Levande cell imaging under mekanisk Stretch

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Rápalo, G., Herwig, J. D., Hewitt, R., Wilhelm, K. R., Waters, C. M., Roan, E. Live Cell Imaging during Mechanical Stretch. J. Vis. Exp. (102), e52737, doi:10.3791/52737 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Celler utsätts för mekanisk belastning i många vävnader, och detta mekanisk stimulering har visats främja förändringar i mönstren för genuttryck, frisättning av tillväxtfaktorer, cytokiner eller ombyggnad av den extracellulära matrisen och cytoskelettet 1-4. De intracellulära signaler omvandlade från sådana mekaniska stimuli inträffar genom processen att mechanotransduction 5-7. I andningssystemet, är ett resultat av mechanotransduction ökningen av reaktiva syreradikaler (ROS) 8,9 och pro-inflammatoriska cytokiner 10 i pulmonära epitelceller i närvaro av cykliska dragpåkänning. Starka bevis tyder också på att överdriven dragpåkänning leder till direkta skada på den alveolära epitelet, utöver de biokemiska svaren av celler 11-14. Även om fokus här är i första hand på svaret från lungceller till mekanisk deformation, vägar inducerade av mechanotransduction spelar en nyckelroll i Basic funktion av många vävnader i kroppen, inklusive regleringen av vaskulära 15 och utvecklingen av tillväxten plattan 16.

Det växande intresset för mechanotransduction har resulterat i utvecklingen av ett flertal anordningar för tillämpningen av fysiologiskt relevanta mekaniska belastningar till odlade celler och vävnad. I synnerhet enheter tillämpar en dragpåkänning, som är en vanlig form av mekanisk belastning upplevs av vävnad, är populära 11,17-19. Men många av de tillgängliga anordningar är antingen utformad som en bioreaktor för vävnadstekniska tillämpningar eller främjar inte realtid avbildning med stretch. Som sådan, det finns ett behov av att utveckla verktyg och metoder som kan visualisera celler och vävnader i spänning för att underlätta utredningen av vägar för mechanotransduction.

Häri var en i planet mekanisk sträckning anordning som är konstruerad och protokoll har utvecklats för att tillämpa multiple former av stam till vävnader och celler medan tillåter avbildning av de biokemiska och mekaniska svar i realtid (Figur 1A-D). Enheten använder sex jämnt fördelade klämmor anordnade perifer att förstå ett flexibelt membran och tillämpa en i planet, radiella utvidgning upp till ca 20% (Figur 1B). Manövreringsanordningen kan placeras i ett cellodlingsinkubator under en längre tidsperiod, medan motorn (Figur 1C) är placerad utanför inkubatorn och styrs av proprietär programvara som tillhandahålls av motorleverantören. Motorn är kopplad till en linjär förare, som roterar en inre kam, driver sex bår klämmor enhetligt i spänning och avkoppling.

Förutom den mekaniska anordningen, var anpassade flexibla membran skapade från kommersiellt tillgängliga cellodlings färdiga membran som skall användas i det mekaniska systemet. Sedan cirkulära väggar (med en diameter av ungefär28 mm) framställdes och fäst på det flexibla membranet, så att celler kunde odlas endast i denna region av väl beskrivna stammen profil. För att bestämma huruvida placeringen av dessa membran inuti manövreringsanordningen skulle ge likformig och isotrop stammen i centrum av det böjliga membranet, var finita elementanalys utfördes med användning av kommersiellt tillgänglig mjukvara (Figur 1E-F). Det flexibla membranet modellerades med symmetriska randvillkor och utnyttja alla fyrsidiga element för nätet. De koncentriska ringar ses i kontur tomt på maximalt huvudstam som visas i figur 1F ange isotrop fördelning av stammen.

Stammen upplevs av membranet mättes genom att registrera bilder av markeringar genom belastning (Figur 2). Figur 2D visar att den genomsnittliga membran stammen mätt i radiella och axiella riktningar var approximativt linjärmed avseende på det påförda motorn räknar upp till en maximal linjär stam av 20%. Det fanns ingen signifikant skillnad mellan de belastningsnivåer som uppmätts under uttänjning jämfört med dem som uppmätts under indragning tillbaka till viloläge. Därefter tillsattes förskjutningen av humana bronkiala epitelceller (16HBE) och deras kärnor odlade på den anpassade flexibla membranet mättes. Fluorescerande (DAPI) kärnor av 16HBE cellerna avbildas med en 20X mål under ett konfokalmikroskop, medan hela cell förskjutning mättes med fas kontrastrika bilder som spelats in med en digital mikroskop. Såsom framgår av fig 3, stammen mätt genom förskjutning av kärnor var liknande den som mäts genom förskjutning av markeringar på membranet, upp till ~ 20% linjär töjning. Detta bekräftar att stammen appliceras på membranen överlämnades till de vidhäftande cellerna. De protokoll som beskriver användningen av den anpassade anordningen på en traditionell mikroskop och ett atomkrafts microscope finns i följande steg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Konstruktion av membran med väl Väggar för Bevarande av cellodlingsmedier (se figur 1D för slutprodukten)

  1. Använda polydimetylsiloxan (PDMS) ark belagda med kollagen I, skär konturerna av det flexibla membranet med en skalpell eller ett munstycke.
  2. Placera varje membran i en 60 mm petriskål för lagring.
  3. Skapande av väggar:
    1. Blanda PDMS vid en 10: 1 viktförhållande av elast A till elastomer B (härdare).
    2. Häll 5 ml av fullt blandade PDMS i 50 ml rör.
    3. Placera 50 ml rör med ohärdade PDMS horisontellt i en hybridiseringsugn.
    4. Använd funktionen rotorn för att belägga de inre väggarna av rören vid 8 varv per minut under härdningstiden. Vid RT, kommer PDMS härdas fullständigt i 2 dagar.
    5. Avlägsna PDMS från röret i en steril cellodlings huva.
    6. Med hjälp av en ny rakblad, partitionera cylinder PDMS i sektioner 4 mm i höjd.
    7. Placera sektioner som kommer att fungera som membranet waLLS, i en petriskål behållare utan att tillåta väggarna att bli skrynkligt.
  4. Välj och centrera en vägg av PDMS på ett membran under bibehållande av två i petriskålen.
  5. Placera försiktigt ohärdade PDMS (10: 1 ratio) på utsidan omkrets av väggen som skall användas som lim. Förhindra bildandet av mellanrum mellan väggen och membranet eftersom det är där för att behålla vätska.
  6. Placera varje petriskål innehållande den fullbordade membranet och täcks i en ugn vid 70 ° C under 24 timmar för att härda.

2. Korrelation av Motor rotationer med Clamp Förskjutning eller Radial Tillväxten för kalibrering (Figur 2)

  1. Starta programmet styr motorn.
  2. Förskjutning klämmor enheten med manuell inställning i motorprogrammet.
  3. Mät avståndet och registrera motor räkna läge mellan motsatta klämmor på både minimal och maximal förskjutning av klämmorna.
  4. Beräkna den procentuella förändringen i distance mellan klämmorna som en funktion av motor räknevärdet (~ 0-75k kroppar). Detta indikerar den maximala potentiella stammen uppnås på membranet.

3. Tillämpning av Stretch på Mus Lung epitelcellinje (MLE12)

  1. Seed MLE12 celler vid 2,5 miljoner celler på det flexibla membranet (Steg 1) per brunn som skall sammanflytande inom två dagar. Den såddtäthet kan variera för olika celltyper.
  2. Se till det mekaniska manöverdonet är i ett helt avslappnad position.
    1. Avlägsna cellkulturmedier.
    2. Med användning av 1,5 mm biopsi stansar, stansa två hål i var och en av de sex klämma (se figur 1D) flikar hos membranet. Den radiella placeringen av hålen bestämmer mängden av förspänningen membran erfarenheter från början. Punch hålen på en radie av 20,5 mm på membranet flikarna om ingen förspänning önskas.
    3. Placera membranet på båren med stansade hål ställer upp med stiften i klämmorna.Placera topp klämmor på plats. Dra åt skruvarna en åt gången omväxlande sidor.
    4. Tillsätt 1 ml cellodlingsmedia.
  3. Placera enheten på mikroskop scenen centre mitten av membranet med strålgången.
  4. Använd tejp eller magneter (om möjligt) för att fästa enheten till scenen. När fasta, styr i planet (parallellt med membranet) och vertikal (Z-riktningen) av den mekaniska anordningen med scenen styrenheten i mikroskop.
  5. Applicera sträcka med den programvara som av tillverkaren genom att manuellt styra position och hastighet av motorns rotations 20.

4. Mätning av mitokondrie-reaktiva syreradikaler (ROS)

  1. När cellerna sammanflytande, tillsätt 1-2 ml RT DMEM med mitokondriell superoxid indikator (5 iM slutkoncentration) direkt på cellerna.
  2. Inkubera i 10 minuter vid 37 ° C.
  3. Tvätta cellerna försiktigt tre gånger med buffert värmdes i ett vattenbad till37 ° C.
  4. Placera omedelbart flexibla membranet på båren (Steg 2.2) redan på plats under en upprätt konfokalmikroskop.
  5. Tillsätt 1 ml DMEM med fenolrött-fritt medium och 25 mM HEPES.
  6. Ställ excitation / emissionsfilter till 510/580 nm.
  7. Bildens flera fält var 15 min för att skapa den önskade tidsförloppet för mitokondriell superoxidproduktion.
  8. Från tagna bilder, histogram rekordfluorescensintensiteten vid varje tidsintervall med hjälp av programvara som kan kvantifiera fluorescensintensitet.

5. Tillämpning av Stretch och Atomic Force Microscopy (AFM)

OBS: Dessa steg finns för en specifik AFM och optiskt mikroskop kombination (Figur 4 och Materials List).

  1. Förbered AFM för experimentet.
    1. Öka höjden på AFM huvudet till dess maximala läge i z-riktningen.
    2. Sätt förlängare på benen av AFM tilllyfta planet där AFM fribärande kontakt med prov. Provet och AFM huvudet måste lyftas för att rymma höjd mekanisk anordning.
  2. Förbered optiskt mikroskop (i förekommande fall).
    1. Ta AFM skannern plattan. Ta det eftersträvade målet.
    2. Lägg till en distans till målet. Höjden på distans skulle bero på målet och den specifika AFM set-up, men det är nödvändigt om optisk avbildning önskas eftersom observationsplanet blir förskjutning i z-riktningen med ett belopp som motsvarar båren och adapterhöjd (figur 5A). Observera att AFM ger vanligtvis låg förstoring avbildning från en optisk väg ovanför enheten.
    3. Montera det önskade målet tillbaka på sin plats. Placera skannern tillbaka till AFM.
    4. Starta AFM programvara. Starta alla nödvändiga ljuskällor inklusive ljuskälla för fluorescensmätningar.
    5. Montera ett chip med en fribärande balk somär lämpligt för de önskade mätningarna. 200 pN / nm eller mindre styvhet föredrages vid mätning av elasticitetsmodulen av levande celler.
    6. Rikta lasern och kalibrera fribärande styvhet enligt tillverkarens förslag på ett täckglas monterad på enheten.
  3. Förbered ett membran som i steg 1, men med följande ändringar.
    1. Omedelbart före montering av membranet på sträckningsanordningen, skär väggarna till ca 1 mm i höjd. Detta förhindrar att störningar upplevt mellan membranväggarna och lastcellen.
    2. Montera membranet på mekanisk anordning som beskrivs 3.2.1-3.2.3.
    3. Avlägsna cellkulturmedia för att förhindra skada på AFM skannern i händelse av ett utsläpp.
    4. Par anordningen med en adapter (figur 5A). Placera den mekaniska anordningen med adaptern på skannern.
    5. Sträck membranet till den önskade dragstamnivå.
  4. Lägg till en begränsad (<0,5 ml) volym media på cellerna för att undvika AFM scanner eller mikroskop skador på grund av ett spill.
  5. Engagera fribärande balk med membranet.
  6. Följ protokollet för den särskilda AFM enheten på att söka intresseområden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Reaktiva syreradikaler och Deformation

Tidigare studier har visat ökningar i reaktiva syreradikaler (ROS) i luftvägarna och alveolära epitelceller som svar på cykliska sträcka 21. Reaktiva syrespecies inkluderar molekyler och fria radikaler härledda från molekylärt syre med hög reaktivitet mot lipider, proteiner, polysackarider och nukleinsyror 22-24. ROS fungera som en gemensam intracellulär signal för att reglera jonkanal funktion, proteinkinas / fosfatas aktivering och genuttryck, men överdriven eller oreglerad produktion kan bidra till Apoptotisk och nekrotisk celldöd, neurodegeneration, åderförkalkning, diabetes och cancer 24,25. Superoxid, en förelöpare för andra former av ROS, kan produceras som en biprodukt av mitokondriell andning när elektroner läcka från elektronöverföringskedjan. Tidigare studier tyder på att cyklisk mekanisk sträckning stimulerade produktionen av superoxid genom en kombination av den NADPH-oxidassystemet (nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat-oxidas) och den mitokondriska elektrontransportkedjan (komplex I och III). Det har föreslagits att denna stimulering berodde på en direkt snedvridning av mitokondrierna 21 möjligen på grund av anslutningar till cell cytoskelettet. För att testa denna hypotes, var cellen sträckningsanordning utvecklats så att vi kunde bild ändras i ROS-produktionen i levande celler som svar på mekanisk sträckning. Här var de mitokondriella ROS produceras av bronkiala epitelceller till följd att sträcka mäts med hjälp av den egna enheten och protokoll. I frånvaro av mekanisk sträckning, gjorde ROS-produktionen inte signifikant öka under 60 min (figur 4). När en enda 17% sträckning applicerades och underhållas, det fanns en ökning av mitokondriell ROS som pågått under ytterligare 60 minuter.

Direkt Epitelial Mono Skador på grund av Stretch

2. Flera studier tyder på att överdriven mekanisk sträckning av lung epitelceller kan orsaka direkt skada som involverar skador på cellerna 11,13,26,27. Denna typ av skada är svår att fånga utan realtid avbildning under den mekaniska disten. Som sådan, med användning av den anpassade anordningen och faskontrastmikroskopi konsekutiva bilder av celler som mekaniskt sträckta registrerades före och efter behandling med en pro-inflammatorisk cytokin (50 ng / ml TNF-α under 6 timmar) (Figur 5). Bilder från samma område av celler fångades vid ökande belastningsnivåer. Bilderna visar bildandet av ett gap när cellerna sträckt mellan 10 och 15% spänning såsom visas med de röda pilarna. Det är viktigt att notera att dessa bilder registrerades i nära realtid, <10 sek fördröjning mellan slutet av stretch h och bildbehandling, medan cellerna sträckt. I tidigare studier av cell imaging av sträckta celler, bilder före och efter sträckning endast jämföra bilder av cellerna inte på sträckt tillstånd 11,13,28.

AFM Nano-indrag på sträckta celler

Den mekaniska anordningen placerades i AFM med hjälp av en adapterplatta (se figur 6A). Använda tidigare publicerade metoder 13, elastiska modul kartor (E-kartor) av MLE12 celler före och efter 10% drag stam erhölls (figur 6D-E). Även faskontrastbild vid 10% töjning (figur 6D) erhölls inom 10 sekunder av sträckan, E-kartor som visas i figur 6D-E konsumeras cirka 22 min med 300 individuella kraft-deformationskurvan noterats under en 40 um x 40 um område med en 2,5 ^ m / s hastighet hos spetsen i z-riktningen.Om / filer / ftp_upload / 52.737 / 52737fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 1
Figur 1. Den specialdesignade enhet för cellodling och stretching. (A) Datorgenererad ritning av den mekaniska utformningen av anordningen, (B) Ett fotografi av den färdiga anordningen, (C) Ett fotografi av enhet som är ansluten till motorn och linjär drivrutin, som omvandlar motorns rotation till en en-dimensionell rörelse som styr kläm biaxiella sträckningen av (D) silikongummimembran. Underlaget innehåller två hål på varje flik klämman placeras på stolpar på varje klämma. (E) Mått FEA modell av det flexibla membranet som är 1/4 av hela strukturen på grund av användning av symmetriska randvillkor. ( trong> F) Högsta huvudsakliga stammen visas i hela membranet som visar bildningen av ringar indikerar isotrop spänningsfältet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. (A) enhet som stöder ett flexibelt membran med markeringar som tillämpas för att mäta anbringad töjning visas. Närbilder av märkningar, före (B) och efter (C) stretch, märktes med en pil att tydligt ange förskjutningen av markeringarna på membranet. (D) Membran stammen som en funktion av motorns räknas under fram- och bortkörning. Membran stam var likartad i både fram- och bortkörning med indragning producerar något högre påfrestningar. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52737/52737fig2highres.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Membran stam överföring till cellerna. (A - B) Fas kontrastrika bilder av mänskliga bronkialepitelceller celler (16HBE) på det flexibla membranet med hjälp av en 10X mål före (A) och efter (B) 20% töjning. (C - D) Fluorescensmärkta (DAPI) kärnorna 16HBE cellerna avbildas med en 20X objektiv under ett konfokalmikroskop, före (C) och efter (D) 20% spänning. (E) Membranet stammen upplevs av celler var linjär och homogen.t = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. Effekten av en enda sträcka på ROS produktion av 16HBE celler observerades med hjälp av en kumulativ mitokondriell supersensor med en 20X mål under ett konfokalmikroskop (A - C). Ögonblicksbilder av tidsförloppet (0, 60 min, och ~ 65 min) av superoxidproduktion under sträckning i samma område av celler. (D) Relativ fluorescensintensiteten hos 16HBE celler över tiden tyder på en ökning med 50% i fluorescensintensitet från baslinjen produktion av superoxid inom den första timmen (A till B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.


Figur 5. Fas kontrastrika bilder i en alveolär epitel (MLE12) mono svar på ökande sträcka (A - D). Var alla spelats in med en digital mikroskop med en 20x mål. Pilarna indikerar platser där cell-till-cellseparation inträffade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6
Figur 6. (A) mekanisk anordning som visas i AFM för nano-indrag av celler med stretch. Skannern måste tas bort för placering av objektiv extender. Tre ben utdrygningsmedel är fästa till alla tre benen av AFM huvudet för att möjliggöra anordningplacering. En adapterplatta används för att montera bår på AFM skannern (svartplåt). Konsolbalken skannar i riktningen av pilen som visas i den före sträck faskontrastbilden en MLE12 cell (B). De röda fyrkanter i innan (B) och efter (C) stretch bilder skildrar området som fångades under nano-indrag (40X objektiv). De elastiska modul kartor, innan (D) och efter (E) stretch, erhålls med tidigare publicerade analystekniker 13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En unik enhet för levande cell imaging under mekanisk stretch har utvecklats; och den här enheten användes i ett protokoll för att studera lung epitelceller mechanobiology. I förstudier, konstaterades det att en enda höll sträcka stimulerade produktionen av mitokondriell superoxid i bronkialepitelceller celler. Dessutom visades det att ökade nivåer av mekaniska påfrestningar orsakade direkta skador på integriteten hos ett monoskikt av alveolära epitelceller.

Att genomföra dessa preliminära experiment enheten först kalibreras, och sedan det visade sig att membranet stammen överförs till celler (figur 2-3). Övergripande anordningen utvecklats väl, vilket framgår av det nära sambandet mellan membranet stammen (mätt genom markeringar på membranet) och cellstammen (mätt genom avstånden mellan kärnor) som visas i figur 3E. Det fanns dock några mindre skillnader observerats mellan strai uppmätt på membranen under tillvägagångssätt samt returkurvorna för markörerna, såsom visas i figur 2D. Detta var troligen på grund av glapp i enheten och möjligen relaterade till gripande frågor. Dessutom behövs en universell monteringsmekanism för anordningen, så att den effektivt kan användas på mikroskop med olika konfigurationer. Detta skulle minska tiden mellan positionering av ackvisitionsanordningen och bild samtidigt behålla en robust koppling till mikroskopet. Stansade hål i membranen användes för att applicera en mindre för-stam till membranet för att förhindra bildning av en initial tryck tillstånd på grund av klämning av ett elastiskt material. Tryck staten leder också till en minskning av högst tillämplig stam.

Den anpassade anordningen utformad för att passa i en asyl MFP3D atomkraftsmikroskop för att tillåta nano-indrag av levande celler under mekanisk stretch. Vi är inte medvetna om någon annan enhet som är kapabel att irande av ett isotropt spänningstillståndet i bildplanet som kan fungera inom ett AFM. Anordningen har också utformats för kontinuerlig användning i en cell-odlingsinkubator (som hölls vid 37 ° C i en fuktig, steril miljö med 5% CO2). Förmågan att fungera inom en inkubator tillåter studiet av celler som undergår långtids stretch regimer.

Det finns flera begränsningar för den presenterade tillvägagångssättet. Först, eftersom membran sträckor inom fokus flyttar ut ur planet, men minimalt (~ 100 mikrometer). Detta blir en begränsning vid spårning ett fält av celler genom en sträcka regim, eftersom synfältet förändras under loppet av membrandisten. Även om membranet inom 22 mm diameter upplever 0,23-0,25 stam, regionerna utanför denna inre erfarenhet diametern en mer varierande spänningsfält. Även imaging studier är lätt begränsad till denna centrala region, är det möjligt att cellerna svarar på högre nivåer av stamvid yttre områden kan påverka svaret av celler inom det centrala området. En likformig stam fördelning över ett större område av intresse kan uppnås med förbättringar av membrandesign. PDMS membranet är automatisk fluorescerande vid våglängder som vanligen används för fluorescerande indikatorer, och detta begränsar möjligheten för avbildning av fluorescens i celler från under membranet. Av denna anledning en upprätt mikroskop användes med vatten nedsänkning mål i våra studier av ROS produktion som beskrivs ovan. Detta kan vara en begränsning för studier där AFM och fluorescens avbildning kombineras.

Den vanligaste kommersiell anordning (Flexcell FX 5000 Drag System) för att anbringa mekanisk påkänning till celler innefattar en styrbar vakuumsystem tillämpar dragpåkänning på ett membran under förflyttning in och ut ur den optiska planet. Membranet och kläm utformning som presenteras häri skapa en bi-axiell spänningsfält där stammen är isotrop och förblir i plan allowing realtid avbildning. Med mindre ändringar av membran design kan båren producera enaxlade stretch lägen också. Om cellerna först ympas på en utspänd membran, i planet tryckbelastningar kan också tillämpas. Anordningen är i stånd att nå både fysiologiska och patologiska nivåer av stammen. Sammanfattningsvis har en ny enhet och protokoll utvecklades som kan användas för att applicera mekaniska påfrestningar att leva celler som kan avbildas med fluorescensmikroskopi och AFM nano-indrag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Författarna vill att tacka Fedex Institute of Technology vid universitetet i Memphis för deras stöd. Författarna vill tacka för elever i senior designprojekt grupp i Maskinteknik avdelningen vid universitetet i Memphis (David Butler, Jackie Carter, Dominick Cleveland, Jacob Shaffer), Daniel Kohn från University of Memphis Teknik avdelning för motorstyrning och Dr. Bin Teng och Ms. Charlean Luellen för deras hjälp i cellkultur. Detta arbete stöddes av K01 HL120912 (ER) och R01 HL123540 (CMW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SmartMotor NEMA 34: 3400 Series MOOG Animatics SM3416D Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus
Flexcell Membrane (Collagen I coated) Flexcell International Corp SM2-1010C 3.5" x 5.25" x 0.020"
Sylgard 184 Dow Corning Corporation 10:1
Hoechst 33342  Sigma-Aldrich H1399 DAPI stain
MitoSOX Sigma-Aldrich M36008
Tiron Sigma-Aldrich D7389  mitochondrial superoxide label
DMEM superoxide inhibitor
FBS
HEPES
50 ml tubes Fisher Scientific 06-443-19 Any centriguge tube can be used to create an area for imaging.
Hybridization oven Bellco Glass
MLE12 Cells ATCC CRL-2110 Mouse Lung Epithelial Cells 
16HBE cells ATCC CRL-2741 Human Bronchial Epithelial Cells
AFM Indentation Experiments
Cantilever Beams for Nano-indentation Budget Sensors Si-Ni30
AFM  Asylum Research MFP3D
Olympus microscope Olympus IX-71 Inverted microscope with 20X and 40X objectives.
AFM Leg Extenders Asylum Research Not available AFM microscope
Finite Element Analyses
ABAQUS Simulia 6.12
Software
ImageJ NIH
Microscopes
Digital microscope Life Technologies EVOS XL Core Initially a self standing company, now owned by Life Technologies.
Confocal microscope Zeiss LSM 710 2-photon upright microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tschumperlin, D. J., Boudreault, F., Liu, F. Recent advances and new opportunities in lung mechanobiology. J Biomech. 43, 99-107 (2010).
  2. Waters, C. M., Roan, E., Navajas, D. Comprehensive Physiology. John Wiley, & Sons, Inc. (2011).
  3. Majkut, S., Dingal, P. C. D. P., Discher, D. E. Stress Sensitivity and Mechanotransduction during Heart Development. Current Biology. 24, R495-R501 (2014).
  4. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475, 316-323 (2011).
  5. Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. Mechanotransduction across the cell-surface and through the cytoskeleton. Science. 260, 1124-1127 (1993).
  6. Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. Mechanical force-induced signal transduction in lung cells. Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).
  7. Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
  8. Waters, C. M. Reactive oxygen species in mechanotransduction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L484-L485 (2004).
  9. Chapman, K. E., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
  10. Chu, E. K., Whitehead, T., Slutsky, A. S. Effects of cyclic opening and closing at low- and high-volume ventilation on bronchoalveolar lavage cytokines. Crit Car Med. 32, 168-174 (2004).
  11. Tschumperlin, D., Margulies, S. Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro. Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).
  12. Vlahakis, N. E., Hubmayr, R. D. Cellular stress failure in ventilator-injured lungs. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1328-1342 (2005).
  13. Roan, E., et al. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L1235-L1241 (2012).
  14. Gamerdinger, K., et al. Mechanical load and mechanical integrity of lung cells - Experimental mechanostimulation of epithelial cell- and fibroblast-monolayers. J Mech Behav Biomed Mater. 4, 201-209 (2014).
  15. Hayashi, K., Naiki, T. Adaptation and remodeling of vascular wall; biomechanical response to hypertension. J Mech Behav Biomed Mater. 2, 3-19 (2009).
  16. Villemure, I., Stokes, I. Growth plate mechanics and mechanobiology. A survey of present understanding. J Biomech. 42, 1793-1803 (2009).
  17. Waters, C. M., et al. A system to impose prescribed homogenous strains on cultured cells. J Appl Physiol (1985). 91, 1600-1610 (2001).
  18. Gerstmair, A., Fois, G., Innerbichler, S., Dietl, P., Felder, E. A device for simultaneous live cell imaging during uni-axial mechanical strain or compression. J Appl Physiol (1985). 107, 613-620 (1985).
  19. Dassow, C., et al. A method to measure mechanical properties of pulmonary epithelial cell layers. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 101, 1164-1171 (2013).
  20. SmartMotor User's Guide v523. Animatics Corporation. Available from: http://www.animatics.com/download/publication/UsersGuide%20v523.pdf (2011).
  21. Chapman, K., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
  22. Birukov, K. G. Cyclic stretch, reactive oxygen species, and vascular remodeling. Antioxid Redox Signal. 11, 1651-1667 (2009).
  23. Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, 335-344 (2003).
  24. Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
  25. Pouvreau, S. Superoxide flashes in mouse skeletal muscle are produced by discrete arrays of active mitochondria operating coherently. PLoS One. 5, (2010).
  26. Yalcin, H. C., et al. Influence of cytoskeletal structure and mechanics on epithelial cell injury during cyclic airway reopening. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297, L881-L891 (2009).
  27. Jacob, A. M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and claudin 4. J Appl Physiol. 113, 1377-1387 (2012).
  28. DiPaolo, B. C., Lenormand, G., Fredberg, J. J., Margulies, S. S. Stretch magnitude and frequency-dependent actin cytoskeleton remodeling in alveolar epithelia. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C345-C353 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics