Skalbar 96-brunnar Baserat iPSC kultur och produktion med hjälp av en Robotic Vätskehantering System

Developmental Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Conway, M. K., Gerger, M. J., Balay, E. E., O'Connell, R., Hanson, S., Daily, N. J., Wakatsuki, T. Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System. J. Vis. Exp. (99), e52755, doi:10.3791/52755 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fortsatt avancemang i pluripotenta stamceller kultur överbrygga klyftan mellan bänk och säng för att använda dessa celler inom regenerativ medicin, läkemedelsutveckling och säkerhetstester. För att framställa stamcells härrör biofarmaci och celler för tissue engineering och transplantation, är en kostnadseffektiv cell-tillverkningsteknik viktigt. Underhåll av pluripotens och stabil prestanda av celler i tillämpningar i efterföljande led (t.ex. celldifferentiering) över tid är avgörande för storskalig kroppar. Men det kan vara svårt att uppnå särskilt om cellerna odlas manuellt där operatören kan införa betydande variation samt vara oöverkomligt dyrt att skala upp. För att möjliggöra hög genomströmning, storskalig stamcellsproduktion och ta bort operatörens påverkan roman stamcellsodlingsprotokoll med användning av en bänk-topp flerkanalig vätska hanteringsrobot utvecklades som kräver minimal tekniker inblandning eller erfarenhet. Meddessa protokoll mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) odlades i matarfria betingelser direkt från en fryst stam och bibehölls i 96-brunnsplattor. Beroende på cellinje och önskad skala upp hastigheten kan föraren enkelt bestämma när passage baserad på en serie bilder som visar de optimala kolonitätheten för delning. Sedan de nödvändiga reagenserna är beredda att göra en koloni split till nya plattor utan ett centrifugeringssteg. Efter 20 passager (~ 3 månader), två IPSC linjer bibehålls stabila karyotyper uttryckte stamcellmarkörer, och differentieras till hjärtmuskelceller med hög verkningsgrad. Systemet kan utföra efterföljande high-throughput screening av nya differentierings protokoll eller genmanipulation avsedda för 96-brunnsplattor. Denna teknik kommer att minska arbete och teknisk börda för att producera ett stort antal identiska stamceller för en mängd olika tillämpningar.

Introduction

Användningen av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) har ökat betydligt sedan sin härledning 2007 1 för förening testning, regenerativ medicin och sjukdom modellering 2-6. Denna efterfrågan kommer från iPSC förmåga att ge ett stort antal pluripotenta celler som kan differentieras i somatiska celler vid en enastående mängd. Som riktade differentiering teknik förbättrar 7 - 10 och utveckling av mänsklig cell eller vävnad modellering och cellterapi ökar från 11 till 14, så gör kravet på massproduktion av hög kvalitet iPSCs. Det är allmänt hänvisas till att bland andra sjukdomar, kommer hjärtinfarkt eller B-cell funktionell ersättning kräver hundratals miljoner till miljarder iPSC härrör somatiska celler 15-18. Dessutom alltmer komplexa 3D vävnad modellering för läkemedelsutveckling och therapy kommer att kräva ett stort antal celler 9,13,19. I alla dessa exempel, definierade, enhetliga och reproducerbara iPSCs måste vara tillgänglig och lätt att producera.

För att framställa stamcells härrör biofarmaci och celler för tissue engineering och transplantation, är en kostnadseffektiv cell-tillverkningsteknik viktigt. Scaled produktion av iPSCs har fokuserat på suspensionskultur 20-25 eller suspension med användning av micro substrat 26 - 28 delvis eftersom dessa tekniker framgångsrikt användas för storskalig, icke-iPSC, eukaryot baserad produktion. Flera grupper har visat suspensionskultur system som ger pluripotenta stamceller 20,21,23,24,29. Men dessa metoder använder dyra och komplexa system inte är lätt tillgängliga för forskare utvecklar nya differentieringsprogram, kör vävnadsteknik och göra Laboratory forskning. Dessutom, fjädring och mikrobärarkulturer IPSC kulturer kräver anpassning och tekniker eller kemikalier som inte finns i traditionella anhängare iPSC kultur som kontinuerlig användning av Rho-kinashämmare, skumdämpande medel och filtrering för att reglera aggregering. Fysisk stress till cellerna är vanligare i suspensionskultur, som infördes genom mekanisk omröring samt under mikrobärare kollision. Dessa frågor begränsar förutsägbarheten och hastigheten med vilken nygenererade stamcellslinjer kan odlas i suspension. Andra har utvecklat robotplåthanteringssystem som efterliknar plattodlingstekniker 30,31 men dessa plattformar kräver betydande investeringar för utrustning och expertis för att arbeta vid sidan av de grundläggande utmaningar som är förknippade med stamcellskultur.

Följande arbete beskriver utvecklingen och bruket av en skalbar iPSC kultursystem som utnyttjar en fristående, standard 8-kanals robot vätskahandler och 96-brunnsplattor. Denna metod har utformats för att överbrygga laboratorieskala iPSC kultur och stora volymer iPSC produktion (t.ex. 10 7-1,5 x 10 9 celler per vecka tekniker) som gör det möjligt dem att utveckla nya IPSC teknik för att enkelt skala upp produktionen utan stora hårdvara eller arbets investeringar. Denna metod är relativt billigt att installera, kräver lite eller ingen stamcellskultur, programmering eller teknisk erfarenhet, har en liten utrustning fotavtryck utan behov av en särskild cellkultur huva, och använder standard cellodling utrustning för att medelhög till hög genomströmning automatiserad cellproduktion. Syftet var att utveckla ett system som kan skalstamcellskultur som kan användas av laboratorier nya stamcellskultur, de som tycker manuell odling ett hinder för att utveckla sina idéer eller dem som vill ha ett ekonomiskt sätt att producera stora mängder stamceller. Plattformen presenteras här avlägsnar teknikern inflytande påstamcellsodling och normaliserar utfodring och passage förfaranden för att möjliggöra konsekvent stamcellsproduktion.

Protocol

Vätskehanterings robotsystem, som för följande protokoll var Gilson s pipetmaX, underlättar automatiserad, skalbar stamcellskultur och produktion med bibehållen traditionella vidhäftande odlingsbetingelser i 96-brunnar format. Liksom traditionella 6-brunnar kultur, iPSCs vuxit med detta protokoll som ett monolager av olika kolonier, men i 96-brunnar format. Varje brunn kan vara isogen eller distinkt och endera konfigurationen kan odlas parallellt eftersom roboten kan hålla varje brunn segregerade. Den typiska robot iPSC kultur rutin har två faser: en utfodringsprogram där kulturer matas på ett anpassningsbart schema och en passage program där användaren väljer dissociation metoden och delningsförhållande därigenom styra sådd densitet och skalan. Följande protokoll beskriver hur en ny kultur startas, hur utfodring och passage är genomförda och de kompletterande program som underlättar iPSC kulturen.

1. Förbereda Extracellulär Matrix Gel Coated 96-brunnsplattor

  1. Ta bort förpackningen från sex nya, RT 96-brunnsplattor och placera dem på vätskehanteringsrobot säng i positionerna 2, 3, 5, 7, 8, 9 (se figur 1A för säng positioner).
  2. Placera en pre-kyld, 4 ° C 4 brunnar tråg i sängen position 6.
  3. Last kolonn 12 av spets kuggstången i sängen läge 1 med pre-kyld, 4 ° C 200 pl pipettspetsar.
  4. Fyll först (längst till vänster) tråg bra i sängen position 6 med 25 ml 4 ° C DMEM / F12 genom att hälla en portion med steril teknik. Alternativt kan du använda en pipett för att slutföra överföringen.
  5. Ta bort de 96-brunnar lock och skjut var i den specialdesignade plattan locket håller ställ (PLHR, se figur 1A). Undvik kontaktmed insidan av plåtlock.
    Anm: Hantering insidan av en platta lock eller stapling av plattlocken där insidan av ett lock berör utsidan av en annan är en utmärkt väg för kontaminering.
  6. Använda robotstyrning pekplattan genom att trycka på följande rad knappar för att starta väl förvätning process:
    1. Tryck på "Kör ett protokoll".
    2. Välj "extracellulära matrisgel Prewet" och tryck på nästa.
    3. Användar beslut: Tryck "testkörning" för att använda steg-för-steg guide för att i förväg testa det valda programmet.
      Obs: Roboten går inte utan programmet testar protokoll för problem med programvara. Med etablerade protokoll, knacka, "hoppa över steget inställningar" är acceptabelt.
    4. Tryck "Run Protocol".
  7. Under förvätning processen (steg 1,6) vidare till steg 1,8.
  8. Tina på is en 4 mg portion av tillväxtfaktor reducerad extracellulär matrisgel (GFRM) ingår i en 50 mlkoniskt rör lagrades vid -80 ° C. Håll portionen på is tills det ska användas.
    Obs: GFRM kommer att stelna om de tillåts att komma till RT och kommer inte att vara användbara.
  9. Resuspendera 4 mg GFRM alikvot i 24 ml 4 ° C DMEM / F12 med en 25 ml glas pipett. Vid överföring av DMEM / F12, paus för 2-3 sekunder för att tillåta pipett svalna innan det blandas GFRM delmängd.
  10. När förvätning processen (steg 1,6) är klar, fortsätter du till steg 1.11.
  11. Överför 24 ml av DMEM / F12 GFRM blandningen till fjärde brunn tråget i sängen position 6.
  12. Använda robotstyrning pekplattan genom att trycka på följande rad knappar för att starta extracellulära matrisgel beläggningsprocess:
    1. Tryck på "Kör ett protokoll".
    2. Välj "extracellulära matrisgel portion" och tryck på nästa.
    3. Användar beslut: Tryck "testkörning" för att använda steg-för-steg guide för att i förväg testa det valda programmet.
      Obs: Roboten går inte men rather programmet testar protokoll för problem med programvara. Med etablerade protokoll, knacka, "hoppa över steget inställningar" är acceptabelt.
    4. Tryck "Run Protocol".
  13. När steg 1,12 är klar, byt plåtlock.
  14. Överför de extracellulära matris gel belagda 96-brunnsplattor till en 37 ° C, 5% CO2, fuktad inkubator och håll där i 24 h vid vilken punkt plattorna kommer att vara redo för användning eller lagras.
    Anmärkning: Under förmildrande omständigheter, kan de nyligen belagda extracellulära matris gelplattor användas efter 15-30 min av inkubation men O / N till 24 timmars inkubering rekommenderas.
  15. Upprepa protokoll steg 1,1, 1,3, 1.5-1.6, 1.10, och 1,12-14 tills all DMEM / F12 med GFRM används.

2. Lagring av extracellulär matrix Gel Coated 96-brunnsplattor

  1. Avlägsna extracellulära matris gel belagda 96-brunnars plattor från 37 ° C, 5% CO2, fuktad inkubator.
  2. Tillval: Allow den extracellulära matrisen gel belagda 96-brunnsplattor för att komma till RT innan man går vidare till steg 2,3.
    Obs! Det här valfria steget kommer att minska kondens bygga upp när plattorna placeras vid 4 ° C.
  3. Placera plattorna på vätskehanteringsroboten säng i positionerna 2, 3, 5, 7, 8, 9 (se figur 1A för säng positioner).
  4. Last kolumn 12 av spetsen rack i sängen position 1 med RT 200 l pipettspetsar.
  5. Placera en fyra tråg reservoar i sängen position 6.
  6. Fyll väl 4 (längst till höger) av behållaren med RT DMEM / F12.
  7. Ta bort de 96-brunnar lock och skjut var i PLHR.
  8. Använda robotstyrning pekplattan genom att trycka på följande kombination av knapparna:
    1. Tryck på "Kör ett protokoll".
    2. Välj "extracellulära matrisgel portion" och tryck på nästa.
    3. Användar beslut: Tryck "testkörning" för att använda steg-för-steg guide för att i förväg testa det valda programmet.
      Obs! Robot går inte utan programmet testar protokoll för problem med programvara. Med etablerade protokoll, knacka, "hoppa över steget inställningar" är acceptabelt.
    4. Tryck "Run Protocol".
  9. När du är klar, byt ut plattan lock och ta bort plattorna från maskinbädden.
  10. Linda runt hela sidan av varje extracellulär matrisgel belagda 96-brunnsplatta (där locket möter plattan) med en en tum gånger sex tum paraffinfilmremsan. Var noga med att sträcka paraffinfilmen för att skapa en lufttät tätning.
  11. Tillval: Märk plattorna med datum för färdig extracellulärmatrix gelbeläggning, den extracellulära matrisgel lotnummer, användarnamn och annan information.
  12. Förvara plattorna vid 4 ° C, där de kommer att vara bra att använda i upp till två veckor.
    Obs: Plattor har med framgång använts bortom tvåveckorsgräns, men det är inte rekommenderat.

3. Utföra en Stem Cell Colony såddtäthetGradient i 96-brunnar format från en Live eller Frozen Kultur: Så här startar eller återställa normal Passage intervall till en stamcellslinje

  1. Om börjar med en frusen kultur, gå vidare till steg 3,2. Om börjar med en levande stamcellskultur redan på en tallrik, börjar du med steg 3.5.
  2. Tina frysta kulturen genom att snurra röret i ett 37 ° C vattenbad tills endast en liten bit av is återstår.
  3. Valfritt: Späd de upptinade cellerna i 10 ml RT stamcelltillväxtmedia (SCGM), centrifugera i 2 minuter vid 300 xg, aspirera supernatanten medier och resuspendera stamcells pelleten i 7 ml färskt SCGM innehållande 10 pM Y27632.
    Obs! Detta steg eliminerar överföring av frysmedier.
  4. Fortsätt till steg 3,6.
  5. Om börjar med levande, redan guldpläterade stamceller: passage cellerna som vanligt med hjälp av enzymatisk eller icke-enzymatisk dissociation. Försök att skörda totalt 1,5 till 3.000.000 celler; vanligtvis en brunn i en sex-brunnar. Centrifugera de skördade cellerna för2 minuter vid 300 xg, aspirera supernatanten media och resuspendera stamcells pelleten i 7 ml färsk SCGM innehållande 10 iM Y27632. Fortsätt till steg 3,6.
  6. Se till cellerna, antingen från en frusen eller levande kultur, suspenderas i 7 ml RT SCGM med 10 iM Y27632.
  7. Last kolumn 12 av spetsen rack i sängen position en med RT 200 l pipettspetsar.
  8. Placera en fyra tråg reservoar i sängen position 2.
  9. Placera en ny extracellulära matrisgel belagda 96-brunnsplatta förvärmas till 37 ° C i sängen position 5 och ta bort locket placera den i PLHR.
  10. Överför 7 ml återsuspenderade celler väl 3 av behållaren med pipett eller steril pour.
    1. Använda robotstyrning pekplattan genom att trycka på följande kombination av knapparna:
    2. Tryck på "Kör ett protokoll".
    3. Välj "sådd densitetsgradient" och tryck på nästa.
    4. Användar beslut: Tryck "testkörning" för att använda steg-för-steg guide för att i förväg testa selected programmet.
      Obs: Roboten går inte utan programmet testar protokoll för problem med programvara. Med etablerade protokoll, knacka, "hoppa över steget inställningar" är acceptabelt.
  11. Tryck "Run Protocol".
  12. När utspädningsserien är avslutad, åter täcka plattan och placera det i en 37 ° C, 5% CO2, fuktad inkubator till nästa utfodring.
  13. Tillval: Märk plattan med datum, stam information användarnamn, mediatyp och annan relevant information.
  14. Över de nästa flera dagar, mata 96-brunnar såsom erfordras med användning av protokoll 4 nedan.
    Obs: En typisk stamcellsplatta kommer att kräva en fullständig media förändring gång per 24 timmar och SCGM inte innehåller Y27632 för utfodring; endast under den initiala ympningen efter passage. Före matning, kontrollera plattan för förorening och kolonitätheten. Se steg 3.16 för mer information om övervakning av kolonitätheten.
  15. Under de närmaste dagarna, flera kolumner i närheten av cin av plattan (vanligtvis kolumnerna 5-8) kommer att närma sig ett perfekt densitet för passage; att identifiera denna densitet, jämför 96-brunnar till densitetsområdet visas i figur 3B med följande information i åtanke:
    1. Passage då utrymmet mellan majoriteten av kolonierna är cirka 25% av angränsande kolonidiametern.
      Obs: Den logiska grunden för att identifiera tiden för passagen är att en annan cykel av utfodring och tillväxt skulle resultera i kolonier kommer i kontakt, vilket bör undvikas.
  16. För att starta en enhetligt utspädd platta och börja regelbunden kultur, välj en kolumn som är den idealiska densitet och passage. Se protokoll 5 till passagen.

4. Utfodring 96-brunnar stamcell Kolonier

Obs: Följande protokoll beskriver matning av en 96-väl stamcellskoloniplattan. Tekniken kan skalas upp för att rymma sex totala plattorna parallellt.

  1. Ta bort 96 brunnar stem cellkoloniplattan från 37 ° C, 5% CO 2, fuktad inkubator.
  2. Kontrollera plattan för kontaminering och celltäthet. För att mata, se till att kolonitätheten är lägre än den ideala passagen tätheten. Se figur 3B för information om densitet.
    Obs: Förorening kan presentera så grumliga medier och åtföljas av en obehaglig lukt. Små, uppenbarligen icke-IPSC aggregat kan också vara synlig under mikroskopisk undersökning. För att utvärdera celltäthet, se steg 3.16.1 ovan.
  3. Placera 96-brunnars stamcellskoloniplattan i sängen ställning 3 på en sluttande, 37 ° C ramp.
  4. Last kolumn 12 av spetsen rack i sängen position 1 med RT 200 l pipettspetsar.
  5. Placera en 4-väl tråg i sängen position 2.
  6. Fyll väl 3 av tråget i sängen position 2 med 8 ml färskt, RT SCGM utan Y27632 antingen genom steril hälla eller pipet överföring.
  7. Ta ut 96-väl stamcellskoloniplatta lock placera den i PLHR.
  8. Användarobotstyrning pekplattan genom att trycka på följande kombination av knapparna:
    1. Tryck på "Kör ett protokoll".
    2. Välj "Colony Feed En tavla" och tryck på nästa.
    3. Användar beslut: på "testkörning" för att använda steg-för-steg guide för att i förväg testa det valda programmet.
      Observera roboten inte köra utan snarare programvaran testar protokoll för problem med programvara. Med etablerade protokoll, knacka, "hoppa över steget inställningar" är acceptabelt.
    4. Tryck "Run Protocol".
  9. När matnings protokollet är fullständig, åter täcka 96-brunnars stamcellskoloniplattan och tillbaka till 37 ° C, 5% CO2, fuktad inkubator tills nästa utfodring eller passagen krävs. Detta krävs vanligtvis efter 24 h.
    Obs: Det rekommenderas att spela matnings händelsen på plattan locket med datum, mediatyp, användarnamn och annan relevant information.

5. Passaging 96-brunnars Plåt Stem Cell Kolonier

  1. Efter flera matningscykler med 96 brunnar stamcellskoloniplattan kommer att vara redo att passage. Detta protokoll beskriver passage av en kolumn till en 96-brunnsplatta, som representerar en 1:12 delningsfaktorn. Användaren kan definiera delningsfaktorn och välja valfritt antal brunnar eller kolumner att dela, inklusive att välja brunnar som inte kan vara intill.
  2. Jämför 96 brunnar stamcellskoloniplattan täthet figur 3B att avgöra om passagen. Den idealiska passagen tätheten är då utrymmet mellan majoriteten av kolonier är ca 25% av angränsande kolonidiameter eller en efterföljande matning skulle resultera i kolonierna som växer in i varandra.
  3. Undersök 96 brunnar stamcellskoloniplattan under ett mikroskop för att se till att det inte finns någon förorening.
  4. Placera 96-brunnars stamcellskoloniplattan i sängen ställning 3 på en sluttande, 37 ° C ramp.
  5. Ladda kolumnerna 8-12 i spetsen lastning rack i sängen position 1 med RT 200 ul pipetttips.
  6. Placera en 4-väl tråg i sängen position 2.
  7. Lämna tråg brunn 1 tom, sätta 8,5 ml SCGM + 10 iM Y27632 väl 2, satte 3,5 ml 30% proteolytiska och kollagenolytisk dissociation reagens (eller EDTA baserat dissociation reagens) i väl 3, satte 4,5 ml PBS i brunn 4.
    Obs: Alla reagens kan vara vid RT eller 37 ° C. RT proteolytiska och kollagenolytiska dissociation reagens vid 30% späddes med PBS användes för Fett och fibroblast härlett iPSC kultur beskrivs här.
  8. Placera en ny, förvärmda 37 ° C extracellulär matrisgel belagda 96-brunnsplatta i sängen ställning 5.
  9. Avlägsna 96-brunnars stamcellskoloniplatta lock, såväl som den nya 96-brunnars lockplattan och placera dem både i PLHR.
  10. Använda robotstyrning pekplattan genom att trycka på följande kombination av knapparna:
    1. Tryck på "Kör ett protokoll".
    2. Välj "Colony Split 01:12 Kolumn 1" och tryck på nästa.
    3. Användar beslut: Tryck "testkörning" för att användasteg-för-steg-guiden för att i förväg testa det valda programmet.
      Obs: Roboten går inte utan programmet testar protokoll för problem med programvara. Med etablerade protokoll, knacka, "hoppa över steget inställningar" är acceptabelt.
    4. Tryck "Run Protocol".
  11. När passagen protokollet är klar, åter täcka båda plattorna.
  12. Tillval: Märk den nya plattan med nödvändig information (dvs. datum, cellinje, passage nummer, mediatyp, användarnamn etc.).
  13. Återgå båda plattorna till 37 ° C, 5% CO2, fuktad inkubator tills nästa utfodring eller passagen krävs. Obs: Nästa utfodring är vanligen efter 24 timmar.
    Obs: Celler och kolonier bör fästa till plattan inom 2-3 timmar att dela upp och ser mycket spritt ut. Detta beror på närvaron av Rho-kinashämmare och cellerna kommer att kondensera och uppvisar den karakteristiska stamcells morfologi (dvs., kullerstens packade kolonier with småcellig volym till stor kärna ratio) efter den första Rho-kinashämmare matning.

6. Skörd 96-brunnar stamceller för produktion

Obs: Stem cellkolonier kan skördas för användning när som helst under odling. Vanligtvis inträffar när cellerna är redo att passagen (se protokoll 5). Detta protokoll beskriver hur man skörda elva kolumner från en 96-väl stamcellskoloniplattan.

  1. Undersök 96 brunnar stamcellskoloniplattan under ett mikroskop för att se till att det inte finns någon förorening.
  2. Placera 96-brunnars stamcellskoloniplattan i sängen ställning 3 på en sluttande, 37 ° C ramp.
  3. Last kolumner 11 och 12 i spetsen lastning rack i sängen position 1 med RT 200 l pipettspetsar.
  4. Placera en 4-väl tråg i sängen position 2.
  5. Lämna tråg brunn 1 tom, sätta 8,5 ml SCGM väl 2, satte 3,5 ml 30% proteolytiska och kollagenolytisk dissociation reagens (eller EDTA baserat dissociation reagens) i väl3, satte 4,5 ml PBS i brunn 4.
    Obs: Alla reagens kan vara vid RT eller 37 ° C.
  6. Ta ut 96-väl stamcellskoloniplatta lock och plats i PLHR.
  7. Använda robotstyrning pekplattan genom att trycka på följande kombination av knapparna:
    1. Tryck på "Kör ett protokoll".
    2. Välj "Colony Harvest Kolumnerna 2-12" och tryck på nästa.
    3. Användar beslut: Tryck "testkörning" för att använda steg-för-steg guide för att i förväg testa det valda programmet.
      Obs: Roboten går inte utan programmet testar protokoll för problem med programvara. Med etablerade protokoll, knacka, "hoppa över steget inställningar" är acceptabelt.
    4. Tryck "Run Protocol".
      Obs: När uppsamlingsproceduren är klar, kommer cellerna att vara i tråg och 2 och redo för avhämtning.

Representative Results

Utveckling av en platta baserad robotstamcellskultur plattform.

Efterfrågan på iPSCs växer på grund av deras användbarhet inom läkemedelsutveckling och regenerativ medicin. Ändå skalbar produktion har fokuserat på suspensionskultur 32 i relativt komplicerad utrustning som utesluter många forskare och avviker från etablerade vidhäftande odlingsmetoder. I stället för att drastiskt förändra beprövad platta baserad stamcellsodlingsmetoder, såsom att byta till en suspensionskultur eller med hjälp av en mikrobärare har vi fokuserat på att miniatyrisera och automatisera våra befintliga vidhäftande IPSC odlingstekniker. Det första målet var att automatisera utfodring och passage att normalisera hela odlingsprocessen. En plattform som kan snabbt skala upp med befintlig teknik krävdes också. För att uppnå dessa mål en metod utformades för att odla stamceller i en 96-brunnsplatta med användning av ett automatiserat vätskehanteringssystem (Figur 1). Den protocols utvecklats här med vätskehanteringsrobot för utfodring och passage inte kräver ett centrifugeringssteg eller kontinuerlig övervakning av en tekniker. Dessa protokoll har utvecklats med två matar gratis IPSC linjer; en härledd från fibroblaster och den andra från adiposceller 33.

Den datorstyrda vätskehanteringssystem (Figur 1A) består av en flatbädd som rör sig fram och tillbaka. Sängen har nio, ca 5 x 3,3 tum numrerade urtag med trycksatta klipp att acceptera standardcellodlingsplattor, flytande reservoarer och andra anpassade hårdvara. Pipetten huvud rör sig från vänster till höger (vinkelrätt mot sängen rörelse) samt uppåt och nedåt. Tillsammans med sängen, kan pipetten huvudet programmeras att ta bort eller leverera medier var som helst på sängen efter att plocka upp pipettspetsar från en påfyllningsställ. Vid behov, kan vart och ett av de 96-brunnarna hållas åtskilda för att eliminera korskontaminering. I föreliggande konfiguration, 0 till200 | il av media kan förflyttas av varje spets pipett huvudet, men andra volymintervall är möjliga baserat på spetsstorlek.

När passage stamceller i standardplattor, enzymatisk eller kemisk dissociation kräver typiskt inkubering vid 37 ° C. Inledande tester bekräftade dissociation med ett proteolytiskt och kollagenolytisk dissociation reagens eller en EDTA reagens utförs bättre vid 37 ° C än RT både tid till dissociation och homogenitet av kolonistorlek produceras för våra två 96-såväl IPSC linjer (data visas ej). För att automatisera split processen och undvika att flytta plattorna in och ut ur en inkubator, lutande, temperaturstyrda ramper som accepterar och reproducerbart placera standardodlingsplattor byggdes (Figur 1A). När ramperna upphettades till 37 ° C, ett proteolytiskt och kollagenolytisk dissociation reagens eller EDTA-baserad dissociation av de iPSCs från 96-brunnars plattor var jämförbar med plattor som placeras i en 37 ° C inkubator (data Not visat). De sluttande ramper användes också för att möjliggöra pipettspetsar för att samla en hel brunnens innehåll (mindre än 5 | il restvolym) genom att nå den lägsta punkten i brunnen medan aspiration från en plan platta lämnade en restvolym av ungefär 10 till 15 pl, vilket resulterar i cellförlust. Den sluttande ramp får också brunnarna tvättas (revs) genom att trycka ut media på toppen av den lutande väl och att samla in det längst ned.

Robotic odling av stamceller i 96-brunnar format; utfodring och passaging.

Odling av iPSCs använder vätskehantering robotsystemet har två faser; passage och utfodring. När en koloni är redo att passagen, delas det upp i ett förutbestämt förhållande för att ympa en ny platta, som sedan matas med jämna mellanrum tills det är redo att passagen igen (Figur 1B). Frysta eller icke-96-brunnsodlingar kan startas i 96-hålsformat och omedelbart in i passagen / fodercykel. Celler som inte används för att upprätthålla kolonin, som är huvuddelen av en platta, skördas för andra ändamål och representerar komponenttillverkning av detta system.

Utfodring 96-brunnars odlade iPSCs åstadkommes när en del eller allt material avlägsnas efter en period av kultur och deponeras i en avfallsbehållare. Sedan färskt medium alikvoteras till samma platta. Roboten kan använda nya tips och medie tråg att segregera varje brunn för helt anpassningsbara utfodring inklusive blandning konditionerat medium med nya medier.

Typiska passage av stamceller kräver en metod för dissociation och ofta ett centrifugeringssteg. De protokoll som beskrivs här syftar till att normalisera dissociation och eliminera centrifugering. Passagen-protokollet börjar när roboten levererar dissociation reagens till 96-brunnars plattor monterade på 37 ° C lutande ramper. Efter en förinställd tid, är de dissocierade cellerna samlas med en tvättverkan där användaren har control över läget, upprepning, volym och finfördelning hastighet. Enzym tid, finfördelning hastigheten och antalet finfördelning repetitioner var tillräckliga för att variera skiljas kolonistorlek och homogenitet (Figur 2), men varje parameter är justerbar för att passa en given cellinje krav. Denna kontroll tar bort variabilitet infördes genom tekniker som pipett med varierande hastigheter, positioner, och upprepningar. När väl de dissocierade cellerna uppsamlades och slogs samman i en reservoar med färskt medium, är de distribueras till en ny platta. För att undvika centrifugering och sådd problem från substrat nedbrytning eller celldöd på grund av enzymverkan, var dissociation reagens späddes till den lägsta punkten av godtagbar dissociation som resulterade i tillförlitlig sådd. Denna teknik var effektiv för ett proteolytiskt och kollagenolytisk dissociation reagens i mTeSR1 mediet 34, som har en relativt hög halt protein, men också effektivt vid låga proteinmedia som Essential-8 35

Styra såddtäthet av stamceller efter passage är avgörande för rutin och framgångsrik stamcellskultur. Sådd för låg eller hög kan resultera i ektopisk differentiering och förlust av pluripotens förutom att orsaka oregelbundna passage mellanrum. Typiska stamcellkultur beroende av förhållandet delning där en brunn i en 6-brunnsplatta användes för att ympa en helt ny 6-brunnars platta (en 1: 6 split). Med vätskerobothantering detta förhållande kan justeras för att passa behoven hos användaren (t.ex., ett: 6, 1: 9, 1:12, etc.) och den har mest inverkan på passagen intervallet. Roboten kan skörda mindre än en kolumn, en hel kolumn (8 brunnar), eller mer än en kolumn beroende på användarens behov, vilket bör bestämmas empiriskt. Fett och fibroblaster härledda iPSCs upprätthållit en vanlig tre dagars utfodring schema med passagen på den fjärde dagen då split 1:12. I detta fall en kolonn skördades och användes för att ympa en ny 96-brunnars platta, vilket skapar en 01:12 split med varje cykel (fig 3A). De återstående 11 brunnar var sedan tillgängliga för tillämpningar efter. Att skörda dessa 11 produktionsbrunnar, var passagen protokollet upprepades med undantag av cellerna avsattes i ett tråg för uppsamling. Alternativt kan cellerna kvar på plattan och användes direkt.

För att uppnå konsekvent såddtäthet passage till passage utan att räkna och underhålla en rutin dela schema, våra protokoll ringa för att dela samma förutbestämda antal kolumner när kolonin är en idealisk täthet för passage. För att hjälpa användarna att identifiera rätt densitet för passage, var en serie bilder som genereras visar en rad densiteter med en perfekt passage täthet markerad (Figur 3B). För att avgöra när passage, undersöker en tekniker sin tallrik och jämför den med densiteten bildskalan. Tankenl densitet passage bestämdes från kultur av fett- och fibroblast härlett iPSCs och befanns vara när utrymmet mellan de flesta kolonierna var omkring 25% av angränsande kolonidiametern. Det är viktigt att kolonierna vara homogent fördelad. Denna mängd av koloniseparations korrelerar med den maximala önskvärda tätheten eftersom en ytterligare matningscykel skulle resultera i kolonier röra, vilket är en utlösande faktor för ektopisk differentiering.

En nödvändig protokoll som utvecklats här adresserar hur man startar en kultur i 96-brunnsformat och hur man återställer en kultur efter en densitet problem. När en ny kultur startas, den bästa såddtäthet och antalet matningscykler innan passage är okända. För att säkerställa en användbar densitet efter sådd, distribuerar roboten befintliga eller upptinade celler över ett 96-brunnsplatta i en serieutspädning (Figur 4A). Såsom resultat från en sådan gradient visas i fig 4B-E. Efter flera utfodringcykler, vissa kolumner närma sig perfekt densitet att dela, vid vilken tidpunkt en tekniker använder roboten att ympa en enhetligt utspädd platta att starta regelbunden kultur. Denna densitetsgradient protokoll användes också för att återställa regelbundna passageintervallen och koloni homogenitet till en oregelbunden platta. Om passage försenas eller missade, kolonidensitet och storlek blir för hög, medan om passagen är för tidigt, är alltför låg kolonidensitet och individuella kolonier kan bli för stor utan att vara jämnt fördelade över brunnen. Densitetsgradienten protokoll löser dessa problem och tillåter användaren att starta genom att plocka en idealt ympades uppsättning brunnar.

Två IPSC linjer förblev pluripotenta efter 3 månaders robot kultur.

Underhåll av stamcells pluripotens kan påverkas negativt av odlingsbetingelser 36,37. För att utvärdera om fett- och fibroblaster härledda IPSC linjer (a-IPSC, f-iPSC respektive) underhålls pluripotency när de odlas robot i 96-brunnsplattor under en längre tidsperiod, de två linjerna odlades på vätskehanteringsrobot såsom beskrivits ovan för 3 månader och sedan pluripotens markörer undersöktes. För denna period båda linjerna passerades med ett proteolytiskt och kollagenolytisk dissociation reagens större än 20 gånger utan centrifugering. Fasta 96-brunnars plattor från en-iPSC och f-IPSC linjer färgades för Oct4 och NANOG uppvisade kärnackumulering av dessa markörer, medan SSEA-4 observerades på cellytan (figur 5A-l). Detta överensstämmer med tidigare rapporter för pluripotenta iPSCs 38-41. Motfärgning med DAPI avslöjade inga ytterligare celler som inte var också positivt för de tre pluripotens markörer. Kromosomavvikelser vanligen observeras under stamcellkultur 42,43 men får inte påverka fördelningen av pluripotens markörer såsom de som visas i figur 5A-L. Karyotype analys visade både robotpasse IPSC linjer hade 46 vanliga kromosomer, vilket tyder på robotodlingsmetoden inte införa kromosomala instabilitet utöver vad som normalt kan förekomma (figur 5M-N).

Att sondera etablerad stamcells genuttryck markörer 1,41,44,45 i robot odlade IPSC linjer, totalt RNA uppsamlades parallellt mot fläckar och karyotyp analys. Både 96-brunnar IPSC linjer hade liknande uttryck pluripotens markörer NANOG, POU5F1 och REX1 medan kardiomyocyter särskiljas från varje linje inte, inte heller en separat rad av humana hudfibroblaster (HDFS) (Figur 6). De kardiomyocyter härledda från båda linjerna var MYL7 positiva medan HDFS och stamceller uttryckte inte MYL7. Båda IPSC linjer differentierades i kardiomyocyter med liten molekyl, Wnt väg manipulation teknik beskrev nyligen 46 (Figur 7). Differentiering till kardiomyocyter i 96-brunnsformatet var framgångsrik i större än 80% av brunnarna (data ej visade). Tillsammans utgör dessa data tyder på 3 månader och mer än 20 passager av robot kultur gav kromosomalt normala celler uppvisar en transkriptionsprogram som överensstämmer med pluripotens som också var i stånd att differentiering till hjärtmuskelceller.

Figur 1
Figur 1. Översikt över robotstamcellskultur utrustning och typiska iPSC kultur rutin. (A) Robotic hanteringssystem vätska visas med typisk säng layout för 96 brunnar stamcellsodling. Nya sterila pipettspetsar (Tips), löstagbar spets avfallsbehållare (Waste), med flera brunnar autoklaverbar tråg för att hålla erforderliga flytande reagens (vätskor), 96-brunnsplattor är placerade en d uppburen på en temperaturstyrd, sluttande ramp (96 brunnar), 8-kanals robot pipett huvud som rör sig åt vänster / höger och uppåt / nedåt (Pipet huvudet). Plate locket håller rack (PLHR). Bed positionsnummer visas nedan i tabellen. (B) Robotic iPSC kultur har två faser: Utfodring och Passage. Cykeln av cellproduktion börjar när en koloni plattan är redo att passagen. Användaren väljer det önskade förhållandet till passage vid och roboten frön en ny grupp av 96-brunnsplattor matas sedan med jämna mellanrum tills för passage igen. När plattorna är redo att passage, de flesta av varje platta inte används för att ympa efterföljande koloni plattor och är tillgänglig för andra ändamål, vilket motsvarar produktionsfasen av systemet. Frysta eller befintliga cellinjer kan införas när som helst och underhållas i fodret / passage cykel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

e_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 2
Figur 2. Robot parametrar vätskehanterings kan användas för att styra IPSC koloni dissociation egenskaper. Varje representativ bild visar fibroblast härrör iPSCs skiljas efter den angivna behandlingen samtidigt upphängd i 96 brunnar. (Övre raden, A - C) Enzym tid, ingen rivning. Fibroblast härledda iPSCs odlade i 96-brunnars plattor utsattes för ökande tider av proteolytiska och kollagenolytiska dissociation reagens dissociation och ingen robot triturering utfördes. (Middle Row, D - F) Rivning hastighet, 3 minuter enzym. Celler exponerades för tre minuter av proteolytiska och kollagenolytiska dissociation reagens behandlingen och sedan 175 | il tillväxtmedium applicerades och varje brunn pipetter upp och ned en gång vid den angivna takt. il / sek = mikroliter per sekund. (Nedersta raden, G - I) Triturering upprepningar, 3 minuter enzym, 160 ul / sek. Cellerna utsattes för proteolytisk och kollagenolytisk dissociation reagens för 3 minuter, var 175 pl odlingsmedium tillämpas, sedan revs vid 160 pl / s för det angivna antalet repetitioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Typisk fett- och fibroblaster iPSC koloni underhållsschemat och en rad koloni densitet bilder för att avgöra när passage att upprätthålla en regelbunden utfodring / passage cykel. (A) Från och med en fett eller fibroblast 96 brunnar iPSC koloni redo att passage, en kolumn med celler fick passera på roboten utan centrifugering och späddes12 nya kolumner som matades med jämna mellanrum därefter tills plattan var redo att passage igen. För cellproduktion, har kolumner som inte används för att upprätthålla kolonin passe och samlas in för senare användning. Vilket antal kolumner kan passe att styra expansionstakt. (B) För att bestämma när passagen, en serie av densitets bilder tagna varje 24 h gavs till användarna. I den översta röda rutan (inom 72 timmar efter den första sådd) kolonin är inte tillräckligt tät passage och ska matas. När densiteten motsvarar den som visas i den gröna rutan (vid ~ 96 h), är kolonin på en ideal densitet för passage. Av 120 h, är för tät passage kolonin och detta scenario bör undvikas. Det senare kan lösas med en seedning densitetsgradient men rutin kultur vid denna densitet är starkt motarbetas. Vit bar motsvarar 200 iM. Klicka här för att se en större versipå denna siffra.

Figur 4
Figur 4. 96 brunnar robot odlingssystem tillåter användare att starta kulturer från frysta eller aktiva cellinjer och utföra en sådd gradient. (A) En cell lösning framställs av användaren från en frusen cell lager eller efter skörd en aktiv kultur och placeras på roboten. Robot Systemet utför sedan en serieutspädningsprotokoll för att fördela initiala cell lösningen längs 96-brunnar med densitetsgradient distribueras av kolonnen. (B - E) Exempel på celltäthet från fyra av de tolv kolonnerna från A, 48 h efter densitetsgradienten ympning protokoll. Vita linjer lika 225 pm. Klicka här för att se en större version av dennafigur.

Figur 5
Figur 5. Pluripotens bibehålls för fett- och fibroblaster härledda IPSC linjer under 96 brunnar robot kultur för 22 (adipose) eller 23 (fibroblast) passager (~ 3 månader). (A - L) Fett och fibroblast härrör IPSC cellinjer var robot matade och passe såsom beskrivits i texten utan centrifugering i 96-brunnars plattor för 22 eller 23 passager därefter fixeras och färgas för pluripotens markörer Oct4, NANOG, eller SSEA4 med DAPI motfärgning. Vit bar motsvarar 100 nm. (M - N). Parallella odlingar till dem som beskrivs i A lämnades för karyotype analys som visade en normal uppsättning av 46 kromosomer Klicka här för att se en större version of denna figur.

Figur 6
Figur 6. Fett (96-A) och fibroblast (96-F) härledd iPSCs odlades i mer än 20 passager i 96-brunnars robot format som underhålls pluripotens genuttryck och differentierade till kardiomyocyter. Totalt mRNA extraherades från både robot odlade IPSC linjer samt kardiomyocyter skiljas från båda linjerna (CM-A = adipos iPSC härledda kardiomyocyter, CM-f = fibroblast iPSC härledda kardiomyocyter, uppsamlades 14 dagar efter differentieringsinduktion) och användes för RT-PCR för att sondera pluripotens markörer NANOG, POU5F1, REX1, cardiomyocyte markör MYL7 och laddningskontroll GAPDH. Humana dermala fibroblaster (HDF) uppsamlades också och användes som en icke-iPSC, icke-cardiomyocyte kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7
Figur 7. Fibroblast och adipos härledda iPSCs bibehöll förmågan att differentiera till kardiomyocyter efter långvarig 96-brunnars robot kultur (A - H). Fett och fibroblast iPSCs odlas i 96-brunnars robot format för mer än 20 passager differentierades in i kardiomyocyter . 14 dagar efter differentiering induktion, var 96-brunnar bundna kardiomyocyter dissocierade och återutströks vid låg densitet på objektglas för immunfärgning av troponin T (röd), F-aktin (grön) och kärnor (blå). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

p_upload / 52755 / 52755fig8.jpg "/>
Figur 8. Ökning 96-brunnar stamcellkultur. Uppskalning av stamcellsproduktion beror på antalet plattor som används för att ympa den efterföljande gruppen av plattor. Användaren kan antingen upprätthålla en produktionsnivå genom att passera samma antal plåtar på varje delad tillfälle eller utöka produktionen genom ympning fler plattor. Till exempel, i cykel 0, är ​​en 96-brunnar passe till tolv nya plattor (cykel 1), vilket skapar en 12-faldig expansion. Denna hastighet kan bibehållas om en av de tolv plattorna passera till en ny uppsättning av tolv plattor (cykel 1 till 2) eller utvidgas genom att passera flera plattor (cykel 2 till 3). Under passagen, några plattor som inte används för att upprätthålla kolonin finns för tillämpningar efter. Därför kan passage 12 plattor rutinmässigt ge så många som 144 plattor i två passager: 12 för koloni underhåll och 132 för andra ändamål."> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 9
Figur 9. Effektivitet av 96-brunnar baserad kultur för cellproduktion överstiger kraftigt manuell odling. Såsom noteras i fig 8, kan en platta passe till utsäde tolv plattor, som sedan kan passe till 144 plattor. Denna expansionstakt kan uppnås i två delade möjligheter. En tekniker kräver cirka 3,5 minuter för att mata en 6-brunnar medan de tillbringar ca 30 sekunder med en 96-brunnar för att undersöka den på mikroskop och placera den på roboten. Om teknikern bär 144 plattor, kommer de tillbringar ca 1,2 tim hanteringsplattor vid matning med roboten medan manuell kulturen kommer att kräva en dedikerad 8 timmar att föda. Klicka här för att view en större version av denna figur.

Discussion

I den aktuella studien har vi utvecklat en metod för robot kultur för iPSC produktion som miniatyriserar och automatiserar utfodring och passage i en 96-brunnar format samtidigt möjliggör en effektiv skala upp. En vätskehanteringsrobot användes för att rutinmässigt mata IPSC kolonier och passage dem med jämna mellanrum genom enzymatisk dissociation. Roboten har också programmerad för att producera extracellulär matrix gel belagda plattor och utföra en sådd densitetsgradient. När fibroblaster och fett härrör iPSCs odlades i detta system under mer än 20 passager, ca 3 månader, var pluripotens hållna, som var stabila karyotyper. Båda cellinjerna var i stånd att differentiering till hjärtmuskelceller. Tillsammans insamling av protokoll som beskrivs här gör det möjligt för användare med mycket liten stamcellskultur erfarenhet eller begränsad tillgång till specialiserad kultur utrustning, att odla stamceller och uppnå hög cellproduktion eller flera linjer hantering med minimal arbete och kostnader.

44,47 - 49 för att bibehålla pluripotens. Medan andra format av skalbar stamcellkultur yield pluripotenta celler 20,23,29 denna platta baserad metod kräver väsentligen ingen förändring i odlings format, som anpassning till suspension, användningen av skumdämpande kemikalier eller långvarig användning av Rho-kinashämmare 20. Denna platta baserad metod kan därför snabbt och förutsägbart, rymma nya linjer eftersom odlingsbetingelser är likartade. Eftersom användningen av iPSCs för sjukdoms modellering ökar 4,6,19,50, är nya IPSC linjer kontinuerligt genereras. De metoder som beskrivs här är bäst lämpade att odla nya linjer i medelstora till stora volymer och genomströmning eftersom hinder för övergången till formatet är läg. Detta är också sant för arbetskraft och utrustning som krävs för att upprätthålla kolonierna. Slutligen, eftersom formatet och hantering liknar miljön används för att härleda och validera IPSC linjer, kultur prestanda, såsom riktad differentiering, kommer sannolikt att vara mer förutsägbart.

Figur 8 illustrerar en strategi för uppskalning av stamcellsproduktion i 96-brunnsplattor. En platta (cykel 0) används för att robot frö 12 nya plattor, en 12-faldig ökning (cykel 0 till 1). Efter flera dagars utfodring, en av de tolv plattor är passerades att ympa en annan uppsättning av tolv plattor (cykel 1 till cykel 2). Resterande elva plattorna finns nu tillgängliga för andra ändamål och representerar komponenttillverkning i systemet. I den här takten kommer passage av en platta ger 11 plattor varje cykel, eller var 3-4 dagar. Denna metod kan skalas mer när flera plattor är passe såsom visas i övergången från cykel 2 till cykel 3. I cykel 3, två plattor äralltid används för att upprätthålla kolonin och utsäde 24 nya plattor. De återstående 22 plattorna är sedan tillgängliga för användning efter varje passage cykel. Vid varje punkt i underhållscykel kan användaren utsäde fler plattor för att öka produktionen. Ett exempel skulle vara att passagen varje kolumn två tillväxtcykler. Den första passagen omvandlar en platta in i tolv plattor, och var och en av de tolv plattor används för att ympa 144 plattor. I detta fall startar en användare med en platta och efter två passager, eller ungefär 1,5 till 2 veckors odling, har 144 plattor. Exempelvis kan fibroblast och adipösa IPSC linjer bildning cirka 25 till 75.000.000 celler per 96-brunnars platta när redo att passagen. 144 plattor kan därför utgöra ca 4-7 x 10 9 celler.

Vad är arbetsbördan för att bära 144 96 brunnar robot? Ett av målen för detta arbete var skalbar stamcellsproduktion som minskad arbetskraft jämfört med traditionell (dvs 6-brunnar) stamcellskultur. Roboten enlomplishes detta genom att minska behovet av att fysiskt hantera varje platta under utfodring och passage. Även om 96-brunnar produktions skalor linjärt som det skulle i traditionella 6-brunnsplattor, den tid en tekniker tillbringar arbetar med plattorna är betydligt mindre med hjälp av robot kultur. Produktionseffektiviteten för robot kultur härleds från denna skillnad (figur 9). Det konstaterades tekniker kunde ta bort en 6-brunnar från inkubatorn, kolla upp det på mikroskopet, sedan aspirera och foder plattan i cirka 3,5 minuter. I jämförelse, tekniker tillbringar ungefär 30 sekunder att ta bort en 96-brunnar från inkubatorn och inspektera den på mikroskopet för densitet och föroreningar innan den placeras på roboten. Med en utökad matnings protokoll liknande det som beskrivits ovan, kan sex 96-brunnars plattor lastas och matas, vilket tar ungefär 21 minuter, eller 3,5 min per platta. Den totala förflutna tiden att föda en platta är jämförbara mellan robotic och manuella metoder, men till hands foder 6 plattor en tekniker krävs för alla 21 minuter medan teknikern spenderar endast 3 min hantering av sex plattor för roboten (30 sek inspektion per platta). Som figur 9 visar den tid en tekniker tillbringar hanterar 144 plattor med hjälp av roboten är ca 1,2 tim i stället för 8 timmar manuellt och roboten kommer aldrig att göra ett misstag hanterar plåtarna eller överföring av vätskor.

De 96 brunnar IPSC odlingsmetoder som beskrivs här ger en lätthanterlig plattform för komplexa screeninguppgifter. Eftersom varje brunn är genetiskt identiska och såddes med samma täthet från samma ursprungliga poolen, kan variabler fördelas över plattan och underhålls av roboten med kommersiellt tillgängliga reservoarer att segregera villkor. Detta skulle vara användbart för experiment, såsom stamcellstillväxt medieutvecklingen 34,35,47, substrat eller odlingsbetingelser testning och toxicitetsstudier utnyttjar stamceller51. Eftersom varje stamcellslinje är unik när det gäller optimala koloni storlek och passage krav, kan man använda detta system för att modulera såddtäthet, utfodring frekvens och passage hantering genom att manipulera kolumnerna skördats, den mekaniska agitation under passage och matningsfrekvensen. Iterera genom dessa variabler gör det möjligt för användaren att snabbt hitta en rad förhållanden som är lämpliga för odling av en ny linje eller utveckla nya odlingstekniker. Robot systemet är också förmåga att bibehålla 96 parallella men oberoende stamcellskolonier. När iPSC härrör från somatiska celler eller klonade efter genetisk manipulation, är många parallella kloner screenas för att ge potentiella IPSC linjer. När enskilda celler sås i 96-brunnsplattor, kan detta system foder och passage de 96-brunnsplattor som håller varje koloni segregerade. Detta möjliggör mycket hög genomströmning vid val potentiella kloner och eliminerar svårigheten att fysiskt odling 96 parallella linjer. Denna metod även ettllows skalas upp produktionen av varje klon så att materialet är lätt tillgängliga för parallell analys. Slutligen, föreställer vi oss att integrera dessa odlingstekniker med en robotplatta handel system som levererar plattor till och från inkubatorn möjliggör helautomatisk kultur. Detta kan åstadkommas med mer komplexa robotar som möjliggör större expansion eftersom de grundläggande protokoll som beskrivs här är överföras till andra plattbaserade system.

De första kritiska stegen för att ta itu med i protokollen är sådana som förebygger och kontrollerar för förorening som steg 1,5 och 4,2. Föroreningar, som diskuterats ovan, kan framgångsrikt undvikas om god sterilteknik och sunt förnuft används. Det är absolut nödvändigt, oavsett stamcellskultur format, att operatören check för kontaminering och att göra det i detta protokoll på de angivna steg avsevärt kommer att minska risken för kontaminering. Korrekt extracellulära matrisgel ansökan är en andra essrential- steg till den totala framgången för detta protokoll. Utan korrekt belägga 96-brunnsplattor, kommer stamcellerna inte växa. En vanlig fråga är ofullständig och beläggning. Erfarenheten har visat att luftbubblor, elektrostatisk attraktion och kapillärverkan hindra komplett bra beläggning. Den förvätning steg (1,6) har utvecklats för att avsevärt förbättra brunnsbotten beläggning och bör inte hoppas över. Denna förvätning steg visas för att minska den skenbara hydrofobiciteten hos plast 96-brunnsplatta så att när den extracellulära matrisen gelbeläggningen appliceras det är jämnt fördelat över brunnens botten och sidor. Det rekommenderas också att försiktigt trycka på 96-brunnsplattor mot en ren handen en gång belagt att säkerställa jämn extracellulärmatrix gellösning distribution. Dissociation parametrarna är också viktigt att optimera. Förlängd inkubering med enzym eller EDTA baserad dissociation reagens kommer att resultera i enstaka celler som kan eller inte kan vara målet under passagen. Därför operatörenbör ägna särskild uppmärksamhet åt hur dissociation tid, finfördelning kraft och tvätta upprepningar påverkar kolonimorfologi och hälsa och justera därefter.

Förstå begränsningar de metoder som beskrivs här är avgörande för framgångsrik verksamhet. Som i alla andra cellkultur inställning, användning av 96-brunnsplattor uppvisar en relativt hög risk för kontaminering. Som beskrivits ovan, är en tekniker att hantera varje platta under utfodring och passager; till exempel, när locket öppnas, sätta plattan på robot sängen, och kontroll av plattan på mikroskopet. Därför, som noterades efter steg 1,5, är det absolut nödvändigt att inte röra vid insidan av varje platta lock eller utsätta denna del till något potentiellt förorenade ytan såsom lutande värmeblock eller vertikala stift på sängen. Under protokoll utveckling denna begränsning upptäcktes och gav impulsen att utveckla ett rack för att hålla plåtlock för att upprätthålla sterilitet. Likaså, tråg reservoarer, pipettspetsar och ovriga varor på vätskehantering robot säng är potentiella föroreningskällor, eftersom de är öppna för miljö och hanteras av tekniker. Därför bör god sterilteknik användas såsom att minska rörelser över exponerade kulturmaterial eller öppna vätskor. En annan begränsning är att när protokollet skalas upp, visuellt kontroll av varje brunn i> 100 96-brunnars plattor är besvärlig. Detta kan hanteras genom visuell inspektion av hela plattan efter tecken på förorening, såsom grumlig medier, för att identifiera misstänkta brunnar. För framtida skala upp, kommer användning av ett automatiserat mikroskop och indikator på celltillväxt och eventuella föroreningar införlivas.

Sammanfattningsvis, den hög genomströmning 96-brunnars baserad plattform som beskrivs här erbjuder ett reproducerbart, high fidelity metod för stamcellkultur och produktion i ett plattformat. Denna metod minskar den erfarenhet som krävs, utrustning som krävs och arbetstid ägnas åt stamcells kulturen samtidigtbevarande av fördelarna med traditionella vidhäftande kultur.

Disclosures

Författarna MKC, MJG, EEB, NJD och RO är eller var vid tidpunkten för utvecklings anställda InvivoSciences, INC som utformades och utvecklat robot protokoll som beskrivs här. TW är CSO för InvivoSciences INC. SH är anställd hos Gilson INC.

Acknowledgments

Detta arbete har stötts delvis av NIH bidrag, R44 GM087784 och R01 HL109505. Författarna tackar den tekniska och OEM teamet på Gilson, INC för utökad teknisk support.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates Corning 3596 96-well; Well volume: 360 μl; Cell growth area: 0.32 cm2; Individually wrapped
Seahorse Trough SeahorseBio 201308-100 Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs
Gilson Tips Gilson F167023 10 racks gilson 96 tips D200 tips
DMEM/F12 Life Technologies 12500062 DMEM/F12 powder.  Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter.
Growth Factor Reduced Matrigel Corning 354230 Referred to as, "extracellular matrix gel" in the text. Matrigel GFR, 10 ml
mTeSR1 StemCell Technologies 5857 mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance.
E8 Media StemCell Technologies 5940 TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance
Y27632 AdooQ BioScience A11001-50 Rock inhinitor Y-27632 2HCI
Accutase Innovative Cell Technologies ACCUTASE Referred to as, "proteolytic and collagenolytic dissociation reagent" in the text. Accutase 500 ml sterile cell solution
PBS Fisher SH30256FS PBS w/o Ca Mg 500 ml, 6/pk
Gilson PIPETMAX Gilson PIPETMAX http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature protocols. 2, (12), 3081-3089 (2007).
  2. Grskovic, M., Javaherian, A., Strulovici, B., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells--opportunities for disease modelling and drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 10, 915-929 (2011).
  3. Shi, Y. Induced pluripotent stem cells, new tools for drug discovery and new hope for stem cell therapies. Current Molecular Pharmacology. 2, 15-18 (2009).
  4. Xu, X., Zhong, Z. Disease modeling and drug screening for neurological diseases using human induced pluripotent stem cells. Nature Publishing Group. 34, (6), 755-764 (2013).
  5. Kirouac, D. C., Zandstra, P. W. The systematic production of cells for cell therapies. Cell stem cell. 3, (4), 369-381 (2008).
  6. Ebert, P., Liang, J. W. Induced Pluripotent Stem Cells as a Disease Modeling and Drug Screening Platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60, (4), 408-416 (2012).
  7. Pa Lalit,, Hei, D. J., Raval, A. N., Kamp, T. J. Induced pluripotent stem cells for post-myocardial infarction repair: remarkable opportunities and challenges. Circulation research. 114, 1328-1345 (2014).
  8. Compagnucci, C., Nizzardo, M., Corti, S., Zanni, G., Bertini, E. In vitro neurogenesis: development and functional implications of iPSC technology. Cellular and Molecular Life Sciences. 1-17 (2013).
  9. Yi, F., Liu, G. -H., Belmonte, J. C. I. Human induced pluripotent stem cells derived hepatocytes: rising promise for disease modeling, drug development and cell therapy. Protein & Cell. 3, 246-250 (2012).
  10. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. a, Elefanty, aG., Kamp, T. J. Differentiation of Human Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes: A Methods Overview. Circulation Research. 111, (3), 344-358 (2012).
  11. Okano, H., et al. Steps toward safe cell therapy using induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 112, 523-533 (2013).
  12. Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The Potential for Immunogenicity of Autologous Induced Pluripotent Stem Cell-derived Therapies. The Journal of biological chemistry. 289, 4571-4577 (2014).
  13. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science translational medicine. 4, (130), 130ra47 (2012).
  14. Gunaseeli, I., Doss, M. X., Antzelevitch, C., Hescheler, J., Sachinidis, A. Induced pluripotent stem cells as a model for accelerated patient- and disease-specific drug discovery. Current medicinal chemistry. 17, 759-766 (2010).
  15. Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 114, 201-235 (2009).
  16. Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends in Biotechnology. 30, 350-359 (2012).
  17. Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Stem/Progenitor cell sources of insulin-producing cells for the treatment of diabetes. Tissue engineering. 13, 1399-1412 (2007).
  18. Jing, D., Parikh, A., Canty, J. M., Tzanakakis, E. S. Stem cells for heart cell therapies. Tissue engineering. Part B, Reviews. 14, 393-406 (2008).
  19. Soldner, F., Jaenisch, R. iPSC Disease Modeling. Science. 338, 1155-1156 (2012).
  20. Olmer, R., et al. Long term expansion of undifferentiated human iPS and ES cells in suspension culture using a defined medium. Stem cell research. 5, (1), 51-64 (2010).
  21. Wang, Y., Chou, B. -K., Dowey, S., He, C., Gerecht, S., Cheng, L. Scalable expansion of human induced pluripotent stem cells in the defined xeno-free E8 medium under adherent and suspension culture conditions. Stem cell research. 11, (3), 1103-1116 (2013).
  22. Chen, V. C., et al. Scalable GMP compliant suspension culture system for human ES cells. Stem cell research. 8, (3), 388-402 (2012).
  23. Amit, M., Laevsky, I., Miropolsky, Y., Shariki, K., Peri, M., Itskovitz-Eldor, J. Dynamic suspension culture for scalable expansion of undifferentiated human pluripotent stem cells. Nature protocols. 6, (5), 572-579 (2011).
  24. Olmer, R., et al. Suspension Culture of Human Pluripotent Stem Cells in Controlled. Stirred Bioreactors. Tissue engineering. Part C. 18, (10), (2012).
  25. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S., Ph, D. Scalable Stirred-Suspension Bioreactor Culture. Tissue engineering. Part A. 16, (2), (2010).
  26. Oh, S. K. W., et al. Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 2, 219-230 (2009).
  27. Chen, A. K. -L., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnology advances. 31, 1032-1046 (2013).
  28. Yang, H. S., Jeon, O., Bhang, S. H., Lee, S. -H., Kim, B. -S. Suspension culture of mammalian cells using thermosensitive microcarrier that allows cell detachment without proteolytic enzyme treatment. Cell transplantation. 19, 1123-1132 (2010).
  29. Zweigerdt, R., Olmer, R., Singh, H., Haverich, A., Martin, U. Scalable expansion of human pluripotent stem cells in suspension culture. Nature. 6, (5), (2011).
  30. Kami, D., et al. Large-scale cell production of stem cells for clinical application using the automated cell processing machine. BMC biotechnology. 13, 102 (2013).
  31. Hussain, W., Moens, N., Veraitch, F. S., Hernandez, D., Mason, C., Lye, G. J. Reproducible culture and differentiation of mouse embryonic stem cells using an automated microwell platform. Biochemical engineering journal. 77, (100), 246-257 (2013).
  32. Tandon, N., Marolt, D., Cimetta, E., Vunjak-Novakovic, G. Bioreactor engineering of stem cell environments. Biotechnology Advances. 31, 1020-1031 (2013).
  33. Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15720-15725 (2009).
  34. Ludwig, T. E., Bergendahl, V., Levenstein, M. E., Yu, J., Probasco, M. D., Thomson, J. A. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature. 3, 637-646 (2006).
  35. Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature methods. 8, (5), 424-429 (2011).
  36. Kinney, M. A., Sargent, C. Y., McDevitt, T. C. The multiparametric effects of hydrodynamic environments on stem cell culture. Tissue engineering. Part B, Reviews. 17, 249-262 (2011).
  37. Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem cells (Dayton, Ohio). 31, (2013).
  38. Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, (7175), 141-146 (2008).
  39. Chambers, I., et al. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113, (5), (2003).
  40. Wright, A. J., Andrews, P. W. Surface marker antigens in the characterization of human embryonic stem cells. Stem cell research. 3, (1), 3-11 (2009).
  41. Thomson, J. a Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282, (5391), 1145-1147 (1998).
  42. Mayshar, Y., et al. Identification and classification of chromosomal aberrations in human induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7, (4), 521-531 (2010).
  43. Martins-Taylor, K., Xu, R. -H. Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells. Stem cells(Dayton, Ohio). 30, (1), 22-27 (2012).
  44. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, (7151), 313-317 (2007).
  45. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature. 26, (11), 1276-1284 (2008).
  46. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (27), E1848-E1857 (2012).
  47. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature biotechnology. 24, (2), 185-187 (2006).
  48. Wang, L., Li, L., Menendez, P., Cerdan, C., Bhatia, M. Human embryonic stem cells maintained in the absence of mouse embryonic fibroblasts or conditioned media are capable of hematopoietic development. Blood. 105, (12), 4598-4603 (2005).
  49. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science(New York, N.Y.). 318, (5858), 1917-1920 (2007).
  50. Kim, C. Disease modeling and cell based therapy with iPSC: future therapeutic option with fast and safe application. Blood research. 49, 7-14 (2014).
  51. Jung, E. -M., et al. Evaluation of developmental toxicity using undifferentiated human embryonic stem cells. Journal of applied toxicology: JAT. (February. (2014).

Comments

1 Comment

  1. For setting the protocol how could I download it? Especially I would like to know how the ramp is specified in your protocol? Did you made ramp as a specialized labware or did you do advanced protocols(injections, moves, etc)?
    Sincerely Ji Young Ryu

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 13, 2017 - 3:45 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics