הדמיה של תא חי במהלך מכאני למתוח

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Rápalo, G., Herwig, J. D., Hewitt, R., Wilhelm, K. R., Waters, C. M., Roan, E. Live Cell Imaging during Mechanical Stretch. J. Vis. Exp. (102), e52737, doi:10.3791/52737 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

תאים חשופים לעומסים מכאניים ברקמות רבות, וגירוי מכאני זה הוכח לקדם שינויים בדפוסי ביטוי גנים, שחרור של גורמי גדילה, ציטוקינים, או שיפוץ של מטריקס ושלד תא 1-4. האותות תאיים transduced מגירויים מכאניים כאלה מתרחשים בתהליך של mechanotransduction 5-7. במערכת הנשימה, תוצאה אחת של mechanotransduction היא העלייה במינים תגובתי חמצן (ROS) 8,9 וציטוקינים פרו-דלקתי 10 בתאי אפיתל ריאה בנוכחות של מתח מתיחה מחזורי. ראיות חזקות גם מצביעות על כך שזן מתיחה מוגזם מוביל לכוון פגיעה באפיתל מכתשי, בנוסף לתגובות הביוכימיות של תאי 11-14. למרות ההתמקדות כאן היא בראש ובראשונה על התגובה של תאי ריאה לעיוות מכאנית, מסלולים הנגרמים על ידי mechanotransduction לשחק תפקיד מפתח בbasפונקצית IC של רקמות רבות בגוף האדם, ובכלל זה הסדרה טון של כלי דם 15 והפיתוח של צלחת צמיחת 16.

ההתעניינות הגוברת בmechanotransduction הביאה בפיתוח של מכשירים רבים ליישום של עומסים מכאניים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית לתאים ורקמות בתרבית. בפרט, מכשירי החלת מתח מתיחה, אשר הוא צורה נפוצה של העמסה מכאנית המנוסים על ידי רקמות, פופולריים 11,17-19. עם זאת, רב של ההתקנים הזמינים נועדו גם כbioreactor עבור יישומי הנדסת רקמות או לא תורם להדמיה בזמן אמת עם מתיחה. ככזה, יש צורך בפיתוח כלים ושיטות שיכולים לדמיין תאים ורקמות במתח כדי להקל על החקירה של מסלולים של mechanotransduction.

במסמך זה, מכשיר מתיחה מכאני במטוס תוכנן ופרוטוקולים שפותחו כדי להחיל מ 'צורות ultiple של מתח לרקמות ותאים ומאפשרים הדמיה של התגובות ביוכימיות ומכאניות בזמן אמת (איור 1 א-ד). המכשיר משתמש בשישה מלחציים מחולק באופן שווה המסודרים circumferentially לתפוס קרום גמיש וליישם, התנפחות עד רדיאלי במטוס לכ -20% (איור 1). מכשיר actuating יכול להיות ממוקם בתרבית תאי חממה לתקופה ארוכה של זמן, ואילו מנוע (איור 1 ג) ממוקם מחוץ לחממה ונשלט על ידי תוכנת קניינית הניתנת על ידי ספק המנוע. המנוע מחובר לנהג ליניארי, אשר מסתובב מצלמת פנימית, נהיגה שישה מלחציים האלונקה אחידה במתח והרפיה.

בנוסף למכשיר המכני, קרומים גמישים מותאמים אישית נוצרו מקרומים מוכנים תרבית תאים זמינים מסחרית לשימוש במערכת המכנית. קירות ואז עגולים (בקוטר של כ28 מ"מ) נעשה ומצורף בקרום גמיש, כך שתאים יכולים להיות מתורבת רק באזור זה של פרופיל מתח מתואר היטב. על מנת לקבוע אם המיקום של הקרומים האלה בתוך המכשיר actuating יספק מתח אחיד ואיזוטרופי במרכז של הקרום גמיש, ניתוח אלמנטים סופי נערך באמצעות תוכנה זמינה באופן מסחרי (איור 1E-F). הקרום גמיש היה דגם עם תנאי גבול סימטריים וניצול כל האלמנטים מרובע לרשת. הטבעות קונצנטריות ראו בעלילת קווי המתאר של זן עיקרי מרבי שמוצגת באיור 1F לציין את חלוקת איזוטרופיים של הזן.

המתח שעבר על הקרום נמדד על ידי הקלטת תמונות של סימונים באמצעות טעינה (איור 2). איור 2 ד מראה כי מתח הקרום הממוצע שנמדד בכיוונים רדיאלי והציריים היה כ יניאריביחס למנוע מיושם סופר עד מתח ליניארי מרבי של 20%. לא היה הבדל משמעותי בין רמות המתח נמדדו במהלך התנפחות בהשוואה לאלו שנמדדו במהלך הנסיגה חזרה למצב המנוחה. בשלב הבא, התזוזה של תאים אנושיים אפיתל הסימפונות (16HBE) והגרעינים שלהם בתרבית על הקרום גמיש המותאם אישית נמדדה. גרעינים (DAPI) שכותרתו fluorescently של תאי 16HBE היו צילמו באמצעות מטרת 20X תחת מיקרוסקופ confocal, ואילו עקירת תא שלמה נמדדה עם תמונות בניגוד השלב נרשמו עם מיקרוסקופ דיגיטלי. כפי שניתן לראות באיור 3, המתח שנמדד על ידי עקירה של גרעינים היה דומה לזה שנמדד על ידי עקירה של סימונים על הקרום, עד 20% מתח ליניארי ~. זו מאשרת כי המאמץ ליישם את הקרומים הועבר לתאים חסיד. הפרוטוקולים מתארים את השימוש במכשיר המותאם אישית על מיקרוסקופ מסורתי וmicroscop כוח אטומידואר מסופק בשלבים הבאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בנייה של ממברנה עם קירות ובכן לשמירת תא תרבות מדיה (ראה איור 1D למוצר הסופי)

  1. באמצעות polydimethylsiloxane גיליונות (PDMS) מצופים בקולגן אני, לחתוך את קווי המתאר של הקרום גמיש עם אזמל או למות.
  2. מניחים כל קרום בצלחת פטרי 60 מ"מ לאחסון.
  3. יצירת קירות:
    1. מערבבים PDMS ב- 10: 1 יחס משקל של אלסטומר אלסטומר לB (סוכן ריפוי).
    2. יוצקים 5 מיליליטר של מעורב באופן מלא PDMS לתוך צינורות 50 מיליליטר.
    3. מניחים צינורות 50 מיליליטר עם PDMS דפוקה אופקי בתנור הכלאה.
    4. השתמש בפונקצית הרוטור למעייל הקירות הפנימיים של הצינורות ב 8 סל"ד בזמן הריפוי. ב RT, PDMS יהיה נרפא לחלוטין ב 2 ימים.
    5. הסר את PDMS מהצינור במכסת מנוע תרבית תאים סטריליים.
    6. באמצעות סכין גילוח חדש, לחלק את הגליל של PDMS לסעיפים 4 מ"מ הגובה.
    7. מניחים את החלקים, שישמשו כwa הקרוםLLS, למכל צלחת פטרי מבלי לאפשר הקירות כדי להיות מקומטים.
  4. בחר ומרכז קיר אחד של PDMS על קרום אחד, תוך שמירה על שתי בצלחת פטרי.
  5. מניח בעדינות PDMS דפוקה (10: 1 יחס) על ההיקף החיצוני של הקיר כדי לשמש כדבק. למנוע היווצרות פערים בין הקיר והקרום שכן הוא שם כדי לשמור על נוזלים.
  6. מניחים כל צלחת פטרי המכיל קרום הושלם ומכוסה בתנור על 70 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי לרפא.

2. מתאם של מוטוריים סיבובים עם קלאמפ תזוזה או רדיאלי צמיחה לכיול (איור 2)

  1. הפעל את תוכנת שליטה המוטורית.
  2. לעקור את מהדק של המכשיר באמצעות ההגדרה הידנית בתוכנת המנוע.
  3. מדוד את המרחק ולהקליט את עמדת הספירה המוטורית בין מנוגדים מלחציים בשתי עקירת המינימום ומקסימום של מהדק.
  4. לחשב את אחוז השינוי בדistance בין מלחציים כפונקציה של ספירת המנוע (~ 0-75k ספירה). זה יציין את מתח הפוטנציאל המרבי הושג בקרום.

3. יישום למתוח על קו סלולארי עכבר ריאות אפיתל (MLE12)

  1. MLE12 תאי זרע ב- 2.5 מיליון תאים בקרום גמיש (שלב 1) לכל גם להיות מחוברים בתוך יומיים. צפיפות הזריעה עשויה להשתנות לתאים מסוגים שונים.
  2. ודא המפעיל המכני הוא במצב רגוע לחלוטין.
    1. הסר תקשורת תרבות תא.
    2. באמצעות 1.5 מ"מ אגרופים ביופסיה, אגרוף שני חורים בכל אחת מששת המהדק (ראה איור 1D) כרטיסיות של הקרום. המיקום הרדיאלי של החורים קובע את כמות מראש מתח חוויות קרום בתחילה. אגרוף החורים ברדיוס של 20.5 מ"מ בכרטיסיות הקרום אם לא מראש מתח הוא רצוי.
    3. מקם את הקרום על האלונקה עם החורים המנוקבים הזדנבות עם הסיכות בתוך מלחציים.הנח מהדק עליון במקום. להדק את הברגים באחד צדדים זמן לסירוגין.
    4. הוסף 1 מיליליטר תרבות תקשורת הסלולרי.
  3. מניחים את המכשיר על הבמה מיקרוסקופ מרכוז אמצע הקרום עם נתיב האור.
  4. השתמש קלטת או מגנטים (אם אפשר) כדי לתקן את המכשיר לבמה. ברגע קבוע, לשלוט (במקביל לממברנה) במטוס ו( Z-כיוון) אנכי של המכשיר המכני עם בקר השלב של המיקרוסקופ.
  5. החל למתוח עם התוכנה המסופקת על ידי היצרן על ידי שליטה על המצב ומהירות סיבוב מנוע 20 באופן ידני.

4. מדידה של מינים חמצן מגיב מיטוכונדריאלי (ROS)

  1. ברגע שתאים ומחוברות, להוסיף 1-2 מיליליטר של RT DMEM עם מחוון המיטוכונדריה סופראוקסיד (5 מיקרומטר ריכוז סופי) ישירות על התאים.
  2. דגירה של 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
  3. לשטוף את תאים בעדינות שלוש פעמים עם חיץ חיממו באמבט מים ל37 מעלות צלזיוס.
  4. מייד למקם את הקרום גמיש על האלונקה (שלב 2.2) כבר במקום תחת מיקרוסקופ confocal זקוף.
  5. הוסף 1 מיליליטר של DMEM עם פנול-אדום בינוני חופשי ו -25 מ"מ של HEPES.
  6. להגדיר מסנני עירור / פליטה ל510 / 580 ננומטר.
  7. שדות מרובים תמונה כל 15 דקות כדי ליצור את קורס הזמן הרצוי של ייצור סופראוקסיד המיטוכונדריה.
  8. מתמונות שנתפסו, עוצמת הקרינה שיא היסטוגרמות בכל מרווח זמן באמצעות תוכנה מסוגלת לכמת את עוצמת הקרינה.

5. יישום של מתיחה וכוח האטומי מיקרוסקופית (AFM)

הערה: שלבים אלה ניתנים לAFM ספציפי ושילוב מיקרוסקופ אופטי (איור 4 וחומרי רשימה).

  1. הכן את AFM לניסוי.
    1. להגדיל את הגובה של ראש AFM לעמדתו המרבית בZ-הכיוון.
    2. שים מרחיבי על הרגליים של AFM ללהרים את המטוס שבו אנשי קשר שלוחה AFM המדגם. הדגימה וראש AFM צריך להיות הרים כדי להתאים את הגובה של המכשיר המכני.
  2. הכן את מיקרוסקופ האופטי (אם קיימים).
    1. הסר את צלחת סורק AFM. הסר את המטרה הרצויה.
    2. הוסף spacer למטרה. הגובה של spacer יהיה תלוי במטרה והגדרת AFM הספציפי, אבל זה הכרחי אם הדמיה אופטית היא רצויה מאז מטוס תצפית יהיה שינוי בכיוון Z-ידי סכום השווה לאלונקה וגובה מתאם (איור 5A). שים לב שAFM בדרך כלל מספק הדמיה בהגדלה נמוכה מנתיב אופטי מעל המכשיר.
    3. הר בחזרה מטרה הרצויה במיקומו. הנח את הסורק בחזרה לAFM.
    4. הפעל את תוכנת AFM. התחל כל מקורות האור הנדרשים כולל מקור האור עבור מדידות הקרינה.
    5. הר שבב עם קרן שלוחה שמתאים למידות הרצויות. 200 PN / נוקשות ננומטר או פחות עדיפה בעת מדידת מודולוס האלסטיות של תאי חיים.
    6. יישר את הלייזר ולכייל את נוקשות שלוחה פי ההצעות של היצרן על coverslip זכוכית רכוב על המכשיר.
  3. הכן קרום כמו בשלב 1, אבל עם השינויים הבאים.
    1. מייד לפני ההרכבה הקרום למכשיר המתיחה, לחתוך את הקירות של כ 1 מ"מ הגובה. זה מונע את ההתערבות חוותה בין קירות הקרום ותא העומס.
    2. הר הקרום במכשיר המכני כפי שתואר 3.2.1-3.2.3.
    3. הסר תקשורת תרבית תאים, כדי למנוע נזק לסורק AFM במקרה של דליפה.
    4. זוג המכשיר עם מתאם (איור 5 א). מניחים את המכשיר המכני עם המתאם בסורק.
    5. למתוח את הקרום לרמת מתח מתיחה הרצויה.
  4. הוספת נפח (<0.5 מיליליטר) מוגבל של תקשורת בתאים, כדי למנוע סורק AFM או נזק מיקרוסקופ בשל דליפה.
  5. לעסוק קרן שלוחה עם הקרום.
  6. בצע את הפרוטוקול של מכשיר AFM המסוים כדי לסרוק תחומי העניין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מינים חמצן מגיבים ודפורמציה

מחקרים קודמים הראו עלייה במינים תגובתי חמצן (ROS) בדרכי נשימה ותאי האפיתל מכתשי בתגובה למחזורית מתיחה 21. מיני חמצן מגיבים כוללים מולקולות ורדיקלים חופשיים הנגזרים מחמצן מולקולרי עם תגובתיות גבוהה לשומנים, חלבונים, סוכרים, חומצות גרעין ו22-24. ROS לשמש כאות נפוצה תאית להסדיר פונקצית ערוץ יון, חלבון kinase / הפעלת phosphatase, וביטוי גנים, אך ייצור מוגזם או ללא פיקוח יכול לתרום לאפופטוטיים ומוות של תאי נמקים, ניוון מוחיים, טרשת עורקים, סוכרת, הסרטן ו24,25. סופראוקסיד, מראש סמן לצורות אחרות של ROS, יכול להיות מיוצר כתוצר לוואי של נשימה המיטוכונדריאלי כאשר אלקטרונים לדלוף מהשרשרת העברת אלקטרונים. מחקרים קודמים הציעו כי מתיחה מכאנית מחזורית מגורה הייצור של סופר תחמוצת באמצעות שילוב של מערכת מונואמין NADPH (פוספט-אוקסידאז dinucleotide nicotinamide אדנין) ושרשרת הובלת אלקטרונים במיטוכונדריה (אני מורכב ושלישי). זה כבר הציע שגירוי זה היה בגלל עיוות ישירה של המיטוכונדריה 21 אולי בשל קשרים לשלד תא התא. על מנת לבחון השערה זו, תא מתיחת מכשיר פותח כך שיכולנו שינויים בתמונת ייצור ROS בתאים חיים בתגובה למתיחה מכאנית. כאן, ROS המיטוכונדריה מיוצר על ידי תאי אפיתל הסימפונות עקב למתוח נמדד באמצעות המכשיר המותאם אישית ופרוטוקול. בהעדר המתיחה מכאנית, ייצור ROS לא להגדיל באופן משמעותי מעל 60 דקות (איור 4). כאשר מתיחת 17% יחידים יושמה ונשמרה, חלה עלייה בROS המיטוכונדריה שנמשכה עוד 60 דקות.

נזק אפיתל חד שכבתי ישיר בשל מתיחה

s = "jove_content"> מנגנונים עקיפים על ידי שמתיחה מוגזמת באפיתל הריאות פוגעת הריאות נידונו בעומק במקומות אחרים 2. מספר מחקרים מצביעים על כך שמתיחה מכאנית מוגזמת של תאי האפיתל ריאות יכולה לגרום לפציעה ישירה כרוכה בניזק לתאי 11,13,26,27. סוג זה של נזק קשה ללכוד ללא הדמיה בזמן אמת במהלך ההתנפחות המכנית. ככזה, ניצול המכשיר המותאם אישית ומיקרוסקופ לעומת שלב תמונות רצופות של תאים שמכאניים מתוחים נרשמו לפני ואחרי טיפול עם ציטוקינים פרו-דלקתי (TNF-α 50 מיליליטר / ng במשך 6 שעות) (איור 5). תמונות של אותו השדה של תאים נתפסו ברמות מתח גוברים. התמונות מראות את היווצרות פער כאשר התאים נמתחו בין זן 10 ו- 15% כפי שצוינו על ידי החצים האדומים. חשוב לציין כי תמונות אלה נרשמו בזמן אמת קרוב, <10 שניות של פיגור בין סוף סטרץ ח והדמיה, ואילו התאים נמתחו. במחקרים קודמים של הדמיה תא של תאים נמתחו, תמונות התקבלו לפני ואחרי מתיחת ההשוואה רק את התמונות של תאים לא במצב מתוח 11,13,28.

AFM ננו-כניסה בתאים נמתחו

המכשיר המכני הוצב בAFM עם השימוש של צלחת מתאם (ראה איור 6 א). שימוש בשיטות שפורסמו בעבר 13, מפות מודולוס אלסטיות (E-מפות) של MLE12 תאים לפני ואחרי 10% מתח מתיחה התקבלו (איור 6 ד-ה). למרות שתמונה בניגוד השלב במתח% 10 (איור 6 ד) הושגה בתוך 10 שניות של המתיחה, E-המפות שמוצגים באיור 6 ד-E צרכו כ 22 דקות עם 300 עקומות כוח-סטייה בודדות נרשמו מעל 40 מיקרומטר X 40 מיקרומטר אזור עם 2.5 מיקרומטר מהירות / s של הקצה בZ-הכיוון.אום קבצים / ftp_upload / 52,737 52737fig1highres.jpg "target =" / / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 1
איור 1. המכשיר מעוצב בהתאמה אישית לתרבית תאים ומתיחה. ציור ממוחשב של התכנון המכני של המכשיר (), (ב) תצלום של המכשיר הושלם, תצלום של ההתקן המחובר לרכב והנהג ליניארי, אשר ממיר את סיבוב המנוע לתנועת 1-ממדית (C) ש שולט במתיחת biaxial המהדק של קרום גומי סיליקון (ד '). המצע מכיל שני חורים בכל כרטיסיית מהדק להיות מושם על הודעות בכל מהדק. מודל (E) dimensioned FEA של הקרום גמיש שהוא 1/4 של כל המבנה בשל שימוש בתנאי גבול סימטריים. ( מתח עיקרי מרבי טרונג> F) מוצג בקרום המלא המתאר את ההיווצרות של טבעות מעידות על שדה מתח איזוטרופיים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. (א) המכשיר תומך קרום גמיש עם סימונים מיושמים למדידת מאמץ ליישם מוצג. תמונות תקריב של הסימונים, לפני (B) ומתיחה לאחר (ג), תויגו עם חץ כדי לציין את עקירתם של הסימונים על הקרום באופן ברור. מתח ממברנה (ד ') כפונקציה של המנוע סופר גישה ונסיגה ב. מתח קרום היה דומה בשתי הגישה והנסיגה עם נסיגה בייצור זנים מעט גבוהים יותר. href = היעד "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52737/52737fig2highres.jpg" = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. העברת ממברנה מתח לתאים. (- B) בניגוד שלב תמונות של תאים אנושיים אפיתל הסימפונות (16HBE) על הקרום גמיש באמצעות מטרת 10X, לפני () ואחרי מאמץ של 20% (ב). (C - D) גרעינים (DAPI) שכותרתו fluorescently של תאי 16HBE היו צילמו באמצעות מטרת 20X תחת מיקרוסקופ confocal, לפני (ג) ולאחר מאמץ 20% (ד '). מתח הקרום חווה על ידי תאים (ה) הייתה ליניארי והומוגנית. t = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. ההשפעה של מתיחה אחד בייצור ROS של 16HBE תאים נצפתה באמצעות חיישן סופראוקסיד המיטוכונדריה מצטבר באמצעות מטרת 20X תחת מיקרוסקופ confocal (- C). מול המצלמה של הזמן כמובן (0, 60 דקות, ו ~ 65 דקות) של ייצור סופראוקסיד במהלך מתיחה באותו תחום של תאים. עצמת יחסית הקרינה של 16HBE תאים לאורך הזמן מצביעה על עלייה של 50% בעוצמת הקרינה מייצור בסיסי של סופראוקסיד בתוך השעה הראשונה (A ל- B) (D). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

r.within עמודים = "תמיד"> איור 5
איור 5. בניגוד שלב תמונות של תגובת monolayer אפיתל מכתשי (MLE12) למתיחת הגדלת (- D). היה כל נרשם באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי עם מטרת 20X. החצים מצביעים על המקומות שבם הפרדת תא אל התא התרחשה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6. (א) מכשיר מכאני שמוצג בAFM עבור ננו-כניסה של תאים עם מתיחה. הסורק יש להסיר עבור המיקום של מאריך אובייקטיבי. שלושה מרחיבי רגל מחוברים לכל שלוש הרגליים של ראש AFM לאפשר למכשירמיקום. צלחת מתאם מנוצלת להר האלונקה לסורק AFM (צלחת שחורה). סריקות קרן שלוחה בכיוון החץ שמופיע בתמונה לפני שלב מתיחת ניגוד תא MLE12 (B). הריבועים האדומים ב( ב ') לפני ואחרי תמונות (C) למתוח מתארים את השטח שנתפס במשך ננו-כניסה (אובייקטיבי 40X). מפות מודולוס האלסטיות, לפני (D) ואחרי (E) מתיחה, מתקבלות בטכניקות ניתוח שפורסמו בעבר 13. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מכשיר ייחודי להדמיה תא חי במהלך מתיחה מכאנית פותח; והמכשיר הזה היה בשימוש בפרוטוקול ללמוד mechanobiology תאי אפיתל ריאות. במחקרים ראשוניים, נמצא כי קטע שנערך אחת עורר את הייצור של סופראוקסיד המיטוכונדריה בתאי אפיתל הסימפונות. בנוסף, הוא הוכיח כי הרמות גבוהות של לחץ מכאני גרמו נזק ישיר לשלמות monolayer של תאי אפיתל מכתשי.

לבצע ניסויים הראשוניים הללו, המכשיר כויל ראשון, ולאחר מכן ניתן היה לראות שמתח הקרום הועבר לתאים (איורים 2-3). בסך הכל המכשיר מבוצע היטב, כפי שצוין על ידי המתאם ההדוק בין מתח הקרום (שנמדד על ידי סימנים על הקרום) ומתח התא (שנמדד על ידי מרחקים בין גרעינים) שמוצג באיור 3E. עם זאת, היו כמה הבדלים קטנים נצפו בין straבנמדד על הקרומים במהלך הגישה ועקומות התשואה של הסמנים, כפי שמוצג באיור 2 ד. זה היה צפוי בשל תגובת הנגד במכשיר ואולי קשור לנושאים מרתקים. בנוסף, יש צורך במנגנון הרכבה אוניוורסלי למכשיר, כך שהוא יכול לשמש ביעילות במיקרוסקופים עם תצורות שונות. זה היה לצמצם את המשך הזמן בין המיקום של רכישת מכשיר ותמונה תוך שמירה על קשר חזק למיקרוסקופ. חורי אגרוף בקרומים שמשו להחיל מראש מתח קטין הקרום כדי למנוע היווצרות של מדינת דחיסה ראשונית בשל הידוק של חומר אלסטי. מדינת הדחיסה מובילה גם לירידה של מתח ישים מרבי.

המכשיר המותאם אישית תוכנן כך שיתאים במקלט MFP3D כוח האטומי מיקרוסקופ כדי לאפשר ננו-כניסה של תאי חיים במהלך מתיחה מכאנית. אנחנו לא מודעים לכל מכשיר אחר שמסוגל בducing מדינת מתח איזוטרופיים במטוס ההדמיה שיכול לתפקד בתוך AFM. המכשיר נועד גם לשימוש רציף בחממה תא-תרבות (שמר על 37 מעלות צלזיוס בסביבה לחה, סטרילי עם 5% CO 2). היכולת לתפקד בתוך חממה מאפשרת המחקר של תאים עוברים טיפולי מתיחה לטווח ארוך.

ישנן מספר מגבלות לגישה שהוצגה. ראשית, כפי שמשתרע הקרום, תחום המיקוד עובר ממטוס, אם כי מינימאלי (~ 100 מיקרומטר). זה הופך למגבלה כאשר מעקב תחום התאים באמצעות משטר מתיחה, כי שדה הראייה משתנה במהלך התנפחות הקרום. למרות שהקרום בתוך הקוטר 22 מ"מ חווה .23-.25 מתח, האזורים מחוץ לניסיון קוטר פנימי זה שדה מתח משתנה יותר. למרות שמחקרי הדמיה מוגבלים בקלות לאזור מרכז זה, ייתכן שהתאים מגיבים לרמות גבוהות יותר של מתחבאזורים חיצוניים יכול להשפיע על התגובה של תאים באזור המרכזי. הפצת מתח אחידה על פני שטח גדול יותר של עניין ניתן להשיג עם שיפורים בעיצוב הקרום. קרום PDMS הוא אוטומטי ניאון באורכי גל המשמשים בדרך כלל לאינדיקטורים ניאון, וזה מגביל את יכולת הדמיה הקרינה בתאים מתחת הקרום. מסיבה זו מיקרוסקופ זקוף נוצל למטרות טבילה במים במחקרים שלנו של ייצור ROS שתוארו לעיל. זה יכול להיות מגבלה ללימודים שבAFM וההדמיה הקרינה משולבת.

המכשיר הנפוץ ביותר המסחרי (מערכת מתח FX 5000 FlexCell) להחלת לחץ מכאני לתאים משלב מערכת ואקום לשליטה החלת מתח מתיחה על קרום תוך כדי התנועה פנימה והחוצה מהמטוס האופטי. עיצוב הקרום ומהדק המוצג כאן ליצור שדה זן דו-צירי בי המתח הוא איזוטרופי ונשאר בallowin מטוסהדמיה בזמן אמת גרם. עם שינויים קלים בעיצוב הקרום, האלונקה יכולה לייצר מצבי מתיחת uniaxial גם כן. אם תאי זרע ראשון על קרום נפוח, במטוס יכול להיות מיושמים גם המון דחיסה. המכשיר הוא מסוגל להגיע לשתי רמות הפיזיולוגיות ופתולוגיים של זן. לסיכום, מכשיר ופרוטוקולים חדשים פותחו כי ניתן להשתמש כדי להחיל מאמץ מכאני לחיות תאים שניתן הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי וננו-כניסת AFM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות שFedex מכון טכנולוגי באוניברסיטת ממפיס על תמיכתם. המחברים מבקשים להודות לתלמידים של קבוצת פרויקט עיצוב הבכירה במחלקה להנדסת מכונות באוניברסיטת ממפיס (דוד באטלר, ג'קי קרטר, דומיניק קליבלנד, יעקב שפר), דניאל כהן ממחלקת אוניברסיטת ממפיס הנדסת הטכנולוגיה לשליטה מוטורית , וד"ר בן טנג והגב 'Charlean Luellen לעזרתם בתרבית תאים. עבודה זו נתמכה על ידי K01 HL120912 (ER) וR01 HL123540 (CMW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SmartMotor NEMA 34: 3400 Series MOOG Animatics SM3416D Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus
Flexcell Membrane (Collagen I coated) Flexcell International Corp SM2-1010C 3.5" x 5.25" x 0.020"
Sylgard 184 Dow Corning Corporation 10:1
Hoechst 33342  Sigma-Aldrich H1399 DAPI stain
MitoSOX Sigma-Aldrich M36008
Tiron Sigma-Aldrich D7389  mitochondrial superoxide label
DMEM superoxide inhibitor
FBS
HEPES
50 ml tubes Fisher Scientific 06-443-19 Any centriguge tube can be used to create an area for imaging.
Hybridization oven Bellco Glass
MLE12 Cells ATCC CRL-2110 Mouse Lung Epithelial Cells 
16HBE cells ATCC CRL-2741 Human Bronchial Epithelial Cells
AFM Indentation Experiments
Cantilever Beams for Nano-indentation Budget Sensors Si-Ni30
AFM  Asylum Research MFP3D
Olympus microscope Olympus IX-71 Inverted microscope with 20X and 40X objectives.
AFM Leg Extenders Asylum Research Not available AFM microscope
Finite Element Analyses
ABAQUS Simulia 6.12
Software
ImageJ NIH
Microscopes
Digital microscope Life Technologies EVOS XL Core Initially a self standing company, now owned by Life Technologies.
Confocal microscope Zeiss LSM 710 2-photon upright microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tschumperlin, D. J., Boudreault, F., Liu, F. Recent advances and new opportunities in lung mechanobiology. J Biomech. 43, 99-107 (2010).
  2. Waters, C. M., Roan, E., Navajas, D. Comprehensive Physiology. John Wiley, & Sons, Inc. (2011).
  3. Majkut, S., Dingal, P. C. D. P., Discher, D. E. Stress Sensitivity and Mechanotransduction during Heart Development. Current Biology. 24, R495-R501 (2014).
  4. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475, 316-323 (2011).
  5. Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. Mechanotransduction across the cell-surface and through the cytoskeleton. Science. 260, 1124-1127 (1993).
  6. Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. Mechanical force-induced signal transduction in lung cells. Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).
  7. Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
  8. Waters, C. M. Reactive oxygen species in mechanotransduction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L484-L485 (2004).
  9. Chapman, K. E., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
  10. Chu, E. K., Whitehead, T., Slutsky, A. S. Effects of cyclic opening and closing at low- and high-volume ventilation on bronchoalveolar lavage cytokines. Crit Car Med. 32, 168-174 (2004).
  11. Tschumperlin, D., Margulies, S. Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro. Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).
  12. Vlahakis, N. E., Hubmayr, R. D. Cellular stress failure in ventilator-injured lungs. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1328-1342 (2005).
  13. Roan, E., et al. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L1235-L1241 (2012).
  14. Gamerdinger, K., et al. Mechanical load and mechanical integrity of lung cells - Experimental mechanostimulation of epithelial cell- and fibroblast-monolayers. J Mech Behav Biomed Mater. 4, 201-209 (2014).
  15. Hayashi, K., Naiki, T. Adaptation and remodeling of vascular wall; biomechanical response to hypertension. J Mech Behav Biomed Mater. 2, 3-19 (2009).
  16. Villemure, I., Stokes, I. Growth plate mechanics and mechanobiology. A survey of present understanding. J Biomech. 42, 1793-1803 (2009).
  17. Waters, C. M., et al. A system to impose prescribed homogenous strains on cultured cells. J Appl Physiol (1985). 91, 1600-1610 (2001).
  18. Gerstmair, A., Fois, G., Innerbichler, S., Dietl, P., Felder, E. A device for simultaneous live cell imaging during uni-axial mechanical strain or compression. J Appl Physiol (1985). 107, 613-620 (1985).
  19. Dassow, C., et al. A method to measure mechanical properties of pulmonary epithelial cell layers. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 101, 1164-1171 (2013).
  20. SmartMotor User's Guide v523. Animatics Corporation. Available from: http://www.animatics.com/download/publication/UsersGuide%20v523.pdf (2011).
  21. Chapman, K., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
  22. Birukov, K. G. Cyclic stretch, reactive oxygen species, and vascular remodeling. Antioxid Redox Signal. 11, 1651-1667 (2009).
  23. Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, 335-344 (2003).
  24. Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
  25. Pouvreau, S. Superoxide flashes in mouse skeletal muscle are produced by discrete arrays of active mitochondria operating coherently. PLoS One. 5, (2010).
  26. Yalcin, H. C., et al. Influence of cytoskeletal structure and mechanics on epithelial cell injury during cyclic airway reopening. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297, L881-L891 (2009).
  27. Jacob, A. M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and claudin 4. J Appl Physiol. 113, 1377-1387 (2012).
  28. DiPaolo, B. C., Lenormand, G., Fredberg, J. J., Margulies, S. S. Stretch magnitude and frequency-dependent actin cytoskeleton remodeling in alveolar epithelia. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C345-C353 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics