Análisis y calcio monocanal Imaging en los podocitos de los glomérulos recién aisladas

Biology

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Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli. J. Vis. Exp. (100), e52850, doi:10.3791/52850 (2015).

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Abstract

Introduction

Los riñones mantienen el equilibrio homeostático para diversas sustancias y regulan el volumen de sangre en una forma que determina la presión de la sangre total. Las perturbaciones en la filtración renal, reabsorción o plomo secreción o acompañar a los estados patológicos, que van desde la hiper o hipotensión que terminan enfermedad renal que eventualmente requiere un trasplante de riñón. La unidad de filtración renal (glomérulo) consiste en tres capas - el endotelio capilar, la membrana basal y una capa de una sola célula de las células epiteliales - podocitos, que desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la integridad y la función 1-rendija de diafragma. Disfunción en el filtro glomerular de permeabilidad selectiva provoca la pérdida urinaria de macromoléculas, tales como proteinuria. Varios agentes pueden afectar a la estructura de los podocitos y sus procesos de pie, que determinan la integridad de la barrera de filtración glomérulos.

Los podocitos están involucrados en el mantenimiento de la Glomfunción de filtración eruli. Se ha establecido que el manejo inadecuado de calcio por el podocitos conduce a la lesión de las células y juega un papel importante en la progresión de diversas formas de nefropatías 2,3. Por lo tanto, el desarrollo de un modelo que permite la medición directa de los cambios de concentración de calcio intracelular será fundamental para el estudio de la función de podocitos. Glomérulos aislados se utilizaron previamente en un numerosos estudios incluyendo la medición del coeficiente de reflexión albúmina cambia 4 y la evaluación de las corrientes celulares integrales en las mediciones electrofisiológicas de patch-clamp de células enteras 5,6. En el presente trabajo se describe el protocolo que permite al investigador para medir cambios en la concentración de calcio intracelular en respuesta a las solicitudes de los agentes farmacológicos, estimar los niveles basales de calcio dentro de las células, y evaluar la actividad de los canales de calcio individual. Mediciones de la concentración de calcio y Ratometric electrop patch-clamphysiology se utilizaron para determinar los cambios en la concentración de calcio intracelular dentro de la actividad de podocitos y el canal, respectivamente.

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Protocol

El uso de animales y el bienestar deben adherirse a la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio siguiendo los protocolos revisados ​​y aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC).

Flush 1. Riñón

  1. Emplear de 8 a 12 semanas de edad rata macho (sugerida es una cepa Sprague Dawley, sin embargo otras cepas de diferente edad y el género se pueden utilizar con los cambios apropiados).
  2. Anestesiar al animal de acuerdo con el procedimiento permitido por protocolo de IACUC; controlar la profundidad de la anestesia e inspeccionar el animal. La descripción detallada de la cirugía que se realiza en 01.03 a 01.08 se pueden encontrar en Ilatovskaya et al 7.
  3. Después de la anestesia adecuada, coloque el animal en una mesa quirúrgica con control de temperatura, hacer una incisión en la línea media del abdomen (hasta 3 pulgadas de largo), y descubrir la vena cava y la aorta.
  4. Inserte ligadura alrededor de los celíacos y mesentéricos superiores arterias y el abdomenaorta por encima de aquellos; no ligar.
  5. Blunt disección de la aorta abdominal por debajo de las arterias renales, y coloque dos ligaduras alrededor de ella, pero no ligar, a continuación, sujetar la aorta por encima de las ligaduras y atar el hilo inferior.
  6. Cateterizar la aorta con un tubo de PE50 de polietileno (que se adjunta a una bomba de jeringa llena con PBS) por debajo de la abrazadera y fijar el catéter con la segunda ligadura; quitar la pinza, encienda la bomba, y ligar la aorta y arterias mesentérica con celíacos. Hacer rápidamente incisión en la vena renal para aliviar la presión.
  7. Infundir la aorta con el PBS pre-enfriado para 2 o 3 min a una velocidad de 6 ml / min.
  8. Deje de perfusión, los impuestos especiales y decapsulate 7 los riñones, y los puso en el hielo en la solución de PBS. La eutanasia del animal según el protocolo aprobado por el IACUC.

2. Aislamiento de la rata Los glomérulos

  1. Preparar 30 ml de solución fresca de 5% de BSA en medio RPMI 1640.
  2. Utilizando una hoja de afeitar y tijeras,aislar la corteza de ambos riñones, y luego picar hasta homogeneidad. Este procedimiento ha sido descrito anteriormente 7.
  3. Empujar el tejido picada durante el paso anterior a través de un tamiz de acero inoxidable de malla 100 (pre-empapado en 5% de solución de BSA / RPMI) usando una espátula. Recoger el flujo a través y por la fuerza de gravedad permiten que el flujo a través pase a través de un tamiz de 140 mesh.
  4. Filtrar el flujo a través recogido de la malla 140 usando un tamiz de 200 tamiz de malla pre-empapado, desechar el filtrado, y lavar la parte superior del tamiz con 10 - 15 ml de la solución de BSA / RPMI preparado para recoger los glomérulos que el sedimento en el tamiz.
  5. Ponga la solución de BSA / RPMI que contiene glomérulos en el hielo en un tubo de 15 ml y dejar que el sedimento glomérulos en la parte inferior del tubo para un máximo de 20 min. El concentrado glomérulos en la parte inferior del tubo se puede ver claramente. Eliminar el exceso de solución, dejando aproximadamente 2 ml en el tubo.

3. monocanal Patch-clamp Electrophysiology

  1. Preparar 5 x 5 mm chips de vidrio cubierta por revestimiento con 70.000 MW - 150000 poli-ʟ-lisina, y dejar secar. Utilice aproximadamente 30 l de solución filtrada estéril 0,01% en agua por cubierta de vidrio.
  2. Calentar las soluciones experimentales a temperatura ambiente y llenar la cámara de patch-clamp y la pipeta. Para el monitoreo canales TRPC, utilice una solución de baño, en mM: 126 NaCl, CaCl2 1, 10 HEPES, 2 MgCl2, 10 glucosa, pH 7,4; pipeta: 126 NaCl, 1,5 CaCl 2, 10 HEPES, 10 glucosa; pH 7,4.
    1. Añadir inhibidores a la solución de la pipeta para bloquear la actividad de los canales endógenos, que no son relevantes para los estudios (recomendados son: 100 mM de ácido niflúmico, o DIDS (para bloquear Ca 2 + activados por Cl - canales), TEA 10 mM (para inhibir la de gran conductancia Ca 2 + - K + dependientes de canal), 10 nM iberiotoxina (para bloquear los Ca2 + activados por canales de K +), 10 mM nicardipina (para bloquear de tipo N Ca2 + canales)) directamente antes del experimento de patch-clamp.
  3. Mezclar suavemente la solución que contiene los glomérulos, y luego aplicar aproximadamente 50 l de a la cubierta revestida virutas de cristal poli-ʟ-lisina. Deje que los glomérulos conceden durante aproximadamente 5 minutos.
  4. Mover los chips de vidrio con glomérulos a la cámara de patch-clamp pre-llenado con la solución del baño; perfundir la cámara a una velocidad de 3 ml / min durante 1 min para asegurar la eliminación de los glomérulos no fijadas.
  5. Llevar a cabo un experimento de patch-clamp convencional en un modo celular conectado a 7. Con una pipeta de vidrio (7 - 10 de mO resistencia pipeta) formar un sello de alta resistencia entre una pipeta y una membrana de podocitos mediante la aplicación de una succión suave (una pipeta unida a una podocitos en la superficie del glomérulo aislado se muestra en la Figura 2, en la izquierda).
  6. Para las mediciones de células inscritos, de paso bajo las corrientes de 300 Hz por un filtro de ocho polos de Bessel.
  7. Use aisló glomérulos en experimentos de patch-clamp para un máximo de 4-6 horas. Mantenga la fracción de stock glomérulos en hielo.

4. Ratiometric confocal de fluorescencia mediciones de la concentración de calcio intracelular en los podocitos

  1. Coloque 500 l de la fracción de glomérulos (descrito en 2.5) en 0,5 ml tubo cónico y añadir colorantes calcio Fura Red, AM y Fluo-4, de AM. Utilice 2 mM y 1 mM concentraciones stock de Fura Red, AM y Fluo-4 AM, respectivamente (almacenar a -20 ° C, se disolvió en DMSO) y el uso de 2,5 l de cada colorante por unos 500 l de fracción glomérulos. Inmediatamente después de la adición de los colorantes cubrir el tubo con papel de aluminio.
  2. Colocar los tubos en un agitador giratorio durante al menos 20 min hasta 1 h a RT.
    Nota: Los agentes farmacológicos pueden ser añadidos durante este paso.
  3. Preparar cubreobjetos de vidrio, cubrirlos con poli-ʟ-lisina y permitir el secado utilizando conjunto placa calentada a 70 ° C.
  4. Una vez que la carga de colorantes de calcio es complete, aplicar 100 l de los glomérulos que contienen solución a los cubreobjetos recubiertos de poli-ʟ-lisina y dejar que ellos se adhieren a la superficie durante aproximadamente 5 min. Montar los cubreobjetos glomérulos conectado a una cámara de formación de imágenes, y perfundir con la solución del baño (que contiene (en mM): 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl 2, 10 HEPES, pH 7,35) a una velocidad de 3 ml / min para eliminar los glomérulos no unidas y los tintes restantes.
  5. Ajuste el microscopio de barrido confocal láser a una longitud de onda de excitación de 488 nm y filtros de emisión (525/25 y 650/25 nm para Fluo-4 y Fura Red, respectivamente). Ajuste el software de imágenes a una frecuencia y resolución deseada.
  6. Encuentra los glomérulos en campo claro y luego girar en la detección de la señal de fluorescencia. Ajuste de la intensidad del láser para cada tinte para evitar la saturación de la señal. Elija el plano focal con los podocitos que están directamente conectados a la copa. Esto minimiza el efecto causado por la contracción de un glomérulo en respuesta a drogassolicitud. Haga doble verificación que el glomérulo de elección es bien unido al cristal;
  7. Comience imágenes del plano focal de elección (tomar 512 x 512 imágenes con la frecuencia establecida en 4 segundos para visualizar Ca 2+ rápida cambios transitorios. Use un NA 1.4 o / lente de objetivo similar 60X imagen de alta resolución para), aplicar fármacos de interés, y registrar la respuesta.
    1. Seleccionar un plano focal deseada (tan cerca de la superficie del vidrio como sea posible, para asegurar la obtención de imágenes de los podocitos en la superficie del glomérulo). Compruebe la intensidad de la fluorescencia en el Fluo4 y canales FuraRed, y asegúrese de que el glomérulo se ve claramente en campo claro.
    2. Iniciar la formación de imágenes. Antes de la aplicación de cualquier droga, ficha al menos 1 min de la fluorescencia de referencia para asegurarse de que la señal es estable (no hay picos repentinos o desvanecimiento de la señal).
    3. Aplicar medicamentos deseados con la ayuda de una micropipeta; tener cuidado y asegurarse de la droga era capaz de difundir bien y llegar a la glomerulus. Mezcle la solución del baño suavemente, si es necesario, controlar el plano focal seleccionada y comprobar que no se movió fuera de foco debido a la aplicación del fármaco.
    4. Registre los cambios en la intensidad de fluorescencia de las señales Fluo4 y FuraRed. Asegúrese de que la grabación es lo suficientemente largo, por la espera hasta que la señal alcanza el nivel de meseta o alcanza un pico y luego vuelve a la línea de base. Realizar el cambio o adición de solución de otros medicamentos si es necesario.
    5. Detener la grabación y guardar el archivo en el formato nativo del software.

5. Análisis de imagen para las mediciones de calcio

  1. Realizar análisis de imágenes con el software ImageJ abierta equipada con el plugin Utilidad ND que permite la importación de imágenes en el formato nativo ND2.
  2. Importe la secuencia de imágenes; asegúrese de dividir los canales y utilizar un modo de escala de grises HyperStack.
  3. Siga el camino → Herramientas → Analizar gerente ROI en el software ImageJ para opluma una ventana del gestor ROI. Seleccione varias regiones de interés (podocitos) utilizando una herramienta de selección ovalada y el "Añadir (t)" función en el Administrador de retorno de la inversión. Como el último ROI, seleccione el área en el fondo; guardar la ROI seleccionados (Más → Guardar).
  4. Resalte la ventana que contiene el canal seleccionado para los análisis. Utilice la función de Más → Medida múltiples en el Administrador de retorno de la inversión, marque la casilla de "una fila por rebanada" en el diálogo que aparece, y luego haga clic en Aceptar. Los resultados se muestran en el formato que se puede configurar en la ventana de resultados: entrar en la opción de menú Resultados → Set mediciones, seleccione "valor de gris medio" y calcular los valores de intensidad de píxel para cada ROI, que se muestra en el ventana Resultados en columnas separadas para cada ROI.
  5. Copiar los valores de intensidad medidos de ROI para cada canal (Fluo-4 y Fura Red) en el software de análisis de datos preferido; valores de intensidad fondo restar de cada datun punto.
  6. Para cada punto de tiempo de calcular la relación de intensidades de la Fluo-4 a los canales de Fura rojas. Gráfico de dispersión / línea cambios en tiempo punto de Ca 2+ transitorio para cada ROI. Calcular los valores medios / SE para glomérulos seleccionados.
    Nota: la columna Tiempo debe ajustarse de acuerdo a la frecuencia de imagen seleccionado en el 4,5.

6. intracelulares cálculos de concentración de calcio Fluo-4 Uso de la señal de fluorescencia

  1. Tomar una muestra de los glomérulos y realizar el protocolo experimental hasta el paso 4.7. Después de la grabación de la fluorescencia de fondo añadir ionomicina (concentración final en la cámara de baño debe ser de 10 M) a la solución del baño, y el aumento de la intensidad de fluorescencia registro. Una vez que la intensidad alcanza su máximo y la decadencia se inicia, agregue MnCl2 (concentración final debe ser de 5 mM) para apagar la fluorescencia 8.
  2. Analizar los datos obtenidos en 6.1. Copie los Fluo-4 valores de intensidad de señal de retorno de la inversión obtenidos de acuerdocon el protocolo descrito en 5.1 a 5.5 por software de análisis preferido.
  3. Calcular la concentración de calcio intracelular (en nM) en el podocito correspondiente a la ROI mediante una fórmula:
    Ecuación 1
    donde K d es una disociación predeterminado constante de Fluo-4 (345 nm), F es la intensidad en el punto de tiempo que se está calculando la concentración de calcio para la (línea de base), y F min y F max son los valores de intensidad de la punto de carga máxima de calcio (después de la aplicación ionomicina) y después de la extinción de la fluorescencia (con MnCl 2), respectivamente (véase la Figura 3).

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Representative Results

Aquí abordamos el problema de la medición de los cambios agudos en los niveles de calcio en los podocitos. La figura 1 muestra una representación esquemática del protocolo experimental diseñado para realizar alta resolución de imagen confocal de fluorescencia en vivo y grabaciones de actividades individuales de los canales iónicos en los podocitos del recién glomérulos roedores aislados. En pocas palabras, después de que se anestesió la rata, los riñones deben lavarse con PBS para borrarlos de la sangre. Entonces, los riñones se extirparon y decapsulated, y glomérulos están aislados de la corteza renal por tamizado diferencial. Parte de la muestra puede ser tomada para el análisis de patch-clamp y el resto se puede cargar con tintes fluorescentes de calcio Fluo-4, AM y Fura Red, AM para realizar imágenes de calcio radiométrica confocal.

Las medidas electrofisiológicas de la única actividad del canal iónico se pueden realizar de inmediato después del aislamiento de los glomérulos. Actividad de cha ionesnnels pueden medirse tanto en configuraciones de células-adjunto y de células enteras del método de patch-clamp. Para demostrar la viabilidad del enfoque que se muestra es la grabación de la única calcio conductor de la actividad del canal de iones como TRPC (Figura 2). Además, es posible aplicar permeable a las células o las drogas para probar sus efectos sobre el influjo de calcio en los podocitos en el nivel de los canales de iones individuales de unión al receptor.

Un enfoque que permite la evaluación de la actividad del canal iónico solo produce una variedad de datos que pueden caracterizar la función de podocitos. Sin embargo, puede ser complementada en gran medida mediante la medición de los cambios en la concentración de calcio a nivel de las células enteras. Para llevar a cabo este tipo de estudios, glomérulos recién aisladas fueron cargados con tintes fluorescentes para la imagen confocal de alto rendimiento. Con una resolución óptica de alta es posible controlar los niveles de calcio en varios podocitos a la vez. La Figura 3 demuestra el tiempo-curso para el experimento típico diseñado para evaluar los cambios de la concentración de calcio en el podocitos. La concentración de calcio basal dentro del podocitos se evaluó en base a la Fluo-4 fluorescencia. Después de registrar la intensidad de señal basal durante 1 min (F), ionomicina se aplica y se hace que la fluorescencia máxima (F max) a ser alcanzado, que luego se inactivó mediante MnCl2 (F min se observa). De acuerdo con la fórmula en 6,3, la intensidad de Fluo-4 de la señal en cada punto del experimento de tiempo se puede entonces traducirse en la concentración real de los iones de calcio en la célula. Como se ve en el gráfico, la fluorescencia en el fondo (aproximadamente 400 unidades arbitrarias) significa traduce en 140 nM, que está dentro de un rango de concentración normal para el calcio intracelular en células no apoptóticas sanos.

La importancia y la utilidad del enfoque descrito se justifica por otra aplicación, lo que permite medir transie calcio agudants en los podocitos en respuesta a diversos fármacos. La Figura 4A ilustra imágenes representativas de los glomérulos de rata teñido con Fluo-4 y Fura Red en la solución que contiene calcio 2 mM (descrito en 4.5) antes y después de la adición de 10 micras ATP. Nota un aumento dramático en el verde (Fluo-4 AM) de fluorescencia de los podocitos (marcado con flechas), y una gota en la fluorescencia Fura Red (pseudocolor rojo). Fluo4 y FuraRed reflejan un aumento en la concentración de calcio a una longitud de onda de excitación de 488 nm en forma opuesta, es decir, cuando la concentración de calcio dentro de la célula aumenta Fluo 4 intensidad sube, mientras que FuraRed va hacia abajo. Eso es posible debido a la naturaleza dual de la excitación FuraRed fluoróforo. Dependiendo de la longitud de onda de excitación que puede comportarse como el calcio unido (420 nm) o libre de calcio (488 nm) fluoróforo con el correspondiente aumento o disminución de la fluorescencia. Por lo tanto, el uso de FuraRed solo en un modo de imagen radiométrica es posible, sin embargo, requirdos longitudes de onda de excitación es - 420 nm y 488 nm. Esto disminuirá la frecuencia de la formación de imágenes al menos dos veces (en comparación con el uso de una longitud de onda de excitación); si el investigador querría mantener el ritmo rápido de las imágenes, la resolución de la imagen debe ser disminuido. Sin embargo, Fluo 4 y FuraRed se pueden utilizar juntos en un modo de radiométrica sin pérdida de resolución o disminución en la frecuencia de formación de imágenes, ya que estos fluoróforos pueden ser excitados por el mismo láser de 488 nm, y proporcionan una buena diferenciación de los espectros de emisión. Un transitorio típico resumido de las ROIs marcados con flechas en la figura 4A se muestra en la Figura 4B; el gráfico demuestra claramente un aumento agudo de Fluo4 relación de intensidad / FuraRed después de la adición de ATP 10 mM, que decae dentro de varios minutos. Las imágenes fueron tomadas cada 4 seg, y por lo tanto, la técnica permite la observación de cambios rápidos en la concentración de calcio dentro de la célula.


Figura 1. Representación esquemática del protocolo experimental. Después de que el animal es anestesiado adecuadamente y preparado para la cirugía, los riñones se lavan con PBS para eliminar la sangre. Entonces, los riñones se extirparon y decapsulated, y glomérulos están aislados de la corteza renal por tamizado diferencial. Aquí, parte de la muestra se toma para el análisis de patch-clamp, y el resto se carga con tintes fluorescentes de calcio y de imágenes de calcio radiométrica confocal se lleva a cabo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. grabación representativo que muestra la actividad de los canales de calcio TRPC en el podocitos de la recién aisladas glomérulos de rata. El panel izquierdo muestra la pipeta patch-clamp unido al cuerpo de podocitos en la superficie del glomérulo durante un registro electrofisiológico en una configuración de célula-adjunto; una parte de un glomérulo encapsulado se puede ver en la esquina inferior derecha de la imagen. Traza actual Representante de la actividad de los canales-TRPC como de un parche de células adjunta hecho en el podocitos del glomérulo rata a un potencial de mantenimiento -40 mV se muestra a la derecha. La c y o i denotan niveles de los canales abiertos y cerrados, respectivamente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. Representante experimento diseñado para evaluar el nivel de calcio intracelular en los podocitos. Para medir la concentración de calcio intracelular, glomérulos se cargan con Fluo-4, AM, la intensidad de fluorescencia se registra en la línea de base y después de la adición de ionomicina y MnCl2. El gráfico demuestra los cambios en la señal de fluorescencia en respuesta a la ionomicina (produciendo el máximo de la Fluo-4 fluorescencia, F max) y MnCl2, que apaga el tinte y los resultados en la intensidad de fluorescencia más bajo (F min). La intensidad de fluorescencia (abscisas izquierdo) para cada punto de tiempo se puede traducir en la concentración de calcio real en nanomoles (derecha abscisa) de acuerdo con la fórmula en 6.3. Tenga en cuenta las inserciones con las imágenes que muestran los podocitos en los puntos de tiempo en los que se calcularon F, F y F max min. El gráfico mostrado aquí refleja la intensidad de fluorescencia de la podocitos marcado por un círculo (ROI); imágenes fueron tomadas cada 4 seg.nk "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Medición de los transitorios de calcio en los podocitos en respuesta a ATP. (A) Imágenes representativas que ilustran el glomérulo tipo salvaje de rata teñido con Fluo-4 (pseudocolor verde) y Fura Red (rojo pseudocolor) en la solución que contiene calcio 2 mM antes y después de la adición de 10 mM ATP. Baja intensidad de fluorescencia de color verde antes de la aplicación de la droga hay que señalar. (B) ejemplo de lo transitorio de calcio intracelular evocada en los podocitos por aplicación de 10 micras ATP Resumido. Nota un aumento fuerte y rápido en relación de intensidad de fluorescencia Fluo-4 / Fura Red después de la adición de la droga, que representa para la estimulación y el agotamiento del depósito de calcio y el influjo de calcio a partir de THe fuera en la célula, lo que resulta en la elevación de la concentración de calcio intracelular. Las barras de error representan el error estándar de las medias calculadas para 11 podocitos del mismo glomérulo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El enfoque descrito aquí permite el análisis de manejo del calcio por los podocitos de los glomérulos de roedores. Esta técnica permite la aplicación de patch-clamp electrofisiología solo canal y de fluorescencia de imagen confocal radiométrica. Sin embargo, ambos enfoques pueden ser utilizados por separado, por su propia cuenta. El protocolo propuesto tiene varios pasos relativamente simples, incluyendo ras 1) del riñón; 2) el aislamiento de los glomérulos por tamizado diferencial; 3) la realización de patch-clamp experimentos electrofisiológicos o incubación de los glomérulos con tintes fluorescentes etiquetado de calcio para la imagen confocal radiométrica de los cambios en el calcio intracelular.

Para aislar los glomérulos, un protocolo modificado basado en Gloy se utilizó et al. 5. La principal ventaja de la técnica actual de tamizado diferencial es que produce glomérulos despojados de la cápsula de Bowman y por lo tanto no requieren el paso sofisticado y consume mucho tiempode desencapsulación manual. La mayoría de los glomérulos en la fracción aislada se decapsulated, sin embargo, el investigador debe ser consciente de que hay glomérulos encapsuladas, también. Es importante asegurarse de que los glomérulos se quitó de la cápsula de Bowman son imágenes, como la cápsula evita que las drogas lleguen a los podocitos. Como se ve en la Figura 2, glomérulos descapsulados tienen una superficie rugosa con capilares distintos y cuerpos podocitos, mientras que los glomérulos encapsuladas aparecen liso y redondo en forma de. Además, encapsulados Fluo4 y FuraRed glomérulos cargados emiten señal de fluorescencia menos intenso en comparación con los descapsulados.

La fracción de glomérulos de rata obtenido es 95% puro (con restos de túbulos proximales) y puede ser utilizado fácilmente para el Western Blot o en otras aplicaciones de biología molecular si es necesario. Es excepcionalmente importante que en esta preparación podocitos están asociadas a los capilares, retener procesos de pie intactas y función como una partede la maquinaria aparato de filtración glomérulo nativo. Los mecanismos de manejo del calcio por los podocitos sirven un papel regulador esencial en el desarrollo y la prevención de complicaciones renales en enfermedades tales como diabetes o hipertensión 9-12. Podocitos contribuyen significativamente a las barreras de permeabilidad, como se evidencia por el hecho de que la lesión aguda altera la morfología y la estructura de podocitos y puede causar proteinuria 2,3,13-15. Por lo tanto, es de gran importancia para observar la capacidad de respuesta de la entrada de calcio en estas células a los fármacos, que pueden ser fácilmente filtrada en esta preparación. Se debe entender que si el investigador está investigando podocitos en un estado patológico, por ejemplo, la hipertensión o la diabetes, que por lo general resulta en proteinuria y glomérulos daño, el rendimiento de los glomérulos podría ser menos pura que la de los animales sanos. Se recomienda para monitorizar siempre las fracciones glomérulos en cada etapa del proceso de aislamiento para evitar la pérdida deel tejido. En algunos casos, los glomérulos fuertemente enferma o glomérulos de animales de edad avanzada o demasiado pequeños pueden requerir el ajuste individual de proceso de aislamiento, incluyendo la selección de tamices de malla más grandes / más pequeños.

Hemos aplicado este enfoque inicialmente para determinar la eficacia de los fármacos anti-inflamatorios no esteroides en la inhibición de los canales de calcio en los podocitos TRPC 16. A raíz de estos estudios 7,16-22 hemos empleado las técnicas descritas para establecer varios mecanismos críticos que controlan la función de los podocitos. Por ejemplo hemos descrito el perfil de los receptores P2 (purinergic) en los podocitos de las ratas y se define la regulación de la entrada de calcio por la angiotensina II en los glomérulos de ratón. Como se describe en un manuscrito más tarde 20, el protocolo puede ser adaptado para realizar estudios similares no sólo en ratas, pero también en otras especies, tales como ratones. Imágenes de fluorescencia de calcio Ratiometric (con el uso de dos fluorescentecolorantes - Fluo-4 y Fura rojo) asegura una fiabilidad adicional de los datos, y si la imagen calcio necesario se puede combinar con otros tintes fluorescentes para monitorear los cambios en otras sustancias dentro de los podocitos. Por ejemplo, hemos usado este enfoque para medir el óxido nítrico con la ayuda del colorante DAF-FM. Electrofisiología patch-clamp se puede utilizar solo o (configuración permite) en combinación con imágenes de calcio. Aparte de los canales de calcio, la técnica permite la grabación de la actividad de otros canales iónicos. Además, el uso de la transfección y siRNA puede ampliar el área de aplicación aún más, como se ha demostrado recientemente por el grupo del Dr. Secador 23.

Microscopía de epifluorescencia convencional puede ser utilizado aquí en lugar de la imagen confocal menos asequible. Sin embargo, el investigador debe ser consciente de que la sensibilidad efectiva de amplia microscopía de campo de fluorescencia es generalmente limitada por la luz fuera de foco. Este (en comparación con imagin confocalg) hace que las limitaciones que la incapacidad para producir alta resolución de imagen de retorno de la inversión individual (podocitos) o sus procesos de pie. Además, la microscopía de campo amplio complica la identificación de los podocitos, ya que es difícil diferenciar entre la superficie del glomérulo y tejido profundo. A partir de ahora la disponibilidad comercial de varios fluoróforos de imagen confocal es mucho mejor y en rápida expansión. Alternativamente, los estudios de epifluorescencia podrían combinarse fácilmente con una configuración electrofisiológico que puede proporcionar Ca intracelular simultánea 2+ y grabación única actividad del canal. Fura2-AM carga de podocitos glomérulos con monocromador filtro de ruedas y los filtros de densidad neutra configuración se utiliza ampliamente, pero no siempre es adecuado para imágenes de alta resolución de calidad.

También hay que señalar que el, glomérulo funcional aislado es capaz de cambiar su volumen en respuesta a estímulos fisiológicos. El investigador debe ser consciente de ello mientras se realiza laexperimentos, y elegir cuidadosamente el plano focal durante los estudios confocales para evitar la pérdida de foco, y llevar a cabo experimentos de control de la selección de nuevos fármacos con el fin de probar la contracción involuntaria o relajación.

Esta técnica ofrece una oportunidad única para observar los cambios en la entrada de calcio en el canal iónico única y niveles células individuales después de los tratamientos farmacológicos u otras manipulaciones, en una variedad de fondos de roedores. Esta técnica también se puede utilizar en estudios de enfermedades renales humanas como un protocolo modificado se puede aplicar a los tejidos obtenidos a partir de biopsias renales, lo que sin duda proporcionar información excepcionalmente valiosa. Además, las mediciones de concentración de calcio podrían estar vinculados con los experimentos de patch-clamp electrofisiológicos en tiempo real, que pueden proporcionar mayor profundidad y una visión mecanicista en la regulación del calcio en el manejo de los podocitos en condiciones normales y patológicas.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer a Glen Slocum (Colegio Médico de Wisconsin) y Colleen A. Lavin (Nikon Instruments, Inc.) para una excelente asistencia técnica con los experimentos de microscopía. Gregory Blass es reconocido por corrección crítica del manuscrito. Esta investigación fue financiada por los Institutos Nacionales de Salud de subvención HL108880 y la Asociación Americana de Diabetes conceder 1-15-BS-172 (AS), y el Ben J. Lipps de Becas de Investigación de la Sociedad Americana de Nefrología (DVI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluo4 AM Life Technologies F14217 500 µl in DMSO
FuraRed AM Life Technologies F-3020
Poly-ʟ-lysine Sigma-Aldrich P4707
Pluronic acid Sigma-Aldrich F-68 solution
Ionomycin Sigma-Aldrich I3909-1ML
Tube rotator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-753 Germany
Nikon confocal microscope (inverted) Nikon Nikon A1R Laser exitation 488 nm. Emission filters 500-550 nm and 570-620 nm
Objective Nikon Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil
Cover Glass Thermo Scientific 6661B52
High vacuum grease Dow Corning Silicone Compound
Software Nikon Nikon NIS-Elements
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Patch clamp amplifier Molecular Devices MultiClamp 700B
Data acquisition system Molecular Devices Digidata 1440A Axon Digidata® System
Low pass filter Warner Instruments LPF-8 8 pole Bessel
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B150F-4
Micropipette puller Sutter Instrument Co P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microforge Narishige MF-830 Japan
Motorized micromanipulator Sutter Instrument Co MP-225
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti
Microvibration isolation table TMC equipped with Faraday cage
Multichannel valve perfusion system AutoMake Scientific Valve Bank II
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Software Molecular Devices pClamp 10.2
Nicardipine Sigma-Aldrich N7510
Iberiotoxin Sigma I5904-5UG
Niflumic acid Sigma-Aldrich N0630
DIDS Sigma-Aldrich D3514-25MG
TEA chloride Tocris T2265
RPMI 1640 Life Technologies 11835030 without antibiotics
BSA Sigma-Aldrich A8327 30% albumin solution
Temperature controlled surgical table MCW core for rodents
Steel sieves: #100 (150 μm), 140 (106 μm)
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200 Fisher Sci 50-871-316
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270 Fisher Sci 50-871-318
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400 Fisher Sci 50-871-320
mesh 200 Sigma-Aldrich s4145 screen for CD-1
Binocular microscope Nikon Eclipse TS100
Binocular microscope Nikon SMZ745
Syringe pump-based perfusion system Harvard Apparatus
Polyethylene tubing Sigma-Aldrich PE50
Isofluorane anesthesia VetEquip, Inc. 911103
Other basic reagents Sigma-Aldrich

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References

  1. Machuca, E., Benoit, G., Antignac, C. Genetics of nephrotic syndrome: connecting molecular genetics to podocyte physiology. Hum. Mol. Genet. 18, R185-R194 (2009).
  2. Haraldsson, B., Nystrom, J., Deen, W. M. Properties of the glomerular barrier and mechanisms of proteinuria. Physiol. Rev. 88, 451-487 (2008).
  3. Patrakka, J., Tryggvason, K. New insights into the role of podocytes in proteinuria. Nat. Rev. Nephrol. 5, 463-468 (2009).
  4. Savin, V. J., Sharma, R., Lovell, H. B., Welling, D. J. Measurement of albumin reflection coefficient with isolated rat glomeruli. J. Am. Soc. Nephrol. 3, 1260-1269 (1992).
  5. Gloy, J., et al. Angiotensin II depolarizes podocytes in the intact glomerulus of the Rat. J. Clin. Invest. 99, 2772-2781 (1997).
  6. Nitschke, R., et al. Angiotensin II increases the intracellular calcium activity in podocytes of the intact glomerulus. Kidney Int. 57, 41-49 (2000).
  7. Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).
  8. Snitsarev, V. A., McNulty, T. J., Taylor, C. W. Endogenous heavy metal ions perturb fura-2 measurements of basal and hormone-evoked Ca2+ signals. Biophys. J. 71, 1048-1056 (1996).
  9. Fukuda, A., Fujimoto, S., Iwatsubo, S., Kawachi, H., Kitamura, K. Effects of mineralocorticoid and angiotensin II receptor blockers on proteinuria and glomerular podocyte protein expression in a model of minimal change nephrotic syndrome. Nephrology (Carlton). 15, 321-326 (2010).
  10. Abramowitz, J., Birnbaumer, L. Physiology and pathophysiology of canonical transient receptor potential channels). FASEB J. 23, 297-328 (2009).
  11. Heeringa, S. F., et al. A novel TRPC6 mutation that causes childhood FSGS. PLoS ONE. 4, e7771 (2009).
  12. Zhang, X., Song, Z., Guo, Y., Zhou, M. The novel role of TRPC6 in vitamin D ameliorating podocyte injury in STZ-induced diabetic rats. Mol. Cell. Biochem. 399, 155-165 (2015).
  13. Bohrer, M. P., et al. Mechanisms of the puromycin-induced defects in the transglomerular passage of water and macromolecules. J. Clin. Invest. 60, 152-161 (1977).
  14. Olson, J. L., Rennke, H. G., Venkatachalam, M. A. Alterations in the charge and size selectivity barrier of the glomerular filter in aminonucleoside nephrosis in rats. Lab. Invest. 44, 271-279 (1981).
  15. Schiessl, I. M., Castrop, H. Angiotensin II AT2 receptor activation attenuates AT1 receptor-induced increases in the glomerular filtration of albumin: a multiphoton microscopy study. Am J Physiol Renal Physiol. 305, F1189-F1200 (2013).
  16. Ilatovskaya, D. V., Levchenko, V., Ryan, R. P., Cowley, A. W., Staruschenko, A. NSAIDs acutely inhibit TRPC channels in freshly isolated rat glomeruli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 408, 242-247 (2011).
  17. Peti-Peterdi, J. Calcium wave of tubuloglomerular feedback. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, F473-F480 (2006).
  18. Peti-Peterdi, J., Warnock, D. G., Bell, P. D. Angiotensin II directly stimulates ENaC activity in the cortical collecting duct via AT(1) receptors. J. Am. Soc. Nephrol. 13, 1131-1135 (2002).
  19. Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305, C1050-C1059 (2013).
  20. Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidney Int. 305, C1050-C1059 (2014).
  21. Schaldecker, T., et al. Inhibition of the TRPC5 ion channel protects the kidney filter. J. Clin. Invest. 123, 5298-5309 (2013).
  22. Roshanravan, H., Dryer, S. E. ATP acting through P2Y receptors causes activation of podocyte TRPC6 channels: role of podocin and reactive oxygen species. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 306, F1088-F1097 (2014).
  23. Anderson, M., Roshanravan, H., Khine, J., Dryer, S. E. Angiotensin II activation of TRPC6 channels in rat podocytes requires generation of reactive oxygen species. J. Cell. Physiol. 229, 434-442 (2014).

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