer em um C57BL / 6 mista; 129 fundo genético, bussulfano e ciclofosfamida condicionado foram insuficientes para gerar quimeras BM estáveis ​​(Figura 2B), ao passo que o enxerto estáveis foi possível após a irradiação letal. Assim, em situações em que são necessárias transplantes alogénicos, a irradiação pode ser um regime mais adequado condicionado devido ao mieloablação completa e imunossupressão grave que ocorre.

Várias medidas adicionais devem ser tomadas a fim de maximizar o quimerismo e consistência deste protocolo. É fundamental que as diluições frescas de busulfano são preparadas para injecção, de preferência imediatamente antes da administração de busulfano, tal como a potência de busulfano parece ser reduzida com a longo prazoarmazenamento. Além disso, quando a trituração BM para dissociar as células, é importante fazê-lo com cuidado para não danificar as células de MO. Enquanto isto pode resultar em alguns aglomerados de tecido que não são completamente dissociados e, consequentemente, um rendimento ligeiramente inferior, a saúde geral e a qualidade das células dissociadas vão ser melhor. Da mesma forma, todas as etapas que requerem re-suspensão da pelota também deve ser feito com cuidado.

Altos níveis de quimerismo pode ser consistentemente alcançada com 60, 80 e 100 mg / kg doses de bussulfano 7 (Figuras 1 - 3). Além disso, existe um aumento dependente da dose na acumulação de GFP + células no sistema nervoso central do tipo-selvagem de 8,9 e 7 ratinhos de ELA. Nós e outros também observado um aumento no número de acumulação de GFP + células dentro do SNC de ratos de neurodegeneração em comparação com ratinhos de tipo selvagem 7,8,10. Irradiação resultados letais em um número ainda maior de GFP + BMDCs em comparação com 60-100 mg / kg, as doses de bussulfano 7 embora um estudo recente sugere que uma dose de busulfano mieloablativa (125 mg / kg) resulta em um maior número de células GFP + no cérebro em relação à irradiação total do corpo 9. A evidência sugere que a entrada BMDC no SNC de ratinhos letalmente irradiados pode ser devido, pelo menos em parte, ao rompimento da barreira sangue-cérebro (BBB). Enquanto busulfano não parece perturbar a certificação com base na ausência de proteínas do soro (albumina) no SNC 11, busulfano é capaz de facilmente atravessar a BHE 17,18 e, assim, tem sido sugerido que o condicionamento busulfano pode abrir-se dentro do espaço nicho SNC, que é posteriormente preenchido por BMDCs 8. Curiosamente, os resultados de Wilkinson et ai. Sugerem que as células GFP + acumular-se no SNC de busulfano condicionado ratinhos, devido a um mecanismo de recrutamento quimiocina enquanto acumulação de células GFP + em ratinhos irradiados letalmente parece ser devido a inflammatory mecanismos gerados pelo próprio irradiação 9. Não Treosulfan não aparecer para condicionar o CNS e, consequentemente, poucas células GFP + foram encontrados no SNC de camundongos treosulfan condicionado 8. Mantém-se a determinar os efeitos de diferentes doses de bussulfano pode ter sobre o SNC do que outros tecidos, embora o busulfano é conhecida para atingir o fígado, os pulmões e os rins 6. Busulfano que pode condicionar outros tecidos devem ser tomados em consideração na escolha de uma dose de busulfano para novas experiências.

Embora este protocolo de busulfano condicionado é relativamente simples de realizar, a geração de ratinhos com BM quimérico é uma ferramenta poderosa que pode ser utilizada para investigar as células hematopoiéticas. A ampla gama de camundongos transgênicos disponíveis no mercado, juntamente com a capacidade de camundongos geneticamente modificados máquinas e BMDCs, aumenta drasticamente o potencial deste protocolo. Por exemplo, existem vários modelos de ratinhos, onde a expressão da GFP é restrita atipos específicos de células e linhagens, tais como ratinhos CX3CR1-GFP que expressam GFP predominantemente em células de linhagem mielomonocítica 19. Estes ratinhos podem ser usados ​​como doadores permitindo a investigação das populações de células hematopoiéticas específicas in vivo. Um número de diferentes fluoróforos também existir em adição ao GFP, que pode ser usado a fim de transplante e monitorizar BMDCs de dois (ou mais) diferentes doadores, uma técnica que pode ser utilizada para ensaios de competição 20. Além disso, existe um número de diferentes modelos de ratinhos transgénicos de doença que pode ser utilizado como recipiente para investigar o papel de BMDCs em uma variedade de desordens. Após o transplante, as células dadoras podem ser analisados ​​usando imuno-histoquímica, ou isolados por FACS e investigado usando uma variedade de técnicas bioquímicas. Além disso, tecnologias avançadas de imagem, como a microscopia de dois fótons podem ser implementadas para viver na detecção vivo de fluorophores como GFP 21. Em última análise, issoPrevê-se que BMDCs pode ser geneticamente modificada e usados ​​para entregar moléculas terapêuticas para os tecidos alvo, tais como o SNC em receptores condicionado de busulfano.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Busulfex Otsuka Canada Pharmaceutical Inc. DIN 02240602 Dilute busulfan to 3 mg/mL with sterile PBS just prior to use. Busulfan is cytotoxic. Handle and dispose according to the MSDS and institutional guidelines.
ACK Lysing Buffer Life Technologies A10492-01 Other lysis buffer could be substituted but incubation times may need to be adjusted accordingly
Fetal Bovine Serum Life Technologies 12483-020

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References

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