एक रोबोट तरल हैंडलिंग प्रणाली का उपयोग करते हुए स्केलेबल 96 अच्छी तरह से IPSC संस्कृति के आधार प्लेट और उत्पादन

Developmental Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Conway, M. K., Gerger, M. J., Balay, E. E., O'Connell, R., Hanson, S., Daily, N. J., Wakatsuki, T. Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System. J. Vis. Exp. (99), e52755, doi:10.3791/52755 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

स्टेम सेल संस्कृति में निरंतर उन्नति पुनर्योजी दवा, दवाओं की खोज और सुरक्षा का परीक्षण में इन कोशिकाओं का उपयोग कर के लिए बेंच और बिस्तर के बीच की खाई को बंद हो रहा है। ऊतक इंजीनियरिंग और प्रत्यारोपण के लिए सेल व्युत्पन्न biopharmaceutics और स्टेम सेल का उत्पादन करने के लिए, एक लागत प्रभावी सेल विनिर्माण प्रौद्योगिकी आवश्यक है। Pluripotency और समय के साथ बहाव के अनुप्रयोगों (जैसे, सेल भेदभाव) में कोशिकाओं के स्थिर प्रदर्शन के रखरखाव के लिए बड़े पैमाने पर कोशिकाओं के उत्पादन के लिए सर्वोपरि है। अभी तक कि ऑपरेटर महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता परिचय के साथ ही बड़े पैमाने अप करने के लिए बेहद महंगा हो सकता है, जहां कोशिकाओं को मैन्युअल रूप से संवर्धित कर रहे हैं विशेष रूप से अगर हासिल करना मुश्किल हो सकता है। न्यूनतम तकनीशियन भागीदारी या अनुभव की आवश्यकता होती है कि तरल रोबोट से निपटने के लिए विकसित किए गए मल्टी चैनल एक बेंच शीर्ष का उपयोग ऑपरेटर प्रभाव उपन्यास स्टेम सेल संस्कृति प्रोटोकॉल उच्च throughput, बड़े पैमाने पर स्टेम कोशिका के उत्पादन में सक्षम है और निकालने के लिए। साथइन प्रोटोकॉल मानव प्रेरित स्टेम सेल (IPSCs) सीधे एक जमे हुए स्टॉक से फीडर मुक्त परिस्थितियों में सुसंस्कृत थे और 96 अच्छी तरह से प्लेट में बनाए रखा। जब पारित होने के लिए सेल लाइन और वांछित पैमाने अप दर पर निर्भर करता है, ऑपरेटर आसानी से बंटवारे के लिए इष्टतम कॉलोनी घनत्व दिखा छवियों की एक श्रृंखला के आधार पर निर्धारित कर सकते हैं। उसके बाद आवश्यक अभिकर्मकों एक centrifugation कदम के बिना नई प्लेटों के लिए एक कॉलोनी विभाजन प्रदर्शन करने के लिए तैयार हैं। 20 मार्ग (~ 3 महीने) के बाद, दो IPSC लाइनों, स्थिर karyotypes बनाए रखा स्टेम सेल मार्कर व्यक्त की, और उच्च दक्षता के साथ cardiomyocytes में विभेदित। प्रणाली 96 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए बनाया गया नया भेदभाव प्रोटोकॉल या आनुवंशिक हेरफेर के बाद के उच्च throughput स्क्रीनिंग प्रदर्शन कर सकते हैं। इस प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों के असंख्य के लिए समान स्टेम कोशिकाओं की बड़ी संख्या के उत्पादन के लिए श्रम और तकनीकी बोझ कम हो जाएगा।

Introduction

6 - मानव प्रेरित स्टेम सेल (IPSCs) के उपयोग यौगिक परीक्षण, पुनर्योजी चिकित्सा और रोग मॉडलिंग 2 के लिए 2007 1 में उनके व्युत्पत्ति के बाद से काफी बढ़ गया है। इस मांग को एक अद्वितीय मात्रा में दैहिक कोशिकाओं में भेदभाव किया जा सकता है कि pluripotent कोशिकाओं की बड़ी संख्या को उपज के लिए IPSC की क्षमता से आता है। निर्देशित भेदभाव तकनीक 7 में सुधार के रूप में - तो उच्च गुणवत्ता IPSCs का बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए आवश्यकता करता है, 14 - 10 और मानव कोशिका या ऊतक मॉडलिंग और सेल थेरेपी के विकास के 11 से बढ़ जाती है। 18 - यह व्यापक रूप से अन्य बुराइयों के बीच में, रोधगलन या बी सेल कार्यात्मक प्रतिस्थापन IPSC के अरबों के लिए लाखों लोगों के सैकड़ों की आवश्यकता होती है दैहिक कोशिकाओं 15 व्युत्पन्न है कि उद्धृत किया जाता है। दवाओं की खोज और टी के लिए इसके अलावा, तेजी से जटिल 3 डी ऊतक मॉडलिंगherapy कोशिकाओं 9,13,19 की बड़ी संख्या की मांग करेंगे। इन सभी उदाहरणों में, परिभाषित वर्दी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य IPSCs उपलब्ध है और निर्माण करने के लिए सरल होना चाहिए।

ऊतक इंजीनियरिंग और प्रत्यारोपण के लिए सेल व्युत्पन्न biopharmaceutics और स्टेम सेल का उत्पादन करने के लिए, एक लागत प्रभावी सेल विनिर्माण प्रौद्योगिकी आवश्यक है। इन तकनीकों को सफलतापूर्वक बड़े पैमाने पर गैर-IPSC, यूकेरियोटिक आधारित उत्पादन के लिए तैनात किए गए हैं, आंशिक रूप क्योंकि 28 - microcarrier substrates के 26 के उपयोग के साथ 25 या निलंबन - IPSCs की स्केल्ड उत्पादन निलंबन संस्कृति 20 पर ध्यान केंद्रित किया है। कई समूहों स्टेम सेल 20,21,23,24,29 निकलेगा कि निलंबन संस्कृति प्रणालियों का प्रदर्शन किया है। हालांकि, इन तरीकों ऊतक इंजीनियरिंग ड्राइविंग और Laborat कर रही है, उपन्यास भेदभाव कार्यक्रमों के विकास के शोधकर्ताओं के लिए आसानी से उपलब्ध नहीं महंगा और जटिल प्रणालियों का उपयोगory पैमाने पर अनुसंधान। इसके अलावा, निलंबन और microcarrier IPSC संस्कृतियों एकत्रीकरण को विनियमित करने के लिए अनुकूलन और तकनीक या इस तरह रो-kinase अवरोध के लगातार प्रयोग के रूप में पारंपरिक पक्षपाती IPSC संस्कृति में नहीं मिला रसायन, antifoaming एजेंटों और निस्पंदन की आवश्यकता होती है। कोशिकाओं को शारीरिक तनाव यांत्रिक आंदोलन से और साथ ही microcarrier टक्कर के दौरान शुरू की, निलंबन संस्कृति में अधिक प्रचलित है। इन मुद्दों को सेल लाइनों निलंबन में संवर्धित किया जा सकता नव स्टेम उत्पन्न जिस पर predictability और गति सीमा। दूसरों की थाली कल्चर तकनीक 30,31 कि नकल रोबोट थाली हैंडलिंग सिस्टम विकसित किया है लेकिन इन प्लेटफार्मों उपकरण और स्टेम सेल संस्कृति के साथ जुड़े मौलिक चुनौतियों के अलावा संचालित करने के लिए विशेषज्ञता के लिए महत्वपूर्ण निवेश की मांग।

निम्नलिखित काम एक घुन्ना, मानक 8 चैनल रोबोट तरल इस्तेमाल करता है कि विकास और एक स्केलेबल IPSC संस्कृति प्रणाली के अभ्यास का वर्णनहैंडलर और 96 अच्छी तरह प्लेटें। इस विधि प्रयोगशाला पैमाने IPSC संस्कृति और उच्च मात्रा IPSC उत्पादन को पाटने के लिए डिजाइन किया गया था (जैसे, 10 7 - तकनीशियन प्रति सप्ताह 1.5 एक्स 10 9 कोशिकाओं) नई IPSC प्रौद्योगिकियों के विकास के उन सक्रिय करने के आसानी से बड़ी हार्डवेयर या श्रम निवेश के बिना उत्पादन को पैमाने पर करने के लिए। इस विधि को स्थापित करने के लिए अपेक्षाकृत सस्ती है कोई स्टेम सेल संस्कृति, प्रोग्रामिंग या इंजीनियरिंग अनुभव करने के लिए थोड़ा की आवश्यकता है, एक समर्पित सेल संस्कृति हुड के लिए आवश्यकता के बिना एक छोटा सा उपकरण निशान है, और स्वचालित उच्च throughput के लिए मध्यम सक्षम करने के लिए मानक सेल संस्कृति उपकरण का इस्तेमाल सेल उत्पादन। उद्देश्य सेल संस्कृति स्टेम करने के लिए नई प्रयोगशालाओं द्वारा उपयोग किया जा सकता है कि स्केलेबल स्टेम सेल संस्कृति में सक्षम प्रणाली विकसित करने के लिए किया गया था, मैनुअल खेती उनके विचारों को विकसित करने या स्टेम कोशिकाओं की बड़ी संख्या के उत्पादन के लिए एक किफायती साधन चाहने वालों के लिए एक बाधा लगता है जो लोग। यहाँ प्रस्तुत मंच पर तकनीशियन प्रभाव को हटासेल संस्कृति स्टेम और लगातार स्टेम कोशिका के उत्पादन को सक्षम करने के लिए भोजन और पारित होने प्रक्रियाओं normalizes।

Protocol

96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में पारंपरिक पक्षपाती संस्कृति की स्थिति बनाए रखने के दौरान निम्नलिखित प्रोटोकॉल के लिए गिल्सन के pipetmaX था जो रोबोट तरल हैंडलिंग प्रणाली, स्केलेबल स्टेम सेल संस्कृति और उत्पादन की सुविधा स्वचालित। पारंपरिक 6 अच्छी तरह से थाली संस्कृति की तरह, IPSCs अलग कालोनियों के एक monolayer के रूप में लेकिन 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में इस प्रोटोकॉल के साथ बड़े हो रहे हैं। हर अच्छी तरह से isogenic या अलग हो सकता है और रोबोट हर अच्छी तरह से अलग रख सकते हैं क्योंकि विन्यास या तो समानांतर में संवर्धित किया जा सकता है। संस्कृतियों के एक अनुकूलन कार्यक्रम और उपयोगकर्ता जिससे बोने घनत्व और बड़े पैमाने दर को नियंत्रित करने के पृथक्करण विधि और बंटवारे अनुपात चुनता है, जहां एक मार्ग कार्यक्रम पर खिलाया जाता है, जहां एक खिला कार्यक्रम: ठेठ रोबोट IPSC संस्कृति दिनचर्या दो चरणों है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल एक नई संस्कृति खिलाने और पारित होने के पूरा कर रहे हैं, कैसे शुरू कर दिया और IPSC संस्कृति की सुविधा है कि अनुपूरक कार्यक्रम का वर्णन कैसे।

1. तैयार कर रहा है बाह्य मैट्रिक्स जेल लेपित 96 अच्छी तरह प्लेटें

  1. छह नए, आर टी 96 अच्छी तरह से प्लेटों से पैकेजिंग निकालें और पदों 2, 3, 5, 7, 8, 9 (बिस्तर पदों के लिए चित्रा 1 ए देखें) में रोबोट बिस्तर से निपटने तरल पर उन्हें जगह है।
  2. बिस्तर स्थिति 6 में एक पूर्व ठंडा, 4 डिग्री सेल्सियस 4 अच्छी तरह से गर्त रखें।
  3. पूर्व ठंडा, 4 डिग्री सेल्सियस 200 μl pipet सुझावों के साथ बिस्तर स्थिति 1 में टिप रैक लोड स्तंभ 12।
  4. बाँझ तकनीक का उपयोग कर एक विभाज्य गिरने से 25 मिलीलीटर 4 डिग्री सेल्सियस DMEM / F12 के साथ बिस्तर स्थिति 6 में अच्छी तरह से पहले (बाएं सबसे) गर्त भरें। वैकल्पिक रूप से, हस्तांतरण को पूरा करने के लिए एक pipet का उपयोग करें।
  5. (PLHR, चित्रा 1 ए देखें) 96 अच्छी तरह से थाली lids निकालें और विशेष रूप से डिजाइन की थाली ढक्कन पकड़े रैक में प्रत्येक स्लाइड। संपर्क से बचेंथाली पलकों के अंदर के साथ।
    ध्यान दें: एक थाली ढक्कन के अंदर से निपटने या एक ढक्कन के अंदर किसी अन्य के बाहर संदूषण के लिए एक उत्कृष्ट मार्ग है छूता है, जहां थाली lids स्टैकिंग।
  6. रोबोट नियंत्रण स्पर्श पैड का उपयोग कर, अच्छी तरह से पूर्व गीला प्रक्रिया शुरू करने के लिए बटन के निम्नलिखित श्रृंखला दबाएँ:
    1. "एक प्रोटोकॉल भागो" टैप करें।
    2. "बाह्य मैट्रिक्स जेल Prewet" का चयन करें और अगले टैप करें।
    3. उपयोगकर्ता का निर्णय: चयनित कार्यक्रम पूर्व परीक्षण करने के लिए कदम-दर-कदम विज़ार्ड का उपयोग करने के लिए "परीक्षण रन" टैप करें।
      नोट: रोबोट भाग नहीं करता है बल्कि सॉफ्टवेयर सॉफ्टवेयर की समस्याओं के लिए प्रोटोकॉल का परीक्षण करती है। "सेटअप छोड़" दोहन स्थापित प्रोटोकॉल, साथ स्वीकार्य है।
    4. "भागो प्रोटोकॉल" टैप करें।
  7. पूर्व गीला प्रक्रिया (कदम 1.6) के दौरान 1.8 कदम करने के लिए जारी है।
  8. विकास का पहलू की बर्फ एक 4 मिलीग्राम विभाज्य पर पिघलना एक 50 मिलीलीटर में निहित बाह्य मैट्रिक्स जेल (GFRM) कमशंक्वाकार ट्यूब -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत। उपयोग करने के लिए तैयार है जब तक बर्फ पर विभाज्य रखें।
    नोट: आरटी के लिए आने के लिए अनुमति दी है और उपयोगी नहीं होगा अगर GFRM स्थिर करना होगा।
  9. एक 25 मिलीलीटर कांच pipet के साथ 24 मिलीलीटर 4 डिग्री सेल्सियस DMEM / F12 में 4 मिलीग्राम GFRM विभाज्य Resuspend। DMEM / F12 स्थानांतरित, pipet का GFRM विभाज्य resuspending करने से पहले शांत करने के लिए अनुमति देने के लिए 2-3 सेकंड के लिए रोकें।
  10. पूर्व गीला प्रक्रिया (कदम 1.6) पूर्ण होने पर, 1.11 कदम के लिए जारी।
  11. बिस्तर स्थिति 6 में गर्त की चौथी अच्छी तरह से करने के लिए DMEM / F12 GFRM मिश्रण के 24 मिलीलीटर स्थानांतरण।
  12. रोबोट नियंत्रण स्पर्श पैड का उपयोग करना, बाह्य मैट्रिक्स जेल कोटिंग की प्रक्रिया शुरू करने के लिए बटन के निम्नलिखित श्रृंखला दबाएँ:
    1. "एक प्रोटोकॉल भागो" टैप करें।
    2. "बाह्य मैट्रिक्स जेल विभाज्य" का चयन करें और अगले टैप करें।
    3. उपयोगकर्ता का निर्णय: चयनित कार्यक्रम पूर्व परीक्षण करने के लिए कदम-दर-कदम विज़ार्ड का उपयोग करने के लिए "परीक्षण रन" टैप करें।
      नोट: रोबोट चला, लेकिन अधिक तत्पर नहीं करताआर सॉफ्टवेयर सॉफ्टवेयर की समस्याओं के लिए प्रोटोकॉल का परीक्षण करती है। "सेटअप छोड़" दोहन स्थापित प्रोटोकॉल, साथ स्वीकार्य है।
    4. "भागो प्रोटोकॉल" टैप करें।
  13. कदम 1.12 पूरा हो गया है, थाली पलकों की जगह।
  14. एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, humidified इनक्यूबेटर करने के लिए बाह्य मैट्रिक्स जेल लेपित 96 अच्छी तरह प्लेटें स्थानांतरण और प्लेटों का उपयोग करें या संग्रहीत करने के लिए तैयार हो जाएगा जो बिंदु पर 24 घंटे के लिए वहाँ पकड़ो।
    नोट: extenuating परिस्थितियों में, नव लेपित बाह्य मैट्रिक्स जेल प्लेटों की सिफारिश की है ऊष्मायन लेकिन 24 घंटा ऊष्मायन के लिए हे / एन के 15-30 मिनट के बाद इस्तेमाल किया जा सकता है।
  15. दोहराएँ प्रोटोकॉल 1.1, 1.3, GFRM साथ DMEM / F12 के सभी जब तक 1.5-1.6, 1.10, और 1.12-14 प्रयोग किया जाता है दोहराएँ।

2. भंडारण बाह्य मैट्रिक्स जेल लेपित 96 अच्छी तरह प्लेटें

  1. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, humidified इनक्यूबेटर से बाह्य मैट्रिक्स जेल लेपित 96 अच्छी तरह प्लेटें निकालें।
  2. वैकल्पिक: एकबाह्य मैट्रिक्स llow जेल लेपित 96 अच्छी तरह प्लेटें 2.3 कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले आर टी के लिए आते हैं।
    नोट: यह वैकल्पिक कदम प्लेटें 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है जब संक्षेपण का निर्माण कम हो जाएगा।
  3. पदों 2, 3, 5, 7, 8, 9 (बिस्तर पदों के लिए चित्रा 1 ए देखें) में तरल से निपटने रोबोट बिस्तर पर प्लेटें प्लेस।
  4. आर टी 200 μl pipet सुझावों के साथ बिस्तर स्थिति 1 में टिप रैक लोड स्तंभ 12।
  5. बिस्तर स्थिति 6 में एक चार गर्त जलाशय रखें।
  6. (दायीं ओर) आर टी DMEM / F12 के साथ जलाशय की अच्छी तरह से 4 भरें।
  7. 96 अच्छी तरह से थाली lids निकालें और PLHR में प्रत्येक स्लाइड।
  8. रोबोट नियंत्रण स्पर्श पैड का उपयोग करना, बटन के निम्नलिखित संयोजन दबाएँ:
    1. "एक प्रोटोकॉल भागो" टैप करें।
    2. "बाह्य मैट्रिक्स जेल विभाज्य" का चयन करें और अगले टैप करें।
    3. उपयोगकर्ता का निर्णय: चयनित कार्यक्रम पूर्व परीक्षण करने के लिए कदम-दर-कदम विज़ार्ड का उपयोग करने के लिए "परीक्षण रन" टैप करें।
      नोट: रोबोटी भाग नहीं करता है बल्कि सॉफ्टवेयर सॉफ्टवेयर की समस्याओं के लिए प्रोटोकॉल का परीक्षण करती है। "सेटअप छोड़" दोहन स्थापित प्रोटोकॉल, साथ स्वीकार्य है।
    4. "भागो प्रोटोकॉल" टैप करें।
  9. पूरी कर लेंगे, थाली पलकों की जगह है और मशीन बिस्तर से प्लेटों को हटा दें।
  10. 6 इंच आयल फिल्म पट्टी से एक एक इंच के साथ एक बाह्य मैट्रिक्स जेल (ढक्कन थाली कहाँ से मिलता है) लेपित 96 अच्छी तरह से थाली की पूरी पक्ष के आसपास लपेटें। एक airtight मुहर बनाने के लिए आयल फिल्म फैलाने के लिए सुनिश्चित करें।
  11. वैकल्पिक: पूरा बाह्य मैट्रिक्स जेल कोटिंग की तारीख के साथ प्लेटों लेबल, बाह्य मैट्रिक्स जेल बहुत संख्या, उपयोगकर्ता नाम और किसी भी अन्य जानकारी।
  12. वे अप करने के लिए दो सप्ताह के लिए उपयोग करने के लिए अच्छा होगा, जहां 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों स्टोर।
    नोट: प्लेट्स सफलतापूर्वक हालांकि, यह अनुशंसित नहीं है, दो सप्ताह की सीमा से परे इस्तेमाल किया गया है।

3. एक स्टेम सेल कॉलोनी बोने घनत्व प्रदर्शनएक लाइव या फ्रोजन संस्कृति से 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में ढाल: कैसे प्रारंभ करें या एक स्टेम सेल लाइन के लिए सामान्य मार्ग अंतराल को पुनर्स्थापित करने के लिए

  1. एक जमे हुए संस्कृति के साथ शुरू करते हैं, तो 3.2 कदम आगे बढ़ना। पहले से ही एक थाली पर एक लाइव स्टेम सेल संस्कृति के साथ शुरू करते हैं, तो 3.5 कदम पर शुरू करते हैं।
  2. बर्फ का केवल एक छोटा सा हिस्सा रहता है जब तक एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्यूब घूमता से जमे हुए संस्कृति गला लें।
  3. वैकल्पिक: 10 माइक्रोन Y27632 युक्त ताजा SCGM सतह पर तैरनेवाला मीडिया महाप्राण और 7 मिलीलीटर में स्टेम सेल गोली resuspend, 300 XG पर 2 मिनट के लिए सेल के विकास मीडिया (SCGM), अपकेंद्रित्र स्टेम RT 10 एमएल में thawed कोशिकाओं पतला।
    नोट: यह कदम ठंड मीडिया का भार समाप्त।
  4. 3.6 कदम आगे बढ़ना।
  5. लाइव के साथ शुरू करते हैं, तो पहले से ही स्टेम कोशिकाओं को चढ़ाया: बीतने कोशिकाओं के रूप में सामान्य एंजाइमी या गैर enzymatic पृथक्करण का उपयोग कर। 1.5-3,000,000 कोशिकाओं की कुल फसल के लिए प्रयास करें; आम तौर पर एक छह अच्छी तरह से थाली में से एक अच्छी तरह से। के लिए काटा कोशिकाओं अपकेंद्रित्र2 मिनट के लिए 300 XG पर, सतह पर तैरनेवाला मीडिया महाप्राण और 10 माइक्रोन Y27632 युक्त 7 मिलीलीटर ताजा SCGM में स्टेम सेल गोली resuspend। 3.6 कदम आगे बढ़ना।
  6. कोशिकाओं सुनिश्चित करें, या तो एक जमे हुए या जीवित संस्कृति से, 10 माइक्रोन Y27632 के साथ 7 मिलीलीटर आरटी SCGM में निलंबित कर रहे हैं।
  7. आर टी 200 μl pipet सुझावों के साथ बिस्तर स्थिति एक में टिप रैक लोड स्तंभ 12।
  8. बिस्तर स्थिति 2 में एक चार गर्त जलाशय रखें।
  9. जगह एक नए बाह्य मैट्रिक्स जेल लेपित 96 अच्छी तरह से थाली बिस्तर स्थिति 5 में 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म और PLHR में रखकर ढक्कन हटा दें।
  10. Pipet से जलाशय का अच्छी तरह से 3 resuspended कोशिकाओं के 7 एमएल हस्तांतरण या बाँझ डालना।
    1. रोबोट नियंत्रण स्पर्श पैड का उपयोग करना, बटन के निम्नलिखित संयोजन दबाएँ:
    2. "एक प्रोटोकॉल भागो" टैप करें।
    3. "बोने घनत्व ढाल" का चयन करें और अगला टैप करें।
    4. उपयोगकर्ता का निर्णय: चयन पूर्व परीक्षण करने के लिए कदम-दर-कदम विज़ार्ड का उपयोग करने के लिए "परीक्षण रन" टैपएड कार्यक्रम।
      नोट: रोबोट भाग नहीं करता है बल्कि सॉफ्टवेयर सॉफ्टवेयर की समस्याओं के लिए प्रोटोकॉल का परीक्षण करती है। "सेटअप छोड़" दोहन स्थापित प्रोटोकॉल, साथ स्वीकार्य है।
  11. "भागो प्रोटोकॉल" टैप करें।
  12. कमजोर पड़ने श्रृंखला के पूरा होने पर, अगले खिला जब तक एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, humidified इनक्यूबेटर में थाली और जगह फिर से कवर किया।
  13. वैकल्पिक: तारीख, तनाव के बारे में जानकारी, उपयोगकर्ता नाम, मीडिया प्रकार और अन्य प्रासंगिक जानकारी के साथ थाली लेबल।
  14. नीचे प्रोटोकॉल 4 का उपयोग कर के रूप में आवश्यक अगले कई दिनों में, 96 अच्छी तरह से थाली खिलाओ।
    नोट: एक ठेठ स्टेम सेल प्लेट एक पूर्ण मीडिया परिवर्तन एक बार हर 24 घंटे की आवश्यकता होगी और SCGM खिलाने के लिए Y27632 शामिल नहीं है; केवल पारित होने के बाद प्रारंभिक बोने के दौरान। खिलाने के लिए पहले, प्रदूषण और कॉलोनी घनत्व के लिए थाली की जाँच करें। कॉलोनी घनत्व की निगरानी के बारे में अधिक के लिए 3.16 से कदम मिलते हैं।
  15. सी के पास अगले कुछ दिनों में, कई कॉलमथाली से दर्ज (आमतौर पर कॉलम 5-8) पारित होने के लिए एक आदर्श घनत्व दृष्टिकोण होगा; इस घनत्व की पहचान करने के लिए, मन में निम्नलिखित जानकारी के साथ चित्रा 3 बी में दिखाया गया है घनत्व श्रृंखला के लिए 96 अच्छी तरह से थाली तुलना करें:
    1. पारित होने कालोनियों के बहुमत के बीच की जगह आसन्न कॉलोनी व्यास का लगभग 25% है।
      नोट: औचित्य पारित होने के लिए समय की पहचान के लिए भोजन और विकास का एक और चक्र से बचा जाना चाहिए जो संपर्क बनाने कालोनियों में परिणाम होगा।
  16. एक समान रूप से पतला प्लेट शुरू करते हैं और नियमित रूप से संस्कृति शुरू करने के लिए, आदर्श घनत्व और बीतने पर है कि एक स्तंभ का चयन करें। पारित होने के लिए प्रोटोकॉल 5 देखें।

4. दूध पिलाने की 96 अच्छी तरह से थाली स्टेम सेल कालोनियों

नोट: निम्न प्रोटोकॉल एक 96 अच्छी तरह से स्टेम सेल कॉलोनी थाली को खिलाने का वर्णन है। तकनीक समानांतर में 6 कुल प्लेटों को समायोजित करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।

  1. 96 अच्छी तरह से है दूर37 डिग्री सेल्सियस से मंदिर सेल कॉलोनी थाली, 5% सीओ 2, humidified इनक्यूबेटर।
  2. प्रदूषण और सेल घनत्व के लिए थाली की जाँच करें। खिलाने के लिए आदेश में, कॉलोनी घनत्व आदर्श बीतने के घनत्व के नीचे है कि सुनिश्चित करते हैं। घनत्व के बारे में जानकारी के लिए 3B चित्रा देखें।
    नोट: संदूषण के रूप पंकिल मीडिया उपस्थित हो सकता है और एक अप्रिय गंध के साथ किया। लघु, स्पष्ट रूप से गैर-IPSC समुच्चय भी सूक्ष्म निरीक्षण के तहत दिखाई जा सकती है। सेल घनत्व का मूल्यांकन करने के लिए, ऊपर चरण 3.16.1 देखें।
  3. एक sloped, 37 डिग्री सेल्सियस रैंप पर बिस्तर स्थिति 3 में 96 अच्छी तरह से स्टेम सेल कॉलोनी प्लेट रखें।
  4. आर टी 200 μl pipet सुझावों के साथ बिस्तर स्थिति 1 में टिप रैक लोड स्तंभ 12।
  5. बिस्तर स्थिति 2 में एक 4 अच्छी तरह से गर्त रखें।
  6. बाँझ डालना या pipet का हस्तांतरण द्वारा या तो Y27632 बिना 2 से 8 के साथ मिलीलीटर ताजा बिस्तर स्थिति, आरटी SCGM में गर्त की अच्छी तरह से 3 भरें।
  7. PLHR में रखकर 96 अच्छी तरह से स्टेम सेल कॉलोनी थाली ढक्कन निकालें।
  8. का प्रयोगरोबोट नियंत्रण स्पर्श पैड, बटन के निम्नलिखित संयोजन दबाएँ:
    1. "एक प्रोटोकॉल भागो" टैप करें।
    2. "कालोनी एक थाली फ़ीड" और अगले नल का चयन करें।
    3. उपयोगकर्ता का निर्णय: चयनित कार्यक्रम पूर्व परीक्षण करने के लिए कदम-दर-कदम विज़ार्ड का उपयोग करने के लिए "परीक्षण रन" टैप करें।
      ध्यान दें, रोबोट भाग नहीं करता है बल्कि सॉफ्टवेयर सॉफ्टवेयर की समस्याओं के लिए प्रोटोकॉल का परीक्षण करती है। "सेटअप छोड़" दोहन स्थापित प्रोटोकॉल, साथ स्वीकार्य है।
    4. "भागो प्रोटोकॉल" टैप करें।
  9. खिला प्रोटोकॉल पूर्ण होने पर, 96 अच्छी तरह से स्टेम सेल कॉलोनी प्लेट फिर से कवर किया और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए लौटने के लिए, 5% सीओ 2, अगले खिला या पारित होने तक humidified इनक्यूबेटर की आवश्यकता है। यह आमतौर पर 24 घंटे के बाद आवश्यक है।
    नोट: यह तिथि, मीडिया प्रकार, उपयोगकर्ता नाम और अन्य प्रासंगिक जानकारी के साथ थाली कवर पर खिला घटना को दर्ज करने के लिए सिफारिश की है।

5. Passaging 96 अच्छी तरह पी एलसेल कालोनियों स्टेम खाया

  1. कई खिला चक्रों के बाद 96 अच्छी तरह से स्टेम सेल कॉलोनी थाली पारित होने के लिए तैयार हो जाएगा। इस प्रोटोकॉल एक 01:12 विभाजन अनुपात का प्रतिनिधित्व करने, एक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए एक स्तंभ के पारित होने का वर्णन करता है। उपयोगकर्ता विभाजन के अनुपात को परिभाषित करने और आसन्न नहीं हो सकता है कि कुओं को चुनने सहित विभाजित करने के लिए कुओं या स्तंभों के किसी भी संख्या का चयन कर सकते हैं।
  2. चाहे पारित होने के लिए निर्धारित करने के लिए 3 बी चित्रा के लिए 96 अच्छी तरह से स्टेम सेल कॉलोनी थाली घनत्व की तुलना करें। कालोनियों के बहुमत के बीच की जगह आसन्न कॉलोनी व्यास का लगभग 25% है या बाद में एक खिला एक दूसरे में बढ़ रही कालोनियों में नतीजा होगा जब आदर्श बीतने के घनत्व है।
  3. कोई संदूषण नहीं है सुनिश्चित करने के लिए एक खुर्दबीन के नीचे 96 अच्छी तरह से स्टेम सेल कॉलोनी प्लेट की जांच करना।
  4. एक sloped, 37 डिग्री सेल्सियस रैंप पर बिस्तर स्थिति 3 में 96 अच्छी तरह से स्टेम सेल कॉलोनी प्लेट रखें।
  5. आर टी 200 μl pipet के साथ बिस्तर स्थिति 1 में टिप लोड हो रहा है रैक में लोड कॉलम 8-12सुझाव।
  6. बिस्तर स्थिति 2 में एक 4 अच्छी तरह से गर्त रखें।
  7. खाली गर्त में अच्छी तरह से 1 छोड़ दो, अच्छी तरह से 2 में 8.5 मिलीलीटर SCGM + 10 माइक्रोन Y27632 डाल अच्छी तरह से 3 में 3.5 मिलीग्राम 30% प्रोटियोलिटिक और collagenolytic हदबंदी अभिकर्मक (या EDTA आधारित हदबंदी अभिकर्मक) रखा है, अच्छी तरह से 4 में 4.5 मिलीलीटर पीबीएस डाल दिया।
    नोट: सभी अभिकर्मकों आर टी या 37 डिग्री सेल्सियस हो सकता है। पीबीएस के साथ पतला 30% पर आरटी प्रोटियोलिटिक और collagenolytic हदबंदी अभिकर्मक वसा के लिए इस्तेमाल किया गया था और fibroblast IPSC संस्कृति यहाँ वर्णित निकाली गई।
  8. बिस्तर स्थिति 5 में एक नया, पूर्व गर्म 37 डिग्री सेल्सियस बाह्य मैट्रिक्स जेल लेपित 96 अच्छी तरह से थाली रखें।
  9. 96 अच्छी तरह से स्टेम सेल कॉलोनी थाली ढक्कन, साथ ही नए 96 अच्छी तरह से थाली ढक्कन निकालें और PLHR में उन दोनों की जगह है।
  10. रोबोट नियंत्रण स्पर्श पैड का उपयोग करना, बटन के निम्नलिखित संयोजन दबाएँ:
    1. "एक प्रोटोकॉल भागो" टैप करें।
    2. "कालोनी स्प्लिट 01:12 कॉलम 1" का चयन करें और अगले टैप करें।
    3. उपयोगकर्ता का निर्णय: नल "परीक्षण चलाने" का उपयोग करने के लिएकदम-दर-कदम विज़ार्ड चयनित कार्यक्रम पूर्व परीक्षण करने के लिए।
      नोट: रोबोट भाग नहीं करता है बल्कि सॉफ्टवेयर सॉफ्टवेयर की समस्याओं के लिए प्रोटोकॉल का परीक्षण करती है। "सेटअप छोड़" दोहन स्थापित प्रोटोकॉल, साथ स्वीकार्य है।
    4. "भागो प्रोटोकॉल" टैप करें।
  11. बीतने प्रोटोकॉल समाप्त हो जाने के बाद, दोनों प्लेटों फिर से कवर किया।
  12. वैकल्पिक: अपेक्षित जानकारी के साथ नई प्लेट लेबल (यानी, तिथि, सेल लाइन, बीतने संख्या, मीडिया प्रकार, उपयोगकर्ता नाम आदि)।
  13. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए दोनों प्लेटें लौटें, 5% सीओ 2, अगले खिला या पारित होने तक humidified इनक्यूबेटर की आवश्यकता है। नोट: अगले खिला 24 घंटे के बाद आमतौर पर है।
    नोट: सेल और कालोनियों बंटवारे के 2-3 घंटे के भीतर थाली करने के लिए देते हैं और बहुत से बाहर फैल दिखना चाहिए। यह रो-kinase अवरोध की मौजूदगी की वजह से है और कोशिकाओं (यानी, पत्थर पैक कालोनियों वाई विशेषता स्टेम सेल आकृति विज्ञान गाढ़ा और प्रदर्शन करेंगेपहले रो-kinase अवरोध मुक्त खिलाने के बाद बड़ा नाभिक अनुपात करने के लिए छोटे सेल मात्रा) वें।

उत्पादन के लिए 6. फसल काटने वाले 96 अच्छी तरह से थाली स्टेम सेल

नोट: सेल कालोनियों संस्कृति के दौरान किसी भी बिंदु पर उपयोग के लिए काटा जा सकता है स्टेम। कोशिकाओं को पारित करने के लिए तैयार कर रहे हैं आमतौर पर जब ऐसा होता है (प्रोटोकॉल 5 देखें)। इस प्रोटोकॉल एक 96 अच्छी तरह से स्टेम सेल कॉलोनी थाली से ग्यारह कॉलम फसल के लिए कैसे करें।

  1. कोई संदूषण नहीं है सुनिश्चित करने के लिए एक खुर्दबीन के नीचे 96 अच्छी तरह से स्टेम सेल कॉलोनी प्लेट की जांच करना।
  2. एक sloped, 37 डिग्री सेल्सियस रैंप पर बिस्तर स्थिति 3 में 96 अच्छी तरह से स्टेम सेल कॉलोनी प्लेट रखें।
  3. लोड कॉलम आरटी 200 μl pipet सुझावों के साथ बिस्तर स्थिति 1 में टिप लोड हो रहा है रैक में 11 और 12।
  4. बिस्तर स्थिति 2 में एक 4 अच्छी तरह से गर्त रखें।
  5. छोड़ दो गर्त में अच्छी तरह से 1 खाली, अच्छी तरह से 2 में 8.5 मिलीलीटर SCGM डाल डाल 3.5 मिलीग्राम 30% प्रोटियोलिटिक और collagenolytic हदबंदी अभिकर्मक (या EDTA आधारित हदबंदी अभिकर्मक) कुएं में3, अच्छी तरह से 4 में 4.5 मिलीलीटर पीबीएस डाल दिया।
    नोट: सभी अभिकर्मकों आर टी या 37 डिग्री सेल्सियस हो सकता है।
  6. PLHR में 96 अच्छी तरह से स्टेम सेल कॉलोनी थाली ढक्कन और जगह निकालें।
  7. रोबोट नियंत्रण स्पर्श पैड का उपयोग करना, बटन के निम्नलिखित संयोजन दबाएँ:
    1. "एक प्रोटोकॉल भागो" टैप करें।
    2. "कालोनी हार्वेस्ट कॉलम 2-12" का चयन करें और अगले टैप करें।
    3. उपयोगकर्ता का निर्णय: चयनित कार्यक्रम पूर्व परीक्षण करने के लिए कदम-दर-कदम विज़ार्ड का उपयोग करने के लिए "परीक्षण रन" टैप करें।
      नोट: रोबोट भाग नहीं करता है बल्कि सॉफ्टवेयर सॉफ्टवेयर की समस्याओं के लिए प्रोटोकॉल का परीक्षण करती है। "सेटअप छोड़" दोहन स्थापित प्रोटोकॉल, साथ स्वीकार्य है।
    4. "भागो प्रोटोकॉल" टैप करें।
      नोट: संग्रह की प्रक्रिया पूरी हो जाने के बाद, कोशिकाओं को गर्त में अच्छी तरह से 2 में हो सकता है और संग्रह के लिए तैयार हो जाएगा।

Representative Results

एक प्लेट आधारित रोबोट स्टेम सेल संस्कृति मंच का विकास।

IPSCs के लिए मांग के कारण दवा के विकास और पुनर्योजी चिकित्सा के क्षेत्र में उनकी उपयोगिता के लिए बढ़ रहा है। फिर भी स्केलेबल उत्पादन कई शोधकर्ताओं शामिल नहीं है और स्थापित पक्षपाती संस्कृति तरीकों से diverges कि अपेक्षाकृत जटिल उपकरणों में निलंबन संस्कृति 32 पर ध्यान केंद्रित किया है। बल्कि तेजी से इस तरह के एक निलंबन संस्कृति के लिए स्विचन या एक microcarrier का उपयोग कर के रूप में साबित थाली आधारित स्टेम सेल संस्कृति के तरीकों को बदलने के बजाय, हम miniaturizing और हमारे मौजूदा पक्षपाती IPSC कल्चर तकनीक स्वचालित पर ध्यान केंद्रित किया। पहला उद्देश्य खिलाने और पूरी संस्कृति प्रक्रिया को सामान्य करने के passaging स्वचालित करने के लिए किया गया था। मौजूदा प्रौद्योगिकी के साथ तेजी पैमाने अप करने में सक्षम एक मंच भी आवश्यक था। एक स्वचालित तरल हैंडलिंग प्रणाली (चित्रा 1) का उपयोग एक 96 अच्छी तरह से थाली में एक विधि संस्कृति स्टेम कोशिकाओं के लिए तैयार किया गया था कि इन लक्ष्यों को प्राप्त करने के लिए। protभोजन और पारित होने के लिए तरल से निपटने रोबोट के साथ यहाँ विकसित ocols एक तकनीशियन द्वारा एक centrifugation कदम या सतत निगरानी की आवश्यकता नहीं है। इन प्रोटोकॉल दो फीडर मुक्त IPSC लाइनों के साथ विकसित किए गए; fibroblasts से ली गई एक और वसा कोशिकाओं को 33 से अन्य।

कंप्यूटर नियंत्रित तरल हैंडलिंग प्रणाली (चित्रा 1 ए) के आगे और पीछे चलता है कि एक flatbed के होते हैं। बिस्तर मानक सेल संस्कृति प्लेटों, तरल जलाशयों और अन्य कस्टम हार्डवेयर को स्वीकार करने के लिए क्लिप बनाए रखने के दबाव के साथ नौ, लगभग 5 x 3.3 इंच गिने recesses है। सही करने के लिए (बिस्तर आंदोलन को सीधा) के रूप में अच्छी तरह के रूप में ऊपर और नीचे छोड़ दिया pipet का सिर चलता रहता है। साथ में बिस्तर के साथ, पिपेट सिर को हटाने या एक refillable रैक से पिपेट सुझावों उठा के बाद कहीं भी बिस्तर पर मीडिया को वितरित करने के लिए प्रोग्राम किया जा सकता है। यदि आवश्यक हो, 96 कुओं में से प्रत्येक पार संक्रमण को खत्म करने के लिए अलग रखा जा सकता है। वर्तमान विन्यास में, 0 करने के लिएमीडिया के 200 μl pipet का सिर के प्रत्येक टिप से ले जाया जा सकता है, लेकिन अन्य मात्रा पर्वतमाला टिप आकार के आधार पर संभव हो रहे हैं।

मानक प्लेटें, एंजाइमी या रासायनिक हदबंदी में स्टेम कोशिकाओं passaging जब आम तौर पर 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन की आवश्यकता है। प्रारंभिक परीक्षण एक प्रोटियोलिटिक और collagenolytic हदबंदी अभिकर्मक या हमारे दो 96 अच्छी तरह से IPSC लाइनों के लिए उत्पादित कॉलोनी आकार की हदबंदी और एकरूपता के लिए समय के लिए आरटी दोनों की तुलना में 37 डिग्री सेल्सियस पर बेहतर प्रदर्शन एक EDTA के आधार पर अभिकर्मक के साथ हदबंदी की पुष्टि की (डेटा) नहीं दिखाया। विभाजन की प्रक्रिया को स्वचालित और में और स्वीकार करते हैं कि एक मशीन, sloped, तापमान नियंत्रित रैंप से बाहर प्लेटें चलती से बचने और reproducibly मानक संस्कृति प्लेट (चित्रा 1 ए) का निर्माण किया गया की स्थिति है। रैंप 37 डिग्री सेल्सियस, एक प्रोटियोलिटिक और collagenolytic हदबंदी अभिकर्मक या 96 अच्छी तरह से प्लेटों से IPSCs की EDTA के आधार पर हदबंदी को गरम थे जब एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर (डेटा n में रखा प्लेटों के बराबर थाओटी) दिखाया गया है। sloped रैंप भी है, जिसके परिणामस्वरूप लगभग 10-15 μl के अवशिष्ट मात्रा छोड़ दिया है एक फ्लैट प्लेट से आकांक्षा जबकि साथ में निम्नतम बिंदु तक पहुँचने के द्वारा एक पूरे अच्छी तरह की सामग्री (कम से कम 5 उल अवशिष्ट मात्रा) इकट्ठा करने के लिए pipet सुझावों को सक्षम करने के लिए उपयोग किया गया सेल नुकसान में। sloped रैंप भी कुओं धोया (triturated) अच्छी तरह से sloped के शीर्ष पर मीडिया बाहर खदेड़ना से और नीचे में यह एकत्र करने के लिए किया जा करने की अनुमति दी।

96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में स्टेम कोशिकाओं के रोबोट संस्कृति; भोजन और passaging की।

रोबोट तरल हैंडलिंग प्रणाली का उपयोग करते हुए IPSCs की संस्कृति को दो चरणों है; पारित होने और खिला। एक कॉलोनी पारित होने के लिए तैयार है, इसे फिर से पारित होने के लिए तैयार है (चित्रा 1 बी) तब तक नियमित अंतराल पर खिलाया जाता है, जो एक नई प्लेट बीज के लिए एक पूर्व निर्धारित अनुपात में विभाजित है। जमे हुए या गैर 96 अच्छी तरह से संस्कृतियों 96 अच्छी तरह प्रारूप में शुरू किया और तुरंत बीतने / फ़ीड में प्रवेश किया जा सकता हैचक्र। एक प्लेट का बहुमत है जो कॉलोनी, बनाए रखने के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं कि सेल, अन्य उपयोगों के लिए काटा जाता है और इस प्रणाली के उत्पादन घटक का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं।

मीडिया के कुछ या सभी संस्कृति की अवधि के बाद हटा दिया है और बर्बादी जलाशय में जमा किया जाता है जब 96 अच्छी तरह से सुसंस्कृत IPSCs दूध पिलाने पूरा किया है। तो फिर नए सिरे से मीडिया में एक ही थाली के लिए aliquoted है। रोबोट नए मीडिया के साथ वातानुकूलित मीडिया सम्मिश्रण सहित पूरी तरह से अनुकूलन खिला, के लिए अच्छी तरह से हर अलग करने के लिए नए सुझावों और मीडिया troughs के उपयोग कर सकते हैं।

स्टेम कोशिकाओं की विशिष्ट बीतने हदबंदी और अक्सर एक centrifugation कदम की एक विधि की आवश्यकता है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल हदबंदी मानक के अनुसार और centrifugation को खत्म करना है। रोबोट 37 डिग्री सेल्सियस sloped रैंप पर मुहिम शुरू की 96 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए हदबंदी अभिकर्मक बचाता है जब बीतने प्रोटोकॉल शुरू होता है। एक पूर्व निर्धारित समय के बाद, अलग कोशिकाओं उपयोगकर्ता विवाद है, जहां एक कपड़े धोने की कार्रवाई के साथ एकत्र कर रहे हैंस्थिति, पुनरावृत्ति, मात्रा और विचूर्णन दर पर एल। एनजाइम समय, विचूर्णन दर और विचूर्णन repetitions की संख्या अलग कॉलोनी आकार और एकरूपता (चित्रा 2) भिन्न करने के लिए पर्याप्त थे, लेकिन प्रत्येक पैरामीटर एक दिया सेल लाइन की आवश्यकताओं को फिट करने के लिए समायोज्य है। इस पर नियंत्रण के अलग-अलग दरें, स्थिति, और repetitions के साथ pipet जो तकनीशियनों द्वारा शुरू की परिवर्तनशीलता को हटा। अलग कोशिकाओं एकत्र की है और ताजा मीडिया के साथ एक जलाशय में जमा कर रहे हैं, वे एक नया थाली करने के लिए वितरित कर रहे हैं। सब्सट्रेट गिरावट या कार्रवाई एंजाइम की वजह से कोशिका मृत्यु से centrifugation और बोने की समस्याओं से बचने के लिए, हदबंदी अभिकर्मक विश्वसनीय बोने के परिणामस्वरूप स्वीकार्य हदबंदी की न्यूनतम बात करने के लिए पतला था। इस तकनीक को आवश्यक -8 35 की तरह भी कम प्रोटीन मीडिया में प्रभावी एक अपेक्षाकृत उच्च प्रोटीन होता है जो mTeSR1 मध्यम 34 में एक प्रोटियोलिटिक और collagenolytic हदबंदी अभिकर्मक, के लिए प्रभावी था, लेकिन

पारित होने के बाद स्टेम कोशिकाओं के बोने के घनत्व को नियंत्रित करने दिनचर्या और सफल स्टेम सेल संस्कृति के लिए सर्वोपरि है। बहुत कम है या उच्च सीडिंग अस्थानिक भेदभाव और अनियमित बीतने के अंतराल पैदा करने के अलावा pluripotency के नुकसान में परिणाम कर सकते हैं। (: 6 विभाजन एक 1) 6 अच्छी तरह से थाली में से एक अच्छी तरह से एक पूरे नए 6 अच्छी तरह से थाली बीज के लिए प्रयोग किया जाता है, जहां विशिष्ट स्टेम सेल संस्कृति अनुपात बंटवारे पर निर्भर करता है। तरल से निपटने रोबोट के साथ इस अनुपात उपयोगकर्ता की जरूरतों के अनुरूप समायोजित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, 1: 6, 1: 9, 01:12, आदि) और इसे पारित होने के अंतराल पर सबसे अधिक प्रभाव है। रोबोट अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए, जो उपयोगकर्ता की जरूरतों के आधार पर कम से कम एक स्तंभ, एक संपूर्ण स्तंभ (8 कुओं), या एक से अधिक स्तंभ फसल कर सकते हैं। 01:12 विभाजित जब वसा और fibroblast व्युत्पन्न IPSCs चौथे दिन बीतने के साथ एक नियमित रूप से तीन दिन भोजन कार्यक्रम बनाए रखा। इस मामले में एक स्तंभ काटा जाता है और प्रत्येक चक्र (चित्रा 3) के साथ एक 1:12 विभाजन पैदा कर रही है, एक नया 96 अच्छी तरह से थाली बीज के लिए इस्तेमाल किया गया था। शेष 11 कुओं बहाव के अनुप्रयोगों के लिए तो उपलब्ध थे। इन 11 उत्पादन कुओं फसल के लिए, पारित होने प्रोटोकॉल कोशिकाओं के संग्रह के लिए एक गर्त में जमा थे सिवाय दोहराया गया था। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं की थाली पर छोड़ा जा सकता है और सीधे इस्तेमाल किया।

एक नियमित बंटवारे अनुसूची गिनती के बिना पारित होने के लिए लगातार बोने घनत्व बीतने को प्राप्त है, और बनाए रखने के लिए, हमारे प्रोटोकॉल कॉलोनी पारित होने के लिए एक आदर्श घनत्व पर जब स्तंभों में से एक ही पूर्व निर्धारित संख्या में बंटवारे के लिए कहते हैं। उपयोगकर्ताओं को पारित होने के लिए उचित घनत्व की पहचान में मदद करने के लिए, छवियों की एक श्रृंखला पर प्रकाश डाला एक आदर्श बीतने के घनत्व (3B चित्रा) के साथ घनत्व की एक श्रृंखला दिखा उत्पन्न किया गया। पारित होने के लिए, एक तकनीशियन उनकी थाली की जाँच और घनत्व छवि पैमाने पर करने के लिए यह तुलना जब निर्धारित करने के लिए। विचारपारित होने के लिए एल घनत्व वसा और fibroblast व्युत्पन्न IPSCs की संस्कृति से निर्धारित होता है और सबसे अधिक कालोनियों के बीच अंतरिक्ष आसन्न कॉलोनी व्यास का लगभग 25% था जब हो पाया था। यह कालोनियों homogenously वितरित किया है कि महत्वपूर्ण है। एक अतिरिक्त खिला चक्र अस्थानिक भेदभाव के लिए एक ट्रिगर है, जो छू कालोनियों में नतीजा होगा क्योंकि कॉलोनी जुदाई की यह राशि अधिकतम वांछनीय घनत्व के साथ संबद्ध करता है।

यहाँ विकसित एक आवश्यक प्रोटोकॉल 96 अच्छी तरह प्रारूप में एक संस्कृति शुरू करने और कैसे एक घनत्व समस्या के बाद एक संस्कृति पुनर्स्थापित करने के लिए कैसे करें के पते। एक नई संस्कृति शुरू कर दिया गया है, जब passaging के पहले सबसे अच्छा बोने घनत्व और खिला चक्रों की संख्या अज्ञात है। बोने के बाद एक उपयोगी घनत्व सुनिश्चित करने के लिए रोबोट एक सीरियल कमजोर पड़ने (चित्रा -4 ए) में एक 96 अच्छी तरह से थाली भर में मौजूदा या thawed कोशिकाओं वितरित करता है। इस तरह के एक ढाल का उदाहरण परिणाम चित्रा 4 बी-ई में दिखाए जाते हैं। कई खिलाने के बादचक्र, कुछ स्तंभों एक तकनीशियन नियमित संस्कृति शुरू करने के लिए एक समान रूप से पतला प्लेट बीज के लिए रोबोट का उपयोग करता है, जो बिंदु पर विभाजित करने के लिए आदर्श घनत्व, दृष्टिकोण। इस घनत्व ढाल प्रोटोकॉल भी एक अनियमित थाली करने के लिए नियमित रूप से पारित होने के अंतराल और कॉलोनी एकरूपता बहाल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। पारित होने में देरी या चूक जाता है तो पारित होने के लिए बहुत जल्दी है, तो कॉलोनी घनत्व बहुत कम है और अलग-अलग कालोनियों में समान रूप से अच्छी तरह से भर में वितरित किया जा रहा बिना बहुत बड़ा हो सकता है, जबकि कॉलोनी घनत्व और आकार, बहुत अधिक हो गया है। घनत्व ढाल प्रोटोकॉल इन मुद्दों को हल करने और उपयोगकर्ता कुओं का एक आदर्श वरीयता प्राप्त सेट उठा द्वारा पुनः आरंभ करने की अनुमति देता है।

दो IPSC लाइनों रोबोट संस्कृति के 3 महीने के बाद pluripotent बने रहे।

स्टेम सेल pluripotency के रखरखाव पर प्रतिकूल संस्कृति की स्थिति 36,37 से प्रभावित हो सकते हैं। वसा और fibroblast IPSC लाइनें (क्रमशः एक-IPSC, एफ-IPSC,) plurip बनाए रखा ली गई है कि क्या मूल्यांकन करने के लिएotency, दो पंक्तियों के 3 महीने के लिए ऊपर वर्णित है और फिर pluripotency मार्कर जांच की गई के रूप में रोबोट से निपटने तरल पर सुसंस्कृत थे जब रोबोट समय की एक विस्तारित अवधि के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेट में सुसंस्कृत। इस अवधि के लिए दोनों लाइनों centrifugation के बिना एक प्रोटियोलिटिक और collagenolytic हदबंदी अभिकर्मक के साथ अधिक से अधिक से अधिक 20 बार passaged गया। SSEA-4 कोशिका की सतह (चित्रा 5 ए-एल) पर मनाया गया, जबकि Oct4 और Nanog के लिए दाग एक-IPSC और F-IPSC लाइनों से तय 96 अच्छी तरह प्लेटें इन मार्करों के परमाणु संचय का प्रदर्शन किया। 41 - इस pluripotent IPSCs 38 के लिए पिछली रिपोर्टों के अनुरूप है। DAPI के साथ counterstaining भी तीन pluripotency मार्करों के लिए सकारात्मक नहीं थे कि किसी भी अतिरिक्त कोशिकाओं का खुलासा नहीं किया। गुणसूत्र असामान्यताओं आमतौर पर स्टेम सेल संस्कृति 42,43 के दौरान मनाया जाता है, लेकिन यह आंकड़ा 5 ए-एल में दिखाया गया है उन लोगों की तरह pluripotency मार्करों के वितरण को प्रभावित नहीं कर सकते हैं। कश्मीरaryotype विश्लेषण दोनों रोबोट passaged IPSC लाइनों रोबोट संस्कृति विधि सामान्य रूप से (चित्रा 5M-एन) उत्पन्न हो सकती है क्या परे गुणसूत्र अस्थिरता का परिचय नहीं दिया, सुझाव 46 सामान्य गुणसूत्रों था पता चला।

स्थापित स्टेम सेल जीन अभिव्यक्ति रोबोट सुसंस्कृत IPSC लाइनों में 1,41,44,45 मार्करों की जांच करने के लिए, कुल शाही सेना धुंधला करने के लिए समानांतर और कुपोषण विश्लेषण में एकत्र किया गया था। दोनों 96 अच्छी तरह से थाली IPSC पंक्तियाँ एक लाइन से अलग cardiomyocytes नहीं किया था जबकि pluripotency मार्करों NANOG, POU5F1 और REX1 के समान अभिव्यक्ति था, और न ही (HDFs) (चित्रा 6) मानव त्वचीय fibroblasts की एक अलग लाइन किया था। दोनों लाइनों से व्युत्पन्न cardiomyocytes MYL7 HDFs जबकि सकारात्मक थे और स्टेम कोशिकाओं MYL7 व्यक्त नहीं किया। दोनों IPSC लाइनों छोटे अणु के साथ cardiomyocytes में भेदभाव कर रहे थे, Wnt मार्ग हेरफेर तकनीक 46 हाल ही में वर्णित (चित्रा 7) के साथ सकारात्मक थे। 96 अच्छी तरह प्रारूप में cardiomyocytes में भेदभाव कुओं का अधिक से अधिक से अधिक 80% में सफल रहा था (डेटा) नहीं दिखाया। साथ में, इन आंकड़ों 3 महीने और रोबोट संस्कृति के 20 से अधिक मार्ग cardiomyocytes में भी भेदभाव करने में सक्षम थे कि pluripotency के साथ सुसंगत प्रतिलेखन कार्यक्रम का प्रदर्शन chromosomally सामान्य कोशिकाओं में हुई सुझाव देते हैं।

चित्र 1
चित्रा रोबोट स्टेम सेल संस्कृति उपकरण और ठेठ IPSC संस्कृति दिनचर्या का 1. अवलोकन। लिए विशिष्ट बिस्तर लेआउट के साथ दिखाया गया है (ए) रोबोट तरल हैंडलिंग प्रणाली 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति स्टेम। नई बाँझ pipet सुझावों (टिप्स), हटाने योग्य टिप बर्बाद कंटेनर (अपशिष्ट), बहु अच्छी तरह से autoclavable गर्त आवश्यक धारण करने के लिए तरल अभिकर्मकों (तरल पदार्थ), 96 अच्छी तरह प्लेटें तैनात कर रहे हैं एक डी नियंत्रित तापमान पर समर्थित, sloped रैंप (96 अच्छी तरह से प्लेट), सही / छोड़ दिया और ऊपर / नीचे (Pipet सिर) चलता है कि 8 चैनल रोबोट pipet का सिर। थाली ढक्कन पकड़े रैक (PLHR)। तालिका में नीचे दिखाया गया बिस्तर स्थिति संख्या। दूध पिलाने की और मार्ग: (बी) रोबोट IPSC संस्कृति को दो चरणों है। एक कॉलोनी थाली पारित होने के लिए तैयार है जब कोशिका के उत्पादन के चक्र शुरू होता है। उपयोगकर्ता पर पारित होने के लिए वांछित अनुपात चुनता है और रोबोट के बीज 96 अच्छी तरह से प्लेटों के एक नए समूह तो फिर से पारित होने के लिए तैयार है जब तक नियमित अंतराल पर खिलाया। प्लेटों पारित होने के लिए तैयार हैं, प्रत्येक थाली में से ज्यादातर के बाद कॉलोनी प्लेटों बीज के लिए नहीं किया जाता है और इस प्रकार प्रणाली के उत्पादन के चरण का प्रतिनिधित्व करने, अन्य उपयोगों के लिए उपलब्ध है। जमे हुए या मौजूदा सेल लाइनों किसी भी समय शुरू की है और फ़ीड / बीतने के चक्र में बनाए रखा जा सकता है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

हमेशा ">:" रख-together.within-पेज = के लिए "e_content चित्र 2
चित्रा 2। रोबोट तरल से निपटने मापदंडों IPSC कॉलोनी हदबंदी विशेषताओं को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रत्येक प्रतिनिधि छवि अभी भी 96 अच्छी तरह से में निलंबित कर दिया है, जबकि तंतुप्रसू व्युत्पन्न IPSCs संकेत उपचार के बाद अलग से पता चलता है। (शीर्ष पंक्ति, एक - सी) एंजाइम बार, कोई विचूर्णन। 96 अच्छी तरह से प्लेट में उगाई तंतुकोशिका व्युत्पन्न IPSCs प्रदर्शन किया गया था प्रोटियोलिटिक और collagenolytic हदबंदी अभिकर्मक हदबंदी और कोई रोबोट विचूर्णन के समय में वृद्धि के लिए किए गए थे। (मध्य पंक्ति, डी - एफ) Trituration दर, 3 मिनट एंजाइम। प्रकोष्ठों प्रोटियोलिटिक और collagenolytic हदबंदी अभिकर्मक उपचार के तीन मिनट के लिए खुल गए थे और उसके बाद 175 μl विकास मीडिया लागू किया गया था और प्रत्येक अच्छी तरह से संकेत दर पर ऊपर और नीचे एक बार pipetted। μl / सेक = microliters के पीएर दूसरा। (नीचे पंक्ति, जी - मैं) Trituration repetitions, 3 मिनट एंजाइम, 160 μl / सेक। कोशिकाओं 3 मिनट के लिए प्रोटियोलिटिक और collagenolytic हदबंदी अभिकर्मक से अवगत कराया गया, 175 μl विकास मीडिया तो 160 μl / repetitions के संकेत दिया संख्या के लिए सेकंड में triturated, लागू किया गया था। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
पारित होने के एक नियमित रूप से खिला / बीतने के चक्र को बनाए रखने के लिए जब चित्रा 3. ठेठ वसा और fibroblast IPSC कॉलोनी रखरखाव योजना और कॉलोनी घनत्व छवियों की एक श्रृंखला का निर्धारण करने के लिए। (ए) के एक वसा या पारित होने के लिए तंतुप्रसू 96 अच्छी तरह से IPSC कॉलोनी तैयार की शुरुआत के साथ, कोशिकाओं के एक स्तंभ centrifugation के बिना रोबोट पर passaged और पतला थाथाली फिर से पारित होने के लिए तैयार किया गया था, जब तक उसके बाद विशिष्ट अंतराल पर खिलाया गया, जो करने के लिए 12 नए स्तंभ। कोशिका के उत्पादन के लिए, कॉलोनी को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल नहीं कॉलम passaged गया और बाद में उपयोग करने के लिए एकत्र की। स्तंभों की संख्या में कोई विस्तार की दर को नियंत्रित करने के passaged किया जा सकता है। पारित होने के लिए, घनत्व छवियों की एक श्रृंखला हर 24 घंटा उपयोगकर्ताओं के लिए प्रदान किया गया था जब कब्जा (बी) का निर्धारण करने के लिए। शीर्ष लाल बॉक्स में (प्रारंभिक बोने के बाद 72 घंटे के भीतर) कॉलोनी पारित होने के लिए काफी घना नहीं है और खिलाया जाना चाहिए। घनत्व (~ 96 घंटा में) ग्रीन बॉक्स में दिखाया गया है कि मेल खाता है, कॉलोनी पारित होने के लिए एक आदर्श घनत्व पर है। 120 घंटा करके, कॉलोनी पारित होने के लिए बहुत घना है और इस परिदृश्य से बचा जाना चाहिए। उत्तरार्द्ध दृढ़ता से हतोत्साहित किया जाता है इस घनत्व में एक बोने घनत्व ढाल लेकिन दिनचर्या संस्कृति के साथ हल किया जा सकता है। सफेद पट्टी 200 माइक्रोन के बराबर होती है। एक बड़ा versi देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े के पर।

चित्रा 4
चित्रा 4। 96 अच्छी तरह से रोबोट संस्कृति प्रणाली उपयोगकर्ताओं जमे हुए या सक्रिय सेल लाइनों से संस्कृतियों शुरू करने और एक बोने ढाल प्रदर्शन करने की अनुमति देता है। (ए) एक सेल समाधान एक जमे हुए सेल स्टॉक से या एक सक्रिय संस्कृति कटाई के बाद उपयोगकर्ता द्वारा तैयार की और रख दिया गया है रोबोट पर। रोबोट प्रणाली तो स्तंभ द्वारा वितरित घनत्व ढाल के साथ 96 अच्छी तरह से थाली के साथ प्रारंभिक सेल समाधान वितरित करने के लिए एक धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रोटोकॉल करता है। (बी - ई) एक से बारह स्तंभों में से चार से सेल घनत्व के उदाहरण हैं, घनत्व ढाल बोने प्रोटोकॉल के बाद 48 घंटा। सफेद लाइनें 225 माइक्रोन बराबर होता है। इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंआंकड़ा।

चित्रा 5
। चित्रा 5. pluripotency 22 (वसा) या 23 (तंतुप्रसू) मार्ग (~ 3 महीने) के लिए 96 अच्छी तरह से रोबोट संस्कृति के दौरान वसा और IPSC लाइनों व्युत्पन्न तंतुप्रसू के लिए बनाए रखा है (ए - एल) वसा और fibroblast व्युत्पन्न IPSC सेल लाइनों रोबोट थे फेड और passaged तो तय हो गई और DAPI counterstain साथ pluripotency मार्करों Oct4, Nanog, या Ssea4 के लिए दाग 22 या 23 मार्ग के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेट में centrifugation बिना पाठ में वर्णित है। सफेद पट्टी 100 माइक्रोन के बराबर होती है। (एम - एन)। ए में वर्णित उन 46 गुणसूत्रों का एक सामान्य पूरक का पता चला है, जो कुपोषण के विश्लेषण के लिए प्रस्तुत किया गया के समांतर संस्कृतियों एक बड़ा संस्करण ओ देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा च।

चित्रा 6
चित्रा 6 वसा (96-ए) और fibroblast (96-एफ) व्युत्पन्न IPSCs pluripotency जीन अभिव्यक्ति बनाए रखा 96 अच्छी तरह से रोबोट प्रारूप में 20 से अधिक मार्ग के लिए सभ्य और cardiomyocytes में विभेदित। कुल mRNA के दोनों रोबोट सुसंस्कृत IPSC लाइनों से निकाला गया था cardiomyocytes दोनों लाइनों से भेदभाव करने के साथ ही, (मुख्यमंत्री-ए = वसा IPSC व्युत्पन्न cardiomyocytes, मुख्यमंत्री-एफ = तंतुप्रसू IPSC 14 दिनों भेदभाव प्रेरण के बाद एकत्र, cardiomyocytes व्युत्पन्न) और pluripotency मार्करों NANOG, POU5F1, REX1 की जांच के लिए आरटी पीसीआर के लिए इस्तेमाल किया cardiomyocyte मार्कर MYL7 और लदान नियंत्रण GAPDH। मानव त्वचीय fibroblasts (HDF) भी एकत्र की है और एक गैर IPSC, गैर cardiomyocyte नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। कृपया क्लिक करें यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्रा 7
। चित्रा 7. तंतुकोशिका और वसा व्युत्पन्न IPSCs अच्छी तरह से 96 दीर्घकालिक रोबोट संस्कृति के बाद cardiomyocytes में अंतर करने की क्षमता को बनाए रखा (ए - एच) वसा और fibroblast IPSCs cardiomyocytes में विभक्त किया गया है 20 से अधिक मार्ग के लिए 96 अच्छी तरह से रोबोट प्रारूप में सुसंस्कृत । 14 दिनों के भेदभाव प्रेरण के बाद, 96 अच्छी तरह से थाली बाध्य cardiomyocytes अलग थे और Troponin टी (लाल), एफ actin (हरा) और नाभिक (नीला) के immunostaining के लिए गिलास स्लाइड पर एक कम घनत्व पर replated। एक देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े का बड़ा संस्करण।

p_upload / 52,755 / 52755fig8.jpg "/>
चित्रा 8. 96 अच्छी तरह से थाली स्टेम सेल संस्कृति स्केलिंग। स्टेम कोशिका के उत्पादन के ऊपर स्केल प्लेटों के बाद समूह के बीज के लिए इस्तेमाल किया प्लेटों की संख्या पर निर्भर करता है। उपयोगकर्ता या तो प्रत्येक विभाजन अवसर पर प्लेटों की एक ही नंबर passaging से एक उत्पादन के स्तर को बनाए रखने या अधिक प्लेटों बोने से उत्पादन का विस्तार कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, साइकिल 0 में, एक 96 अच्छी तरह से थाली में एक 12 गुना विस्तार बनाने, बारह नई प्लेटों के लिए (साइकिल 1) passaged है। बारह प्लेटों में से एक बारह प्लेट (2 चक्र 1) का एक नया सेट करने के लिए passaged या एकाधिक प्लेट (3 चक्र 2) passaging से विस्तार किया है, तो यह दर को बनाए रखा जा सकता है। पारित होने के दौरान, कॉलोनी बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है न कि किसी प्लेटों बहाव के अनुप्रयोगों के लिए उपलब्ध हैं। इसलिए, नियमित तौर पर 12 प्लेटें passaging दो मार्ग में कई के रूप में 144 के रूप में प्लेटें उपज सकता है: कॉलोनी के रखरखाव के लिए 12 और 132 अन्य उपयोगों के लिए।"> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

9 चित्रा
सेल के उत्पादन के लिए 96 अच्छी तरह से थाली आधारित संस्कृति के 9 चित्रा क्षमता बहुत पुस्तिका खेती से अधिक है। चित्रा 8 में उल्लेखित है, एक थाली तो 144 प्लेटों के लिए passaged किया जा सकता है, जो बारह प्लेटें, बीज के लिए passaged किया जा सकता है। विस्तार की यह दर दो विभाजन के अवसरों में प्राप्त किया जा सकता है। एक तकनीशियन वे माइक्रोस्कोप पर यह जांच करने और रोबोट पर यह जगह करने के लिए एक 96 अच्छी तरह से थाली के साथ के बारे में 30 सेकंड खर्च जबकि एक 6 अच्छी तरह से थाली को खिलाने के लिए के बारे में 3.5 मिनट की आवश्यकता है। तकनीशियन 144 प्लेटें ले जा रहा है, तो वे खिलाने के लिए एक समर्पित 8 घण्टे की आवश्यकता होगी पुस्तिका संस्कृति जबकि रोबोट के साथ जब खिला। के बारे में 1.2 घंटे से निपटने प्लेटों खर्च करेगा वी करने के लिए यहाँ क्लिक करेंइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण iew।

Discussion

वर्तमान अध्ययन में हम miniaturizes और भी कुशल पैमाने को सक्षम करते हुए एक 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में खिलाने और पारित होने के automates कि IPSC उत्पादन के लिए रोबोट संस्कृति की एक विधि विकसित की है। एक तरल से निपटने रोबोट नियमित एंजाइमी हदबंदी द्वारा नियमित अंतराल पर IPSC कालोनियों और बीतने उन्हें खिलाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। रोबोट भी बाह्य मैट्रिक्स जेल लेपित प्लेटों का उत्पादन और एक बोने घनत्व ढाल प्रदर्शन करने के लिए प्रोग्राम था। तंतुप्रसू और वसा व्युत्पन्न IPSCs अधिक से अधिक से अधिक 20 मार्ग, के बारे में 3 महीने के लिए इस प्रणाली में सुसंस्कृत थे जब स्थिर karyotypes थे, pluripotency, बनाए रखा गया था। दोनों सेल लाइनों cardiomyocytes में भेदभाव करने में सक्षम थे। साथ में, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का संग्रह संस्कृति स्टेम कोशिकाओं के लिए, बहुत कम स्टेम सेल संस्कृति का अनुभव है, या विशेष संस्कृति उपकरण तक ही सीमित पहुँच के साथ उपयोगकर्ताओं को सक्षम बनाता है और उच्च सेल उत्पादन या कम से कम श्रम और लागत के साथ निपटने के लिए बहु-लाइन प्राप्त करने के।

44,47 - 49 pluripotency बनाए रखने के लिए। स्केलेबल स्टेम सेल संस्कृति उपज pluripotent कोशिकाओं के अन्य प्रारूपों 20,23,29 इस प्लेट आधारित विधि रूपांतरण की तरह निलंबन के लिए संस्कृति प्रारूप में अनिवार्य रूप से कोई परिवर्तन नहीं, रसायन या रो-kinase अवरोध 20 के लंबे समय तक इस्तेमाल antifoaming के उपयोग की आवश्यकता है। संस्कृति की स्थिति के समान हैं क्योंकि यह प्लेट आधारित विधि इसलिए तेजी से, और जाहिर है, नई लाइनों को समायोजित कर सकते हैं। रोग मॉडलिंग के लिए IPSCs का उपयोग 4,6,19,50 बढ़ जाती है, नए IPSC लाइनों लगातार उत्पन्न कर रहे हैं। प्रारूप पर स्थानांतरण करने के लिए बाधा एल है क्योंकि यहाँ वर्णित तकनीक उच्च मात्रा और प्रवाह में के माध्यम में संस्कृति नई लाइनों के लिए सबसे उपयुक्त हैंओउ। यह भी कालोनियों बनाए रखने के लिए आवश्यक श्रम और उपकरणों के लिए सच है। प्रारूप और हैंडलिंग निकाले जाते हैं और इस तरह का निर्देश भेदभाव के रूप में IPSC लाइनों, संस्कृति प्रदर्शन, मान्य किया पर्यावरण के लिए समान हैं, क्योंकि अंत में, अधिक पूर्वानुमान होने की संभावना है।

8 चित्रा 96 अच्छी तरह से प्लेट में स्टेम सेल उत्पादन का स्तर ऊपर के लिए एक रणनीति को दिखाता है। एक प्लेट (साइकिल 0) रोबोट 12 नए प्लेटें, एक 12 गुना वृद्धि (1 चक्र 0) बीज के लिए प्रयोग किया जाता है। खिलाने के कई दिनों के बाद, बारह प्लेटों में से एक बारह प्लेट (चक्र 2 चक्र 1) का एक और सेट बीज के लिए passaged है। शेष ग्यारह प्लेटों अन्य उपयोगों के लिए अब उपलब्ध हैं और इस प्रणाली के उत्पादन घटक का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस दर पर, एक थाली के पारित होने के 11 प्लेटें हर चक्र, या हर 3-4 दिनों प्रदान करेगा। चक्र 3 में साइकिल 3. चक्र 2 से संक्रमण के रूप में दिखाया गया है कई प्लेटें passaged कर रहे हैं जब इस पद्धति अधिक बढ़ाया जा सकता है, दो प्लेटें हैंहमेशा कॉलोनी को बनाए रखने और 24 नए प्लेटों बीज के लिए इस्तेमाल किया। शेष 22 प्लेटें हर बीतने के चक्र के बाद उपयोग के लिए तो उपलब्ध हैं। रखरखाव चक्र में किसी भी बिंदु पर उपयोगकर्ता उत्पादन को बढ़ाने के लिए और अधिक प्लेटों बीज सकते हैं। एक उदाहरण के पारित होने के लिए दो विकास चक्र के लिए हर स्तंभ होगा। पहले पारित होने के बारह प्लेटों में एक प्लेट बदल देता है, और बारह प्लेटों के प्रत्येक 144 प्लेटें बीज के लिए प्रयोग किया जाता है। इस मामले में, एक यूजर को एक थाली के साथ शुरू होता है और दो मार्ग हैं, या संस्कृति के बारे में 1.5-2 सप्ताह के बाद, 144 प्लेटें है। उदाहरण के लिए, तंतुप्रसू और वसा IPSC लाइनों पारित होने के लिए 96 अच्छी तरह से थाली के अनुसार लगभग 25-75,000,000 कोशिकाओं तैयार जब निकलेगा। 144 प्लेटें इसलिए बारे में 4-7 एक्स 10 9 कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करेगा।

रोबोट 144 96 अच्छी तरह प्लेटें ले जाने के लिए श्रम बोझ क्या है? इस काम के लिए लक्ष्यों में से एक सेल संस्कृति स्टेम पारंपरिक (यानी, 6 अच्छी तरह से थाली) की तुलना में श्रम कम है कि स्केलेबल स्टेम कोशिका के उत्पादन किया गया था। रोबोट एसीसीomplishes इस शारीरिक रूप से खिलाने और passaging के दौरान प्रत्येक थाली को संभालने की जरूरत को समाप्त करने से। रैखिक की तरह यह 96 अच्छी तरह से थाली उत्पादन तराजू पारंपरिक 6 अच्छी तरह प्लेटें, एक तकनीशियन प्लेटों के साथ काम कर खर्च करता है समय रोबोट संस्कृति का उपयोग करने में काफी कम है होता है। रोबोट संस्कृति की उत्पादन क्षमता में इस अंतर (9 चित्रा) से ली गई है। यह तकनीशियनों में थाली लगभग 3.5 मिनट, इनक्यूबेटर से 6 अच्छी तरह से थाली हटा माइक्रोस्कोप पर यह जांच, फिर महाप्राण और खिला सकता पाया गया था। इसकी तुलना में, तकनीशियनों लगभग 30 सेकंड इनक्यूबेटर से एक 96 अच्छी तरह से थाली को दूर करने और रोबोट पर रखने से पहले घनत्व और प्रदूषण के लिए माइक्रोस्कोप पर यह निरीक्षण खर्च करते हैं। ऊपर वर्णित एक करने के लिए इसी तरह की एक विस्तारित खिला प्रोटोकॉल के साथ छह 96 अच्छी तरह प्लेटें लगभग 21 मिनट, या प्रति प्लेट 3.5 मिनट लगते हैं, जो भरी हुई है और खिलाया जा सकता है। एक प्लेट को खिलाने के लिए कुल गुजरे समय रोबोट के बीच तुलनीय हैतकनीशियन रोबोट के लिए छह प्लेट (प्लेट प्रति एक 30 सेकंड निरीक्षण) से निपटने के लिए केवल 3 मिनट खर्च करता है, जबकि आईसी और मैनुअल तरीके, लेकिन हाथ फ़ीड करने के लिए 6 प्लेटें एक तकनीशियन के सभी 21 मिनट के लिए आवश्यक है। मैन्युअल रूप से 8 घण्टे करने का विरोध किया और रोबोट एक गलती प्लेटों से निपटने या तरल पदार्थ स्थानांतरित कर कभी नहीं होगा के रूप में 9 चित्रा से पता चलता है के रूप में, एक तकनीशियन रोबोट का उपयोग कर 144 प्लेटों से निपटने खर्च करता है समय के बारे में 1.2 घंटा है।

यहाँ वर्णित 96 अच्छी तरह से IPSC संस्कृति तरीकों जटिल स्क्रीनिंग कार्यों के लिए एक विनयशील मंच प्रदान करते हैं। प्रत्येक अच्छी तरह से आनुवंशिक रूप से समान है और एक ही प्रारंभिक पूल से एक ही घनत्व पर वरीयता प्राप्त है, क्योंकि चर थाली भर में वितरित और शर्तों को अलग करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जलाशयों के साथ रोबोट द्वारा बनाए रखा जा सकता है। यह एक ऐसी स्टेम सेल के विकास के मीडिया विकास 34,35,47, सब्सट्रेट या संस्कृति हालत परीक्षण और स्टेम कोशिकाओं का उपयोग विषाक्तता अध्ययन के रूप में प्रयोगों के लिए उपयोगी होगाप्रत्येक स्टेम सेल लाइन इष्टतम कॉलोनी आकार और पारित होने जरूरतों के संदर्भ में अद्वितीय है के बाद से 51।, एक काटा कॉलम, पारित होने के दौरान यांत्रिक आंदोलन और खिला आवृत्ति जोड़ तोड़ द्वारा बोने घनत्व, खिला आवृत्ति और पारित होने से निपटने मिलाना करने के लिए इस प्रणाली का उपयोग कर सकते हैं। इन चर के बीच से गुजरती उपयोगकर्ता जल्दी से एक नई लाइन की संस्कृति के लिए उपयुक्त परिस्थितियों का एक सेट खोजने के लिए या नई संस्कृति तकनीक विकसित करने के लिए अनुमति देगा। रोबोट प्रणाली भी 96 समानांतर लेकिन स्वतंत्र स्टेम सेल कालोनियों को बनाए रखने में सक्षम है। IPSC दैहिक कोशिकाओं से व्युत्पन्न या आनुवंशिक हेरफेर के बाद क्लोन कर रहे हैं, कई समानांतर क्लोन संभावित IPSC लाइनों उपज के लिए जांच कर रहे हैं। एकल कक्षों 96 अच्छी तरह प्लेटों में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, इस प्रणाली खिला सकते हैं और प्रत्येक कॉलोनी रखने के पारित होने के 96 अच्छी तरह प्लेटें अलग। इस संभावित क्लोन का चयन करते समय बहुत उच्च throughput सक्षम बनाता है और शारीरिक रूप से 96 समानांतर लाइनों के संवर्धन में कठिनाई समाप्त। इस विधि को भी एकसामग्री है कि समानांतर विश्लेषण के लिए आसानी से उपलब्ध है तो llows प्रत्येक क्लोन के उत्पादन को बढ़ाया। अंत में, हम करने के लिए और पूरी तरह से स्वचालित संस्कृति को सक्षम करने इनक्यूबेटर से प्लेटें बचाता है कि एक रोबोट की थाली की तस्करी प्रणाली के साथ इन कल्चर तकनीक को एकीकृत कल्पना। यह यहां वर्णित बुनियादी प्रोटोकॉल अन्य थाली आधारित प्रणालियों के लिए हस्तांतरणीय हैं के बाद से अधिक से अधिक विस्तार के लिए अनुमति है कि और अधिक जटिल रोबोटिक्स के साथ पूरा किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल में पता करने के लिए पहला महत्वपूर्ण कदम को रोकने और 1.5 और 4.2 कदमों जैसे संदूषण के लिए जाँच कर रहे हैं। ऊपर चर्चा के रूप में अच्छा बाँझ तकनीक और सामान्य ज्ञान का उपयोग कर रहे हैं अगर संदूषण, सफलतापूर्वक बचा जा सकता है। यह संकेत दिया चरणों में प्रदूषण और इस प्रोटोकॉल में ऐसा करने के लिए ऑपरेटर की जांच में काफी प्रदूषण के लिए जोखिम कम हो जाएगा कि, भले ही स्टेम सेल संस्कृति प्रारूप की, आवश्यक है। उचित बाह्य मैट्रिक्स जेल आवेदन एक दूसरे ईएसएस हैइस प्रोटोकॉल के समग्र सफलता के लिए ential कदम है। ठीक से 96 अच्छी तरह प्लेटें बिना कोटिंग, स्टेम कोशिकाओं को बढ़ने नहीं दिया जाएगा। एक आम मुद्दा अधूरा अच्छी तरह से कोटिंग है। अनुभव हवा के बुलबुले, electrostatic आकर्षण और केशिका क्रिया को पूरा अच्छी तरह से कोटिंग में बाधा दिखाया है। पूर्व गीला कदम (1.6) काफी अच्छी तरह से नीचे कोटिंग सुधार करने के लिए विकसित किया गया था और छोड़ नहीं होना चाहिए। बाह्य मैट्रिक्स जेल कोटिंग यह समान रूप से अच्छी तरह से नीचे और पक्षों भर में वितरित किया जाता है लागू किया जाता है जब इस पूर्व गीला कदम कि इस तरह के प्लास्टिक के 96 अच्छी तरह से थाली के स्पष्ट hydrophobicity कम करने के लिए प्रकट होता है। यह भी धीरे एक बार भी बाह्य मैट्रिक्स जेल समाधान वितरण सुनिश्चित करने के लिए लेपित एक साफ हाथ के खिलाफ 96 अच्छी तरह प्लेटें दोहन करने के लिए सिफारिश की है। हदबंदी मानकों को भी अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। एंजाइम या EDTA आधारित हदबंदी अभिकर्मक के साथ विस्तारित ऊष्मायन या पारित होने के दौरान लक्ष्य नहीं हो सकता है जो एकल कक्षों में परिणाम होगा। इसलिए, ऑपरेटरहदबंदी समय, विचूर्णन बल, और धोने पुनरावृत्ति कॉलोनी आकृति विज्ञान और स्वास्थ्य को प्रभावित और तदनुसार समायोजित कैसे करने के लिए विशेष ध्यान देना चाहिए।

यहाँ वर्णित तकनीकों के लिए सीमाओं को समझना सफल संचालन के लिए सर्वोपरि हैं। किसी भी अन्य सेल संस्कृति की स्थापना में के रूप में, 96 अच्छी तरह से प्लेटों के उपयोग के एक अपेक्षाकृत उच्च संदूषण जोखिम प्रस्तुत करता है। ऊपर वर्णित के रूप में, एक तकनीशियन खिलाने और passaging के दौरान प्रत्येक थाली से निपटने है; उदाहरण के लिए, ढक्कन खोलने रोबोट बिस्तर पर प्लेट डाल, और माइक्रोस्कोप पर थाली जब जाँच। 1.5 कदम के बाद के रूप में विख्यात इसलिए, यह इस तरह के बिस्तर पर sloped हीटिंग ब्लॉक या खड़ी पिन के रूप में किसी भी थाली ढक्कन के अंदर छूने या किसी भी संभावित दूषित सतह के लिए इस हिस्से को बेनकाब करने के लिए नहीं जरूरी है। प्रोटोकॉल के विकास के दौरान इस सीमा की खोज की और बाँझपन बनाए रखने के लिए थाली lids धारण करने के लिए एक रैक को विकसित करने के लिए प्रोत्साहन था। इसी तरह, गर्त जलाशयों, pipet सुझावों और ओवे पर्यावरण के लिए खुला है और तकनीशियन द्वारा नियंत्रित किया जाता है क्योंकि तरल से निपटने रोबोट बिस्तर पर वहाँ की आपूर्ति संदूषण के संभावित स्रोत हैं। इसलिए, अच्छा बाँझ तकनीक से अवगत कराया संस्कृति सामग्री या खुले तरल पदार्थ भर में आंदोलनों को कम करने के रूप में इस तरह लागू किया जाना चाहिए। एक और सीमा प्रोटोकॉल नेत्रहीन> 100 96 अच्छी तरह से प्लेटों की हर अच्छी तरह से जाँच के लिए बढ़ाया गया है जब बोझिल है। यह संदिग्ध कुओं की पहचान करने के लिए, नेत्रहीन ऐसे पंकिल मीडिया के रूप में संदूषण के संकेत के लिए पूरी थाली के निरीक्षण से निपटा जा सकता है। भविष्य पैमाने अप के लिए, एक स्वचालित माइक्रोस्कोप और सेल के विकास और संभावित प्रदूषण की सूचक का उपयोग शामिल किया जाएगा।

सारांश में, यहाँ वर्णित उच्च throughput 96 अच्छी तरह से आधारित प्लेटफॉर्म एक थाली प्रारूप में स्टेम सेल संस्कृति और उत्पादन के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, उच्च निष्ठा तरीका प्रदान करता है। इस विधि सेल संस्कृति, जबकि स्टेम करने के लिए समर्पित अपेक्षित अनुभव, उपकरण आवश्यक है और श्रम समय कम कर देता हैपारंपरिक पक्षपाती संस्कृति के लाभों को बनाए रखने।

Disclosures

लेखकों MKC, MJG, EEB, NJD और आरओ कर रहे हैं या यहाँ वर्णित रोबोट प्रोटोकॉल की कल्पना की थी और विकसित की है जो InvivoSciences के विकास के कर्मचारियों, कांग्रेस के समय में थे। ताइवान InvivoSciences कांग्रेस के लिए सीएसओ है। एसएच गिल्सन कांग्रेस के एक कर्मचारी है।

Acknowledgments

यह काम एनआईएच अनुदान, R44 GM087784 और R01 HL109505 में भाग द्वारा समर्थित किया गया है। लेखक विस्तारित तकनीकी सहायता के लिए, गिल्सन पर कांग्रेस तकनीकी और OEM टीम को धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates Corning 3596 96-well; Well volume: 360 μl; Cell growth area: 0.32 cm2; Individually wrapped
Seahorse Trough SeahorseBio 201308-100 Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs
Gilson Tips Gilson F167023 10 racks gilson 96 tips D200 tips
DMEM/F12 Life Technologies 12500062 DMEM/F12 powder.  Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter.
Growth Factor Reduced Matrigel Corning 354230 Referred to as, "extracellular matrix gel" in the text. Matrigel GFR, 10 ml
mTeSR1 StemCell Technologies 5857 mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance.
E8 Media StemCell Technologies 5940 TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance
Y27632 AdooQ BioScience A11001-50 Rock inhinitor Y-27632 2HCI
Accutase Innovative Cell Technologies ACCUTASE Referred to as, "proteolytic and collagenolytic dissociation reagent" in the text. Accutase 500 ml sterile cell solution
PBS Fisher SH30256FS PBS w/o Ca Mg 500 ml, 6/pk
Gilson PIPETMAX Gilson PIPETMAX http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature protocols. 2, (12), 3081-3089 (2007).
  2. Grskovic, M., Javaherian, A., Strulovici, B., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells--opportunities for disease modelling and drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 10, 915-929 (2011).
  3. Shi, Y. Induced pluripotent stem cells, new tools for drug discovery and new hope for stem cell therapies. Current Molecular Pharmacology. 2, 15-18 (2009).
  4. Xu, X., Zhong, Z. Disease modeling and drug screening for neurological diseases using human induced pluripotent stem cells. Nature Publishing Group. 34, (6), 755-764 (2013).
  5. Kirouac, D. C., Zandstra, P. W. The systematic production of cells for cell therapies. Cell stem cell. 3, (4), 369-381 (2008).
  6. Ebert, P., Liang, J. W. Induced Pluripotent Stem Cells as a Disease Modeling and Drug Screening Platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60, (4), 408-416 (2012).
  7. Pa Lalit,, Hei, D. J., Raval, A. N., Kamp, T. J. Induced pluripotent stem cells for post-myocardial infarction repair: remarkable opportunities and challenges. Circulation research. 114, 1328-1345 (2014).
  8. Compagnucci, C., Nizzardo, M., Corti, S., Zanni, G., Bertini, E. In vitro neurogenesis: development and functional implications of iPSC technology. Cellular and Molecular Life Sciences. 1-17 (2013).
  9. Yi, F., Liu, G. -H., Belmonte, J. C. I. Human induced pluripotent stem cells derived hepatocytes: rising promise for disease modeling, drug development and cell therapy. Protein & Cell. 3, 246-250 (2012).
  10. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. a, Elefanty, aG., Kamp, T. J. Differentiation of Human Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes: A Methods Overview. Circulation Research. 111, (3), 344-358 (2012).
  11. Okano, H., et al. Steps toward safe cell therapy using induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 112, 523-533 (2013).
  12. Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The Potential for Immunogenicity of Autologous Induced Pluripotent Stem Cell-derived Therapies. The Journal of biological chemistry. 289, 4571-4577 (2014).
  13. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science translational medicine. 4, (130), 130ra47 (2012).
  14. Gunaseeli, I., Doss, M. X., Antzelevitch, C., Hescheler, J., Sachinidis, A. Induced pluripotent stem cells as a model for accelerated patient- and disease-specific drug discovery. Current medicinal chemistry. 17, 759-766 (2010).
  15. Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 114, 201-235 (2009).
  16. Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends in Biotechnology. 30, 350-359 (2012).
  17. Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Stem/Progenitor cell sources of insulin-producing cells for the treatment of diabetes. Tissue engineering. 13, 1399-1412 (2007).
  18. Jing, D., Parikh, A., Canty, J. M., Tzanakakis, E. S. Stem cells for heart cell therapies. Tissue engineering. Part B, Reviews. 14, 393-406 (2008).
  19. Soldner, F., Jaenisch, R. iPSC Disease Modeling. Science. 338, 1155-1156 (2012).
  20. Olmer, R., et al. Long term expansion of undifferentiated human iPS and ES cells in suspension culture using a defined medium. Stem cell research. 5, (1), 51-64 (2010).
  21. Wang, Y., Chou, B. -K., Dowey, S., He, C., Gerecht, S., Cheng, L. Scalable expansion of human induced pluripotent stem cells in the defined xeno-free E8 medium under adherent and suspension culture conditions. Stem cell research. 11, (3), 1103-1116 (2013).
  22. Chen, V. C., et al. Scalable GMP compliant suspension culture system for human ES cells. Stem cell research. 8, (3), 388-402 (2012).
  23. Amit, M., Laevsky, I., Miropolsky, Y., Shariki, K., Peri, M., Itskovitz-Eldor, J. Dynamic suspension culture for scalable expansion of undifferentiated human pluripotent stem cells. Nature protocols. 6, (5), 572-579 (2011).
  24. Olmer, R., et al. Suspension Culture of Human Pluripotent Stem Cells in Controlled. Stirred Bioreactors. Tissue engineering. Part C. 18, (10), (2012).
  25. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S., Ph, D. Scalable Stirred-Suspension Bioreactor Culture. Tissue engineering. Part A. 16, (2), (2010).
  26. Oh, S. K. W., et al. Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 2, 219-230 (2009).
  27. Chen, A. K. -L., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnology advances. 31, 1032-1046 (2013).
  28. Yang, H. S., Jeon, O., Bhang, S. H., Lee, S. -H., Kim, B. -S. Suspension culture of mammalian cells using thermosensitive microcarrier that allows cell detachment without proteolytic enzyme treatment. Cell transplantation. 19, 1123-1132 (2010).
  29. Zweigerdt, R., Olmer, R., Singh, H., Haverich, A., Martin, U. Scalable expansion of human pluripotent stem cells in suspension culture. Nature. 6, (5), (2011).
  30. Kami, D., et al. Large-scale cell production of stem cells for clinical application using the automated cell processing machine. BMC biotechnology. 13, 102 (2013).
  31. Hussain, W., Moens, N., Veraitch, F. S., Hernandez, D., Mason, C., Lye, G. J. Reproducible culture and differentiation of mouse embryonic stem cells using an automated microwell platform. Biochemical engineering journal. 77, (100), 246-257 (2013).
  32. Tandon, N., Marolt, D., Cimetta, E., Vunjak-Novakovic, G. Bioreactor engineering of stem cell environments. Biotechnology Advances. 31, 1020-1031 (2013).
  33. Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15720-15725 (2009).
  34. Ludwig, T. E., Bergendahl, V., Levenstein, M. E., Yu, J., Probasco, M. D., Thomson, J. A. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature. 3, 637-646 (2006).
  35. Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature methods. 8, (5), 424-429 (2011).
  36. Kinney, M. A., Sargent, C. Y., McDevitt, T. C. The multiparametric effects of hydrodynamic environments on stem cell culture. Tissue engineering. Part B, Reviews. 17, 249-262 (2011).
  37. Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem cells (Dayton, Ohio). 31, (2013).
  38. Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, (7175), 141-146 (2008).
  39. Chambers, I., et al. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113, (5), (2003).
  40. Wright, A. J., Andrews, P. W. Surface marker antigens in the characterization of human embryonic stem cells. Stem cell research. 3, (1), 3-11 (2009).
  41. Thomson, J. a Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282, (5391), 1145-1147 (1998).
  42. Mayshar, Y., et al. Identification and classification of chromosomal aberrations in human induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7, (4), 521-531 (2010).
  43. Martins-Taylor, K., Xu, R. -H. Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells. Stem cells(Dayton, Ohio). 30, (1), 22-27 (2012).
  44. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, (7151), 313-317 (2007).
  45. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature. 26, (11), 1276-1284 (2008).
  46. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (27), E1848-E1857 (2012).
  47. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature biotechnology. 24, (2), 185-187 (2006).
  48. Wang, L., Li, L., Menendez, P., Cerdan, C., Bhatia, M. Human embryonic stem cells maintained in the absence of mouse embryonic fibroblasts or conditioned media are capable of hematopoietic development. Blood. 105, (12), 4598-4603 (2005).
  49. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science(New York, N.Y.). 318, (5858), 1917-1920 (2007).
  50. Kim, C. Disease modeling and cell based therapy with iPSC: future therapeutic option with fast and safe application. Blood research. 49, 7-14 (2014).
  51. Jung, E. -M., et al. Evaluation of developmental toxicity using undifferentiated human embryonic stem cells. Journal of applied toxicology: JAT. (February. (2014).

Comments

1 Comment

  1. For setting the protocol how could I download it? Especially I would like to know how the ramp is specified in your protocol? Did you made ramp as a specialized labware or did you do advanced protocols(injections, moves, etc)?
    Sincerely Ji Young Ryu

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 13, 2017 - 3:45 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics