قابلة لوحة 96-جيدا وبناء التوجيهية الثقافة والإنتاج باستخدام نظام الروبوتية معالجة السائل

Developmental Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Conway, M. K., Gerger, M. J., Balay, E. E., O'Connell, R., Hanson, S., Daily, N. J., Wakatsuki, T. Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System. J. Vis. Exp. (99), e52755, doi:10.3791/52755 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

استمرار التقدم في زراعة الخلايا الجذعية المحفزة تضيق الفجوة بين مقاعد البدلاء، والسرير لاستخدام هذه الخلايا في الطب التجديدي، واكتشاف المخدرات واختبار الأمان. من أجل إنتاج الخلايا الجذعية المستمدة الصيدلة الحيوية والخلايا لهندسة الأنسجة وزراعة الأعضاء، وتكنولوجيا خلايا تصنيع فعالة من حيث التكلفة ضرورية. الحفاظ على تعدد القدرات والأداء المستقر من الخلايا في التطبيقات المصب (على سبيل المثال، تمايز الخلايا) مع مرور الوقت أمر بالغ الأهمية لإنتاج خلايا نطاق واسع. بعد التي يمكن أن يكون من الصعب تحقيق خاصة إذا مثقف الخلايا يدويا حيث يمكن للمشغل إدخال تقلب كبير وكذلك يكون مكلفا للغاية لتوسيع نطاق المتابعة. لتمكين الإنتاجية العالية، وإنتاج الخلايا الجذعية على نطاق واسع، وإزالة نفوذ مشغل بروتوكولات زراعة الخلايا الجذعية رواية باستخدام مقعد بين كبار متعدد القنوات وضعت التعامل مع الروبوت السائلة التي تتطلب الحد الأدنى من تورط فني أو الخبرة. معوكانت هذه يسببها الخلايا الجذعية المحفزة بروتوكولات البشرية (iPSCs) مثقف في ظروف خالية من تغذية مباشرة من الأسهم المجمدة وحافظت في لوحات 96-جيدا. اعتمادا على خط الخلية ومعدل تصعيد المطلوب، يمكن للمشغل تحدد بسهولة عندما بالمرور على أساس سلسلة من الصور التي تبين كثافة مستعمرة المثلى للتقسيم. ثم الكواشف اللازمة مستعدة لإجراء تقسيم مستعمرة لوحات جديدة دون خطوة الطرد المركزي. بعد 20 الممرات (~ 3 أشهر)، حافظت على خطين التوجيهية [كروتب مستقرة، أعربت علامات الخلايا الجذعية، ومتميزة في العضلية ذات كفاءة عالية. النظام يمكن أن تؤدي لاحقا فحص عالية الإنتاجية من البروتوكولات تمايز جديدة أو التلاعب الجيني مصممة لوحات 96-جيدا. وهذه التقنية تقلل من عبء العمل والتقني لإنتاج أعداد كبيرة من الخلايا الجذعية متطابقة لعدد لا يحصى من التطبيقات.

Introduction

وقد ازداد استخدام الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان (iPSCs) بشكل ملحوظ منذ اشتقاقها في عام 2007 1 لاختبار مركب، الطب التجديدي والنمذجة المرض 2-6. هذا الطلب يأتي من القدرة التوجيهية لتسفر عن أعداد كبيرة من الخلايا المحفزة التي يمكن أن تكون متباينة في الخلايا الجسدية في كمية لم يسبق لها مثيل. كما تقنيات التمايز الموجهة تحسين 7-10 وتطوير الخلايا البشرية أو النمذجة الأنسجة والعلاج بالخلايا يزيد 11-14، لذلك لا شرط الانتاج الكبير للiPSCs جودة عالية. ويستشهد على نطاق واسع أن من بين أمراض أخرى، احتشاء عضلة القلب أو ب خلايا استبدال وظيفية سيتطلب مئات الملايين إلى المليارات من IPSC اشتقاق الخلايا الجسدية 15-18. وعلاوة على ذلك، معقدة بشكل متزايد نمذجة الأنسجة 3D لاكتشاف الأدوية ورherapy سيطالب أعداد كبيرة من الخلايا 9،13،19. في كل هذه الأمثلة، تعريف وموحدة ويجب أن يكون iPSCs استنساخه المتاحة واضحة لإنتاج.

من أجل إنتاج الخلايا الجذعية المستمدة الصيدلة الحيوية والخلايا لهندسة الأنسجة وزراعة الأعضاء، وتكنولوجيا خلايا تصنيع فعالة من حيث التكلفة ضرورية. وقد ركزت إنتاج تحجيم iPSCs على ثقافة تعليق 20-25 أو تعليق مع استخدام ركائز microcarrier 26-28 ويرجع ذلك جزئيا تنتشر هذه التقنيات بنجاح على نطاق واسع، وعدم التوجيهية، الإنتاج القائمة حقيقية النواة. وقد أثبتت العديد من المجموعات نظم الاستزراع تعليق أن تسفر عن الخلايا الجذعية المحفزة 20،21،23،24،29. ومع ذلك، هذه الأساليب تستخدم أنظمة مكلفة ومعقدة ليست متاحة بسهولة للباحثين تطوير برامج التمايز جديدة، والقيادة هندسة الأنسجة والقيام laboratبحث نطاق وأوري. وعلاوة على ذلك، تعليق وmicrocarrier الثقافات التوجيهية تتطلب التكيف والتقنيات والمواد الكيميائية التي لا توجد في ثقافة التوجيهية ملتصقة التقليدية مثل الاستخدام المتواصل رو-كيناز المانع، وكلاء رغوة والترشيح لتنظيم التجميع. الاجهاد البدني للخلايا هو أكثر انتشارا في الثقافة تعليق، الذي عرضته الإثارة الميكانيكية وكذلك خلال microcarrier الاصطدام. هذه القضايا تحد من القدرة على التنبؤ والسرعة التي تم إنشاؤها حديثا الخلايا الجذعية يمكن تربيتها في تعليق. وقد وضعت آخرين أنظمة مناولة لوحة الروبوتية التي تحاكي تقنيات زراعة لوحة 30،31 ولكن هذه المنصات يطالب استثمارات كبيرة لمعدات وخبرات للعمل بالإضافة إلى التحديات الأساسية المرتبطة زراعة الخلايا الجذعية.

ويصف العمل وفقا للتنمية وممارسة نظام الثقافة التوجيهية للتحجيم التي تستخدم بذاتها، ومعيار السائل الروبوتية 8 قنواتمعالج و96-جيدا لوحات. وقد تم تصميم هذا الأسلوب لرأب الثقافة التوجيهية نطاق المختبر وارتفاع حجم الإنتاج التوجيهية (على سبيل المثال، 10 7-1،5 × 10 9 خلايا أسبوعيا في كل فني) تمكين تلك تطوير تقنيات جديدة التوجيهية يسهل على مقياس يصل الانتاج دون أجهزة أو العمل استثمارات كبيرة. هذه الطريقة غير مكلفة نسبيا لإعداد، يتطلب قليل من دون زراعة الخلايا الجذعية والبرمجة والهندسة الخبرة، لديه بصمة المعدات الصغيرة دون الحاجة إلى متخصص غطاء زراعة الخلايا، ويستخدم معيار المعدات زراعة الخلايا لتمكين متوسطة إلى عالية الإنتاجية الآلي إنتاج خلايا. وكان الهدف هو تطوير نظام قادر على تحجيم زراعة الخلايا الجذعية التي يمكن استخدامها من قبل مختبرات جديدة للحد من زراعة الخلايا، أولئك الذين يجدون زراعة اليدوية عائقا أمام تطوير أفكارهم أو أولئك الذين يريدون وسيلة اقتصادية لإنتاج أعداد كبيرة من الخلايا الجذعية. منصة المعروضة هنا يزيل تأثير فني علىوقف زراعة الخلايا وتطبيع الإجراءات التغذية والمرور لتمكين إنتاج الخلايا الجذعية ثابت.

Protocol

نظام المناولة السائل الروبوتية، والتي لالبروتوكولات التالية كان pipetmaX جيلسون، ويسهل الآلي، قابلة للزراعة الخلايا الجذعية والإنتاج مع الحفاظ على ظروف التربية ملتصقة التقليدية في شكل لوحة 96-جيدا. مثل التقليدية الثقافة وحة 6 جيدا، تزرع iPSCs مع هذا البروتوكول باعتباره أحادي الطبقة من المستعمرات متميزة ولكن في شكل لوحة 96-جيدا. كل بئر يمكن أن يكون إسوي أو متميزة ويمكن تربيتها إما التكوين في موازاة ذلك منذ الروبوت يمكن أن تبقي كل فصلها بشكل جيد. نموذجي الروبوتية التوجيهية الثقافة روتين له مرحلتين: برنامج التغذية حيث يتم تغذية الثقافات على برنامج الممر حيث يختار المستخدم طريقة التفكك ونسبة تقسيم بالتالي السيطرة على كثافة البذر ومعدل نطاق جدول زمني للتخصيص و. البروتوكولات التالية تصف كيفية بدء ثقافة جديدة، وكيف يتم إنجاز التغذية والمرور والبرامج التكميلية التي تسهل الثقافة التوجيهية.

"jove_content"> ملاحظة: يرجى الاطلاع على قائمة مواد توصيات محددة بشأن المواد المصفوفة طلاء والكواشف التفكك التحقق من صحة البروتوكولات التالية.

1. إعداد مصفوفة خارج الخلية جل لوحات المغلفة 96-جيدا

  1. إزالة التعبئة والتغليف من ستة، RT لوحات جديدة 96-جيدا ووضعها على السرير التعامل مع الروبوت في المناصب 2، 3، 5، 7، 8، 9 (انظر الشكل 1A للمناصب السرير) السائل.
  2. وضع قبل المبردة، 4 ° C 4 جيدا الحوض الصغير في موقف السرير 6.
  3. العمود حمولة 12 من رف طرف في موقف السرير 1 مع ما قبل المبردة، 4 ° C 200 نصائح ميكرولتر الماصة.
  4. ملء أول (يسار أكثر) الحوض بشكل جيد في موقف سرير 6 مع 25 مل 4 ° C DMEM / F12 بصب قسامة باستخدام تقنية معقمة. بدلا من ذلك، استخدام الماصة لإتمام عملية النقل.
  5. إزالة أغطية لوحة 96-جيدا، وحرك كل إلى المصممة خصيصا لوحة غطاء عقد الرف (PLHR، انظر الشكل 1A). تجنب الاتصالمع الداخل من الأغطية لوحة.
    ملاحظة: التعامل مع الداخل لوحة غطاء أو التراص الأغطية لوحة فيها داخل غطاء واحد يلمس خارج آخر هو طريق ممتاز للتلوث.
  6. باستخدام الروبوتية لوحة التحكم باللمس، اضغط على السلسلة التالية من أزرار لبدء عملية التبول قبل أيضا:
    1. اضغط على "تشغيل البروتوكول".
    2. حدد "خارج الخلية هلام مصفوفة Prewet"، ثم انقر فوق التالي.
    3. قرار المستخدم: انقر على "تشغيل اختبار" لاستخدام المعالج خطوة بخطوة إلى ما قبل اختبار البرنامج المحدد.
      ملاحظة: لا يتم تشغيل الروبوت بل البرنامج يختبر بروتوكول لمشاكل البرامج. مع البروتوكولات المعمول بها، والتنصت، و"تخطي الإعداد" غير مقبولة.
    4. اضغط على "بروتوكول تشغيل".
  7. أثناء عملية التبول قبل (الخطوة 1.6) انتقل إلى الخطوة 1.8.
  8. ذوبان الجليد على الجليد واحد قسامة 4 ملغ من عامل النمو تخفيض خارج الخلية هلام مصفوفة (GFRM) الوارد في 50 ملأنبوب مخروطي تخزينها في -80 ° C. الحفاظ على قسامة على الجليد حتى جاهزة للاستخدام.
    ملاحظة: سوف GFRM يصلب إذا ما سمح للحضور إلى RT ولن تكون مفيدة.
  9. Resuspend وGFRM قسامة 4 ملغ في 24 مل 4 ° C DMEM / F12 مع كوب 25 مل الماصة. عند نقل DMEM / F12، وقفة لمدة 2-3 ثانية للسماح الماصة لتبرد قبل إعادة التعليق على قسامة GFRM.
  10. عند عملية ما قبل ترطيب (الخطوة 1.6) كاملة، انتقل إلى الخطوة 1.11.
  11. نقل 24 مل من DMEM / F12 خليط GFRM إلى البئر الرابع من القاع في موقف السرير 6.
  12. باستخدام الروبوتية لوحة التحكم باللمس، اضغط على السلسلة التالية من أزرار لبدء عملية طلاء هلام المصفوفة خارج الخلية:
    1. اضغط على "تشغيل البروتوكول".
    2. حدد "الخلية قسامة جل المصفوفة"، ثم انقر فوق التالي.
    3. قرار المستخدم: انقر على "تشغيل اختبار" لاستخدام المعالج خطوة بخطوة إلى ما قبل اختبار البرنامج المحدد.
      ملاحظة: لا يتم تشغيل الروبوت ولكن راذهص البرنامج يختبر بروتوكول لمشاكل البرامج. مع البروتوكولات المعمول بها، والتنصت، و"تخطي الإعداد" غير مقبولة.
    4. اضغط على "بروتوكول تشغيل".
  13. عندما الخطوة 1.12 كاملة، واستبدال أغطية لوحة.
  14. نقل المصفوفة خارج الخلية هلام المغلفة لوحات 96-جيدا إلى 37 درجة مئوية، و 5٪ CO حاضنة مرطب وعقد هناك لمدة 24 ساعة وعند هذه النقطة لوحات سوف تكون جاهزة للاستخدام أو تخزينها.
    ملاحظة: في ظل الظروف المخففة، خارج الخلية لوحات هلام مصفوفة مطلية حديثا يمكن أن تستخدم بعد 15-30 دقيقة من الحضانة ولكن O / N إلى 24 ساعة حضانة يوصى.
  15. كرر الخطوات بروتوكول 1.1، 1.3، 1،5-1،6، 1.10، و1،12-14 حتى كل من DMEM / F12 مع GFRM يستخدم.

2. تخزين خارج الخلية مصفوفة هلام المغلفة لوحات 96-جيدا

  1. إزالة الخلية مصفوفة هلام المغلفة لوحات 96-جيدا من 37 درجة مئوية، و 5٪ CO حاضنة مرطب.
  2. اختياري: Allow المصفوفة خارج الخلية هلام المغلفة لوحات 96-جيدا أن يأتي إلى RT قبل الانتقال إلى الخطوة 2.3.
    ملاحظة: ستكون هذه خطوة اختيارية تقليل التكثيف تتراكم عندما يتم وضع لوحات في 4 ° C.
  3. وضع لوحات على السرير الروبوت معالجة السائل في وظائف 2، 3، 5، 7، 8، 9 (انظر الشكل 1A للمناصب السرير).
  4. العمود حمولة 12 من رف طرف في موقف السرير 1 مع RT 200 نصائح ميكرولتر الماصة.
  5. وضع خزان أربعة الحوض في موقف السرير 6.
  6. ملء جيدا 4 (أقصى اليمين) من الخزان مع RT DMEM / F12.
  7. إزالة أغطية لوحة 96-جيدا، وحرك كل إلى PLHR.
  8. باستخدام الروبوتية لوحة التحكم باللمس، اضغط على التركيبة التالية من الأزرار:
    1. اضغط على "تشغيل البروتوكول".
    2. حدد "الخلية قسامة جل المصفوفة"، ثم انقر فوق التالي.
    3. قرار المستخدم: انقر على "تشغيل اختبار" لاستخدام المعالج خطوة بخطوة إلى ما قبل اختبار البرنامج المحدد.
      ملاحظة: روبوتي لا يعمل بل البرنامج يختبر بروتوكول لمشاكل البرامج. مع البروتوكولات المعمول بها، والتنصت، و"تخطي الإعداد" غير مقبولة.
    4. اضغط على "بروتوكول تشغيل".
  9. مرة واحدة كاملة، واستبدال أغطية لوحة وإزالة لوحات من السرير الجهاز.
  10. التفاف حول الجانب كامل من كل هلام مصفوفة خارج الخلية المغلفة لوحة 96-جيدا (حيث يلتقي غطاء لوحة) مع بوصة واحدة بنسبة 6 بوصة شريط الفيلم البارافين. مما لا شك فيه أن تمتد الفيلم البارافين لإنشاء ختم محكم.
  11. اختياري: تسمية لوحات مع تاريخ الانتهاء طلاء خارج الخلية هلام مصفوفة، وخارج الخلية هلام مصفوفة عدد الكثير، واسم المستخدم وأية معلومات أخرى.
  12. تخزين لوحات في 4 ° C حيث أنها ستكون جيدة لاستخدام لمدة تصل إلى أسبوعين.
    ملاحظة: لقد تم استخدام لوحات بنجاح خارج حدود أسبوعين، ومع ذلك، فمن غير المستحسن.

3. تنفيذ عملية الخلايا الجذعية مستعمرة البذر الكثافةالتدرج في تنسيق لوحة 96-جيدا من الثقافة الحية أو المجمدة: كيفية بدء أو استعادة فواصل المرور العادية إلى خط الخلايا الجذعية

  1. إذا بدءا ثقافة المجمدة، انتقل إلى الخطوة 3.2. إذا بدءا من زراعة الخلايا الجذعية الحية بالفعل على طبق من ذهب، والبدء في الخطوة 3.5.
  2. ذوبان الجليد ثقافة المجمدة التي تدور الأنبوب في 37 ° C حمام الماء حتى يبقى سوى قطعة صغيرة من الجليد.
  3. اختياري: تمييع الخلايا إذابة إلى 10 مل RT وقف نمو الخلايا وسائل الإعلام (SCGM)، أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 300 x ج، نضح في وسائل الإعلام طاف و resuspend بيليه الخلايا الجذعية في 7 مل SCGM الطازجة التي تحتوي على 10 ميكرومتر Y27632.
    ملاحظة: هذه الخطوة يلغي المرحل من وسائل الإعلام التجميد.
  4. انتقل إلى الخطوة 3.6.
  5. إذا بدءا من العيش، مطلي بالفعل الخلايا الجذعية: مرور الخلايا بشكل طبيعي باستخدام تفارق الأنزيمية أو غير الأنزيمية. محاولة حصاد ما مجموعه 1،5-3٬000٬000 الخلايا. عادة بئر واحدة من لوحة ستة جيدا. الطرد المركزي الخلايا تحصد ل2 دقيقة في 300 x ج، نضح في وسائل الإعلام طاف و resuspend بيليه الخلايا الجذعية في 7 مل SCGM الطازجة التي تحتوي على 10 ميكرومتر Y27632. انتقل إلى الخطوة 3.6.
  6. ضمان الخلايا، إما من ثقافة المجمدة أو الحية، وعلقت في 7 مل RT SCGM مع 10 ميكرومتر Y27632.
  7. العمود حمولة 12 من رف طرف في موقف سرير واحد مع RT 200 نصائح ميكرولتر الماصة.
  8. وضع خزان أربعة الحوض في موقف السرير 2.
  9. مكان واحد جديد هلام المصفوفة خارج الخلية المغلفة لوحة 96-جيدا قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية في موقف السرير 5 وإزالة الغطاء وضعه في PLHR.
  10. نقل 7 مل من معلق الخلايا إلى جانب 3 من الخزان بواسطة الماصة أو عقيمة صب.
    1. باستخدام الروبوتية لوحة التحكم باللمس، اضغط على التركيبة التالية من الأزرار:
    2. اضغط على "تشغيل البروتوكول".
    3. حدد "متدرجة الكثافة بذور"، ثم انقر فوق التالي.
    4. قرار المستخدم: انقر على "تشغيل اختبار" لاستخدام المعالج خطوة بخطوة إلى ما قبل اختبار حددبرنامج أد.
      ملاحظة: لا يتم تشغيل الروبوت بل البرنامج يختبر بروتوكول لمشاكل البرامج. مع البروتوكولات المعمول بها، والتنصت، و"تخطي الإعداد" غير مقبولة.
  11. اضغط على "بروتوكول تشغيل".
  12. عندما سلسلة التخفيف كاملة، وإعادة تغطية لوحة والمكان في 37 ° C، 5٪ CO حاضنة مرطب حتى التغذية المقبل.
  13. اختياري: تسمية لوحة مع التاريخ والمعلومات سلالة، واسم المستخدم ونوع الوسائط وغيرها من المعلومات ذات الصلة.
  14. خلال الأيام القليلة القادمة، وإطعام وحة 96-كذلك المطلوبة باستخدام بروتوكول 4 أدناه.
    ملاحظة: سوف صفيحة الخلايا الجذعية نموذجية يتطلب تغيير وسائل الاعلام كامل مرة واحدة كل 24 ساعة وSCGM لا يحتوي على Y27632 للتغذية. فقط خلال زرع البذور الأولي بعد مرور. قبل التغذية، والتحقق من لوحة للتلوث وكثافة مستعمرة. راجع الخطوة 3.16 لمعرفة المزيد عن رصد كثافة مستعمرة.
  15. خلال الأيام القليلة المقبلة، عدة أعمدة بالقرب من جسيدخل لوحة (عادة الأعمدة 5-8) نهج كثافة مثالية للمرور. للتعرف على هذه الكثافة، مقارنة لوحة 96-جيدا لمدى كثافة هو مبين في الشكل 3B بالمعلومات التالية في الاعتبار:
    1. مرور عند الفراغ بين الغالبية العظمى من المستعمرات حوالي 25٪ من قطر مستعمرة مجاورة.
      ملاحظة: إن الأساس المنطقي لتحديد الوقت المناسب للمرور هو أن دورة أخرى للتغذية والنمو من شأنه أن يؤدي في مستعمرات مما يجعل الاتصال، والتي ينبغي تجنبها.
  16. لبدء لوحة المخفف بشكل موحد والبدء الثقافة العادية، حدد العمود الذي هو في كثافة مثالية والمرور. نرى بروتوكول 5 بالمرور.

4. تغذية 96-جيدا المستعمرات لوحة الخلايا الجذعية

ملاحظة: يصف بروتوكول التالي التغذية واحد وقف 96-جيدا خلية لوحة مستعمرة. يمكن زيادتها تقنية لاستيعاب مجموع 6 لوحات في نفس الوقت.

  1. إزالة الصورة 96-جيداتيم لوحة مستعمرة الخلية من 37 درجة مئوية، و 5٪ CO حاضنة مرطب.
  2. تحقق من لوحة للتلوث وكثافة الخلايا. من أجل إطعام، تأكد من أن كثافة مستعمرة أقل كثافة مرور مثالية. انظر الشكل 3B للحصول على معلومات حول كثافة.
    ملاحظة: التلوث قد تشكل وسائل الإعلام العكرة كما وتكون مصحوبة رائحة كريهة. قد يكون، وحدات غير الواضح التوجيهية صغيرة أيضا مرئية تحت التفتيش المجهري. لتقييم كثافة الخلية، راجع الخطوة 3.16.1 أعلاه.
  3. وضع وقف 96-جيدا لوحة مستعمرة خلية في موقف السرير 3 على منحدر، 37 ° C المنحدر.
  4. العمود حمولة 12 من رف طرف في موقف السرير 1 مع RT 200 نصائح ميكرولتر الماصة.
  5. وضع الحوض 4-جيدا في موقف السرير 2.
  6. ملء جيد 3 من الحوض في موقف السرير 2 مع 8 مل الطازجة، RT SCGM دون Y27632 إما عن طريق عقيم صب أو الماصة نقل.
  7. إزالة لوحة 96-جيدا الخلايا الجذعية مستعمرة غطاء وضعه في PLHR.
  8. باستخدامالروبوتية لوحة التحكم باللمس، اضغط على التركيبة التالية من الأزرار:
    1. اضغط على "تشغيل البروتوكول".
    2. حدد "مستعمرة تغذية واحدة لوحة"، ثم انقر فوق التالي.
    3. قرار المستخدم: اضغط على "تشغيل اختبار" لاستخدام المعالج خطوة بخطوة إلى ما قبل اختبار البرنامج المحدد.
      ملاحظة لا يتم تشغيل الروبوت بل البرنامج يختبر بروتوكول لمشاكل البرامج. مع البروتوكولات المعمول بها، والتنصت، و"تخطي الإعداد" غير مقبولة.
    4. اضغط على "بروتوكول تشغيل".
  9. عندما بروتوكول تغذية كاملة، وإعادة تغطية لوحة مستعمرة 96-جيدا الخلايا الجذعية والعودة إلى 37 درجة مئوية، و 5٪ CO مطلوب حاضنة مرطب حتى التغذية أو مرور المقبلة. وعادة ما تطلب الأمر ذلك بعد 24 ساعة.
    ملاحظة: من المستحسن لتسجيل الحدث التغذية على الغلاف لوحة مع التاريخ ونوع الوسائط واسم المستخدم وغيرها من المعلومات ذات الصلة.

5. الركض 96-جيدا ررأكلت الجذعية المستعمرات الخلية

  1. بعد عدة دورات التغذية لوحة مستعمرة 96-جيدا الخلايا الجذعية ستكون جاهزة للمرور. يصف هذا البروتوكول مرور عمود واحد إلى واحد لوحة 96-جيدا، وهو ما يمثل نسبة 01:12 الانقسام. يمكن للمستخدم تحديد نسبة الانقسام واختيار أي عدد من الآبار أو أعمدة لتقسيم، بما في ذلك اختيار الآبار التي قد لا تكون مجاورة.
  2. مقارنة 96-جيدا الخلايا الجذعية لوحة مستعمرة الكثافة إلى الشكل 3B لتحديد ما إذا كان مرور. كثافة مرور المثالي هو عندما المسافة بين الغالبية العظمى من المستعمرات حوالي 25٪ من قطر مستعمرة مجاورة أو من شأنه أن يؤدي التغذية اللاحقة في المستعمرات متزايد إلى واحد آخر.
  3. فحص 96-جيدا الخلايا الجذعية لوحة مستعمرة تحت المجهر للتأكد من عدم وجود تلوث.
  4. وضع وقف 96-جيدا لوحة مستعمرة خلية في موقف السرير 3 على منحدر، 37 ° C المنحدر.
  5. تحميل أعمدة 12/08 في رف طرف التحميل في موقف السرير 1 مع RT 200 ميكرولتر الماصةنصائح.
  6. وضع الحوض 4-جيدا في موقف السرير 2.
  7. ترك الحوض الصغير جيدا 1 فارغة، وطرح 8.5 مل SCGM + 10 ميكرومتر Y27632 بشكل جيد 2، ووضع 3.5 مل 30٪ بروتين وحال للكولاجين كاشف تفارق (أو EDTA أساس التفكك الكاشف) في بئر 3، وطرح 4.5 مل PBS بشكل جيد 4.
    ملاحظة: يمكن لجميع الكواشف تكون على RT أو 37 درجة مئوية. وقد استخدم RT بروتين وحال للكولاجين التفكك كاشف بنسبة 30٪ المخفف مع برنامج تلفزيوني لالدهنية والخلايا الليفية المستمدة الثقافة التوجيهية وصفت هنا.
  8. مكان واحد جديدة، 37 ° C خارج الخلية هلام مصفوفة المغلفة لوحة 96-جيدا قبل تحسنت في موقف السرير 5.
  9. إزالة 96-جيدا الخلايا الجذعية لوحة مستعمرة الغطاء، وكذلك الجديد 96-جيدا لوحة الغطاء ووضعها في كل من PLHR.
  10. باستخدام الروبوتية لوحة التحكم باللمس، اضغط على التركيبة التالية من الأزرار:
    1. اضغط على "تشغيل البروتوكول".
    2. حدد "مستعمرة سبليت 01:12 العمود 1"، ثم انقر فوق التالي.
    3. قرار المستخدم: انقر على "تشغيل اختبار" لاستخدامالمعالج خطوة بخطوة إلى ما قبل اختبار البرنامج المحدد.
      ملاحظة: لا يتم تشغيل الروبوت بل البرنامج يختبر بروتوكول لمشاكل البرامج. مع البروتوكولات المعمول بها، والتنصت، و"تخطي الإعداد" غير مقبولة.
    4. اضغط على "بروتوكول تشغيل".
  11. بمجرد الانتهاء من بروتوكول مرور، وإعادة تغطية على حد سواء لوحات.
  12. اختياري: تسمية وحة جديدة مع المعلومات المطلوبة (أي تاريخ، خط الخلية، رقم المرور، اكتب وسائل الإعلام، واسم المستخدم الخ).
  13. عودة كل من لوحات ل37 ° C، 5٪ CO مطلوب حاضنة مرطب حتى التغذية أو مرور المقبلة. ملاحظة: التغذية التالية هي عادة بعد 24 ساعة.
    ملاحظة: خلايا والمستعمرات يجب أن نعلق على لوحة داخل 2-3 ساعة من تقسيم وتبدو انتشار جدا بها. ويرجع ذلك إلى وجود رو-كيناز والخلايا سوف تتكثف ويحمل مورفولوجيا الخلايا الجذعية مميزة (أي حصاة كبيرة معبأة المستعمرات وايث حجم الخلية الصغيرة إلى نسبة نواة كبيرة) بعد أول رو-كيناز التغذية الحرة.

6. حصاد 96-جيدا الخلايا الجذعية لوحة للإنتاج

ملاحظة: الجذعية يمكن أن تحصد مستعمرات الخلايا لاستخدامها في أي وقت خلال الثقافة. عادة ما يحدث هذا عندما تكون الخلايا جاهزة للمرور (انظر بروتوكول 5). يصف هذا البروتوكول كيفية حصاد عشر أعمدة من لوحة مستعمرة 96-جيدا الخلايا الجذعية.

  1. فحص 96-جيدا الخلايا الجذعية لوحة مستعمرة تحت المجهر للتأكد من عدم وجود تلوث.
  2. وضع وقف 96-جيدا لوحة مستعمرة خلية في موقف السرير 3 على منحدر، 37 ° C المنحدر.
  3. أعمدة حمولة 11 و 12 في رف طرف التحميل في موقف السرير 1 مع RT 200 نصائح ميكرولتر الماصة.
  4. وضع الحوض 4-جيدا في موقف السرير 2.
  5. ترك جيدا الحوض الصغير 1 فارغة، وطرح 8.5 مل SCGM بشكل جيد 2، وضع 3.5 مل 30٪ بروتين وحال للكولاجين كاشف تفارق (أو EDTA أساس التفكك كاشف) بشكل جيد3، ووضع 4.5 مل PBS بشكل جيد 4.
    ملاحظة: يمكن لجميع الكواشف تكون على RT أو 37 درجة مئوية.
  6. إزالة لوحة 96-جيدا الخلايا الجذعية مستعمرة غطاء ومكان في PLHR.
  7. باستخدام الروبوتية لوحة التحكم باللمس، اضغط على التركيبة التالية من الأزرار:
    1. اضغط على "تشغيل البروتوكول".
    2. حدد "أعمدة مستعمرة الحصاد 12/02"، ثم انقر فوق التالي.
    3. قرار المستخدم: انقر على "تشغيل اختبار" لاستخدام المعالج خطوة بخطوة إلى ما قبل اختبار البرنامج المحدد.
      ملاحظة: لا يتم تشغيل الروبوت بل البرنامج يختبر بروتوكول لمشاكل البرامج. مع البروتوكولات المعمول بها، والتنصت، و"تخطي الإعداد" غير مقبولة.
    4. اضغط على "بروتوكول تشغيل".
      ملاحظة: مرة واحدة في عملية جمع كاملة، فإن الخلايا يكون في الحوض بشكل جيد 2 وعلى استعداد لجمع.

Representative Results

وضع الساق الروبوتية منصة زراعة الخلايا لوحة القائمة.

الطلب على iPSCs يتزايد نظرا لفائدتها في تطوير العقاقير والطب التجديدي. بعد إنتاج تحجيم ركزت على الثقافة تعليق 32 في معدات معقدة نسبيا يستبعد العديد من الباحثين ويحيد عن طرق ثقافة ملتصقة المعمول بها. بدلا من تغيير جذري الجذعية على أساس أساليب زراعة الخلايا لوحة مثبتة، مثل التحول إلى ثقافة تعليق أو باستخدام microcarrier، ركزنا على التصغير وأتمتة التقنيات الموجودة لدينا ملتصقة التوجيهية الثقافة. كان الهدف الأول لأتمتة التغذية والركض لتطبيع العملية ثقافة بأكملها. كان مطلوبا أيضا منصة قادرة على تصعيد السريع مع التكنولوجيا الحالية. ولتحقيق هذه الأهداف تم استحداث طريقة للخلايا الجذعية الثقافة في لوحة 96-جيدا باستخدام نظام مناولة السائل الآلي (الشكل 1). وبروتocols وضعت هنا مع الروبوت مناولة السائل لتغذية والمرور لا تتطلب خطوة الطرد المركزي أو المراقبة المستمرة من قبل فني. وقد وضعت هذه البروتوكولات مع اثنين من رافدة خطوط التوجيهية الحرة؛ واحد المستمدة من الخلايا الليفية والآخر من الخلايا الدهنية 33.

الكمبيوتر التي تسيطر عليها نظام مناولة السائل (الشكل 1A) يتكون من مسطحة يتحرك الأمام والخلف. السرير تسعة، ما يقرب من 5 × 3.3 بوصة استراحة مرقمة مع الضغط الاحتفاظ مقاطع لقبول لوحات ثقافة الخلية القياسية، خزانات السائل وأجهزة أخرى مخصصة. رئيس التحركات الماصة اليسار إلى اليمين (عمودي على حركة السرير)، وكذلك صعودا وهبوطا. جنبا إلى جنب مع السرير، رئيس ماصة يمكن برمجتها لإزالة أو تقديم وسائل الإعلام في أي مكان على السرير بعد حصوله على نصائح ماصة من رف القابلة لإعادة التعبئة. إذا لزم الأمر، كل من الآبار 96 يمكن أن تبقى منفصلة للقضاء على التلوث العرضي. في التكوين الحالي، ل0200 ميكرولتر من وسائل الاعلام يمكن نقل كل طرف رئيس الماصة، ولكن يتراوح حجم أخرى ممكنة على أساس حجم غيض.

عندما الركض الخلايا الجذعية في لوحات القياسية، الأنزيمية أو التفكك الكيميائي عادة يتطلب الحضانة عند 37 درجة مئوية. الاختبارات الأولية وأكد التفكك مع بروتين وحال للكولاجين التفكك كاشف أو كاشف يستند EDTA أداء أفضل عند 37 درجة مئوية من RT سواء بالنسبة للوقت لالتفكك وتجانس حجم مستعمرة المنتجة لبلدينا 96-جيدا خطوط التوجيهية (لا تظهر البيانات). لأتمتة عملية تقسيم وتجنب نقل لوحات داخل وخارج حاضنة، منحدر، ودرجة الحرارة التي تسيطر عليها سلالم التي تقبل وموقف بتكاثر بنيت لوحات ثقافة القياسية (الشكل 1A). عندما يسخن سلالم إلى 37 درجة مئوية، وهو بروتين وحال للكولاجين التفكك كاشف أو EDTA التفكك أساس من iPSCs من لوحات 96-جيدا وقابلة للمقارنة لوحات وضعت في الحاضنة 37 درجة مئوية (ن البياناتيظهر بعد التمديد). واستخدمت سلالم منحدرة أيضا لتمكين نصائح الماصة لجمع محتويات بأكمله البئر (أقل من 5 ماي الحجم المتبقي) من خلال الوصول إلى أدنى نقطة في البئر في حين تطلع من لوحة مسطحة ترك الحجم المتبقي من حوالي 10-15 ميكرولتر، مما أدى في فقدان الخلية. يسمح المنحدر منحدر أيضا الآبار لغسلها (triturated) من خلال إخراج الوسائط في الجزء العلوي من منحدر بشكل جيد وجمع ذلك في الجزء السفلي.

الثقافة الروبوتية الخلايا الجذعية في شكل لوحة 96-جيدا. التغذية والركض.

ثقافة iPSCs باستخدام نظام مناولة السائل الروبوتية مرحلتين؛ المرور والتغذية. عندما مستعمرة مستعدة للمرور، وتقسيمه على نسبة محددة سلفا على البذور لوحة جديدة التي يتم بعد ذلك تتغذى على فترات منتظمة حتى انها مستعدة للمرور مرة أخرى (الشكل 1B). يمكن بدء الثقافات المجمدة أو غير 96-جيدا في شكل 96-جيدا وتدخل على الفور مرور / تغذيةدورة. الخلايا التي لا تستخدم للحفاظ على المستعمرة، التي تمثل أغلبية طبق من ذهب، ويتم حصاد لاستخدامات أخرى، وتمثل عنصر إنتاج هذا النظام.

التغذية 96-جيدا iPSCs مثقف ويتم إنجاز عند إزالة بعض أو كل وسائل الإعلام بعد فترة من الثقافة وإيداعها في مستودع النفايات. ثم يتم aliquoted وسائل الإعلام الجديدة على نفس اللوحة. يمكن للروبوت استخدام نصائح جديدة وأحواض وسائل الاعلام للفصل بين كل جيدا للتغذية للتخصيص بشكل كامل، بما في ذلك مزج سائل الإعلام مكيفة مع وسائل الإعلام الجديدة.

مرور نموذجية من الخلايا الجذعية يتطلب طريقة التفكك وغالبا ما يكون خطوة الطرد المركزي. والبروتوكولات المذكورة هنا تهدف إلى تطبيع التفكك والقضاء الطرد المركزي. يبدأ بروتوكول مرور عند الروبوت يسلم التفكك كاشف لوحات 96-جيدا شنت على 37 ° C سلالم المنحدرة. بعد انتهاء وقت معين، يتم جمع الخلايا فصلها مع العمل الغسيل حيث أن المستخدم لديه كنتروللتر في أكثر من موقف، والتكرار، وحجم، ومعدل سحن. الوقت الانزيم، ومعدل سحن وعدد من حالات التكرار سحن كانت كافية لتغيير فصل حجم مستعمرة والتجانس (الشكل 2)، ولكن كل معلمة هو قابل للتعديل لتناسب متطلبات خط خلية معينة ل. هذه السيطرة يزيل التباين الذي عرضته الفنيين الذين الماصة مع بنسب متفاوتة، ومواقف، والتكرار. مرة واحدة يتم جمع الخلايا فصلها وتجميعها في خزان مع وسائل الإعلام الجديدة، وتوزيعها على لوحة جديدة. لتجنب الطرد المركزي والبذر مشاكل من تدهور الركيزة أو موت الخلية المقرر ان انزيم العمل، وقد تضعف التفكك كاشف لدرجة الحد الأدنى من التفكك المقبول أن أسفرت البذر موثوق بها. وكانت هذه التقنية فعالة لبروتين وحال للكولاجين التفكك كاشف في mTeSR1 المتوسطة 34، والذي يحتوي على نسبة عالية نسبيا من البروتين، ولكن أيضا فعالة في وسائل الإعلام البروتين منخفضة مثل الضرورية 8 35

السيطرة على كثافة البذر من الخلايا الجذعية بعد مرور غير قصوى لزراعة الخلايا الجذعية الروتينية وناجحة. يمكن زرع البذور منخفضة جدا أو مرتفعة يؤدي إلى التفريق خارج الرحم وفقدان تعدد القدرات بالإضافة إلى التسبب في فترات غير منتظمة مرور. وتعتمد زراعة الخلايا الجذعية نموذجية على نسبة تقسيم حيث يتم استخدام بئر واحدة من لوحة 6 جيدا البذور كاملة جديدة لوحة 6 جيدا (1: 6 الانقسام). مع التعامل مع الروبوت السائل هذه النسبة يمكن تعديلها لتتناسب مع احتياجات المستخدم (على سبيل المثال، 1: 6، 1: 9، 1:12، الخ) ولها التأثير الأكبر على الفاصل الزمني مرور. يمكن للروبوت حصاد العمود أقل من واحد أو عمود كامل واحد (8 آبار)، أو أكثر من عمود واحد حسب احتياجات المستخدم، والتي ينبغي أن تحدد تجريبيا. حافظت iPSCs الدهنية والليفية المستمدة جدول منتظم لمدة ثلاثة أيام تغذية مع مرور في اليوم الرابع عندما انقسمت 01:12. في هذه الحالة كان حصادها عمود واحد وتستخدم لبذرة واحدة جديدة لوحة 96-جيدا، وخلق انقسام 01:12 مع كل دورة (الشكل 3A). كانت 11 الآبار المتبقية ثم المتاحة لتطبيقات المصب. لحصاد هذه الآبار إنتاج 11، وتكررت بروتوكول مرور باستثناء ترسبت الخلايا في حوض لجمع. بدلا من ذلك، فإن الخلايا يمكن أن تترك على لوحة واستخدامها مباشرة.

لتحقيق متسقة مرور كثافة البذر بالمرور دون احتساب، والحفاظ على الجدول الزمني تقسيم الروتيني والبروتوكولات دعوتنا لتقسيم عدد محدد سلفا نفس الأعمدة عند المستعمرة هي في كثافة مثالية للمرور. لمساعدة المستخدمين على التعرف على الكثافة المناسبة للمرور، تم إنشاء سلسلة من الصور تظهر مجموعة من الكثافات مع كثافة مرور مثالية الضوء (الشكل 3B). لتحديد متى مرور، وهو فني يفحص لوحة ويقارنها مقياس كثافة صورة. الفكرةتم تحديد لتر الكثافة إلى الانتقال من ثقافة الدهنية والليفية المستمدة iPSCs وجدت لتكون عندما كان الفضاء بين معظم المستعمرات حوالي 25٪ من قطر مستعمرة مجاورة. من المهم أن المستعمرات توزع متجانس. هذه الكمية من فصل المستعمرة يرتبط الحد الأقصى للكثافة المرغوبة لدورة واحدة تغذية إضافية من شأنه أن يؤدي في المستعمرات لمس، وهو نقطة انطلاق لتمايز خارج الرحم.

بروتوكول الضروري وضعت هنا يتناول كيفية بدء الثقافة في شكل 96-جيدا وكيفية إعادة ثقافة بعد مشكلة الكثافة. عند بدء ثقافة جديدة، أفضل كثافة البذر وعدد من دورات التغذية قبل الركض غير معروفة. لضمان كثافة قابلة للاستخدام بعد الغرس، والروبوت بتوزيع الخلايا الموجودة أو إذابة عبر لوحة 96-جيدا في التخفيف المتسلسل (الشكل 4A). وتظهر نتائج الأمثلة على هذا الانحدار في الشكل 4B-E. بعد عدة التغذيةدورات، وبعض الأعمدة نهج كثافة مثالية لتقسيم، وعند هذه النقطة فني يستخدم الروبوت على البذور لوحة المخفف موحد لبدء الثقافة العادية. وقد استخدم هذا البروتوكول التدرج الكثافة أيضا لاستعادة فترات مرور العادية ومستعمرة تجانس لوحة غير النظامية. إذا تأخر مرور أو غاب، تصبح كثافة مستعمرة وحجم مرتفعة جدا، في حين إذا المقطع هو في وقت مبكر جدا، والكثافة مستعمرة منخفضة جدا ويمكن أن تصبح المستعمرات الفردية كبيرة جدا دون أن توزع بالتساوي في جميع أنحاء البئر. بروتوكول كثافة التدرج يحل هذه القضايا، ويسمح للمستخدم لإعادة تشغيل عن طريق التقاط مجموعة المصنف مثالي من الآبار.

ظلت خطين التوجيهية المحفزة بعد 3 أشهر من الثقافة الروبوتية.

الحفاظ على تعدد القدرات الخلايا الجذعية يمكن أن تتأثر سلبا بسبب الظروف الثقافة 36،37. لتقييم ما إذا الدهنية والليفية تستمد خطوط التوجيهية (أ-التوجيهية، F-التوجيهية، على التوالي) حافظ pluripotency عند المثقف آليا في لوحات 96-جيدا لفترة طويلة من الزمن، كان الخطين مثقف على التعامل مع الروبوت كما هو موضح أعلاه لمدة 3 أشهر ثم تم فحص علامات تعدد القدرات السائل. في هذه الفترة تم passaged كلا الخطين مع بروتين وحال للكولاجين التفكك كاشف أكبر من 20 مرات دون الطرد المركزي. ثابتة لوحات 96-جيدا من على بعد التوجيهية وخطوط F-التوجيهية الملون لOct4 وNANOG أظهرت تراكم النووي من هذه العلامات في حين لوحظ SSEA-4 على سطح الخلية (الشكل 5A-L). وهذا يتفق مع التقارير السابقة لiPSCs المحفزة 38-41. Counterstaining مع دابي لم تكشف عن أية خلايا إضافية لم تكن إيجابية للعلامات تعدد القدرات الثلاثة أيضا. ويلاحظ شذوذ الكروموسومات عادة خلال زراعة الخلايا الجذعية 42،43 ولكن قد لا تؤثر على توزيع علامات تعدد القدرات مثل تلك التي تظهر في الشكل 5A-L. Kوكشف تحليل aryotype كان كلا الخطين التوجيهية passaged آليا 46 الكروموسومات الطبيعية، مما يشير إلى لم طريقة الثقافة الروبوتية لا أعرض عدم الاستقرار الكروموسومات يتجاوز ما قد يحدث عادة (الشكل 5M-N).

للتحقيق في علامات تأسيس الجذعية التعبير الجيني خلية 1،41،44،45 في الخطوط التوجيهية مثقف آليا، تم جمع الحمض النووي الريبي مجموع بالتوازي مع تلطيخ وتحليل النمط النووي. وكان كل لوحة 96-جيدا خطوط التوجيهية تعبير مشابه من علامات تعدد القدرات NANOG، POU5F1 وREX1 حين العضلية متباينة من كل سطر لم يفعل ذلك، ولم سطر منفصل من الخلايا الليفية الجلدية الإنسان (HDFs) (الشكل 6). كانت العضلية المستمدة من كلا الخطين MYL7 إيجابية في حين أن HDFs ولم الخلايا الجذعية تعبر عن MYL7. تم التفريق بين كلا الخطين التوجيهية إلى العضلية مع جزيء صغير، WNT تقنية التلاعب مسار وصفت مؤخرا 46 (الشكل 7). كان التمايز في العضلية في شكل 96-جيدا ناجح في أكثر من 80٪ من الآبار (لا تظهر البيانات). معا، وتشير هذه البيانات أسفرت 3 أشهر وأكثر من 20 مقاطع من ثقافة الروبوتية في الخلايا الطبيعية صبغويا اظهار برنامج النسخ يتفق مع تعدد القدرات التي كانت أيضا قادرة على التمايز إلى العضلية.

الشكل 1
الشكل 1. نظرة عامة على الروبوتية معدات زراعة الخلايا الجذعية والنمطية التوجيهية الثقافة الروتين. (A) الروبوتية نظام مناولة السائل تظهر مع تخطيط نموذجي السرير لمدة 96 جيدا وقف زراعة الخلايا. السائل الكواشف الجديدة نصائح عقيمة الماصة (نصائح)، قابل للنقل حاوية النفايات طرف (النفايات)، متعددة جيدا حوض autoclavable لإمساك مطلوبة (السوائل)، يتم وضع لوحات 96-جيدا ل د معتمدة على التحكم في درجة حرارته، المنحدر منحدر (لوحات 96-جيدا)، 8 قناة رأس الماصة الروبوتية التي تتحرك يسار / يمين وأعلى / أسفل (رئيس الماصة). لوحة غطاء عقد الرف (PLHR). أرقام موقف السرير هو مبين أدناه في الجدول. ثقافة (B) الروبوتية التوجيهية مرحلتين: التغذية والمرور. دورة إنتاج خلايا تبدأ عندما لوحة مستعمرة مستعدة للمرور. اختار المستخدم النسبة المطلوبة للمرور في وبذور الروبوت مجموعة جديدة من لوحات 96-جيدا ثم غذيت على فترات منتظمة لتصبح جاهزة للمرور مرة أخرى. عندما لوحات جاهزة للمرور، لم يتم استخدامه أكثر من كل لوحة على البذور لوحات مستعمرة اللاحقة، وهي متاحة لاستخدامات أخرى، وبالتالي تمثل مرحلة الإنتاج للنظام. خطوط الخلايا المجمدة أو القائمة يمكن تقديمها في أي وقت، والحفاظ في دورة تغذية / مرور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

e_content "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الرقم 2
الرقم 2. الروبوتية المعلمات معالجة السائل يمكن أن تستخدم للسيطرة التوجيهية خصائص مستعمرة التفكك. وتظهر كل صورة تمثيلية نأت الخلايا الليفية المستمدة iPSCs بعد العلاج المشار إليها في حين لا تزال معلقة في جيد 96. (أعلى الصف، A - C) أنزيم الوقت، لا سحن. تعرض الخلايا الليفية iPSCs المستمدة تزرع في لوحات 96-جيدا لزيادة أوقات بروتين وحال للكولاجين التفكك كاشف تفارق ولا سحن الروبوتية تم تنفيذها. (الصف الأوسط، D - F) معدل سحن، 3 دقائق الانزيم. تعرض الخلايا إلى ثلاث دقائق من بروتين وحال الكولاجين علاج التفكك كاشف ومن ثم تم تطبيق وسائل الاعلام نمو 175 ميكرولتر وكل pipetted جيدا صعودا وهبوطا مرة واحدة بمعدل المشار إليه. ميكرولتر / ثانية = ميكرولتر صإيه الثانية. (الصف السفلي، G - I) سحن التكرار، 3 دقائق الإنزيم، 160 ميكرولتر / ثانية. تعرضت الخلايا لبروتين وحال للكولاجين التفكك كاشف لمدة 3 دقائق، وطبق 175 وسائط النمو ميكرولتر، ثم triturated في 160 ميكرولتر / ثانية لوأشار عدد من التكرار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. الدهنية نموذجي ومخطط صيانة مستعمرة الخلايا الليفية التوجيهية وسلسلة من الصور كثافة مستعمرة لتحديد متى مرور للحفاظ على دورة التغذية / مرور العادية. (A) ابتداء مع الدهنية أو الليفية 96-جيدا التوجيهية مستعمرة على استعداد للمرور، تم passaged عمود واحد من الخلايا على الروبوت دون الطرد المركزي وتضعفإلى 12 الأعمدة الجديدة التي تم تغذيتها على فترات محددة بعد ذلك حتى كانت لوحة مستعدة للمرور مرة أخرى. لإنتاج خلايا، تم passaged الأعمدة لم تستخدم للحفاظ على مستعمرة وجمعها لاستخدامها لاحقا. يمكن passaged أي عدد من الأعمدة للسيطرة على معدل التوسع. (B) لتحديد متى يتم مرور، سلسلة من الصور كثافة اعتقلت وقدمت كل 24 ساعة للمستخدمين. في المربع الأحمر العلوي (في غضون 72 ساعة بعد الغرس الأولي) مستعمرة ليست كثيفة بما فيه الكفاية لمرور ويجب أن تغذى. عندما مباريات الكثافة التي تظهر في المربع الأخضر (في ~ 96 ساعة)، ومستعمرة هي في كثافة مثالية للمرور. 120 ساعة، ومستعمرة كثيفة جدا لمرور وينبغي تجنب هذا السيناريو. هذا الأخير يمكن حلها مع التدرج كثافة البذر ولكن الثقافة الروتينية في هذه الكثافة يوصي بشدة. يساوي شريط أبيض 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر فيرسيعلى هذا الشكل.

الرقم 4
الرقم 4. 96-جيدا يسمح نظام الثقافة الروبوتية المستخدمين لبدء الثقافات من خطوط الخلايا المجمدة أو نشطة وأداء التدرج البذر. (A) هو من قبل المستخدم إعداد حل الخلية من مخزون الخلايا المجمدة أو بعد حصاد ثقافة نشطة وضعها على الروبوت. النظام الآلي ثم تنفيذ بروتوكول التخفيف المتسلسل لتوزيع حل الخلية الأولي على طول لوحة 96-جيدا مع التدرج الكثافة التي وزعتها العمود. (B - E) أمثلة على كثافة الخلية من أربعة أعمدة اثني عشر من 48 ساعة بعد بروتوكول البذر التدرج الكثافة. خطوط بيضاء يساوي 225 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذاالشكل.

الرقم 5
ويحتفظ الشكل 5. تعدد القدرات لالدهنية والليفية المستمدة خطوط التوجيهية خلال 96 جيدا الثقافة الروبوتية ل22 (الدهنية) أو 23 (الليفية) مقاطع (~ 3 أشهر). (A - L) الدهنية والليفية كانت مستمدة من خطوط الخلايا التوجيهية آليا بنك الاحتياطي الفيدرالي وpassaged كما هو موضح في النص دون الطرد المركزي في لوحات 96-جيدا لمدة 22 أو 23 الممرات ثم الثابتة والملون للعلامات تعدد القدرات Oct4، NANOG، أو Ssea4 مع دابي مباين. يساوي شريط أبيض 100 ميكرون. (M - N). الثقافات موازية لتلك التي وصفها في وقدمت لتحليل النمط النووي الذي كشف مكمل طبيعي من 46 كروموسوم الرجاء انقر هنا لعرض أكبر نسخة سو هذا الرقم.

الشكل (6)
مثقف الرقم 6. الدهنية (96-A) والخلايا الليفية (96-F) المستمدة iPSCs لأكثر من 20 مقاطع في شكل الروبوتية 96-بحالة جيدة التعبير الجيني تعدد القدرات ومتميزة في العضلية. تم استخراج عدد مرنا من كل خطوط التوجيهية مثقف آليا فضلا عن متباينة العضلية من كلا الخطين (CM-A = الدهنية العضلية التوجيهية المستمدة، مستمدة CM-F = الليفية العضلية التوجيهية، التي جمعت بعد 14 يوما التمايز الاستقراء) وتستخدم لRT-PCR للتحقيق علامات تعدد القدرات NANOG، POU5F1، REX1، cardiomyocyte علامة MYL7 والسيطرة تحميل GAPDH. كما تم جمع الخلايا الليفية الجلدية الإنسان (HDF) واستخدامها بوصفها غير التوجيهية، ومراقبة غير cardiomyocyte. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم 7. الخلايا الليفية والدهنية المشتقة iPSCs حافظت القدرة على التمايز إلى العضلية بعد على المدى الطويل 96-جيدا الثقافة الروبوتية (A - H). الدهنية والليفية iPSCs تربيتها في شكل الروبوتية 96-جيدا لأكثر من 20 الممرات ومتباينة في العضلية . بعد 14 يوما التمايز التعريفي، وفصلها لوحة ملزمة العضلية 96-جيدا وreplated في مناطق ذات كثافة منخفضة على الشرائح الزجاجية لالمناعية من التروبونين T (أحمر)، F-الأكتين (الخضراء) ونوى (الأزرق). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

p_upload / 52755 / 52755fig8.jpg "/>
يعتمد الرقم 8. توسيع نطاق 96-جيدا لوحة زراعة الخلايا الجذعية. • زيادة الإنتاج الخلايا الجذعية على عدد من لوحات تستخدم البذور المجموعة التالية من اللوحات. يمكن للمستخدم الحفاظ على مستوى الإنتاج إما واحدا تلو الركض نفس العدد من لوحات في كل فرصة الانقسام أو توسيع الإنتاج عن طريق بذر المزيد من لوحات. على سبيل المثال، في دورة 0، يتم passaged واحدة لوحة 96-جيدا إلى اثني عشر لوحات جديدة (1 دورة)، وخلق التوسع أضعاف 12. ويمكن الاحتفاظ بهذا المعدل إذا كان أحد الاثني عشر لوحات وpassaged إلى مجموعة جديدة من اثني عشر لوحات (دورة 1-2) أو الموسعة التي كتبها الركض لوحات متعددة (دورة 2-3). أثناء مرور، أي لوحات لا تستخدم للحفاظ على مستعمرة متاحة للتطبيقات المصب. ولذلك، الركض 12 لوحات بشكل روتيني يمكن أن تسفر عن ما يصل الى 144 لوحات في ممرين: 12 للصيانة مستعمرة و 132 لاستخدامات أخرى."> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 9
الرقم 9. كفاءة 96-جيدا ثقافة قائمة لوحة لإنتاج خلايا يتجاوز إلى حد كبير زراعة اليدوية. وكما لوحظ في الشكل 8، لوحة واحدة يمكن passaged البذور اثني عشر لوحات، ومن ثم يمكن passaged إلى 144 لوحات. ويمكن تحقيق هذا المعدل من التوسع في فرصتين الانقسام. يتطلب فني حوالي 3.5 دقيقة لتغذية واحدة لوحة 6 جيدا في حين أنها تنفق حوالي 30 ثانية واحدة لوحة 96-جيدا لفحص على المجهر ووضعه على الروبوت. إذا كان فني يحمل 144 لوحات، وأنها سوف تنفق حوالي 1.2 وحات التعامل ساعة عند تغذية مع الروبوت في حين ثقافة اليدوية سيتطلب 8 ساعة مخصصة لتغذية. يرجى النقر هنا لضدiew نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

في هذه الدراسة قمنا بتطوير طريقة لثقافة الروبوتية لإنتاج التوجيهية التي miniaturizes وبأتمتة التغذية والمرور في شكل لوحة 96-جيدا في حين تمكن أيضا كفاءة تصعيد. تم استخدام الروبوت التعامل مع السائل لإطعام بشكل روتيني المستعمرات التوجيهية والمرور لهم على فترات منتظمة من قبل تفارق الأنزيمية. تمت برمجة الروبوت أيضا لإنتاج الخلية هلام مصفوفة لوحات المغلفة وإجراء التدرج كثافة البذر. عندما مثقف الخلايا الليفية والدهنية المشتقة iPSCs في هذا النظام لأكثر من 20 الممرات، حوالي 3 أشهر، واستمر تعدد القدرات، وكذلك كروتب] مستقرة. وكانت كل من خطوط الخلايا قادرة على التمايز إلى العضلية. معا، وجمع من البروتوكولات المذكورة هنا يمكن للمستخدمين مع القليل جدا من تجربة زراعة الخلايا الجذعية، أو محدودية فرص الحصول على المعدات الثقافة المتخصصة، إلى الخلايا الجذعية الثقافة وتحقيق إنتاج خلايا عالية أو التعامل مع مع الحد الأدنى من العمل والتكلفة متعدد الخطوط.

الصورة = "jove_content"> البروتوكولات الروبوتية مفصلة هنا توفر طريقة لاقتصادية على نطاق ويصل الإنتاج التوجيهية والتعامل معها. ميزة واحدة هي ثقافة الخلايا الجذعية قابلة للفي شكل لوحة أنشئت على أساس تظاهر هنا وسابقا 44،47 - 49 للحفاظ على تعدد القدرات. بينما الأشكال الأخرى من الخلايا المحفزة للتحجيم الخلايا الجذعية الثقافة العائد يتطلب 20،23،29 طريقة هذا الطبق يقوم أساسا أي تغيير في شكل ثقافة، مثل التأقلم مع تعليق، واستخدام رغوة المواد الكيميائية أو استخدامها لفترات طويلة من رو-كيناز 20. يمكن لهذا الأسلوب لوحة مقرها ولبسرعة، وكما هو متوقع، تستوعب خطوط جديدة لأن الظروف ثقافة متشابهة. كما استخدام iPSCs لنمذجة المرض يزيد 4،6،19،50، يتم إنشاء خطوط التوجيهية الجديدة بشكل مستمر. الأساليب المذكورة هنا هي الأنسب لخطوط ثقافة جديدة في المتوسط ​​إلى ارتفاع حجم وسرعة لأن حاجز للانتقال على الشكل هو لآه. هذا ينطبق على العمالة والمعدات اللازمة للحفاظ على المستعمرات أيضا. وأخيرا، لأن شكل والتعامل معها تشبه البيئة المستخدمة لاستخلاص والتحقق من صحة الخطوط التوجيهية، والأداء الثقافة، مثل التمييز الموجه، ومن المرجح أن يكون أكثر قابلية للتنبؤ.

ويوضح الشكل 8 استراتيجية واحدة للتصعيد من إنتاج خلايا جذعية في لوحات 96-جيدا. واحد وتستخدم لوحة (دورة 0) البذور آليا 12 لوحات جديدة، أي بزيادة 12 أضعاف (دورة 0-1). بعد عدة أيام من التغذية، واحد من الاثني عشر لوحات غير passaged البذور مجموعة أخرى من اثني عشر لوحات (دورة 1 إلى دورة 2). هي ما تبقى من لوحات إحدى عشرة متاحة الآن للاستخدامات الأخرى، وتمثل عنصر إنتاج النظام. على هذا المعدل، سوف مرور لوحة واحدة توفر 11 لوحات في كل دورة، أو كل 3-4 أيام. هذه المنهجية يمكن زيادتها أكثر عندما و passaged لوحات متعددة كما هو مبين في الانتقال من دورة 2 إلى دورة 3. في دورة 3، اثنين من لوحات هيتستخدم دائما للحفاظ على مستعمرة والبذور 24 لوحات جديدة. ثم يتم المتاحة للاستخدام بعد مرور كل دورة ال 22 لوحات المتبقية. في أي نقطة في دورة صيانة يمكن للمستخدم البذور لوحات أكثر لزيادة الإنتاج. ومن الأمثلة على ذلك لمرور كل عمود لدورات نمو اثنين. مرور أول تحويل لوحة واحدة إلى اثني عشر لوحات، ولكل من اثني عشر لوحات تستخدم البذور 144 لوحات. في هذه الحالة، يبدأ مستخدم مع لوحة واحدة، وبعد اثنين من الممرات، أو حول 1،5-2 أسابيع من الثقافة، لديها 144 لوحات. على سبيل المثال، الخلايا الليفية والدهنية خطوط التوجيهية تسفر حوالي 25 حتي 75000000 خلايا لكل لوحة 96-جيدا عندما تصبح جاهزة للمرور. وبالتالي يمكن أن 144 لوحات تمثل حوالي 4-7 × 10 9 خلايا.

ما هو عبء العمل لتنفيذ 144 لوحات 96-جيدا آليا؟ كان واحدا من الأهداف لهذا العمل قابلة للإنتاج الخلايا الجذعية التي خفضت العمل مقارنة مع التقليدية (لوحة أي 6 جيدا) وقف زراعة الخلايا. لجنة التنسيق الإدارية الروبوتomplishes ذلك عن طريق تخفيف الحاجة إلى التعامل مع جسديا كل لوحة خلال التغذية والركض. في حين 96-جيدا موازين إنتاج لوحة خطيا ان الامر سيكون في 6 لوحات جيدة التقليدية، وهي المرة فني تنفق العمل مع لوحات أقل بكثير استخدام الثقافة الروبوتية. مشتق كفاءة إنتاج الثقافة الروبوتية من هذه الفرق (الشكل 9). تبين الفنيين يمكن إزالة لوحة 6 جيدا من الحاضنة، التحقق من ذلك على المجهر، ثم نضح والأعلاف لوحة في ما يقرب من 3.5 دقيقة. في المقابل، الفنيين تنفق ما يقرب من 30 ثانية إزالة لوحة 96-جيدا من الحاضنة والتفتيش على المجهر لكثافة والتلوث قبل وضعه على الروبوت. مع بروتوكول التغذية موسعة مماثلة لتلك المذكورة أعلاه، ست لوحات 96-جيدا يمكن تحميلها وبنك الاحتياطي الفيدرالي، والذي يستغرق حوالي 21 دقيقة، أو 3.5 دقيقة لكل لوحة. مجموع الوقت المنقضي لتغذية لوحة غير قابلة للمقارنة بين الروبوتمطلوب جيم والأساليب اليدوية، ولكن لتغذية اليد 6 لوحات فني للجميع 21 دقيقة في حين فني تنفق التعامل مع ستة لوحات للروبوت (تفتيش 30 ثانية لكل لوحة) 3 دقيقة فقط. كما يبين الشكل 9، وهي المرة فني تنفق التعامل مع 144 لوحات باستخدام الروبوت هو حوالي 1.2 ساعة بدلا من 8 ساعات يدويا والروبوت سوف تجعل أبدا من الخطأ التعامل مع لوحات أو نقل السوائل.

96-جيدا أساليب الثقافة التوجيهية وصفها هنا توفر منصة الانقياد للمهام الفحص المعقدة. لأن كل بئر غير متطابقة وراثيا والمصنف في نفس الكثافة من نفس المجموعة الأولي، والمتغيرات يمكن توزيعها عبر لوحة والتي تحتفظ بها الروبوت مع الخزانات المتاحة تجاريا لفصل الظروف. وهذا من شأنه أن يكون مفيدا للتجارب مثل تطوير نمو الخلايا الجذعية وسائل الإعلام 34،35،47، الركيزة أو شرط الثقافة الاختبار ودراسات السمية باستخدام الخلايا الجذعية51. وبما أن كل خط الخلايا الجذعية هي فريدة من نوعها من حيث حجم مستعمرة والمرور متطلبات المثلى، يمكن للمرء أن استخدام هذا النظام لتعديل كثافة البذر، وتردد التغذية ومعالجة مرور عن طريق التلاعب في الأعمدة التي تحصد، والإثارة الميكانيكية أثناء مرور وتواتر التغذية. سوف بالتكرار عبر هذه المتغيرات تسمح للمستخدم العثور بسرعة على مجموعة من الظروف المناسبة لثقافة خط جديد أو تطوير تقنيات ثقافة جديدة. النظام الآلي هو أيضا قادرة على الحفاظ على 96 موازية ولكن مستقلة مستعمرات الخلايا الجذعية. عندما يتم اشتقاق التوجيهية من الخلايا الجسدية أو المستنسخة بعد التلاعب الجيني، يتم فحص العديد من الحيوانات المستنسخة موازية لانتاج خطوط التوجيهية المحتملة. بمجرد المصنف الخلايا وحيدة في لوحات 96-جيدا، ويمكن هذا النظام إطعام والمرور لوحات 96-جيدا حفظ كل مستعمرة منفصلة. وهذا يتيح سرعة عالية جدا عند اختيار الحيوانات المستنسخة المحتملة ويلغي صعوبة في زراعة جسديا 96 خطوط متوازية. هذه الطريقة أيضاllows تحجيمها يصل إنتاج كل استنساخ بحيث المواد متاحة بسهولة لتحليل الموازي. أخيرا، نحن نتصور دمج هذه التقنيات الثقافة مع لوحة نظام الاتجار الروبوتية من شأنها أن توفر لوحات من وإلى حاضنة تمكين ثقافة مؤتمتة بالكامل. ويمكن تحقيق ذلك مع المزيد من الروبوتات المعقدة التي تسمح لمزيد من التوسع منذ البروتوكولات الأساسية المبينة هنا هي قابلة للتحويل إلى أنظمة وحة أخرى مقرها.

الخطوات الحاسمة الأولى للتصدي لفي البروتوكولات هي تلك التي تمنع وتحقق للتلوث مثل الخطوات 1.5 و 4.2. تلوث، كما ذكرنا آنفا، يمكن تجنب بنجاح إذا تم استخدام تقنية معقمة جيدة والحس السليم. ومن الضروري، بغض النظر عن شكل ثقافة الخلايا الجذعية، أن الاختيار مشغل للتلوث وذلك في هذا البروتوكول في الخطوات المشار إليها سوف تقلل إلى حد كبير من خطر التلوث. الصحيح خارج الخلية تطبيق هلام مصفوفة هو وفاق سطيف الثانيخطوة ential لنجاح هذا البروتوكول. دون طلاء صحيح لوحات 96-جيدا، فإن الخلايا الجذعية لا تنمو. قضية واحدة مشتركة هي ناقصة طلاء جيدا. فقد أثبتت التجربة أن فقاعات الهواء، والجذب الكهربائي وعمل شعري تعيق إكمال الطلاء بشكل جيد. وقد وضعت الخطوة ما قبل التبول (1،6) إلى تحسن ملحوظ طلاء القاع جيدا ويجب أن لا يتم تخطي. ويبدو أن هذه الخطوة ترطيب مسبقا للحد من للا مائية واضح من البلاستيك لوحة 96 جيدا بحيث أنه عندما يتم تطبيق هلام خارج الخلية مصفوفة طلاء يتم توزيعه بالتساوي على القاع جيدا والجانبين. ويوصى أيضا للاستفادة بلطف لوحات 96-جيدا ضد يد نظيفة مرة واحدة المغلفة لضمان حتى خارج الخلية توزيع حل جل المصفوفة. المعلمات التفكك مهمة لتحسين أيضا. ومدد الحضانة مع انزيم أو EDTA أساس التفكك كاشف يؤدي في زنازين انفرادية التي قد تكون أو لا تكون هدفا خلال مرور. ولذلك، فإن المشغلوينبغي إيلاء اهتمام خاص لكم من الوقت التفكك، قوة سحن، والتكرار غسل تؤثر مورفولوجيا مستعمرة والصحة وضبط وفقا لذلك.

فهم القيود المفروضة على الأساليب المذكورة هنا بالغ الأهمية لنجاح العملية. كما هو الحال في أي مكان زراعة الخلايا الأخرى، واستخدام لوحات 96-جيدا يمثل خطرا تلوث عالية نسبيا. كما هو موضح أعلاه، فني هو التعامل مع كل لوحة أثناء الرضاعة والركض. على سبيل المثال، عند فتح الغطاء، وضع لوحة على السرير الروبوت، وفحص لوحة على المجهر. لذلك، كما لوحظ بعد الخطوة 1.5، فمن الضروري عدم لمس داخل أي لوحة غطاء أو فضح هذا الجزء على أي سطح يحتمل أن تكون ملوثة مثل كتل التدفئة منحدر أو دبابيس العمودية على السرير. خلال تطوير بروتوكول تم اكتشاف هذا القيد، وكان الدافع لتطوير رف لعقد أغطية لوحة للحفاظ على عقم. وبالمثل، فإن الخزانات الحوض الصغير، نصائح الماصة وسإمدادات ذر على السرير التعامل مع الروبوت السائلة هي المصادر المحتملة للتلوث لأنهم منفتحون على البيئة والتعامل معها من قبل فني. ولذلك، ينبغي أن تطبق تقنية معقمة جيدة مثل الحد من تحركات على المواد الثقافة تتعرض أو السوائل المفتوحة. قيود آخر هو أنه عندما يتم تحجيم بروتوكول يصل، والتحقق بصريا كل جانب من> 100 لوحات 96-جيدا مرهقة. هذا يمكن التعامل معها عن طريق التفتيش بصريا لوحة كاملة بحثا عن علامات على التلوث، مثل وسائل الإعلام العكرة، لتحديد الآبار المشبوهة. على نطاق والمستقبل، وسوف تدرج استخدام المجهر الآلي ومؤشر على نمو الخلايا والتلوث المحتمل.

وباختصار، فإن الإنتاجية العالية 96-جيدا منطلقا الموصوفة هنا تقدم استنساخه أو أسلوب الدقة العالية لزراعة الخلايا الجذعية والإنتاج في شكل لوحة. هذا الأسلوب يقلل من الخبرة المطلوبة، والمعدات الوقت اللازم والعمل مكرسة لوقف زراعة الخلايا في حينالحفاظ على فوائد ثقافة ملتصقة التقليدية.

Disclosures

الكتاب MKC، MJG، EEB، NJD وRO هي أو كانت في ذلك الوقت من الموظفين تطوير InvivoSciences، INC التي تصور وتطوير بروتوكولات الروبوتية هو موضح هنا. TW هي منظمات المجتمع المدني لInvivoSciences INC. SH هو موظف من جيلسون INC.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل في جزء من المنح NIH، R44 GM087784 وR01 HL109505. الكتاب أشكر الفريق الفني وOEM في جيلسون، INC للدعم التقني الموسع.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates Corning 3596 96-well; Well volume: 360 μl; Cell growth area: 0.32 cm2; Individually wrapped
Seahorse Trough SeahorseBio 201308-100 Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs
Gilson Tips Gilson F167023 10 racks gilson 96 tips D200 tips
DMEM/F12 Life Technologies 12500062 DMEM/F12 powder.  Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter.
Growth Factor Reduced Matrigel Corning 354230 Referred to as, "extracellular matrix gel" in the text. Matrigel GFR, 10 ml
mTeSR1 StemCell Technologies 5857 mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance.
E8 Media StemCell Technologies 5940 TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance
Y27632 AdooQ BioScience A11001-50 Rock inhinitor Y-27632 2HCI
Accutase Innovative Cell Technologies ACCUTASE Referred to as, "proteolytic and collagenolytic dissociation reagent" in the text. Accutase 500 ml sterile cell solution
PBS Fisher SH30256FS PBS w/o Ca Mg 500 ml, 6/pk
Gilson PIPETMAX Gilson PIPETMAX http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature protocols. 2, (12), 3081-3089 (2007).
  2. Grskovic, M., Javaherian, A., Strulovici, B., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells--opportunities for disease modelling and drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 10, 915-929 (2011).
  3. Shi, Y. Induced pluripotent stem cells, new tools for drug discovery and new hope for stem cell therapies. Current Molecular Pharmacology. 2, 15-18 (2009).
  4. Xu, X., Zhong, Z. Disease modeling and drug screening for neurological diseases using human induced pluripotent stem cells. Nature Publishing Group. 34, (6), 755-764 (2013).
  5. Kirouac, D. C., Zandstra, P. W. The systematic production of cells for cell therapies. Cell stem cell. 3, (4), 369-381 (2008).
  6. Ebert, P., Liang, J. W. Induced Pluripotent Stem Cells as a Disease Modeling and Drug Screening Platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60, (4), 408-416 (2012).
  7. Pa Lalit,, Hei, D. J., Raval, A. N., Kamp, T. J. Induced pluripotent stem cells for post-myocardial infarction repair: remarkable opportunities and challenges. Circulation research. 114, 1328-1345 (2014).
  8. Compagnucci, C., Nizzardo, M., Corti, S., Zanni, G., Bertini, E. In vitro neurogenesis: development and functional implications of iPSC technology. Cellular and Molecular Life Sciences. 1-17 (2013).
  9. Yi, F., Liu, G. -H., Belmonte, J. C. I. Human induced pluripotent stem cells derived hepatocytes: rising promise for disease modeling, drug development and cell therapy. Protein & Cell. 3, 246-250 (2012).
  10. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. a, Elefanty, aG., Kamp, T. J. Differentiation of Human Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes: A Methods Overview. Circulation Research. 111, (3), 344-358 (2012).
  11. Okano, H., et al. Steps toward safe cell therapy using induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 112, 523-533 (2013).
  12. Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The Potential for Immunogenicity of Autologous Induced Pluripotent Stem Cell-derived Therapies. The Journal of biological chemistry. 289, 4571-4577 (2014).
  13. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science translational medicine. 4, (130), 130ra47 (2012).
  14. Gunaseeli, I., Doss, M. X., Antzelevitch, C., Hescheler, J., Sachinidis, A. Induced pluripotent stem cells as a model for accelerated patient- and disease-specific drug discovery. Current medicinal chemistry. 17, 759-766 (2010).
  15. Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 114, 201-235 (2009).
  16. Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends in Biotechnology. 30, 350-359 (2012).
  17. Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Stem/Progenitor cell sources of insulin-producing cells for the treatment of diabetes. Tissue engineering. 13, 1399-1412 (2007).
  18. Jing, D., Parikh, A., Canty, J. M., Tzanakakis, E. S. Stem cells for heart cell therapies. Tissue engineering. Part B, Reviews. 14, 393-406 (2008).
  19. Soldner, F., Jaenisch, R. iPSC Disease Modeling. Science. 338, 1155-1156 (2012).
  20. Olmer, R., et al. Long term expansion of undifferentiated human iPS and ES cells in suspension culture using a defined medium. Stem cell research. 5, (1), 51-64 (2010).
  21. Wang, Y., Chou, B. -K., Dowey, S., He, C., Gerecht, S., Cheng, L. Scalable expansion of human induced pluripotent stem cells in the defined xeno-free E8 medium under adherent and suspension culture conditions. Stem cell research. 11, (3), 1103-1116 (2013).
  22. Chen, V. C., et al. Scalable GMP compliant suspension culture system for human ES cells. Stem cell research. 8, (3), 388-402 (2012).
  23. Amit, M., Laevsky, I., Miropolsky, Y., Shariki, K., Peri, M., Itskovitz-Eldor, J. Dynamic suspension culture for scalable expansion of undifferentiated human pluripotent stem cells. Nature protocols. 6, (5), 572-579 (2011).
  24. Olmer, R., et al. Suspension Culture of Human Pluripotent Stem Cells in Controlled. Stirred Bioreactors. Tissue engineering. Part C. 18, (10), (2012).
  25. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S., Ph, D. Scalable Stirred-Suspension Bioreactor Culture. Tissue engineering. Part A. 16, (2), (2010).
  26. Oh, S. K. W., et al. Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 2, 219-230 (2009).
  27. Chen, A. K. -L., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnology advances. 31, 1032-1046 (2013).
  28. Yang, H. S., Jeon, O., Bhang, S. H., Lee, S. -H., Kim, B. -S. Suspension culture of mammalian cells using thermosensitive microcarrier that allows cell detachment without proteolytic enzyme treatment. Cell transplantation. 19, 1123-1132 (2010).
  29. Zweigerdt, R., Olmer, R., Singh, H., Haverich, A., Martin, U. Scalable expansion of human pluripotent stem cells in suspension culture. Nature. 6, (5), (2011).
  30. Kami, D., et al. Large-scale cell production of stem cells for clinical application using the automated cell processing machine. BMC biotechnology. 13, 102 (2013).
  31. Hussain, W., Moens, N., Veraitch, F. S., Hernandez, D., Mason, C., Lye, G. J. Reproducible culture and differentiation of mouse embryonic stem cells using an automated microwell platform. Biochemical engineering journal. 77, (100), 246-257 (2013).
  32. Tandon, N., Marolt, D., Cimetta, E., Vunjak-Novakovic, G. Bioreactor engineering of stem cell environments. Biotechnology Advances. 31, 1020-1031 (2013).
  33. Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15720-15725 (2009).
  34. Ludwig, T. E., Bergendahl, V., Levenstein, M. E., Yu, J., Probasco, M. D., Thomson, J. A. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature. 3, 637-646 (2006).
  35. Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature methods. 8, (5), 424-429 (2011).
  36. Kinney, M. A., Sargent, C. Y., McDevitt, T. C. The multiparametric effects of hydrodynamic environments on stem cell culture. Tissue engineering. Part B, Reviews. 17, 249-262 (2011).
  37. Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem cells (Dayton, Ohio). 31, (2013).
  38. Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, (7175), 141-146 (2008).
  39. Chambers, I., et al. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113, (5), (2003).
  40. Wright, A. J., Andrews, P. W. Surface marker antigens in the characterization of human embryonic stem cells. Stem cell research. 3, (1), 3-11 (2009).
  41. Thomson, J. a Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282, (5391), 1145-1147 (1998).
  42. Mayshar, Y., et al. Identification and classification of chromosomal aberrations in human induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7, (4), 521-531 (2010).
  43. Martins-Taylor, K., Xu, R. -H. Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells. Stem cells(Dayton, Ohio). 30, (1), 22-27 (2012).
  44. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, (7151), 313-317 (2007).
  45. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature. 26, (11), 1276-1284 (2008).
  46. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (27), E1848-E1857 (2012).
  47. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature biotechnology. 24, (2), 185-187 (2006).
  48. Wang, L., Li, L., Menendez, P., Cerdan, C., Bhatia, M. Human embryonic stem cells maintained in the absence of mouse embryonic fibroblasts or conditioned media are capable of hematopoietic development. Blood. 105, (12), 4598-4603 (2005).
  49. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science(New York, N.Y.). 318, (5858), 1917-1920 (2007).
  50. Kim, C. Disease modeling and cell based therapy with iPSC: future therapeutic option with fast and safe application. Blood research. 49, 7-14 (2014).
  51. Jung, E. -M., et al. Evaluation of developmental toxicity using undifferentiated human embryonic stem cells. Journal of applied toxicology: JAT. (February. (2014).

Comments

1 Comment

  1. For setting the protocol how could I download it? Especially I would like to know how the ramp is specified in your protocol? Did you made ramp as a specialized labware or did you do advanced protocols(injections, moves, etc)?
    Sincerely Ji Young Ryu

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 13, 2017 - 3:45 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics