Live-Cell Imaging under Mekanisk Stretch

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rápalo, G., Herwig, J. D., Hewitt, R., Wilhelm, K. R., Waters, C. M., Roan, E. Live Cell Imaging during Mechanical Stretch. J. Vis. Exp. (102), e52737, doi:10.3791/52737 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Celler blir utsatt for mekanisk belastning i mange vev, og denne mekaniske stimuleringen har vist seg å fremme endringer i genekspresjonsmønster, frigjøring av vekstfaktorer, cytokiner eller ombygging av den ekstracellulære matriks og cytoskjelettet 1-4. De intracellulære signaler transdusert fra slike mekaniske stimuli skje gjennom prosessen med mechanotransduction 5-7. I luftveiene, er et resultat av økningen i mechanotransduction reaktive oksygenarter (ROS) 8,9 og pro-inflammatoriske cytokiner 10 pulmonal epitel-celler i nærvær av sykliske strekk- belastning. Sterke bevis tyder også på at overdreven strekk påkjenning fører til direkte skade alveolar epitel, i tillegg til de biokjemiske responser i cellene 11-14. Selv om fokuset her er først og fremst på responsen av lungeceller til mekanisk deformasjon, trasé indusert av mechanotransduction spille en nøkkelrolle i basic funksjon av mange vev i kroppen, deriblant regulering av vaskulær tone 15 og utviklingen av vekstplaten 16.

Den voksende interessen for mechanotransduction har resultert i utviklingen av en rekke enheter for påføring av fysiologisk relevante mekaniske belastninger til dyrkede celler og vev. Spesielt anordninger anvender en strekk belastning, noe som er en vanlig form for mekanisk belastning som oppleves av vev, er populære 11,17-19. Imidlertid er mange av de tilgjengelige anordninger er enten utformet som en bioreaktor for vev tekniske anvendelser eller er ikke bidrar til sanntids avbildning med strekk. Som sådan, er det behov for å utvikle verktøy og metoder som kan visualisere celler og vev i spenning for å lette etterforskningen av veier av mechanotransduction.

Heri, ble en in-plane mekanisk strek enhet konstruert og protokoller ble utviklet for å bruke multiple former for belastning til vev og celler mens tillater avbildning av de biokjemiske og mekaniske responser i sanntid (figur 1A-D). Anordningen benytter seks jevnt fordelte klemmer anordnet langs omkretsen for å gripe en fleksibel membran og anvende en in-plan, radial oppblåsthet opp til ca 20% (figur 1B). Aktiveringsanordningen kan være plassert i en cellekulturinkubator i en lengre periode, mens motoren (figur 1C) er posisjonert utenfor inkubatoren og styrt av proprietær programvare levert av motoren leverandøren. Motoren er koblet til en lineær drivenhet, som roterer en innvendig kam, som driver seks båreklemmene jevnt i spenning og avslapning.

I tillegg til den mekaniske enheten, ble tilpasset fleksible membraner laget av kommersielt tilgjengelige cellekultur klare membraner som skal anvendes i det mekaniske systemet. Deretter sirkulære vegger (med en diameter på ca.28 mm) ble laget og festet til den fleksible membranen, slik at cellene kan dyrkes kun i denne regionen av vel beskrevne stamme profil. For å bestemme hvorvidt plassering av disse membranene inne i aktiveringsanordningen ville gi enhetlig og isotrop belastning i midten av den fleksible membranen, ble elementanalyse utført ved bruk av kommersielt tilgjengelige programvarer (figur 1E-F). Den fleksible membranen ble modellert med symmetriske grensebetingelser og utnytte alle firkant elementer for mesh. De konsentriske ringer sett i konturplott av maksimal hovedstammen vist i figur 1F viser isotrop fordeling av belastningen.

Stammen oppleves av membranen ble målt ved opptak av bilder av markeringer via belastning (figur 2). Figur 2D viser at den gjennomsnittlige membran belastning målt i radiale og aksiale retninger var tilnærmet lineærmed hensyn til den anvendte motor teller opp til en maksimal lineær belastning på 20%. Det var ingen signifikant forskjell mellom de belastningsnivået målt i løpet av oppblåsthet, sammenlignet med de som ble målt under tilbaketrekking tilbake til hvilestilling. Deretter ble den forskyvning av humane bronkiale epitelceller (16HBE) og deres kjerner dyrket på den tilpassede fleksibel membran måles. Fluorescensmerkede (DAPI) kjerner av 16HBE celler ble avbildes med en 20X objektiv under et konfokal mikroskop, mens hele cellen forskyvning ble målt med bilder fase kontrast tatt opp med et digitalt mikroskop. Som vist i figur 3, er den spenning som måles ved forskyvning av kjernene var den samme som målt ved fortrengning av markeringer på membranen, opp til ~ 20% lineær belastning. Dette bekrefter at belastningen påført membranene ble overført til de adherente celler. Protokollene som beskriver bruken av den tilpassede enheten på en tradisjonell mikroskop og en atomic force microscope er gitt i de følgende trinnene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Konstruksjon av membran med brønnveggene for Retensjon av cellekulturmedier (se figur 1D for sluttproduktet)

  1. Bruke polydimethylsiloxane (PDMS) ark belagt med Collagen jeg, kutte omrisset av den fleksible membranen med en skalpell eller en dør.
  2. Plasser hver membran i en 60 mm petriskål for lagring.
  3. Opprettelse av vegger:
    1. Bland PDMS ved et 10: 1 vektforhold av elastomer A til elastomer B (herder).
    2. Hell 5 ml fullstendig blandede PDMS i 50 ml rør.
    3. Plasser 50 ml rør med uherdet PDMS horisontalt i en ovn hybridisering.
    4. Bruk rotoren funksjonen til å belegge de indre vegger av rørene 8 rpm i løpet av herdetiden. Ved RT, vil PDMS være fullt herdet i 2 dager.
    5. Fjern de PDMS fra røret i en steril cellekultur hette.
    6. Ved hjelp av et nytt barberblad, partisjonere sylinder av PDMS i seksjoner 4 mm høyde.
    7. Plasser delene, som vil tjene som membran walls, inn i en petriskål container uten å tillate at veggene blir krøllete.
  4. Velg og midt en vegg av PDMS med en membran under opprettholdelse av to i petriskålen.
  5. Forsiktig plassere uherdet PDMS (10: 1 forhold) på utsiden omkretsen av veggen som skal brukes som lim. Hindre dannelse av åpninger mellom veggen og membranen ettersom det er der for å holde væske.
  6. Plasser hver petriskål som inneholdt den ferdige membran og dekket i en ovn ved 70 ° C i 24 timer for å herde.

2. Korrelasjon av Motor rotasjoner med Clamp Displacement eller Radial Vekst for kalibrering (figur 2)

  1. Start programvaren som styrer motoren.
  2. Fortrenge klemmene på enheten ved hjelp av manuell innstilling i motor programvare.
  3. Mål avstanden og registrering av motor count posisjon mellom motstridende klemmer på både minimum og maksimum forskyvning av klemmene.
  4. Beregn prosent endring i distance mellom klemmene som en funksjon av motorens telling (~ 0-75k tellinger). Dette vil indikere det maksimale potensialet belastningen oppnådd på membranen.

3. Bruk av Stretch på Mouse Lung epitelcellelinje (MLE12)

  1. Seed MLE12 celler på 2,5 millioner celler på den fleksible membran (Trinn 1) per brønn som skal sammenflytende i løpet av to dager. Seeding tetthet kan variere for forskjellige celletyper.
  2. Sørg for at den mekaniske aktuatoren er i en helt avslappet posisjon.
    1. Fjern cellekulturmedier.
    2. Ved hjelp av 1,5 mm biopsi slag, punch to hull i hver av de seks klemmen (se figur 1D) tappene på membranen. Radial plassering av hullene avgjør hvor mye stramming membran erfaringer i utgangspunktet. Punch hull med en radius på 20,5 mm på flikene membran hvis ingen pre-spenning er ønsket.
    3. Plasser membran på båren med hull stille opp med pinnene i klemmene.Plasserer de beste klemmer på plass. Stramme skruene en om gangen vekslende sider.
    4. Tilsett 1 ml cellekulturmedier.
  3. Plassere enheten på mikroskopet scenen sentre midten av membranen med lysbanen.
  4. Bruk tape eller magneter (hvis mulig) for å feste utstyret til scenen. Når faste, kontrollere i planet (parallelt med membranen) og vertikal (z-retning) av den mekaniske anordning med scenen kontrolleren av mikroskop.
  5. Påfør strekning med programvaren som leveres av produsenten ved å manuelt styre posisjonen og hastigheten på motorrotasjonen 20.

4. Måling av mitokondriell reaktive oksygenforbindelser (ROS)

  1. Når cellene blir sammenflytende, tilsett 1-2 ml RT DMEM med mitokondrie superoksid indikatoren (5 mikrometer endelig konsentrasjon) direkte på cellene.
  2. Inkuber i 10 minutter ved 37 ° C.
  3. Vask cellene forsiktig tre ganger med buffer varmet i et vannbad til37 ° C.
  4. Umiddelbart plassere fleksibel membran på båren (trinn 2.2) allerede på plass under en oppreist konfokalmikroskop.
  5. Tilsett 1 ml DMEM med fenol rød-fritt medium og 25 mM HEPES.
  6. Still eksitasjon / emisjonsfiltre til 510/580 nm.
  7. Bilde flere felt hvert 15 min for å skape den ønskede tidsforløpet av mitokondriell superoksydproduksjon.
  8. Fra bildene, histogrammer posten fluorescens intensitet ved hvert tidsintervall ved hjelp av programvare som kan kvantifisere fluorescens intensitet.

5. Bruk av Stretch og Atomic Force Mikroskopi (AFM)

MERK: Disse trinnene er gitt for et bestemt AFM og optisk mikroskop kombinasjon (figur 4 og Materials List).

  1. Forbered AFM for forsøket.
    1. Øke høyden av AFM hodet til sin maksimale posisjon i z-retningen.
    2. Sett forlengere på bena til AFM tilløfte flyet på som AFM cantilever kontakter prøven. Prøven og AFM hodet må løftes for å få plass til høyden av mekanisk innretning.
  2. Klargjør optisk mikroskop (hvis tilgjengelig).
    1. Fjern AFM skanner plate. Fjern det ønskede målet.
    2. Legg en spacer til målet. Høyden av avstands vil avhenge av formålet og den spesifikke AFM oppsett, men det er nødvendig hvis optisk avbildning er ønsket fordi observasjonsplanet vil være forskyvning i Z-retningen med en størrelse lik til båren og adapteren høyde (figur 5A). Merk at AFM gir vanligvis lav forstørrelse avbildning fra en optisk bane over enheten.
    3. Monter den ønskede målet tilbake på plass. Plasser skanneren tilbake på AFM.
    4. Start AFM programvare. Begynn alle nødvendige lyskilder inkludert lyskilde for fluorescensmålinger.
    5. Montere en chip med en cantilever beam somer hensiktsmessig for de ønskede målinger. 200 pN / nm eller mindre stivhet foretrekkes ved måling av elastisitetsmodulen av levende celler.
    6. Juster laser og kalibrere cantilever stivhet i henhold til produsentens forslag om et glass dekkglass montert på enheten.
  3. Forbered en membran som i trinn 1, men med følgende modifikasjoner.
    1. Umiddelbart før montering av membranen på den strammeanordning, kuttet veggene til omtrent 1 mm i høyde. Dette forhindrer interferens opplevde mellom membranveggene og lastcellen.
    2. Monter membran på mekanisk innretning som beskrevet 3.2.1-3.2.3.
    3. Fjern cellekulturmedier for å hindre skade på AFM skanner i tilfelle utslipp.
    4. Par den med en adapter (Figur 5A). Plasser mekanisk innretning med adapteren på skanneren.
    5. Strekk membranen til det ønskede strekknivå belastning.
  4. Legg en begrenset (<0,5 ml) volum av media på cellene for å unngå AFM skanner eller mikroskop skade på grunn av et spill.
  5. Engasjere cantilever beam med membranen.
  6. Følg protokollen til bestemte AFM enheten skal søke områder av interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Reaktive oksygenforbindelser og deformasjon

Tidligere studier har vist en økning i reaktive oksygenarter (ROS) i luftveiene og alveolære epitel-celler i respons til syklisk strekning 21. Reaktive oksygenarter omfatter molekyler og frie radikaler avledet fra molekylært oksygen med høy reaktivitet overfor lipider, proteiner, polysakkarider, nukleinsyrer og 22-24. ROS tjene som en felles intracellulært signal for å regulere ionekanal funksjon, protein kinase / fosfatase-aktivering, og genekspresjon, men overdreven eller uregulert produksjon kan bidra til apoptotisk og nekrotisk celledød, nevrodegenerasjon, aterosklerose, diabetes, kreft og 24,25. Superoksid, en pre-markør for andre former for ROS, kan fremstilles som et biprodukt av mitokondriell respirasjon når elektroner lekke fra elektronoverføringskjeden. Tidligere studier antydet at syklisk mekanisk stretch stimulerte produksjonen av superoksid gjennom en kombinasjon av det NADPH oksidase-systemet (nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat-oxidase) og mitokondrielle elektrontransportkjeden (kompleks I og III). Det er blitt foreslått at denne stimuleringen var på grunn av en direkte forvrengning av mitochondria 21 muligens på grunn av tilkobling til cellen cytoskjelettet. For å teste denne hypotesen, ble celle strekker enhet utviklet slik at vi kunne bildeendringer i ROS produksjon i levende celler i respons til mekanisk stretch. Her ble de mitokondrielle ROS produsert av bronkial epitelceller grunn til å strekke målt ved hjelp av tilpassede enheten og protokoll. I fravær av mekanisk stretch, gjorde ROS produksjon ikke signifikant økning over 60 min (figur 4). Når en enkelt 17% strekking ble påført og opprettholdt, var det en økning i mitokondrie ROS som vedvarte i ytterligere 60 min.

Direkte Epithelial ett lag skade på grunn av Stretch

to steder. Flere studier tyder på at overdreven mekanisk stretch av lunge epitelceller kan føre til direkte skade som involverer skade på celler 11,13,26,27. Denne type skade er vanskelig å fange opp uten sanntids avbildning under mekanisk utvidelse. Som sådan, utnytte den tilpassede enheten og fasekontrastmikroskopi av cellene etterfølgende bilder som er mekanisk strukket ble registrert før og etter behandling med et pro-inflammatorisk cytokin (50 ng / ml TNF-α i 6 timer) (figur 5). Bilder av samme felt av celler ble tatt med økende belastningsnivåer. Bildene viser dannelsen av et gap når cellene ble strukket mellom 10 og 15% belastning som antydet med de røde pilene. Det er viktig å merke seg at disse bildene ble tatt opp i nær sanntid, <10 sek etterslep mellom slutten av strekke h og bildebehandling, mens cellene ble strukket. I tidligere studier av celle avbildning av strukket celler, ble bildene tatt før og etter strekk sammenligne bare bilder av cellene ikke på strukket tilstand 11,13,28.

AFM Nano-innrykk på strukket celler

Den mekaniske enheten ble plassert i AFM med bruk av en adapterplate (se figur 6A). Ved hjelp av tidligere publiserte metoder 13, elastisk modulus maps (E-maps) av MLE12 celler før og etter 10% strekk belastningsskader ble oppnådd (figur 6D-E). Selv fase kontrast ved 10% belastning (figur 6D) ble oppnådd i løpet av 10 sekunder av strekningen, e-kartene vist i Figur 6D-E konsumert ca 22 min med 300 individuelle tvangs nedbøyning kurvene registrert i løpet av en 40 mikrometer X 40 mikrometer med en 2,5 um / s hastighet av spissen i z-retningen.om / filer / ftp_upload / 52737 / 52737fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 1
Figur 1. Den spesialdesignede enhet for cellekultur og stretching. (A) datagenerert tegning av den mekaniske utformingen av anordningen, (B) fotografi av det ferdige enheten (C) fotografi av enheter som er koblet til motoren og lineære drivenhet, som omdanner motorens rotasjons inn i en en-dimensjonal bevegelse som styrer klemmen biaksiale strekning av (D) silikongummimembran. Underlaget inneholder to hull på hver klemme fane for å bli plassert på innlegg på hver klemme. (E) Målskisse FEA modell av den fleksible membranen som er 1/4 av hele strukturen på grunn av bruken av symmetriske grensebetingelser. ( trong> F) Maksimal rektor belastningen blir vist i full membran som viser dannelsen av ringene indikerer isotrop belastning feltet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2 (A) Anordningen understøttelse av en fleksibel membran med markeringer anvendes for å måle påtrykt belastning er vist. Nærbilder av markeringene, før (B) og etter (C) strekning, ble merket med en pil for å tydelig angi forskyvning av markeringene på membranen. (D) Membran-stammen som en funksjon av motorens teller under tilnærming og tilbaketrekning. Membran stammen var lik i både tilnærming og tilbaketrekking med tilbaketrekking produsere litt høyere stammer. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52737/52737fig2highres.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Membran belastning overføring til cellene. (A - B) fasekontrast av humane bronkiale epitelceller (16HBE) på den fleksible membranen ved hjelp av et 10X objektiv, før (A) og etter (B) 20% belastning. (C - D) fluorescensmerkede (DAPI) kjerner av 16HBE cellene ble fotografert ved hjelp av et 20X objektiv under et konfokalt mikroskop, før (C) og etter (D) 20% belastning. (E) Membranen belastningen for cellene var lineær og homogen.t = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Virkningen av en enkelt strekning på ROS produksjon av 16HBE celler ble observert ved hjelp av en kumulativ mitokondrie superoksid-sensoren med en 20X objektiv under et konfokal mikroskop (A - C). Snapshots av tidsforløpet (0, 60 min, og ~ 65 min) på superoksydproduksjon i strekk i det samme feltet av celler. (D) Relativ fluorescens intensitet 16HBE celler over tid indikerer en 50% økning i fluorescens intensitet fra baseline produksjon av superoksid innen den første timen (A til B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


Figur 5. bilder fase kontrast av en alveolar epithelial (MLE12) mono svar på økende strekning (A - D). Ble alle tatt opp med et digitalt mikroskop med en 20X objektiv. Pilene viser de stedene der celle-til-celle separasjon oppstått. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. (A) mekanisk enhet vises i AFM for nano-innrykk av celler med stretch. Skanneren må fjernes for plassering av objektiv extender. Tre skjøtestykkene er festet til alle tre ben av AFM hodet for å tillate enhetenplassering. En adapterplate anvendes for å montere båren på den AFM scanner (sort plate). Skanninger utkragerbjelke i retning av pilen vist i før strekningen fasekontrastbilde en MLE12 celle (B). De røde rutene i før (B) og etter (C) strekke bildene viser området som ble tatt til fange under nano-innrykk (40X objektiv). De elastiske modulus kart, før (D) og etter (E) strekning, oppnås med tidligere publiserte analyseteknikker 13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En unik enhet for live cell imaging under mekanisk stretch ble utviklet; og denne enheten ble brukt i en protokoll for å studere lunge epitelcellelinje mechanobiology. I innledende studier ble det funnet at en enkelt holdt strekning stimulerte produksjonen av superoksyd i mitokondrie bronchial epitelceller. I tillegg ble det vist at økte nivåer av mekaniske påkjenninger forårsaket direkte skade på integriteten av et monolag av alveolære epitelceller.

For å gjennomføre disse foreløpige eksperimenter ble anordningen først kalibrert, og deretter ble det vist at membranen stammen ble overført til celler (figurene 2-3). Samlet anordningen gode resultater, som indikert av den nære sammenhengen mellom membranen stamme (målt ved hjelp av merker på membranen) og cellestamme (målt ved hjelp av avstanden mellom kjernene) som er vist i figur 3E. Men var det noen mindre forskjeller observert mellom strai målt på membranene under tilnærmingen og retur kurver av markører, som vist i figur 2D. Dette var sannsynligvis på grunn av tilbakeslag i enheten, og mulig sammenheng med gripende problemer. I tillegg er en universell festemekanisme for anordningen er nødvendig, slik at den effektivt kan brukes på mikroskoper med forskjellige konfigurasjoner. Dette vil redusere tidsbruk mellom plassering av enheten og bildeopptak samtidig opprettholde en robust tilkobling til mikroskopet. Hull slått i membraner ble brukt til å påføre en liten pre-belastning til membranen for å hindre dannelse av en innledende kompresjonstilstand på grunn av fastklemming av et elastisk materiale. Trykk staten fører også til en reduksjon av gjeldende maksimale belastning.

Skikken enheten er designet for å passe i en Asylum MFP3D Atomic Force Microscope å tillate nano-innrykk av levende celler i løpet av mekanisk stretch. Vi kjenner ikke til noen annen enhet som er i stand til iducing en isotrop spenningstilstand i bildeplanet som kan fungere i en AFM. Anordningen er også konstruert for kontinuerlig bruk i et cellekulturinkubator (holdt ved 37 ° C i en fuktig, sterilt miljø med 5% CO 2). Evnen til å fungere innenfor en inkubator gjør studiet av celler som gjennomgår langtidsstrekk regimer.

Det er flere begrensninger i presenteres tilnærming. Først, som membran strekker seg, beveger seg innenfor fokus ut av flyet, selv om minimalt (~ 100 mikrometer). Dette blir en begrensning ved sporing av et felt av cellene gjennom en strekning diett, fordi synsfeltet endringer i løpet av membranen oppblåsthet. Selv om membran i diameter 22 mm opplever 0,23 til 0,25 belastning, regionene utenfor denne indre diameter oppleve en mer variabel belastning feltet. Selv om avbildningsstudier er lett Begrenset til dette sentrale område, er det mulig at cellene reagerer på høyere nivåer av stammeved ytre regioner kan påvirke responsen av celler i den sentrale regionen. En jevn belastning fordeling over et større område av interesse kan oppnås med forbedringer i membranen design. PDMS Membranen er auto-fluorescerende ved bølgelengder som vanligvis anvendes for fluorescerende indikatorer, og dette begrenser muligheten for å avbilde fluorescens i cellene fra under membranen. Av denne grunn en oppreist mikroskop ble utnyttet med vann nedsenking mål i våre studier av ROS produksjon beskrevet ovenfor. Dette kan være en begrensning for studier hvor AFM og fluorescensavbildning kombineres.

Den vanligste kommersielle enhet (Flexcell FX 5000 strekksystem) for å påføre mekaniske påkjenninger på cellene inkorporerer en styrbar vakuumsystem påføre strekk belastning på en membran mens de beveger seg inn og ut av det optiske plan. Membranen og klemme utforming som presenteres her skape en bi-aksialt spenn felt hvor belastningen er isotropisk og forblir i planet allowing sanntids billeddannelse. Med mindre modifikasjoner til membranen design, kan båren produsere uniaksiale strekk modi i tillegg. Dersom cellene blir først sådd på en oppblåst membran, i planet kompresjonsbelastninger kan også anvendes. Anordningen er i stand til å nå både fysiologiske og patologiske nivåer av belastning. I sammendraget, ble en ny enhet og protokoller utviklet som kan brukes til å søke mekanisk belastning å leve celler som kan avbildes ved hjelp av fluorescens mikroskopi og AFM nano-innrykk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker at takke Fedex Institute of Technology ved University of Memphis for deres støtte. Forfatterne ønsker å takke elevene på senior design prosjektgruppe i Mechanical Engineering avdeling ved University of Memphis (David Butler, Jackie Carter, Dominick Cleveland, Jacob Shaffer), Daniel Kohn fra University of Memphis Engineering avdeling for motorkontroll og Dr. Bin Teng og Ms. Charlean Luellen for deres hjelp i cellekultur. Dette arbeidet ble støttet av K01 HL120912 (ER) og R01 HL123540 (CMW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SmartMotor NEMA 34: 3400 Series MOOG Animatics SM3416D Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus
Flexcell Membrane (Collagen I coated) Flexcell International Corp SM2-1010C 3.5" x 5.25" x 0.020"
Sylgard 184 Dow Corning Corporation 10:1
Hoechst 33342  Sigma-Aldrich H1399 DAPI stain
MitoSOX Sigma-Aldrich M36008
Tiron Sigma-Aldrich D7389  mitochondrial superoxide label
DMEM superoxide inhibitor
FBS
HEPES
50 ml tubes Fisher Scientific 06-443-19 Any centriguge tube can be used to create an area for imaging.
Hybridization oven Bellco Glass
MLE12 Cells ATCC CRL-2110 Mouse Lung Epithelial Cells 
16HBE cells ATCC CRL-2741 Human Bronchial Epithelial Cells
AFM Indentation Experiments
Cantilever Beams for Nano-indentation Budget Sensors Si-Ni30
AFM  Asylum Research MFP3D
Olympus microscope Olympus IX-71 Inverted microscope with 20X and 40X objectives.
AFM Leg Extenders Asylum Research Not available AFM microscope
Finite Element Analyses
ABAQUS Simulia 6.12
Software
ImageJ NIH
Microscopes
Digital microscope Life Technologies EVOS XL Core Initially a self standing company, now owned by Life Technologies.
Confocal microscope Zeiss LSM 710 2-photon upright microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tschumperlin, D. J., Boudreault, F., Liu, F. Recent advances and new opportunities in lung mechanobiology. J Biomech. 43, 99-107 (2010).
  2. Waters, C. M., Roan, E., Navajas, D. Comprehensive Physiology. John Wiley, & Sons, Inc. (2011).
  3. Majkut, S., Dingal, P. C. D. P., Discher, D. E. Stress Sensitivity and Mechanotransduction during Heart Development. Current Biology. 24, R495-R501 (2014).
  4. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475, 316-323 (2011).
  5. Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. Mechanotransduction across the cell-surface and through the cytoskeleton. Science. 260, 1124-1127 (1993).
  6. Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. Mechanical force-induced signal transduction in lung cells. Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).
  7. Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
  8. Waters, C. M. Reactive oxygen species in mechanotransduction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L484-L485 (2004).
  9. Chapman, K. E., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
  10. Chu, E. K., Whitehead, T., Slutsky, A. S. Effects of cyclic opening and closing at low- and high-volume ventilation on bronchoalveolar lavage cytokines. Crit Car Med. 32, 168-174 (2004).
  11. Tschumperlin, D., Margulies, S. Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro. Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).
  12. Vlahakis, N. E., Hubmayr, R. D. Cellular stress failure in ventilator-injured lungs. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1328-1342 (2005).
  13. Roan, E., et al. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L1235-L1241 (2012).
  14. Gamerdinger, K., et al. Mechanical load and mechanical integrity of lung cells - Experimental mechanostimulation of epithelial cell- and fibroblast-monolayers. J Mech Behav Biomed Mater. 4, 201-209 (2014).
  15. Hayashi, K., Naiki, T. Adaptation and remodeling of vascular wall; biomechanical response to hypertension. J Mech Behav Biomed Mater. 2, 3-19 (2009).
  16. Villemure, I., Stokes, I. Growth plate mechanics and mechanobiology. A survey of present understanding. J Biomech. 42, 1793-1803 (2009).
  17. Waters, C. M., et al. A system to impose prescribed homogenous strains on cultured cells. J Appl Physiol (1985). 91, 1600-1610 (2001).
  18. Gerstmair, A., Fois, G., Innerbichler, S., Dietl, P., Felder, E. A device for simultaneous live cell imaging during uni-axial mechanical strain or compression. J Appl Physiol (1985). 107, 613-620 (1985).
  19. Dassow, C., et al. A method to measure mechanical properties of pulmonary epithelial cell layers. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 101, 1164-1171 (2013).
  20. SmartMotor User's Guide v523. Animatics Corporation. Available from: http://www.animatics.com/download/publication/UsersGuide%20v523.pdf (2011).
  21. Chapman, K., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
  22. Birukov, K. G. Cyclic stretch, reactive oxygen species, and vascular remodeling. Antioxid Redox Signal. 11, 1651-1667 (2009).
  23. Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, 335-344 (2003).
  24. Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
  25. Pouvreau, S. Superoxide flashes in mouse skeletal muscle are produced by discrete arrays of active mitochondria operating coherently. PLoS One. 5, (2010).
  26. Yalcin, H. C., et al. Influence of cytoskeletal structure and mechanics on epithelial cell injury during cyclic airway reopening. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297, L881-L891 (2009).
  27. Jacob, A. M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and claudin 4. J Appl Physiol. 113, 1377-1387 (2012).
  28. DiPaolo, B. C., Lenormand, G., Fredberg, J. J., Margulies, S. S. Stretch magnitude and frequency-dependent actin cytoskeleton remodeling in alveolar epithelia. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C345-C353 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics