Imagens de células vivas durante Mecânica estiramento

Bioengineering

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Rápalo, G., Herwig, J. D., Hewitt, R., Wilhelm, K. R., Waters, C. M., Roan, E. Live Cell Imaging during Mechanical Stretch. J. Vis. Exp. (102), e52737, doi:10.3791/52737 (2015).

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Abstract

Introduction

As células são submetidas a cargas mecânicas em muitos tecidos, e este estímulo mecânico foi mostrado para promover a alterações dos padrões de expressão de genes, a libertação de factores de crescimento, citoquinas, ou remodelação da matriz extracelular e do citoesqueleto 1-4. Os sinais intracelulares transduzidas de tais estímulos mecânicos ocorrer através do processo de mecanotransdutores 5-7. No sistema respiratório, um resultado de mecanotransdutores é o aumento de espécies reactivas de oxigénio (ROS) e 8,9 citocinas pró-inflamatórias 10 em células epiteliais pulmonares, na presença de cíclica esforço de tensão. Uma forte evidência também sugere que a tensão de tracção excessiva leva a dirigir a lesão do epitélio alveolar, para além das respostas bioquímicas das células 11-14. Embora o foco é principalmente na resposta de células pulmonares a deformação mecânica, as vias induzidas por mecanotransdutores desempenhar um papel-chave nos basic função de muitos tecidos no corpo humano, incluindo a regulação do tónus vascular e 15 o desenvolvimento da placa de crescimento 16.

O interesse crescente em mecanotransdutores resultou no desenvolvimento de numerosos dispositivos para a aplicação de cargas mecânicas fisiologicamente relevantes para células cultivadas e tecidos. Em particular, dispositivos de aplicação de um esforço de tensão, que é uma forma comum de carregamento mecânico experimentado pelo tecido, são populares 11,17-19. No entanto, muitos dos dispositivos disponíveis ou são concebidos como um biorreactor para aplicações de engenharia de tecidos ou não são favoráveis ​​para imagiologia em tempo real com estiramento. Como tal, existe uma necessidade para desenvolver ferramentas e métodos que podem visualizar as células e tecidos em tensão para facilitar a investigação das vias de mecanotransdutores.

Aqui, um dispositivo de estiramento mecânico no plano foi concebido e protocolos foram desenvolvidos para aplicar multiple formas de estirpe para os tecidos e células, enquanto permitindo imagiologia das respostas bioquímicas e mecânicas em tempo real (Figura 1A-D). O dispositivo utiliza seis grampos espaçados uniformemente dispostas circunferencialmente de compreender uma membrana flexível e aplicar uma no plano, a distensão radial até aproximadamente 20% (Figura 1B). O dispositivo de accionamento pode ser colocado em uma incubadora de cultura de células por um período prolongado de tempo, enquanto o motor (Figura 1C) está posicionado do lado de fora da incubadora e controlada por software proprietário fornecido pelo fornecedor do motor. O motor é ligado a um controlador linear, o qual roda um ressalto interno, conduzindo os seis grampos esticadores uniformemente em tensão e relaxamento.

Em adição ao dispositivo mecânico, membranas flexíveis personalizadas foram criadas a partir de membranas de cultura de células imediata disponíveis comercialmente para serem utilizados no sistema mecânico. Em seguida, as paredes circulares (com um diâmetro de aproximadamente28 mm) foram feitos e ligados para a membrana flexível, de modo que as células podem ser cultivadas apenas na região do perfil estirpe bem descrito. A fim de determinar se o posicionamento destas membranas no interior do dispositivo de accionamento proporcionaria deformação uniforme e isotrópico no centro da membrana flexível, a análise de elementos finitos foi realizada usando o software comercialmente disponível (Figura 1E-F). A membrana flexível foi modelada com condições de contorno simétricas e utilizando todos os elementos quadrilaterais para a malha. Os anéis concêntricos visto no gráfico de contorno da estirpe principal máxima mostrada na Figura 1F indicam a distribuição isotrópica da estirpe.

A tensão experimentado por a membrana foi medida por gravar imagens de marcações através de carga (Figura 2). A Figura 2D mostra que a tensão média de membrana medido em direcções radiais e axiais era aproximadamente linearno que diz respeito ao motor aplicado conta-se a uma estirpe linear máxima de 20%. Não houve diferença significativa entre os níveis de tensão medidos durante a distensão em comparação com os medidos durante a retracção de volta para a posição de repouso. Em seguida, o deslocamento de células epiteliais brônquicas humanas (16HBE) e seus núcleos cultivadas sobre a membrana flexível costume foram medidos. Marcado por fluorescência (DAPI) núcleos das células 16HBE foram visualizados utilizando uma objectiva de 20x num microscópio confocal, enquanto que o deslocamento de células inteiras foi medida com imagens de contraste de fase gravados com um microscópio digital. Como pode ser visto na Figura 3, a tensão medida pelo deslocamento de núcleos foi semelhante ao medido por deslocamento de marcações na membrana, até ~ 20% de deformação linear. Isto confirma que a estirpe aplicada às membranas foi transmitida para as células aderentes. Os protocolos que descrevem a utilização do dispositivo personalizado em um microscópio tradicional e uma força atómica microscope são fornecidos nas seguintes etapas.

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Protocol

1. Construção de membrana com Bem Paredes de Retenção de celular Meios de Cultura (ver Figura 1D para o produto final)

  1. Usando o polidimetilsiloxano (PDMS) folhas revestidas com colagénio I, cortar o contorno da membrana flexível com um bisturi ou uma matriz.
  2. Colocar cada membrana numa placa de 60 mm de Petri para o armazenamento.
  3. Criação de paredes:
    1. Misture PDMS em uma proporção de 10: 1 em peso, de elastômero A a elastômero B (agente de cura).
    2. Pour 5 ml de PDMS totalmente misturadas em tubos de 50 ml.
    3. Coloque tubos de 50 ml com PDMS não curado horizontalmente num forno de hibridação.
    4. Utilizar a função do rotor para revestir as paredes interiores dos tubos a 8 rpm durante o tempo de cura. À TA, o PDMS será totalmente curado em 2 dias.
    5. Remover o PDMS do tubo em uma capa de cultura de células estéril.
    6. Usando uma nova lâmina de barbear, particionar o cilindro de PDMS em seções 4 mm de altura.
    7. Coloque as seções, que servirão de wa membranalls, para um recipiente de placa de Petri, sem permitir que as paredes se tornar vincado.
  4. Escolher e um centro da parede de PDMS em uma membrana, mantendo os dois na placa de Petri.
  5. Suavemente colocar PDMS não curado (10: 1) de razão no perímetro exterior da parede a ser utilizados como cola. Evitar a formação de lacunas entre a parede ea membrana uma vez que é lá para reter líquido.
  6. Colocar cada placa de Petri contendo a membrana e completou coberto num forno a 70 ° C durante 24 horas para curar.

2. Correlação de rotações do motor com braçadeira de deslocamento ou Crescimento Radial de Calibração (Figura 2)

  1. Inicie o software que controla o motor.
  2. Deslocar os grampos do dispositivo usando a configuração manual no software do motor.
  3. Medir a distância e registrar a posição do motor de contagem entre opostos grampos em ambos deslocamento mínimo e máximo dos grampos.
  4. Calcule a variação percentual no distance entre os grampos em função da contagem do motor (~ 0-75k contagens). Isto irá indicar a tensão máxima atingida no potencial de membrana.

3. Aplicação de estiramento na linha celular epitelial de pulmão do rato (MLE12)

  1. Semente MLE12 células em 2,5 milhões de células sobre a membrana flexível (Passo 1) por cavidade a ser confluente dentro de dois dias. A densidade de sementeira pode variar para diferentes tipos de células.
  2. Certifique-se o actuador mecânico está numa posição completamente relaxado.
    1. Remover o meio de cultura de células.
    2. Usando 1,5 milímetros punções, dois furos em cada um dos seis braçadeira (ver Figura 1D) separadores de membrana. O posicionamento radial dos furos determina a quantidade de pré-tensão da membrana inicialmente as experiências. Perfurar os orifícios com um raio de 20,5 mm nas abas de membrana se sem pré-tensão é desejado.
    3. Posicione a membrana na maca com os buracos perfurados se alinhando com os pinos dentro dos grampos.Coloque grampos superiores no lugar. Aperte os parafusos, um por vez alternando os lados.
    4. Adicionar 1 ml de meio de cultura de células.
  3. Colocar o dispositivo na platina do microscópio de centragem meio da membrana com o percurso da luz.
  4. Use fita ou ímãs (se possível) para fixar o dispositivo para o palco. Uma vez fixo, o controlo (em paralelo com a membrana) e no plano vertical (direcção z) do dispositivo mecânico com o controlador de fase do microscópio.
  5. Aplicar estiramento com o software fornecido pelo fabricante por meio do controle manualmente a posição e velocidade de rotação do motor 20.

4. Medição da mitocondriais Espécies Reativas de Oxigênio (ROS)

  1. Uma vez que as células estão confluentes, adicionar 1-2 mL de MEMD com RT indicador superóxido mitocondrial (5 uM de concentração final) directamente nas células.
  2. Incubar durante 10 min a 37 ° C.
  3. Lavar as células suavemente três vezes com tampão aquecido num banho de água a37 ° C.
  4. Imediatamente coloque a membrana flexível na maca (Passo 2.2) já em vigor sob um microscópio confocal vertical.
  5. Adicionar 1 ml de DMEM com acesso médio de vermelho de fenol e 25 mM de HEPES.
  6. Definir filtros de excitação / emissão de 510/580 nm.
  7. Vários campos de imagem cada 15 min para criar o curso da produção de superóxido mitocondrial tempo desejado.
  8. A partir de imagens capturadas, a intensidade de fluorescência registro histogramas a cada intervalo de tempo usando software capaz de quantificar a intensidade de fluorescência.

5. Aplicação de estiramento e Microscopia de Força Atômica (AFM)

Observação: Essas etapas são fornecidas para um AFM específico e combinação microscópio óptico (Figura 4 e Lista de Materiais).

  1. Prepare o AFM para o experimento.
    1. Aumentar a altura da cabeça AFM para a sua posição máxima na direcção z.
    2. Coloque extensores sobre as pernas da AFM paralevantar o avião no qual AFM cantilever contatos da amostra. O espécime e a cabeça AFM tem de ser levantada para acomodar a altura do dispositivo mecânico.
  2. Prepare o microscópio óptico (se disponível).
    1. Remova a placa de scanner de AFM. Remova o objetivo desejado.
    2. Adicionar um espaçador para o objectivo. A altura do espaçador dependerá do objetivo eo AFM específico set-up, mas é necessário se imageamento óptico é desejada desde avião de observação será mudança na direção z de um montante igual à maca e altura adaptador (Figura 5A). Note-se que a AFM geralmente proporciona uma baixa ampliação de imagens a partir de um trajecto óptico de cima do dispositivo.
    3. Monte o objectivo pretendido de volta em sua localização. Coloque o scanner de volta para a AFM.
    4. Inicie o software AFM. Comece todas as fontes luminosas necessárias, incluindo a fonte de luz para medições de fluorescência.
    5. Montar um chip com um cantilever queÉ conveniente que as medições desejadas. 200 pN / rigidez nm ou menos é preferida quando se mede o módulo de elasticidade de células vivas.
    6. Alinhar o laser e calibrar a rigidez cantilever de acordo com as sugestões do fabricante em uma lamela de vidro montado sobre o dispositivo.
  3. Prepara-se uma membrana que no Passo 1, mas com as seguintes modificações.
    1. Imediatamente antes da montagem da membrana no dispositivo de alongamento, cortar as paredes de cerca de 1 mm de altura. Isto evita a interferência entre as paredes experimentado membrana e a célula de carga.
    2. Montagem da membrana no dispositivo mecânico como descrito 3.2.1-3.2.3.
    3. Remover o meio de cultura de células, para evitar danos AFM para o scanner, no caso de um derramamento.
    4. Acoplar o dispositivo com um adaptador (Figura 5A). Coloque o dispositivo mecânico com o adaptador no scanner.
    5. Distender a membrana para o nível de tensão de tracção desejada.
  4. Adicionar uma limitada (<0,5 mL) de volume da mídia sobre as células para evitar scanner de AFM ou danos microscópio devido a um derrame.
  5. Envolver o cantilever com a membrana.
  6. Seguir o protocolo do dispositivo de AFM em particular para verificar as áreas de interesse.

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Representative Results

Espécies Reativas de Oxigênio e Deformação

Estudos anteriores mostraram aumentos de espécies reativas de oxigênio (ROS) em vias aéreas e células epiteliais alveolares em resposta ao estiramento cíclico 21. Espécies reactivas de oxigénio incluem moléculas e radicais livres derivados de oxigénio molecular com alta reactividade com lípidos, proteínas, polissacáridos, ácidos nucleicos e 22-24. ROS servir como um sinal intracelular comum para regular a função de canal iónico, cinase de proteína / activação da fosfatase, e a expressão do gene, mas a produção excessiva ou desregulada pode contribuir para apoptóticos e necróticos de morte celular, neurodegeneração, aterosclerose, diabetes, e cancro 24,25. Superóxido, um precursor para outras formas de ROS, pode ser produzido como um subproduto da respiração mitocondrial quando electrões vazar a partir da cadeia de transferência de electrões. Estudos anteriores sugeriram que estiramento mecânico cíclico estimulada a produção de super-óxido através de uma combinação do sistema de NADPH-oxidase (nicotinamida-adenina-dinucleótido fosfato-oxidase) e a cadeia de transporte electrónico mitocondrial (complexo I e III). Foi proposto que este estímulo era devido a uma distorção directa da mitocôndria 21, possivelmente devido a ligações ao citoesqueleto celular. A fim de testar essa hipótese, a célula alongamento dispositivo foi desenvolvido para que pudéssemos imagem muda em produção de ROS em células vivas em resposta ao estiramento mecânico. Aqui, as ROS mitocondrial produzidos por células epiteliais brônquicas devido ao esticar foi medida utilizando o dispositivo personalizado e protocolo. Na ausência de estiramento mecânico, a produção de ROS não aumentar significativamente ao longo de 60 minutos (Figura 4). Quando um único troço 17% foi aplicada e mantida, houve um aumento na ROS mitocondrial que persistiu durante mais 60 minutos.

Direto dano epitelial Monolayer Devido ao estiramento

2. Vários estudos sugerem que estiramento mecânico excessivo de células epiteliais do pulmão podem causar lesão direta envolvendo danos às células 11,13,26,27. Este tipo de danos é difícil para capturar, sem imagiologia em tempo real durante a distensão mecânica. Como tal, o dispositivo personalizado utilizando microscopia de contraste de fase e imagens consecutivas de células que foram esticados mecanicamente foram gravadas antes e após o tratamento com uma citoquina pró-inflamatória (50 ng ml de TNF-α / durante 6 h) (Figura 5). As imagens do mesmo campo de células foram capturados em níveis crescentes de tensão. As imagens mostram a formação de uma abertura quando as células foram esticados entre 10 e 15% de deformação, tal como indicado pelas setas vermelhas. É importante notar que estas imagens foram gravadas em tempo quase real, <10 s de atraso entre o fim de estiramento h e de imagem, enquanto que as células foram esticados. Em estudos anteriores de imagens de células de células esticados, as imagens foram obtidas antes e após estiramento comparando apenas as imagens de células não na condição esticada 11,13,28.

AFM Nano-recuo em células esticadas

O dispositivo mecânico foi colocado no AFM com o uso de uma placa de adaptação (ver Figura 6A). Usando métodos previamente publicados 13 mapas, módulo de elasticidade (E-Maps) de MLE12 células antes e depois 10% de deformação à tração foram obtidos (Figura 6D-E). Embora imagem de contraste de fase com 10% de tensão (Figura 6D) foi obtido dentro de 10 segundos do trecho, os mapas-E mostrado na Figura 6D-E consumiu aproximadamente 22 min com 300 curvas individuais de força-deformação registados ao longo de 40 mm X 40 mm com uma área / s de velocidade de 2,5 um a ponta na direcção z.om / files / ftp_upload / 52737 / "target =" _ blank 52737fig1highres.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 1
Figura 1. O dispositivo projetado para cultura de células e alongamento. (A) desenho gerado por computador da concepção mecânica do dispositivo, (B) fotografia de o dispositivo completado, (C) fotografia de dispositivo ligado ao motor e controlador linear, que converte a rotação do motor num movimento 1-dimensional que controla o estiramento biaxial braçadeira de a membrana de borracha (D) silicone. O substrato contém dois buracos em cada guia braçadeira para serem colocados em postes em cada grampo. (E) modelo FEA cotado da membrana flexível que é 1/4 de toda a estrutura, devido à utilização de condições de contorno simétricas. ( trong> F) tensão máxima principal é mostrado na membrana completa que descreve a formação de anéis indicativos de campo de deformação isotrópico. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. (A) O dispositivo de suporte de uma membrana flexível, com marcações aplicadas para medir a tensão aplicada é mostrado. Close-up imagens das marcações, antes (B) e depois (C) trecho, foram marcadas com uma seta para indicar claramente o deslocamento das marcas na membrana. (D) estirpe de membrana como uma função do motor conta durante a aproximação e afastamento. Membrana cepa foi semelhante em ambos abordagem e retração com retração cepas produtoras ligeiramente superiores. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52737/52737fig2highres.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Membrana de transmissão de tensão para as células. (A - B) imagens de contraste de fase de células epiteliais brônquicas humanas (16HBE) sobre a membrana flexível utilizando uma objectiva de 10X, antes de (A) e depois (B) de 20% de deformação. (C - D) marcado por fluorescência (DAPI) núcleos das células 16HBE foram visualizados utilizando uma objectiva de 20x num microscópio confocal, antes (C) e depois (D), 20% de deformação. (E) A tensão vivida por células de membrana foi linear e homogênea.t = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. O efeito de uma única estiramento sobre a produção de ROS 16HBE células foi observada usando um sensor de superóxido mitocondrial cumulativa usando uma objectiva de 20x num microscópio confocal (A - C). Instantâneos do tempo de percurso (0, 60 min, e ~ 65 min) de estiramento durante a produção de superóxido no mesmo campo de células. (D) a intensidade de fluorescência relativa de 16HBE células ao longo do tempo, indicando um aumento de 50% na intensidade de fluorescência da produção basal de superóxido na primeira hora (A para B). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


Figura 5. imagens de contraste de fase de uma epitelial alveolar (MLE12) monocamada para aumentar a resposta de estiramento (A - D). Todos foram registados utilizando um microscópio digital com uma objectiva 20X. As setas indicam os locais onde a separação de célula para célula ocorrido. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6. (A) do dispositivo mecânico mostrado na AFM para nano-indentação das células com estiramento. O scanner deve ser removido para a colocação do extensor objectivo. Três extensores da perna estão ligados a todas as três pernas da cabeça AFM para permitir dispositivocolocação. Uma placa de adaptação é utilizada para montar a maca sobre o scanner para a AFM (placa preta). As varreduras de cantilever no sentido da seta indicada na imagem de contraste de fase de alongamento antes de uma célula MLE12 (B). Os quadrados vermelhos no antes (B) e (C) após estiramento imagens retratam a área que foi capturado em nano-recuo (objetiva de 40X). Os mapas do módulo de elasticidade, antes de (D) e depois (E) estiramento, são obtidos com técnicas de análise publicados anteriormente 13. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Um dispositivo único para imagens de células vivas durante estiramento mecânico foi desenvolvido; e este dispositivo foi usado em um protocolo para estudar epiteliais do pulmão mechanobiology celular. Em estudos preliminares, verificou-se que uma única estiramento realizada estimulou a produção de superóxido mitocondrial em células epiteliais brônquicas. Além disso, foi demonstrado que o aumento dos níveis de tensão mecânica causou danos directos para a integridade de uma monocamada de células epiteliais alveolares.

Para realizar estas experiências preliminares, o aparelho foi calibrado em primeiro lugar, e, em seguida, foi demonstrado que a estirpe de membrana foi transmitida para as células (Figuras 2-3). Em geral, o dispositivo assim realizado, como indicado pela correlação estreita entre a estirpe de membrana (medido por marcas na membrana) e a estirpe de célula (medida pela distância entre núcleos) mostrado na Figura 3E. No entanto, houve algumas pequenas diferenças observadas entre strana medida nas membranas durante a aproximação e as curvas de retorno dos marcadores, como mostrado na Figura 2D. Isto era provavelmente devido ao efeito adverso no dispositivo e possivelmente relacionado com questões de aperto. Além disso, um mecanismo universal de montagem para o dispositivo é necessário para que ele pode ser usado eficientemente em microscópios com diferentes configurações. Isto reduziria o tempo gasto entre o posicionamento do dispositivo de aquisição de imagem e mantendo ao mesmo tempo uma ligação robusta ao microscópio. Buracos perfurados nas membranas foram usadas para aplicar uma pequena pré-tensão à membrana para evitar a formação de um estado de compressão inicial, devido à fixação de um material elástico. O estado de compressão, também conduz a uma redução da tensão máxima aplicável.

O dispositivo personalizado foi projetado para caber em um Microscópio de Força Atômica Asylum MFP3D para permitir nano-recuo de células vivas durante estiramento mecânico. Nós não estamos cientes de qualquer outro dispositivo que é capaz de emdução de um estado de tensão isotrópica no plano de imagem que pode funcionar dentro de um AFM. O dispositivo também foi concebido para uso contínuo numa incubadora de cultura de células (mantida a 37 ° C num ambiente húmido, estéril, com 5% de CO 2). A capacidade de funcionar dentro de uma incubadora permite o estudo de células em regimes de estiramento de longa duração.

Existem várias limitações para a abordagem apresentada. Em primeiro lugar, como os alongamentos da membrana, o domínio de foco move-se para fora do plano, embora minimamente (~ 100 mm). Isto torna-se uma limitação quando o controle de um campo de células através de um regime de estiramento, porque o campo de visão muda ao longo do curso da distensão da membrana. Apesar de membrana dentro do diâmetro 22 milímetros experimenta 0,23-0,25 tensão, as regiões fora desta experiência interior diâmetro de um campo estirpe mais variável. Embora os estudos de imagiologia são facilmente limitado a esta região central, é possível que as células que respondem a níveis mais elevados de tensãoem regiões exteriores pode impactar a resposta das células no interior da região central. Uma distribuição de deformação uniforme sobre uma área maior de interesse pode ser conseguida com melhorias no desenho membrana. A membrana é de PDMS de auto-fluorescente a comprimentos de onda geralmente utilizados para os indicadores fluorescentes, o que limita a capacidade para imagens de fluorescência em células de baixo da membrana. Por esta razão um microscópio vertical foi utilizado com objectivos de imersão em água em nossos estudos de produção ROS descritos acima. Isso pode ser uma limitação para estudos nos quais AFM e imagens de fluorescência são combinados.

O dispositivo comercial mais comum (FlexCell FX 5000 sistema de tensão) para aplicar tensão mecânica às células incorpora um sistema de vácuo controlável aplicação de tração pressão sobre uma membrana enquanto se move dentro e fora do plano óptico. O projeto de membrana e braçadeira aqui apresentada criar um campo de tensão bi-axial em que a linhagem é isotrópico e permanece no plano allowing imagens em tempo real. Com pequenas modificações no projeto de membrana, a maca pode produzir modos de estiramento uniaxial também. Se as células são primeiro semeadas sobre uma membrana distendida, cargas de compressão pode também ser aplicada no plano. O dispositivo é capaz de alcançar ambos os níveis fisiológicos e patológicos da estirpe. Em resumo, um novo dispositivo e protocolos foram desenvolvidas que podem ser usadas para aplicar tensão mecânica às células que podem ser visualizados utilizando microscopia de fluorescência e AFM nano-indentação vivo.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Os autores gostariam que agradecer Fedex Instituto de Tecnologia da Universidade de Memphis para seu apoio. Os autores gostariam de agradecer os alunos do grupo de projeto sênior de design no Departamento de Engenharia Mecânica da Universidade de Memphis (David Butler, Jackie Carter, Dominick Cleveland, Jacob Shaffer), Daniel Kohn do departamento de Universidade de Tecnologia de Engenharia de Memphis para controle de motor e Dr. Teng Bin e Ms. Charlean Luellen por sua ajuda em cultura de células. Este trabalho foi apoiado por K01 HL120912 (ER) e R01 HL123540 (CMW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SmartMotor NEMA 34: 3400 Series MOOG Animatics SM3416D Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus
Flexcell Membrane (Collagen I coated) Flexcell International Corp SM2-1010C 3.5" x 5.25" x 0.020"
Sylgard 184 Dow Corning Corporation 10:1
Hoechst 33342  Sigma-Aldrich H1399 DAPI stain
MitoSOX Sigma-Aldrich M36008
Tiron Sigma-Aldrich D7389  mitochondrial superoxide label
DMEM superoxide inhibitor
FBS
HEPES
50 ml tubes Fisher Scientific 06-443-19 Any centriguge tube can be used to create an area for imaging.
Hybridization oven Bellco Glass
MLE12 Cells ATCC CRL-2110 Mouse Lung Epithelial Cells 
16HBE cells ATCC CRL-2741 Human Bronchial Epithelial Cells
AFM Indentation Experiments
Cantilever Beams for Nano-indentation Budget Sensors Si-Ni30
AFM  Asylum Research MFP3D
Olympus microscope Olympus IX-71 Inverted microscope with 20X and 40X objectives.
AFM Leg Extenders Asylum Research Not available AFM microscope
Finite Element Analyses
ABAQUS Simulia 6.12
Software
ImageJ NIH
Microscopes
Digital microscope Life Technologies EVOS XL Core Initially a self standing company, now owned by Life Technologies.
Confocal microscope Zeiss LSM 710 2-photon upright microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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