갓 격리 된 사구체 족 세포의 단일 채널 분석 및 칼슘 이미징

1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin
Biology

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Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli. J. Vis. Exp. (100), e52850, doi:10.3791/52850 (2015).

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Abstract

Introduction

신장은 다양한 물질에 대한 항상성 균형을 유지하고 전체의 혈압을 결정하는 방식으로 혈액량을 조절한다. 하이퍼 또는 저혈압에 이르기까지의 신장의 여과, 재 흡수 또는 분비 리드의 장애 또는 동반 병적 인 상태는, 결국 신장 이식을 필요로 무대 신장 질환을 종료합니다. 모세 혈관 내피, 기저막 및 상피 세포의 단세포 층 - - 슬릿 다이어프램 무결성 및 기능 (1)의 유지에 중요한 역할을 족 세포, 신장 필터링 부 (사구체)은 3 개의 층으로 이루어져있다. 투과성 사구체 필터 부전은 단백뇨와 같은 거대 분자의 소변 손실이 발생합니다. 각종 제제는 사구체 여과 장벽의 완전성을 결정 족 세포 및 그들의 발 프로세스의 구조에 영향을 미칠 수있다.

족 세포는 glom의 유지에 관여eruli 여과 기능. 이는 발 세포 부적절한 칼슘 처리가 세포 손상에 이르게하고 병증 2,3- 다양한 형태의 진행에 중요한 역할을하는 것으로 확립되어있다. 따라서, 발 세포의 기능 연구를위한 수단이 될 것입니다 세포 내 칼슘 농도의 변화를 직접 측정 가능하게하는 모델의 개발. 격리 사구체 이전 알부민 반사 계수의 측정 (4) 및 전체 셀 전기 생리 패치 - 클램프 측정 5,6-에서 적분 셀룰러 전류의 평가를 변경 포함한 수많은 연구에 사용 하였다. 본 논문에서는, 약학 제제의 적용에 응답하여 세포 내 칼슘 농도의 변화를 측정하는 세포 내 칼슘의 기저 레벨을 추정하고, 개별 칼슘 채널의 활성을 평가하기 위해 연구를 허용하는 프로토콜을 기술한다. Ratometric 칼슘 농도 측정 및 패치 클램프 electrophysiology 각각 발 세포 및 채널 활동 내에서 세포 내 칼슘 농도의 변화를 결정하는데 사용 하였다.

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Protocol

동물 사용 및 복지 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 검토 및 승인 프로토콜 다음과 같은 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드를 준수해야합니다.

1. 신장 세척

  1. (그러나 다른 연령과 성별의 다른 균주에 따라 변경 사용할 수 있습니다, 스프 라그 돌리 변형이 제안) 8-12주 세 남성 쥐를 사용합니다.
  2. IACUC 프로토콜에 의해 허용 된 절차에 따라 동물을 마취; 마취 깊이를 모니터링하고 동물을 검사한다. 수술의 상세한 설명은 1.3에서 수행되는 - 1.8 Ilatovskaya 외에서 찾을 수있다 (7).
  3. 적절한 마취 후, 온도 조절 수술 테이블에 동물을 배치 (최대 길이 3 인치) 복부의 정중선 절개를하고, 대정맥과 대동맥을 발견.
  4. 복강 및 상 장간막 동맥과 복부 주위에 합자를 삽입그 위의 대동맥; 결찰하지 않습니다.
  5. 신장 동맥 아래 복부 대동맥을 해부하고, 주위에 두 개의 합자를 배치하지만, 결찰하지 않는 무딘, 다음 합자 위의 대동맥을 고정하고 밑실 넥타이.
  6. 클램프 아래 (PBS로 가득 주사기 펌프에 부착) 폴리에틸렌 PE50 튜브와 대동맥을 카테 테르를 꽂다 두 번째 합자와 카테터를 해결; 클램프를 제거 펌프를 켜고 대동맥을 결찰 및 복강 동맥과 장간막. 빠르게 압력을 완화하기 위해 신장 정맥 절개를합니다.
  7. / 분의 6 ml의 속도로 2 ~ 3 분 동안 프리 - 냉각 PBS로 대동맥 달이다.
  8. 관류, 소비세를 중지하고 7 신장을 디 캡슐하고, PBS 용액에 얼음에 넣어. IACUC에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 동물을 안락사.

쥐 사구체 2. 분리

  1. RPMI 1640에서 5 % BSA의 신선한 용액 30 ㎖를 준비합니다.
  2. 면도날과 가위를 사용하여,모두 신장의 피질을 분리 한 다음 균일까지 말하다. 이 절차는 앞에서 설명 하였다 7.
  3. 100 메쉬 스테인레스 강 체를 통해 이전 단계 동안 다진 조직을 밀어 주걱을 사용하여 (BSA / RPMI 5 % 용액에 미리 침지). 관류 및 중력에 의해이 플로우 스루는 140 메쉬 체를 통과 할 수 있도록 수집.
  4. , 미리 적신 200 메쉬 체를 사용하여 체 140 메쉬로부터 수집 관류 필터 여과 액을 폐기하고 (10) 자체의 상단 세척 -에 침강 사구체를 수집하기 위해 제조 된 BSA / RPMI 용액 15 ml에 체.
  5. 최대 20 분 동안 튜브의 하단 사구체 침전물을 15ml의 튜브에 얼음 사구체 함유 BSA / RPMI 용액을 넣고하자. 튜브의 하단에있는 사구체 농축 명확하게 볼 수 있습니다. 튜브에 약 2 mL를 떠나, 초과 솔루션을 제거합니다.

3. 단일 채널 패치 클램프 엘ectrophysiology

  1. MW 70,000로 코팅하여 5 × 5mm 커버 유리 칩을 준비 - 150,000 폴리 ʟ 라이신, 건조 할 수 있습니다. 커버 유리 당 물에 0.01 % 멸균 여과 된 용액의 약 30 μl를 사용합니다.
  2. RT에 대한 실험 솔루션을 따뜻하게하고, 패치 클램프 챔버와 피펫을 입력합니다. TRPC 채널 모니터링의 경우, mM의에서 목욕 솔루션, 사용 : (126)의 NaCl, CaCl2를 1, 10 HEPES, 2의 MgCl 2, 10 포도당, 산도 7.4; 피펫 : (126)의 NaCl, CaCl2를 1.5, 10 HEPES, 10 포도당; pH가 7.4.
    1. 추천 연구 (관련이 없습니다 내생 채널의 활동을 차단하는 피펫 솔루션에 억제제를 추가 있습니다 : 100 μm의 니플 룸산 또는 DIDS이 (칼슘 부활 CL 차단 - 채널), 10 mM의 차 (을 억제하는 큰 컨덕턴스 칼슘 + - 의존적 K + 채널), 10 나노 iberiotoxin (,)를 10 μM 니 카르 디핀 칼슘 부활 K + 채널을 차단하는 (N 형 칼슘을 차단2+ 직접 패치 클램프 실험 전 채널)).
  3. 조심스럽게 사구체 함유 용액을 혼합 한 후 폴리 ʟ 라이신 코팅 커버 유리 칩에 약 50 μl를 적용합니다. 사구체는 약 5 분 동안 연결하자.
  4. 패치 - 클램프 챔버 욕 용액으로 미리 충전하는 사구체으로 유리 절삭 가루를 이동; 부착 사구체의 제거를 보장하기 위해 1 분 / mL의 3 분의 속도로 관류 챔버.
  5. 세포 부착 모드 7에서 기존의 패치 클램프 실험을 실시한다. 유리 피펫 (7 - 10 MΩ 피펫 저항) 피펫 부드러운 흡입 (고립 사구체의 표면에 발 세포 부착 피펫을 적용하여 발 세포 막 사이에 고 저항 시일을 형성하기에,도 2에 도시 왼쪽).
  6. 세포 부착 된 측정을 위해 팔 극 베셀 필터에 의해 300 Hz에서 전류를 낮은 패스.
  7. 유6 시간 - SE는 최대 4에 대한 패치 클램프 실험에서 사구체를 격리합니다. 얼음에 주식 사구체의 비율을 유지합니다.

족 세포에서 세포 내 칼슘 농도의 4 비례 공 초점 형광 측정

  1. 원뿔 튜브 0.5 ml의 (2.5에서 설명) 사구체 분획 500 μl를 넣고 칼슘 염료의 Fura 레드, AM 및 FLUO-4, 오전를 추가합니다. 2 mM의과 (DMSO에 용해 -20 ° C에서 저장,)은 Fura 레드, AM 및 FLUO-4, 오전, 각각의 1 mM의 재고 농도를 사용하여 사구체 분획 500 ㎕를 각 염료의 2.5 μl를 사용합니다. 즉시 염료 첨가 후 알루미늄 호일로 커버 튜브.
  2. 실온에서 1 시간에 적어도 20 분까지를위한 회전하는 통에 장소 튜브.
    주 : 약리 제제는이 단계에서 첨가 될 수있다.
  3. , 커버 글라스를 준비 폴리 ʟ 라이신로를 커버하고 70 ℃로 가열 플레이트 세트를 사용하여 건조 할 수 있습니다.
  4. 칼슘 염료 로딩 COMPLET되면E는, 폴리 리신 코팅 ʟ 커버 슬립을 함유 용액 사구체 100 μL를 적용하고 약 5 분 동안 표면에 충실하자. 촬상 챔버 내로 사구체 부착 된 커버를 장착하고 욕 용액 (() mm 단위 함유 :의 MgCl 2 (145)의 NaCl, 4.5 KCl을, 2, 10 HEPES, pH가 7.35)으로 관류 3 ㎖의 속도 / 분 제거 사구체 부착하고 나머지 염료.
  5. 488 nm의 여기 파장과 방출 필터 (각각 FLUO-4의 Fura 레드에 대한 25분의 525과 25분의 650 nm의)에 공 초점 레이저 주사 현미경을 설정합니다. 원하는 주파수와 해상도 이미징 소프트웨어를 설정합니다.
  6. 시야에서 사구체를 찾아 다음 형광 신호의 검출을 켭니다. 신호의 포화를 피하기 위해 각각의 염료에 대해 레이저의 강도를 조정한다. 직접 유리에 부착 된 족 세포에 초점면을 선택합니다. 이는 약물에 반응 사구체의 수축에 의한 영향을 최소화신청. 선택의 사구체가 아니라 유리에 연결되어 있는지 다시 확인;
  7. 선택의 초점면을 이미징 시작, (높은 해상도 이미지에 대한 60X / NA 1.4 또는 유사한 대물 렌즈를 사용합니다. 빠른 칼슘 과도 변화를 시각화하기 위해 4 초에서 설정 한 주파수로 512 X 512 이미지를 가지고) 관심의 약물을 적용 하고 응답을 기록합니다.
    1. (사구체 족 세포의 표면 상에 이미징을 보장하기 위해 가능한 한 유리 표면에 가까운) 원하는 초점면을 선택한다. Fluo4 및 FuraRed 채널에 형광의 강도를 확인하고, 사구체 분명히 시야에서 볼 수 있는지 확인하십시오.
    2. 영상을 시작합니다. 어떤 약물의 응용 프로그램을하기 전에, 기본 형광 기록 적어도 1 분은 신호가 (이 갑작스런 스파이크가 없거나 신호의 페이딩) 안정적인지 확인합니다.
    3. 마이크로 피펫의 도움으로 원하는 약물을 적용; 주의 및 약물이 잘 확산 할 수 있었다 확인하고 glomer에 도달ulus. 필요한 경우, 상기 선택된 초점면을 감시하고 있기 때문에 약물 애플리케이션의 초점이 이동되지 않았다는 것을 확인 부드럽게 욕 용액을 섞는다.
    4. Fluo4 및 FuraRed 신호에 대한 형광 강도의 변화를 기록한다. 녹음이 신호가 고원 수준에 도달 또는 피크에 도달 한 후베이스 라인으로 복귀 할 때까지 대기하여 충분히 긴 있는지 확인합니다. 필요한 경우 솔루션의 변경 또는 다른 약물의 추가를 수행합니다.
    5. 녹음을 중지하고 소프트웨어의 기본 형식으로 파일을 저장합니다.

칼슘 측정 5. 이미지 분석

  1. 기본 ND2 형식으로 이미지를 가져 오기 할 수 있습니다 ND 유틸리티 플러그인을 갖춘 ImageJ에 열려있는 소프트웨어와 이미지 분석을 수행합니다.
  2. 이미지 시퀀스를 가져옵니다; 채널을 분할하고 hyperstack 그레이 스케일 모드를 사용하십시오.
  3. O에 ImageJ에 소프트웨어의 분석 → 도구 → 투자 수익 (ROI) 관리자 경로를 따라펜 투자 수익 (ROI) 관리자 창. 타원형 선택 도구 및 투자 수익 (ROI) 관리자의 "추가 (T)"기능을 사용하여 관심 (족 세포)의 여러 지역을 선택합니다. ROI 마지막으로, 배경 영역을 선택; (저장 → 기타) 선택된 ROI를 저장합니다.
  4. 분석을 위해 선택된 채널을 포함하는 윈도우를 강조. , 투자 수익 (ROI) 관리자에서 멀티 측정 기능 → 이상을 사용 튀어 나올 대화에서 "하나의 행 조각 당"상자를 표시 한 다음 확인을 클릭합니다. 선택 집합 측정 → 메뉴 옵션의 결과에 입력 "회색 평균치"와 표시되는 각 ROI에 대한 화소 강도 값을 계산 : 결과는 결과 창에서 설정 될 수 형식으로 표시 될 각각의 투자 수익 (ROI)에 대한 별도의 컬럼에서 결과 창.
  5. 바람직한 데이터 분석 소프트웨어로 각 채널 (FLUO-4의 Fura 레드)에 대한 ROI 측정 강도 값을 복사; 각 DAT에서 빼기 배경 강도 값점.
  6. 각 시점의 Fura 들어 레드 채널 FLUO-4의 세기의 비율을 계산한다. 플롯 분산 / 각각의 투자 수익 (ROI)에 대한 칼슘 과도의 라인 포인트 - 시간 변경. 선택 사구체에 대한 평균 / SE 값을 계산합니다.
    참고 : 시간 ​​열은 4.5에서 선택한 영상 주파수에 따라 설정해야합니다.

FLUO-4 형광 신호를 이용하여 제 세포 내 칼슘 농도 계산

  1. 사구체의 샘플을 가지고 4.7 단계로 실험 프로토콜을 수행합니다. 배경 형광의 기록 후에 조 용액 및 기록 형광 강도 증가 (10 μM이어야 화장실 실내에 최종 농도) 이오 노마 이신을 추가한다. 강도가 최대에 도달하고 붕괴가 시작되면, MnCl 2 추가 8 형광을 켄칭 (최종 농도 5 mM의이어야).
  2. 6.1에서 얻어진 데이터를 분석한다. 수득 FLUO-4 ROI 신호 세기 값이있어서 복사선호하는 분석 소프트웨어에 의해 5.1-5.5에 설명 된 프로토콜.
  3. 수식을 이용하여 ROI에 대응 발 세포에서 (㎚)에서 세포 내 칼슘 농도를 계산한다 :
    식 (1)
    K d를 FLUO-4 (345 ㎚)에 대한 일정한 소정 해리이고, F는 (기준)에 대한 칼슘 농도를 산출하는 평가시기에서의 세기는이고, F 최소 및 F 최대의 강도 값이며 (이오 노마 이신 신청 후) 및 (MnCl 2) 형광의 담금질 후의 칼슘 최대 하중 점의 각각 (도 3 참조).

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Representative Results

여기에서는 족 세포에서 칼슘 농도 급성 변화를 측정하는 문제를 해결. 1 갓의 족 세포에서 고해상도 실시간 형광 공 초점 이미지 및 단일 이온 채널 활성 레코딩을 수행하기 위해 설계된 실험 프로토콜의 개략도를 나타낸다 고립 된 쥐 사구체. 쥐를 마취 한 후 간단히, 신장은 피를 취소 PBS로 플러시해야합니다. 그런 다음, 신장 절제와 디 캡슐화하고, 사구체는 차동 체질에 의한 신장 피질에서 분리되어 있습니다. 시료의 일부는 패치 - 클램프 분석을 위해 취해질 수 있으며, 나머지는 형광성 칼슘 염료 FLUO-4 AM과의 Fura 레드로드 될 수 있고, 공 초점 비율 적 칼슘 이미징을 수행하기 위해 AM.

단일 이온 채널 활성의 측정은 전기 생리 사구체 차단 후 즉시 수행 될 수있다. 이온 차의 활동nnels 패치 - 클램프 방법의 세포 부착 및 전체 셀 구성에서 모두 측정 할 수있다. 도시 된 접근법의 타당성을 입증하는 것은 단일 TRPC 형 칼슘 이온 전도성 채널 활동 (도 2)의 기록이다. 또한, 세포 - 투과성 또는 수용체 - 결합 단일 이온 채널의 레벨에서 족 세포에서 칼슘 유입에 대한 그들의 효과를 테스트하기 위해 약물을 적용하는 것이 가능하다.

단일 이온 채널 활성 평가를 허용 접근법 발 세포 기능을 특성화 할 수있는 다양한 데이터를 생성한다. 그러나, 크게 전체 셀 레벨에서 칼슘 농도의 변화를 측정함으로써 보충 될 수있다. 이러한 연구를 수행하려면, 갓 고립 된 사구체는 높은 처리량 공 촛점 이미징을위한 형광 염료와 함께로드되었다. 높은 광학 해상도로 한 번에 여러 족 세포 내의 칼슘 농도를 모니터링 할 수있다. (3)는 시간 -을 보여주는 도표발 세포 내 칼슘 농도의 변화를 평가하기위한 전형적인 실험 과정. 발 세포 내 기저 칼슘 농도를 FLUO-4 형광에 기초하여 평가 하였다. 1 분 (F)에 대한 기저 신호 강도를 기록 후, 이오 노마 이신을 적용한 후, MnCl 2 급냉하는 피크 형광 (F 최대)에 도달되도록한다 (F 유의한다). 6.3의 식에 따라, 실험의 각 시점에서 FLUO-4 신호의 강도는 세포에 칼슘 이온의 실제 농도로 변환 될 수있다. 그래프로부터 알 수있는 바와 같이, 배경 (약 400 임의 단위)의 평균 형광을 건강한 비 - 아폽토시스 세포에서의 세포 내 칼슘 농도가 정상 범위 내에 140nm를로 변환한다.

기술 접근​​ 방식의 중요성과 유용성 급성 칼슘 transie을 측정 할 수 있습니다 다른 응용 프로그램에 의해 정당화된다다양한 약물에 반응 족 세포에 국세청은. 그림 4a는 전에 10 μm의 ATP를 첨가 한 후 (4.5에서 설명) 2 mM의 칼슘 함유 용액에 FLUO-4의 Fura 레드로 염색 쥐 사구체의 대표 이미지를 보여줍니다. 녹색의 극적인 증가를 주 (FLUO-4 AM) (화살표로 표시) 족 세포의 형광 및은 Fura 레드 형광의 감소 (빨간색 사색). FuraRed가 다운 반면 세포 내 칼슘 농도가 4 강도가 상승 할 때 증가 FLUO Fluo4 FuraRed과는 반대 방향 즉, 488 나노 미터의 여기 파장에서의 칼슘 농도의 증가를 반영한다. 그 때문에 FuraRed의 형광의 이중 여기 자연 가능하다. 여기 파장에 따라서는 형광에 해당 증가 또는 감소와 칼슘 바인딩 (420 ㎚) 또는 칼슘이없는 (488 ㎚) 형광처럼 행동 할 수 있습니다. 따라서, 단독으로 비율 적 촬상 모드 FuraRed의 사용은 그러나의 requir 가능420 nm 내지 488 nm 인 - 두 여기 파장 ES. 이것은 회 이상 (하나의 여기 파장의 사용에 비해)의 촬상 주파수를 감소; 연구원은 영상의 빠른 속도를 유지하려는 것인지, 이미지 해상도는 감소한다. 이들 형광체는 동일한 488 nm의 레이저에 의해 여기 및 발광 스펙트럼의 좋은 차별화를 제공 할 수있다 그러나 FLUO 4 FuraRed는 이미징 주파수 해상도 또는 감소의 손실없이 비율 적 모드에서 함께 사용될 수있다. 로아에서 요약 전형적인 과도 그림 4A의 화살표는 그림 (b)에 표시됩니다 표시; 그래프는 분명히 몇 분 이내에 붕괴 10 μM의 ATP의 첨가 한 후 Fluo4 / FuraRed 강도 비의 급성 증가를 보여줍니다. 이미지는 4 초마다 촬영하고, 따라서,이 기술은 세포 내 칼슘 농도의 신속한 변화를 관찰 허용한다.


실험 프로토콜의 도식 표현을 그림. 동물이 제대로 마취 및 수술 준비 후에, 신장 혈액을 제거하기 위해 PBS로 플러싱한다. 그런 다음, 신장 절제와 디 캡슐화하고, 사구체는 차동 체질에 의한 신장 피질에서 분리되어 있습니다. 여기에, 샘플의 일부가 패치 클램프 분석을 위해 촬영하고, 나머지는 형광 칼슘 염료 및 공 초점 비율 계량 칼슘 이미징을 수행와 함께로드됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
PODO에 TRPC 칼슘 채널의 활성을 나타내는도 2 기록 주제갓 격리 된 쥐의 사구체의 cytes. 왼쪽 패널은 세포 부착 구성에서 전기 생리 학적 기록시 사구체의 표면에 발 세포 본체에 부착 패치 - 클램프 피펫을 보여준다; 캡슐화 사구체의 부분 화상의 하부 우측 코너에서 볼 수있다. -40 MV 들고 전위 쥐의 사구체의 발 세포에서 만든 세포 부착 된 패치에서 TRPC 같은 채널 활동의 대표 현재 추적이 오른쪽에 표시됩니다. C 및 O 내가 닫힌 및 오픈 채널 레벨을 표시, 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
도 3은 대표적인 실험에서 세포 내 칼슘 수준을 평가하기위한 족 세포는. 사구체를 FLUO-4 AM, 형광 강도가 기준 및 이오 노마 이신과 MnCl 2 첨가 한 후 기록되어 적재되어, 세포 내 칼슘 농도를 측정 하였다. 그래프는 염료 및 낮은 형광 강도 (F 최소)의 결과를 소멸하고 MnCl 2, (FLUO-4 형광, F 최대의 최대 제조) 이오 노마 이신에 응답하여 형광 신호의 변화를 보여준다. 각 시점에 대한 형광 (좌측 횡축)의 강도는 6.3의 식에 따라 (오른쪽 횡축) nanomoles의 실제 칼슘 농도로 변환 될 수있다. F, F 최대와 F 분을 계산했을 때 시점에서 족 세포를 보여주는 이미지 세트를합니다. 여기에 표시된 그래프는 원 (ROI)에 의해 표시 발 세포의 형광 강도를 반영; 이미지는 매 4 초를 촬영했다."NK>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 ATP에 대한 응답으로 족 세포에서 칼슘 과도 4. 측정. (A)하기 전에, 10 μM ATP를 첨가 한 후 2 mM의 칼슘 - 함유 용액 FLUO-4 (녹색 사색)과의 Fura 레드 (적색 사색)로 염색 야생형 래트 사구체를 나타내는 대표적인 이미지. 약물의 도장 전에 낮은 강도 녹색의 형광을 주목해야한다. (B) 10 ㎛ 인 ATP의인가에 의해 유발 된 족 세포에서 세포 내 칼슘의 일시적 예 요약. 일부터 칼슘 저장소 칼슘 유입의 자극 및 공핍 차지하는 약물을 첨가 한 다음 FLUO-4 /의 Fura 적색 형광 강도 비의 강하고 빠른 증가를 참고즉 외부의 세포에, 세포 내 칼슘 농도의 상승을 초래. 오차 막대가 같은 사구체의 11 족 세포에 대해 계산 수단의 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

여기에 설명 된 방법은 설치류 사구체의 족 세포에 의한 칼슘 처리의 분석을 위해 수 있습니다. 이 기술은 패치 클램프 단일 채널 전기 생리학 및 형광 비율 계량 공 초점 영상의 응용 프로그램을 할 수 있습니다. 그러나, 두 방식은 자신에, 별도로 사용할 수있다. 제안 된 프로토콜은 1) 신장 플러시 등 여러 상대적으로 간단한 단계를 가지고있다; 2) 차동 체질에 의한 사구체의 분리; 3) 패치 클램프 전기 생리학 실험을 수행, 또는 세포 내 칼슘의 변화의 비율 계량 공 촛점 이미징을위한 형광 칼슘 라벨 염료와 사구체의 배양.

사구체 Gloy에 기초하여 수정 된 프로토콜을 분리하려면 외. (5)를 사용 하였다. 차동 체질의 현재 기술의 주요 장점은 복잡하고 시간 소모적 인 단계를 필요로하지 않는, 따라서 보우만 캡슐 스트리핑 사구체 발생하고 있다는수동 캡슐화의. 격리 된 부분에서 사구체의 대부분이 디 캡슐 레이트, 그러나 연구원도 캡슐화 사구체이 있다는 것을 알고 있어야합니다. 캡슐 족 세포에 도달하는 약물을 방지으로는, 보먼의 캡슐의 벗겨 사구체가 몇 군데 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 그림 2에서 보는 바와 같이 캡슐화 사구체 부드럽고 둥근 모양의 표시 반면, 디 캡슐화 사구체는 별개의 모세 혈관과 발 세포 시체가있는 거친 표면을 가지고있다. 또한, Fluo4 및 FuraRed로드 사구체가 디 캡슐화들에 비해 덜 강한 형광 신호를 방출 캡슐.

얻은 쥐 사구체의 비율은 95 % (근위 세뇨관의 흔적을) 순수하고 필요한 경우 쉽게 서쪽 블로 팅 또는 다른 분자 생물학 응용​​ 프로그램을 사용할 수 있습니다. 그것은이 준비 족 세포가 모세 혈관에 연결되어 있는지 매우 중요 한 부분으로 그대로 발 프로세스와 기능을 유지네이티브 사구체 여과 장치 기계. 족 세포에 의한 칼슘 처리의 메커니즘은 당뇨병이나 고혈압 9-12과 같은 질환에서 신장 합병증의 개발과 예방에 필수적인 규제 역할을 수행. 급성 부상 발 세포 형태 및 구조를 변경 단백뇨 2,3,13-15 발생할 수 있다는 사실에 의해 입증 족 세포는 투과성 장벽에 크게 기여한다. 그러므로, 쉽게 제조 될 수 스크리닝 약물에 대한 이들 세포의 칼슘 유입의 반응성을 관찰하기 위해 매우 중요하다. 이는 연구자가 병적 상태 족 세포를 프로빙하는 경우, 일반적으로 단백뇨 및 사구체 손상이 발생할 경우, 고혈압 또는 당뇨병에 대해, 사구체의 수율은 건강한 동물의 것보다 덜 순수 할 수 있다는 것을 이해해야한다. 그것은 항상 손실을 피하기 위해 분리 과정의 각 단계에서 사구체 분획을 모니터링 할 것을 권장조직. 어떤 경우에는, 세거나 너무 어린 동물에서 주로 병에 걸린 사구체 또는 사구체 큰 / 작은 메쉬 체의 선택을 포함하여 분리 과정의 개별 조정을해야 할 수도 있습니다.

우리는 16 족 세포에서 칼슘 TRPC 채널의 억제에 비 스테로이드 항 - 염증 약물의 효능을 결정하기 위해 초기에이 방법을 적용했다. 이러한 연구 7,16-22 따라 우리 족 세포 기능을 조절 몇몇 중요한 메커니즘을 확립하는 방법을 설명 채용. 예를 들어 우리는 쥐의 족 세포에서 P2 (퓨린) 수용체의 프로필을 설명하고 마우스 사구체에서 안지오텐신 II에 의한 칼슘 유입의 규제를 정의했습니다. 이후 원고 (20)에서 설명한 바와 같이, 프로토콜은 이러한 마우스로서 래트에서뿐만 아니라, 다른 종에서뿐만 아니라 유사한 연구를 수행하도록 구성 될 수있다. 두 형광체의 사용에 비례 칼슘 형광 이미징 (염료 - FLUO-4의 Fura 적색)의 부가 데이터의 신뢰성을 보장하고, 필요 칼슘 이미징 다른 형광 염료와 조합 될 수 있다면 족 세포 내에서 다른 물질의 변화를 모니터링. 예를 들어, 우리는 DAF-FM 염료의 도움으로 산화 질소를 측정하기 위해이 방법을 사용 하였다. 패치 - 클램프 전기 생리학은 단독으로 사용할 수도 있고 칼슘 이미징과 조합 (설정은 허용). 외에도 칼슘 채널에서, 다른 방법은 이온 채널의 활성을 기록 허용한다. 최근 박사 드라이어의 그룹 (23)에 의해 도시 된 바와 같이 또한, siRNA의 형질 감염과의 사용은 더욱 적용 범위를 확장 할 수있다.

종래의 표면 형광 현미경 대신 적은 저렴한 촛점 이미징 여기서 사용될 수있다. 그러나 연구원은 넓은 필드 형광 현미경의 유효 감도가 일반적으로 초점이 맞지 빛에 의해 제한되는 것을 알고 있어야합니다. 공 초점 imagin이 (의 비교g)의 단일 ROI (발 세포) 또는 발 프로세스 높은 해상도 이미지를 생성 할 수없는 등의 제약을 야기한다. 이 사구체과 깊은 조직의 표면을 구별하기 어렵다 더욱이, 넓은 필드 현미경 족 세포의 식별을 복잡하게한다. 현재로서는 공 촛점 이미징을위한 다양한 형광 물질의 상용화는 훨씬 더 빠르게 확장하고있다. 대안 적으로, 표면 형광 연구가 용이 동시 내 Ca 2+ 및 단일 채널 활동 기록을 제공 할 수있는 전기 생리 설치와 결합 될 수있다. 필터 휠 단색 중성 밀도 필터 설정과 사구체 족 세포의 Fura2-AM 로딩 널리 사용되지만, 항상 질 높은 해상도의 영상에 적합하지 않다.

또한 격리 기능 사구체 생리적 자극에 응답하여 체적을 변화시킬 수 있음을 주목해야한다. 연구원을 수행하는 동안이 알고 있어야합니다실험은, 신중 초점의 손실을 방지하기 위해 공 초점 연구 중에 초점면을 선택하고, 의도하지 않은 수축 또는 이완을 테스트하기 위해 신규 한 약물의 선택에 따라 제어 실험을 수행한다.

이 기술은 설치류 배경의 다양한 약물 치료 또는 다른 조작 후 단일 이온 채널에서 칼슘 유입의 변화와 개별 셀 수준을 모니터링 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 수정 된 프로토콜은 의심 할 여지없이 매우 귀중한 정보를 제공 할 것이다 신장 생검으로부터 얻은 조직에 적용 할 수 있기 때문에 이러한 기술은 또한 인간 신장 질환 연구에 사용될 수있다. 또한, 칼슘 농도 측정은 정상 및 병리학 적 상태에서 족 세포 내 칼슘 처리의 조절로 심층과 기계론 통찰력을 더 제공 할 수있다 실시간 전기 생리 패치 클램프 실험와 결합 될 수있다.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgements

저자는 현미경 실험과 우수한 기술 지원을 글렌 슬로 컴 (위스콘신 의과 대학)과 콜린 A. Lavin (니콘 인스트루먼트, Inc.에) 감사의 말씀을 전합니다. 그레고리 블라스는 원고의 중요한 교정을 인정한다. 이 연구는 (AS에) 1-15-BS-172 및 DVI (에) 신장의 미국 사회에서 벤 제이 Lipps 연구 활동을 부여 건강 보조금 HL108880 및 미국 당뇨병 협회 (American Diabetes Association)의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluo4 AM Life Technologies F14217 500 µl in DMSO
FuraRed AM Life Technologies F-3020
Poly-ʟ-lysine Sigma-Aldrich P4707
Pluronic acid Sigma-Aldrich F-68 solution
Ionomycin Sigma-Aldrich I3909-1ML
Tube rotator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-753 Germany
Nikon confocal microscope (inverted) Nikon Nikon A1R Laser exitation 488 nm. Emission filters 500-550 nm and 570-620 nm
Objective Nikon Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil
Cover Glass Thermo Scientific 6661B52
High vacuum grease Dow Corning Silicone Compound
Software Nikon Nikon NIS-Elements
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Patch clamp amplifier Molecular Devices MultiClamp 700B
Data acquisition system Molecular Devices Digidata 1440A Axon Digidata® System
Low pass filter Warner Instruments LPF-8 8 pole Bessel
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B150F-4
Micropipette puller Sutter Instrument Co P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microforge Narishige MF-830 Japan
Motorized micromanipulator Sutter Instrument Co MP-225
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti
Microvibration isolation table TMC equipped with Faraday cage
Multichannel valve perfusion system AutoMake Scientific Valve Bank II
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Software Molecular Devices pClamp 10.2
Nicardipine Sigma-Aldrich N7510
Iberiotoxin Sigma I5904-5UG
Niflumic acid Sigma-Aldrich N0630
DIDS Sigma-Aldrich D3514-25MG
TEA chloride Tocris T2265
RPMI 1640 Life Technologies 11835030 without antibiotics
BSA Sigma-Aldrich A8327 30% albumin solution
Temperature controlled surgical table MCW core for rodents
Steel sieves: #100 (150 μm), 140 (106 μm)
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200 Fisher Sci 50-871-316
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270 Fisher Sci 50-871-318
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400 Fisher Sci 50-871-320
mesh 200 Sigma-Aldrich s4145 screen for CD-1
Binocular microscope Nikon Eclipse TS100
Binocular microscope Nikon SMZ745
Syringe pump-based perfusion system Harvard Apparatus
Polyethylene tubing Sigma-Aldrich PE50
Isofluorane anesthesia VetEquip, Inc. 911103
Other basic reagents Sigma-Aldrich

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References

  1. Machuca, E., Benoit, G., Antignac, C. Genetics of nephrotic syndrome: connecting molecular genetics to podocyte physiology. Hum. Mol. Genet. 18, R185-R194 (2009).
  2. Haraldsson, B., Nystrom, J., Deen, W. M. Properties of the glomerular barrier and mechanisms of proteinuria. Physiol. Rev. 88, 451-487 (2008).
  3. Patrakka, J., Tryggvason, K. New insights into the role of podocytes in proteinuria. Nat. Rev. Nephrol. 5, 463-468 (2009).
  4. Savin, V. J., Sharma, R., Lovell, H. B., Welling, D. J. Measurement of albumin reflection coefficient with isolated rat glomeruli. J. Am. Soc. Nephrol. 3, 1260-1269 (1992).
  5. Gloy, J., et al. Angiotensin II depolarizes podocytes in the intact glomerulus of the Rat. J. Clin. Invest. 99, 2772-2781 (1997).
  6. Nitschke, R., et al. Angiotensin II increases the intracellular calcium activity in podocytes of the intact glomerulus. Kidney Int. 57, 41-49 (2000).
  7. Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).
  8. Snitsarev, V. A., McNulty, T. J., Taylor, C. W. Endogenous heavy metal ions perturb fura-2 measurements of basal and hormone-evoked Ca2+ signals. Biophys. J. 71, 1048-1056 (1996).
  9. Fukuda, A., Fujimoto, S., Iwatsubo, S., Kawachi, H., Kitamura, K. Effects of mineralocorticoid and angiotensin II receptor blockers on proteinuria and glomerular podocyte protein expression in a model of minimal change nephrotic syndrome. Nephrology (Carlton). 15, 321-326 (2010).
  10. Abramowitz, J., Birnbaumer, L. Physiology and pathophysiology of canonical transient receptor potential channels). FASEB J. 23, 297-328 (2009).
  11. Heeringa, S. F., et al. A novel TRPC6 mutation that causes childhood FSGS. PLoS ONE. 4, e7771 (2009).
  12. Zhang, X., Song, Z., Guo, Y., Zhou, M. The novel role of TRPC6 in vitamin D ameliorating podocyte injury in STZ-induced diabetic rats. Mol. Cell. Biochem. 399, 155-165 (2015).
  13. Bohrer, M. P., et al. Mechanisms of the puromycin-induced defects in the transglomerular passage of water and macromolecules. J. Clin. Invest. 60, 152-161 (1977).
  14. Olson, J. L., Rennke, H. G., Venkatachalam, M. A. Alterations in the charge and size selectivity barrier of the glomerular filter in aminonucleoside nephrosis in rats. Lab. Invest. 44, 271-279 (1981).
  15. Schiessl, I. M., Castrop, H. Angiotensin II AT2 receptor activation attenuates AT1 receptor-induced increases in the glomerular filtration of albumin: a multiphoton microscopy study. Am J Physiol Renal Physiol. 305, F1189-F1200 (2013).
  16. Ilatovskaya, D. V., Levchenko, V., Ryan, R. P., Cowley, A. W., Staruschenko, A. NSAIDs acutely inhibit TRPC channels in freshly isolated rat glomeruli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 408, 242-247 (2011).
  17. Peti-Peterdi, J. Calcium wave of tubuloglomerular feedback. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, F473-F480 (2006).
  18. Peti-Peterdi, J., Warnock, D. G., Bell, P. D. Angiotensin II directly stimulates ENaC activity in the cortical collecting duct via AT(1) receptors. J. Am. Soc. Nephrol. 13, 1131-1135 (2002).
  19. Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305, C1050-C1059 (2013).
  20. Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidney Int. 305, C1050-C1059 (2014).
  21. Schaldecker, T., et al. Inhibition of the TRPC5 ion channel protects the kidney filter. J. Clin. Invest. 123, 5298-5309 (2013).
  22. Roshanravan, H., Dryer, S. E. ATP acting through P2Y receptors causes activation of podocyte TRPC6 channels: role of podocin and reactive oxygen species. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 306, F1088-F1097 (2014).
  23. Anderson, M., Roshanravan, H., Khine, J., Dryer, S. E. Angiotensin II activation of TRPC6 channels in rat podocytes requires generation of reactive oxygen species. J. Cell. Physiol. 229, 434-442 (2014).

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