Live cell imaging tijdens Mechanical Stretch

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rápalo, G., Herwig, J. D., Hewitt, R., Wilhelm, K. R., Waters, C. M., Roan, E. Live Cell Imaging during Mechanical Stretch. J. Vis. Exp. (102), e52737, doi:10.3791/52737 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

De cellen worden onderworpen aan mechanische belasting in veel weefsels, en deze mechanische stimulatie is aangetoond dat veranderingen in de patronen van genexpressie, afgifte van groeifactoren, cytokinen, of verbouwen van de extracellulaire matrix te bevorderen cytoskelet 1-4. De intracellulaire signalen getransduceerd door deze mechanische stimuli optreden door het proces van mechanotransductie 5-7. In het ademhalingssysteem, vloeit uit mechanotransduction de toename van reactieve zuurstof species (ROS) 8,9 en pro-inflammatoire cytokinen 10 in pulmonaire epitheelcellen in aanwezigheid van cyclische trekbelasting. Sterk bewijs suggereert ook dat overmatige trekbelasting leidt tot directe schade aan het alveolaire epitheel, naast de biochemische reacties van cellen 11-14. Hoewel de nadruk ligt hier vooral op de reactie van longcellen aan mechanische vervorming, paden veroorzaakt door mechanotransductie spelen een belangrijke rol in de basic functie van vele weefsels in het menselijk lichaam, waaronder de regulering van de vasculaire tonus en de 15 ontwikkeling van de groeiplaat 16.

De toenemende belangstelling mechanotransduction heeft geleid tot de ontwikkeling van talrijke inrichtingen voor de toepassing van fysiologisch relevante mechanische belastingen op gekweekte cellen en weefsels. Met name inrichtingen aanbrengen van een trekspanning, die een gebruikelijke vorm van mechanische belasting ervaren door weefsel, populair 11,17-19. Veel van de beschikbare inrichtingen zijn ofwel uitgevoerd als een bioreactor voor weefselregeneratie toepassingen of niet bevorderlijk real time imaging met stretch. Als zodanig is er behoefte aan middelen en methoden om cellen en weefsels kunnen visualiseren spanning het onderzoek trajecten van mechanotransduction vergemakkelijken.

Hierin werd een in-plane mechanische spaninrichting ontworpen en protocollen werden ontwikkeld om m passenultiple vormen van stam aan weefsels en cellen terwijl beeldvorming van de biochemische en mechanische reacties in real time (Figuur 1A-D). De inrichting maakt gebruik van zes regelmatig verdeelde klemmen omtrek aangebracht op een flexibel membraan begrijpen en toepassen van een in-vlak radiale uitzetting tot ongeveer 20% (Figuur 1B). De bedieningsinrichting kan in een celkweek incubator geplaatst gedurende een langere tijd, terwijl de motor (figuur 1C) gepositioneerd buiten de incubator en gecontroleerd door proprietaire software die door de motor leverancier. De motor is verbonden met een lineaire driver, die een interne nok roteert, drijven de zes stretcher klemmen gelijkmatig in spanning en ontspanning.

Naast de mechanische inrichting zijn aangepast flexibele membranen gemaakt van commercieel verkrijgbare celkweek bereid membranen voor gebruik in het mechanische systeem. Dan cirkelvormige wanden (met een diameter van ongeveer28 mm) werden gemaakt en vastgemaakt aan het flexibele membraan zodat cellen kunnen worden gekweekt alleen in dit gebied goed beschreven soort profiel. Om te bepalen of de positie van deze membranen in de aandrijfinrichting uniform en isotroop rek zou voorzien in het midden van het flexibele membraan, werd eindige elementen analyse uitgevoerd met behulp van commercieel verkrijgbare software (Figuur 1E-F). Het flexibele membraan werd gemodelleerd met symmetrische randvoorwaarden en gebruik van alle vierhoekige elementen van de maas. De concentrische ringen gezien in de contourgrafiek van maximum hoofdrek figuur 1F geven de isotrope verdeling van de spanning.

De rek ervaren door het membraan werd gemeten door beelden markeringen doorladen (figuur 2). Figuur 2D laat zien dat de gemiddelde membraan rek gemeten in radiale en axiale richting ongeveer lineairmet betrekking tot de toegepaste motor telt maximaal lineaire rek van 20%. Er was geen significant verschil tussen de rekniveaus gemeten tijdens uitzetting vergeleken met die gemeten tijdens het terugtrekken terug naar de rustpositie. Vervolgens wordt de verplaatsing van humane bronchiale epitheelcellen (16HBE) en hun kernen gekweekt op de aangepaste flexibel membraan werden gemeten. Fluorescent gelabelde (DAPI) kernen van de 16HBE cellen werden afgebeeld met behulp van een 20X objectief onder een confocale microscoop, terwijl hele cel verplaatsing werd gemeten met fase contrast beelden die zijn opgenomen met een digitale microscoop. Zoals blijkt uit figuur 3, de spanning gemeten door verplaatsing van kernen was vergelijkbaar met die gemeten door verplaatsing van markeringen op het membraan, tot ~ 20% lineair rek. Dit bevestigt dat de spanning uitgeoefend op de membranen van de hechtende cellen werd overgebracht. De protocollen die het gebruik van de aangepaste inrichting op een traditionele microscoop en een atomic force microscope worden in de volgende stappen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. De bouw van de membraan met Well Muren voor Behoud van de Cel Cultuur Media (zie figuur 1D voor het eindproduct)

  1. Met behulp van polydimethylsiloxaan (PDMS) platen bekleed met collageen I, snijd de omtrek van het flexibele membraan met een scalpel of een matrijs.
  2. Plaats elk membraan in een 60 mm petrischaal voor opslag.
  3. Oprichting van de muren:
    1. Meng PDMS bij een 10: 1 gewichtsverhouding van elastomeer A tot elastomeer B (verharder).
    2. Giet 5 ml volledig gemengde PDMS in 50 ml buizen.
    3. Plaats 50 ml buizen met uitgeharde PDMS horizontaal in een hybridisatieoven.
    4. Gebruik de rotor het bekleden van de binnenwanden van de buizen bij 8 rpm gedurende de hardingstijd. Bij KT, wordt de PDMS volledig uitgehard in 2 dagen.
    5. Verwijder de PDMS uit de buis in een steriele celkweek kap.
    6. Met behulp van een nieuw scheermesje, partitioneren de cilinder van PDMS in secties 4 mm in de hoogte.
    7. Plaats de secties, die zal dienen als het membraan walls, in een petrischaal container zonder dat de wanden kreuken te vermijden.
  4. Selecteren en middelste wand van PDMS op een membraan terwijl de twee in de petrischaal.
  5. Plaats voorzichtig uitgeharde PDMS (10: 1-verhouding) op de buitenomtrek van de wand te gebruiken lijm. Voorkom vorming van spleten tussen de wand en het membraan omdat het er om vloeistof vast te houden.
  6. Plaats elke petrischaal met de voltooide membraan en bedekt met een oven bij 70 ° C gedurende 24 uur om uit te harden.

2. Correlatie van Motor Rotaties met klem Verplaatsing of Radial Groei voor Calibration (figuur 2)

  1. Start de software besturen van de motor.
  2. Verplaats de klemmen van het apparaat met behulp van de handmatige instelling in de motor software.
  3. Meet de afstand en noteer de motor telling positie tussen tegenover elkaar liggende klemmen zowel minimum en maximum verplaatsing van de klemmen.
  4. De procentuele verandering van het distance tussen de klemmen als functie van het aantal motor (~ 0-75k tellingen). Hierdoor wordt de maximum mogelijke belasting verwezenlijkt op het membraan te geven.

3. Toepassing van Stretch op Mouse Lung epitheelcellijn (MLE12)

  1. Zaad MLE12 cellen met 2,5 miljoen cellen op het flexibele membraan (stap 1) per putje worden confluent binnen twee dagen. De zaaidichtheid kan variëren voor verschillende celtypen.
  2. Controleer de mechanische actuator in een volledig ontspannen positie.
    1. Verwijder celcultuur media.
    2. Met 1,5 mm biopt stoten, punch twee gaten in elk van de zes klemmen (zie figuur 1D) tabs van het membraan. De radiale positie van de gaten bepaalt de hoeveelheid voorspanning van het membraan ervaringen oorspronkelijk. Pons de gaten op een straal van 20,5 mm op de tabs membraan indien geen voorspanning wordt gewenst.
    3. Plaats het membraan op de brancard met de geponste gaten rij met de pennen in de klemmen.Plaats de top klemmen op zijn plaats. Draai de schroeven een voor een afwisselend kanten.
    4. Voeg 1 ml celcultuur media.
  3. Plaats het apparaat op de microscooptafel centrering het midden van de membraan met de lichtweg.
  4. Gebruik tape of magneten (indien mogelijk) om het apparaat naar het podium. Eenmaal opgelost, regelen in het vlak (parallel aan het membraan) en verticale (z-richting) van de mechanische inrichting van fase controller van de microscoop.
  5. Breng traject met de software van de fabrikant door het handmatig regelen van de positie en de snelheid van rotatie van de motor 20.

4. Meting van de mitochondriale reactive oxygen species (ROS)

  1. Zodra cellen zijn confluent, voeg 1-2 ml RT DMEM met mitochondriale superoxide indicator (5 uM uiteindelijke concentratie) direct op de cellen.
  2. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
  3. Was de cellen voorzichtig drie keer met buffer verwarmd in een waterbad37 ° C.
  4. Plaats onmiddellijk het flexibele membraan op de brancard (Stap 2.2) reeds in plaats onder een rechtopstaande confocale microscoop.
  5. Voeg 1 ml van DMEM met fenolrood-vrij medium en 25 mM HEPES.
  6. Stel excitatie / emissie filters om 510/580 nm.
  7. Afbeelding meerdere velden elke 15 minuten naar het gewenste tijdsverloop van mitochondriale superoxide productie creëren.
  8. Van de opgenomen beelden, opnemen fluorescentie-intensiteit histogrammen op elk tijdsinterval met behulp van software in staat te kwantificeren fluorescentie-intensiteit.

5. Toepassing van de Stretch en Atomic Force Microscopy (AFM)

OPMERKING: Deze stappen zijn bedoeld voor een bepaalde AFM en optische microscoop combinatie (Figuur 4 en Materials List).

  1. Bereid de AFM het experiment.
    1. Vergroot de hoogte van de AFM kop tot de maximale positie in de z-richting.
    2. Zet extenders op de benen van de AFMTil het vliegtuig waarin AFM cantilever contacten het monster. Het monster en de AFM printkop moet worden opgetild tot de hoogte van de mechanische koppelstuk.
  2. Bereid de optische microscoop (indien beschikbaar).
    1. Verwijder de AFM scanner plaat. Verwijder het gewenste doel.
    2. Voeg een afstandhouder aan de doelstelling. De hoogte van de afstandhouder zal afhangen van het doel en de specifieke AFM opzet, maar het is noodzakelijk als optische beeldvorming gewenst aangezien waarnemingsvlak verschuiving in de z-richting met een bedrag gelijk aan de brancard en de hoogte van de adaptor (figuur wordt 5A). Merk op dat de AFM biedt meestal lage vergroting beeldvorming van een optisch pad boven het apparaat.
    3. Monteer de gewenste doel weer op zijn plaats. Plaats de scanner terug naar de AFM.
    4. Start de AFM software. Start alle benodigde lichtbronnen inclusief de lichtbron voor fluorescentie metingen.
    5. Monteer een chip met een vrijdragende balkgeschikt is voor de gewenste metingen. 200 pN / nm of minder stijfheid heeft de voorkeur bij het meten van de elastische modulus van levende cellen.
    6. Lijn de laser en kalibreren van de cantilever stijfheid volgens de suggesties van de fabrikant op een glazen dekglaasje gemonteerd op het apparaat.
  3. Bereid een membraan als in stap 1, maar met de volgende modificaties.
    1. Onmiddellijk voor het monteren van de membraan naar de spaninrichting, snijd de wanden ongeveer 1 mm in hoogte. Dit voorkomt de ondervonden interferentie tussen de membraanwanden en de meetcel.
    2. Monteer het membraan op de mechanische apparaat zoals beschreven 3.2.1-3.2.3.
    3. Celkweek media verwijderen om beschadiging van de AFM scanner bij een lekkage te voorkomen.
    4. Koppel het apparaat met een adapter (Figuur 5A). Plaats het mechanische apparaat met de adapter op de scanner.
    5. Trek de membraan naar de gewenste trekspanning level.
  4. Voeg een beperkt (<0,5 ml) volume van de media op de cellen naar AFM scanner of microscoop schade te voorkomen als gevolg van een lekkage.
  5. Schakel de cantilever met het membraan.
  6. Volg het protocol van de bijzondere AFM apparaat om gebieden van belang te scannen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Reactive oxygen species en vervorming

Eerdere studies toonden verhogingen reactive oxygen species (ROS) in de luchtwegen en alveolaire epitheelcellen in respons op cyclische rek 21. Reactieve zuurstofspecies omvatten moleculen en vrije radicalen afgeleid van moleculaire zuurstof met een hoge reactiviteit met lipiden, eiwitten, polysachariden, en nucleïnezuren 22-24. ROS als gemeenschappelijke intracellulair signaal ionkanaalfunctie reguleren, proteïne kinase / fosfatase activatie en genexpressie, maar overmatige of ongereguleerde productie kan bijdragen tot apoptotische en necrotische celdood, neurodegeneratie, athérosclérose, diabetes en kanker 24.25. Superoxide, een voorloper voor andere vormen van ROS kunnen worden geproduceerd als bijproduct van mitochondriale respiratie wanneer elektronen lekken uit de elektron overbrengende keten. Eerdere studies suggereerden dat cyclische mechanische stretch stimuleerde de productie van superoxide door een combinatie van het NADPH oxidase systeem (nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat-oxidase) en de mitochondriale elektronentransportketen (complex I en III). Voorgesteld is dat deze stimulatie het gevolg was van een directe verstoring van de mitochondria 21 mogelijk als gevolg van verbindingen met de cel cytoskelet. Om deze hypothese te testen, de cel strekinrichting ontwikkeld zodat we kunnen beeld verandert in ROS productie in levende cellen als reactie op mechanische rek. Hier, de mitochondriale ROS door bronchiale epitheelcellen vanwege rekken werd gemeten met de aangepaste inrichting en protocol. Bij gebrek aan mechanische rek heeft ROS productie niet significant toenemen in 60 min (figuur 4). Wanneer een 17% rek werd toegepast en gehandhaafd, was er een toename van mitochondriale ROS die bleef nog eens 60 min.

Direct Epithelial Monolayer schade door Stretch

2. Verschillende studies suggereren dat overmatige mechanische gedeelte van longepitheelcellen directe letsel waarbij schade aan cellen 11,13,26,27 kan veroorzaken. Dit soort schade is moeilijk om vast te leggen zonder real-time beeldvorming tijdens de mechanische uitzetting. Als zodanig gebruikmaking van de aangepaste inrichting en fasecontrastmicroscopie opeenvolgende afbeeldingen cellen die werden mechanisch gerekt werd opgenomen voor en na behandeling met een pro-inflammatoir cytokine (50 ng / ml TNF-α gedurende 6 uur) (figuur 5). Foto's van hetzelfde gebied van cellen werden gevangen bij toenemende rekniveaus. De beelden tonen de vorming van een spleet wanneer de cellen werden gespannen tussen 10 en 15% rek zoals aangegeven door de rode pijlen. Het is belangrijk op te merken dat deze beelden werden in bijna real-time, <10 sec interval tussen het einde van stretc h en weergave, terwijl de cellen werden uitgerekt. In eerdere studies van cell imaging van uitgerekt cellen, werden beelden verkregen voor en na stretch vergelijken alleen de beelden van de cellen niet uitgerekte toestand 11,13,28.

AFM Nano-inspringen op gespannen cellen

De mechanische inrichting werd geplaatst in de AFM met behulp van een adapterplaat (zie figuur 6A). Met behulp van eerder gepubliceerde werkwijzen 13, elasticiteitsmodulus kaarten (E-maps) van MLE12 cellen voor en na 10% rek werden verkregen (Figuur 6D-E). Hoewel fasecontrastbeeld bij 10% rek (figuur 6D) werd verkregen binnen 10 seconden van het traject, de E-kaarten in figuur 6D-E verbruikte ongeveer 22 min met 300 afzonderlijke kracht-indrukkingscurven gedurende een 40 urn X 40 urn met een 2,5 um / s snelheid van de tip in de z-richting.OM / files / ftp_upload / 52737 / 52737fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 1
Figuur 1. De op maat ontworpen apparaat voor celcultuur en stretching. (A) Computer gegenereerde tekening van het mechanische ontwerp van de inrichting, (B) een foto van de voltooide inrichting, (C) een foto van het apparaat verbonden met de motor en lineaire driver, die de motor rotatie omzet in een 1-dimensionale beweging, die bestuurt de klem biaxiale stuk van de (D) siliconen rubber membraan. Het substraat heeft twee gaten op elk tabblad klem op posten op elke klem te plaatsen. (E) Maatschetsen FEA model van het flexibele membraan dat 1/4 van de gehele constructie door gebruik van symmetrische randvoorwaarden. ( trong> F) Maximale belangrijkste stam wordt weergegeven in het volledige membraan die de vorming van ringen indicatief isotrope stam veld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. (A) Het apparaat dat een flexibel membraan met markeringen aangebracht op aangebrachte spanning te meten weergegeven. Close-up beelden van de markeringen, vóór (B) en na (C) stretch, werden gemerkt met een pijl om duidelijk aan te geven de verplaatsing van de markeringen op het membraan. (D) Membraan stam als een functie van de motor telt bij benadering en terugtrekking. Membraan stam was vergelijkbaar in beide aanpak en intrekken met terugtrekking produceren iets hoger stammen. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52737/52737fig2highres.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Membraan stam transmissie naar de cellen. (A - B) fasecontrastbeelden van humane bronchiale epitheelcellen (16HBE) op het flexibele membraan met een 10X objectief, voor (A) en na (B) 20% rek. (C - C) Fluorescerend gemerkte (DAPI) kernen van de 16HBE cellen werden afgebeeld met behulp van een 20X objectief onder een confocale microscoop, voor (C) en na (D) 20% rek. (E) Het membraan rek ervaren door cellen was lineair en homogeen.t = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. De impact van een enkel stuk van de ROS productie van 16HBE cellen werd waargenomen met behulp van een cumulatieve mitochondriale superoxide sensor met een 20X objectief onder een confocale microscoop (A - C). Snapshots van het tijdsverloop (0, 60 min, en ~ 65 min) van de superoxide productie tijdens rek in hetzelfde gebied van cellen. (D) Relatieve fluorescentie-intensiteit van 16HBE cellen na verloop van tijd wat wijst op een toename van 50% in fluorescentie-intensiteit ten opzichte van baseline productie van superoxide binnen het eerste uur (A naar B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.


Figuur 5. fasecontrastbeelden van een alveolaire epitheel (MLE12) monolayer respons op toenemende rek (A - D). Werden alle opgenomen met een digitale microscoop met een 20X objectief. De pijlen geven de locaties waar de cel-cel scheiding opgetreden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6
Figuur 6. (A) Mechanische inrichting volgens de AFM voor nano-indentatie van cellen met stretch. De scanner moet worden verwijderd voor het plaatsen van doelstelling extender. Drie been extenders zijn verbonden met de drie benen van de AFM kop om voor toestelplaatsing. Een adapterplaat gebruikt om de brancard te monteren aan de AFM scanner (zwarte plaat). De vrijdragende ligger scan in de richting van de pijl getoond in de hiervoor beelduitrekking fasecontrast een MLE12 cel (B). De rode vierkanten in de voor (B) en na (C) strek afbeeldingen tonen het gebied dat is gevangen tijdens nano-indentatie (40X objectief). De elastische modulus kaarten, vóór (D) en na (E) stretch, worden verkregen met eerder gepubliceerde analysetechnieken 13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een uniek apparaat voor live-cell imaging tijdens mechanische stretch is ontwikkeld; en dit apparaat werd gebruikt in een protocol om long epitheelcellen Mechanobiology bestuderen. In voorlopige studies werd gevonden dat een enkele plaats rek stimuleerde de productie van mitochondriale superoxide in bronchiale epitheelcellen. Bovendien werd aangetoond dat verhoogde mechanische belasting veroorzaakt directe schade aan de integriteit van een monolaag van alveolaire epitheelcellen.

Om deze voorlopige experimenten uit te voeren, werd het apparaat eerst gekalibreerd, en vervolgens werd aangetoond dat het membraan stam cellen (figuren 2-3) werd doorgegeven. Algemeen het apparaat goed gepresteerd, zoals aangegeven door de nauwe correlatie tussen het membraan stam (gemeten merktekens op het membraan) en de cellijn (gemeten afstanden tussen kernen) getoond in figuur 3E. Toch waren er enkele kleine verschillen waargenomen tussen strain afgemeten op de membranen tijdens de nadering en de terugkeer rondingen van de markers, zoals getoond in figuur 2D. Dit was waarschijnlijk te wijten aan terugslag in de inrichting en mogelijk in verband met het grijpen kwesties. Bovendien wordt een universeel bevestigingsmechanisme voor het apparaat nodig opdat deze efficiënt kan worden gebruikt microscopen met verschillende configuraties. Dit zal de tijd tussen het positioneren van de inrichting en beeldopname met behoud van een robuuste verbinding met de microscoop te verminderen. Gaatjes in de membranen zijn gebruikt om een ​​kleine pre-stam toepassing op het membraan om de vorming van een eerste samendrukkende toestand te vermijden als gevolg van het vastklemmen van een elastisch materiaal. De samendrukkende toestand leidt ook tot een vermindering van de maximaal toe rek.

De aangepaste apparaat is ontworpen om te passen in een asiel MFP3D Atomic Force Microscope naar nano-inspringen van levende cellen mogelijk te maken tijdens mechanische stretch. We zijn niet op de hoogte van elk ander apparaat dat in staat is inducing een isotrope spanning staat in de beeldvorming vliegtuig dat kan functioneren binnen een AFM. De inrichting is ook geschikt voor continu gebruik in een cel-kweek incubator (bij 37 ° C in een vochtige, steriele omgeving met 5% CO 2). De mogelijkheid om te functioneren in een incubator maakt het onderzoek mogelijk van cellen die langdurig stretch regimes.

Er zijn verscheidene beperkingen aan de gepresenteerde aanpak. Ten eerste, zoals het membraan strekt, het gebied van de focus verplaatst van het vliegtuig, hoewel minimaal (~ 100 micrometer). Dit wordt een beperking bij het volgen van een veld van cellen door een stuk regime omdat het gezichtsveld verandert in de loop van het membraan uitzetting. Hoewel membraan binnen de 22 mm diameter ervaart 0,23-0,25 stam, de regio's buiten deze binnendiameter ervaring een meer variabel veldstam. Hoewel imaging studies gemakkelijk toe beperkt centrale gebied, is het mogelijk dat de cellen reageren op hogere niveaus van stamin buitengebieden kunnen de respons van cellen in het centrale gebied beïnvloeden. Een uniforme spanningsdistributie over een groter gebied van belang kan worden bereikt met verbeteringen in het membraan ontwerp. De PDMS membraan auto-fluorescentie golflengte gebruikt voor fluorescente indicatoren, en dit beperkt de mogelijkheden voor beeldvorming fluorescentie in cellen van onder het membraan. Om deze reden werd een rechtopstaande microscoop gebruikt met doelstellingen water onderdompeling in onze studies van de ROS productie zoals hierboven beschreven. Dit kan een beperking voor studies waarin AFM en fluorescentie beeldvorming tezamen.

De meest voorkomende commerciële inrichting (FlexCell FX 5000 Tension System) voor het uitoefenen van mechanische spanning op cellen omvat een regelbaar vacuümsysteem toepassing trekspanning op een membraan tijdens het bewegen in en uit het optische vlak. Het membraan en klem ontwerp hierin gepresenteerd creëren van een bi-axiale stam gebied waar de stam is isotroop en blijft in het vliegtuig allowing real-time imaging. Met kleine aanpassingen aan het membraan ontwerp kan de brancard uniaxiale rek modes produceren ook. Als de cellen eerst worden gezaaid op een opgezwollen membraan, in-plane drukkrachten kunnen ook worden toegepast. Het apparaat kan zowel fysiologische en pathologische niveaus van stam bereiken. Kortom, een nieuwe inrichting en protocollen ontwikkeld die kunnen worden gebruikt om mechanische belastingen toepassing op levende cellen die kunnen worden afgebeeld met behulp van fluorescentiemicroscopie en AFM nano-indentatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

De auteurs willen graag dat Fedex Instituut voor Technologie van de Universiteit van Memphis bedanken voor hun steun. De auteurs willen graag aan studenten van de senior ontwerp projectgroep in het Mechanical Engineering Department te erkennen aan de Universiteit van Memphis (David Butler, Jackie Carter, Dominick Cleveland, Jacob Shaffer), Daniel Kohn van de afdeling Universiteit van Memphis CTW voor motorbesturing en Dr. Bin Teng en mevrouw Charlean Luellen voor hun hulp in celcultuur. Dit werk werd ondersteund door K01 HL120912 (ER) en R01 HL123540 (CMW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SmartMotor NEMA 34: 3400 Series MOOG Animatics SM3416D Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus
Flexcell Membrane (Collagen I coated) Flexcell International Corp SM2-1010C 3.5" x 5.25" x 0.020"
Sylgard 184 Dow Corning Corporation 10:1
Hoechst 33342  Sigma-Aldrich H1399 DAPI stain
MitoSOX Sigma-Aldrich M36008
Tiron Sigma-Aldrich D7389  mitochondrial superoxide label
DMEM superoxide inhibitor
FBS
HEPES
50 ml tubes Fisher Scientific 06-443-19 Any centriguge tube can be used to create an area for imaging.
Hybridization oven Bellco Glass
MLE12 Cells ATCC CRL-2110 Mouse Lung Epithelial Cells 
16HBE cells ATCC CRL-2741 Human Bronchial Epithelial Cells
AFM Indentation Experiments
Cantilever Beams for Nano-indentation Budget Sensors Si-Ni30
AFM  Asylum Research MFP3D
Olympus microscope Olympus IX-71 Inverted microscope with 20X and 40X objectives.
AFM Leg Extenders Asylum Research Not available AFM microscope
Finite Element Analyses
ABAQUS Simulia 6.12
Software
ImageJ NIH
Microscopes
Digital microscope Life Technologies EVOS XL Core Initially a self standing company, now owned by Life Technologies.
Confocal microscope Zeiss LSM 710 2-photon upright microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tschumperlin, D. J., Boudreault, F., Liu, F. Recent advances and new opportunities in lung mechanobiology. J Biomech. 43, 99-107 (2010).
  2. Waters, C. M., Roan, E., Navajas, D. Comprehensive Physiology. John Wiley, & Sons, Inc. (2011).
  3. Majkut, S., Dingal, P. C. D. P., Discher, D. E. Stress Sensitivity and Mechanotransduction during Heart Development. Current Biology. 24, R495-R501 (2014).
  4. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475, 316-323 (2011).
  5. Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. Mechanotransduction across the cell-surface and through the cytoskeleton. Science. 260, 1124-1127 (1993).
  6. Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. Mechanical force-induced signal transduction in lung cells. Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).
  7. Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
  8. Waters, C. M. Reactive oxygen species in mechanotransduction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L484-L485 (2004).
  9. Chapman, K. E., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
  10. Chu, E. K., Whitehead, T., Slutsky, A. S. Effects of cyclic opening and closing at low- and high-volume ventilation on bronchoalveolar lavage cytokines. Crit Car Med. 32, 168-174 (2004).
  11. Tschumperlin, D., Margulies, S. Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro. Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).
  12. Vlahakis, N. E., Hubmayr, R. D. Cellular stress failure in ventilator-injured lungs. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1328-1342 (2005).
  13. Roan, E., et al. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L1235-L1241 (2012).
  14. Gamerdinger, K., et al. Mechanical load and mechanical integrity of lung cells - Experimental mechanostimulation of epithelial cell- and fibroblast-monolayers. J Mech Behav Biomed Mater. 4, 201-209 (2014).
  15. Hayashi, K., Naiki, T. Adaptation and remodeling of vascular wall; biomechanical response to hypertension. J Mech Behav Biomed Mater. 2, 3-19 (2009).
  16. Villemure, I., Stokes, I. Growth plate mechanics and mechanobiology. A survey of present understanding. J Biomech. 42, 1793-1803 (2009).
  17. Waters, C. M., et al. A system to impose prescribed homogenous strains on cultured cells. J Appl Physiol (1985). 91, 1600-1610 (2001).
  18. Gerstmair, A., Fois, G., Innerbichler, S., Dietl, P., Felder, E. A device for simultaneous live cell imaging during uni-axial mechanical strain or compression. J Appl Physiol (1985). 107, 613-620 (1985).
  19. Dassow, C., et al. A method to measure mechanical properties of pulmonary epithelial cell layers. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 101, 1164-1171 (2013).
  20. SmartMotor User's Guide v523. Animatics Corporation. Available from: http://www.animatics.com/download/publication/UsersGuide%20v523.pdf (2011).
  21. Chapman, K., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
  22. Birukov, K. G. Cyclic stretch, reactive oxygen species, and vascular remodeling. Antioxid Redox Signal. 11, 1651-1667 (2009).
  23. Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, 335-344 (2003).
  24. Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
  25. Pouvreau, S. Superoxide flashes in mouse skeletal muscle are produced by discrete arrays of active mitochondria operating coherently. PLoS One. 5, (2010).
  26. Yalcin, H. C., et al. Influence of cytoskeletal structure and mechanics on epithelial cell injury during cyclic airway reopening. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297, L881-L891 (2009).
  27. Jacob, A. M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and claudin 4. J Appl Physiol. 113, 1377-1387 (2012).
  28. DiPaolo, B. C., Lenormand, G., Fredberg, J. J., Margulies, S. S. Stretch magnitude and frequency-dependent actin cytoskeleton remodeling in alveolar epithelia. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C345-C353 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics