과도 대뇌 저산소증 - 허혈을 기반으로 혈전 성 뇌졸중 모델

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Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. A Thrombotic Stroke Model Based On Transient Cerebral Hypoxia-ischemia. J. Vis. Exp. (102), e52978, doi:10.3791/52978 (2015).

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Abstract

스트로크 연구는 임상 적으로 신경 치료를 번역에 많은 좌절을 견디고있다. 반대로, 실제 치료 (TPA의 혈전)이 거의 스트로크 전임상 연구를 지배 기계적 폐색 기반 실험 모델의 이익을 생성하지 않는다. 벤치와 침대 옆 간의 분할 전임상 행정 연구 TPA에 반응하는 모델을 채용 할 필요성을 시사한다. 이를 위해, 간단하고 TPA에 반응성 혈전 성 뇌졸중 모델 발명은 여기에 설명된다. 37.5 ± 0.5 ° C에서 동물의 직장 온도를 유지하면서,이 모델은, 30 분 동안 마우스에서 성인 안면 마스크를 통해 일방적 경동맥 및 7.5 %의 산소의 전달의 일시적 폐색 이루어져있다. 일방적 경동맥 또는 저산소증 가역 결찰 각 만 일시적 뇌 혈류를 억제하지만, 양쪽의 조합 욕설 재관류 결핍, 혈소판 피브린 침착, 및 대형 infar 지속 야기중간 대뇌 동맥 제공 영토에서 CT. 중요한 것은, 꼬리 정맥 0.5, 1, 또는 4 시간 후의 생 (10 밀리그램 / kg)에서 재조합의 TPA 주입 사망률 경색 크기의 시간에 따른 감소를 제공 하였다. 이 새로운 뇌졸중 모델은 단순 및 실험 결과를 비교하는 실험실에 걸쳐 표준화 될 수있다. 또한, 두개 절제술 또는 예비 형성된 색전을 도입하지 않고, 혈전증을 유도한다. 이러한 독특한 장점을 감안할 때, 티 모델은 전임상 뇌졸중 연구의 레퍼토리에 유용한 추가이다.

Introduction

혈전 용해 및 개통은 임상 1 급성 허혈성 뇌졸중의 가장 효과적인 치료입니다. 그러나, 임상 신경 연구의 대부분은 혈관 폐색 제거하여 뇌 혈류의 신속한 복구가 발생하고, 단자 위치 보장 혈전에 의해 아무 효과는 거의 도시 과도 정비공 폐색 모델 (관내 봉합 중간 대뇌 동맥 폐쇄)에서 수행 하였다. 이는 뇌졸중 모델의 선택 모호한 환자에게 신경 치료 2,3- 변환하는 어려움에 적어도 부분적으로 기여한다고 제안되었다. 따라서, 전임상 연구에서 TPA에 반응 혈전 색 전성 뇌졸중 모델을 사용하는 증가 통화가 있지만, 이러한 모델은 기술적 인 문제 (토론 참조) 4-7 있습니다. 여기에서 우리는 일방적 과도 저산소 허혈성 (THI) 모욕과 정맥의 TPA 치료 8의 응답에 따라 새로운 혈전 성 뇌졸중 모델을 설명합니다.

생 스트로크 모델은 1960 9 성인 쥐 실험을 위해 발명 된 레빈 절차 (챔버 일시적인 저산소증에 노출 다음 일방적 경동맥의 영구 결찰)를 기반으로 개발되었다. 원래 레빈 절차는 무명에 머 금고 있기 때문에 그것은 단지 변수 뇌 손상을 생산하지만, 1981 10 신생아 저산소 성 허혈성 뇌증 (HIE)의 모델로 로버트 Vannucci와 그의 동료에 의해 ​​다시 도입 될 때 같은 모욕 쥐 새끼에서 일관된 신경 병리학을 일으키는 원인이되었다. 최근에는 일부 연구자들은 저산소 챔버 (11) 내의 온도를 조정함으로써 성인 마우스에 레빈-Vannucci 모델을 적응 재. 원래 레빈 절차의 일관성 뇌 병변 저산소 실에서 성인 쥐의 체온 변동으로 인해 발생할 수 있음을 그럴듯. 이 가설을 테스트하기 위해, 우리는 저산소 가스를 투여하여 레빈 절차를 수정안면 마스크를 통해 수술 테이블 (12)에서 37 ° C에서 설치류 코어 온도를 유지하면서. 예상대로, 엄격한 신체 온도 제어가 크게 HI-유도 뇌 병리학의 재현성 증가했다. HI 모욕은 응고, 자식 작용, 및 그레이 - 흰색 - 문제 부상 (13)을 트리거합니다. 다른 연구자들은 또한 뇌졸중 후 염증 반응 (14)를 조사하기 위해 HI 모델을 사용하고 있습니다.

HI 뇌졸중 모델의 독특한 특징은 밀접 혈류, 내피 손상 (예 인해 HI 유도 된 산화 적 스트레스에 대한) 및 과다 응고 (HI 유도 된 혈소판 활성화)의 정체를 포함한 혈전 형성의 Virchow의 화음을 (이하 있다는 도 1A) 15. 이와 같이, HI 모델은 실제 허혈성 뇌졸중에 중요한 일부 병리 생리 학적 메카니즘을 포착 할 수있다. 마음에 이런 생각과 함께, 우리는 또한 유엔의 가역적 결찰과 HI 모델을 정제ilateral 경동맥는 (따라서 과도 HI 모욕을 만드는)와 함께 또는 Edaravone없이 단자 위치 보장 혈전 용해에의 반응을 시험했다. Edaravone은 이미 시작 9의 24 시간 이내에 허혈성 뇌졸중을 치료하기 위해 일본에서 승인 된 자유 라디칼 스 캐빈입니다. 우리의 실험은 짧은 30 분 과도 HI를 혈전 경색을 유발 것을 보여 주었다, 그 결합 된 TPA에 Edaravone 치료는 시너지 효과 8을 부여. 여기에서는 상세한 외과 적 절차, 급성 허혈성 뇌졸중의 재관류 치료를 최적화하는 데 사용될 수있는 모델의 생 방법 론적 고려 사항을 설명한다.

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Protocol

이 프로토콜은에 모리 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 건강 지침의 국립 연구소를 다음입니다.

1. 설치

  1. 수술 전 적어도 15 분 동안 37 ℃에서 열 펌프와 연결 온난화 패드에 수술 침대를 준비합니다. 수술 침대에 3 ML의 주사기의 배럴을 사용하여 목 롤을 놓습니다. 의료 공기에 2 % 이소 플루 란 마취 가스를 준비합니다.
  2. 멸균 된 집게, 가위, 마이크로 니들 홀더, 지혈제, 면봉과 봉합을 준비합니다. 조직 접착제와 눈 연고를 준비합니다.
  3. 가열 램프와 직장 프로브 저산소증 시스템과 온도 컨트롤러를 설정합니다. 92.5 %의 N 2로 균형 7.5 %의 O 2의 2 % 이소 플루 란과 저산소증 가스를 준비합니다.
  4. 한 시간 수술 전, 마우스는 서방 멜 록시 캄 (4.0 ㎎ / ㎏)의 피하 주사에 의해 analgesized된다.
<P 클래스 = "jove_title"> 2. 과도 대뇌 저산소증 - 허혈 (그림 1B)

  1. 10~13주 세 남성 C57BL을 마취 / 동물이 발 짜기에 응답하지 않는 한 다음 전자 면도기를 사용하여 오른쪽 목에 머리를 제거 할 때까지 3 % 이소 플루 란으로 마취 유도 챔버 (22) 30g에 무게 6 마우스.
  2. 2 L / 분의 유량으로 공기 의료 2 % 이소 플루 란으로 연결 수술 침대에 마우스를 놓는다. 안전 앞발 의료 테이프를 사용 측면에서 목 롤을 따라 밖으로 뻗어있다.
  3. 알코올 다음 면봉 다음 betadine와 절개의 수술 부위를 청소합니다.
  4. 해부 현미경, 직선 집게 약 0.2 센티미터 중간 선 피부에서 측 방향의 마이크로 가위를 사용하여 0.5 cm 오른쪽 자궁 절개를합니다.
  5. 오른쪽 경동맥 (RCCA)를 노출 근막 조직을 따로 뽑아 미세 톱니 모양의 집게 한 쌍을 사용합니다. 조심스럽게 좋은 부드러운 포셉 한 쌍을 사용하여 미주 신경에서 RCCA를 구분합니다.
  6. 라이브 RCCA에 (이형성) 개의 미리 절단 5-0 실크 봉합사 매듭 후 4-0 나일론 모노 필라멘트 봉합사 (도 1C)를 사용하여 피부를 봉합.
  7. 건조를 방지하기 위해 두 눈에 눈 연고를 적용합니다.
  8. 신속 저산소증 시스템에 마우스를 전송하고, 30 분간 / 0.5 L의 유속으로 7.5 %에서 2 % 이소 플루 란으로 페이스 마스크 분 O 2를 코와 입에 넣어.
    1. 저산소증 동안에, 37.5 ± 0.5 ° C로 직장 온도를 제어하기 위해 가열 램프와 온도 조절기를 사용한다. / 분 80-120 호흡에서 호흡을 모니터링합니다. 저산소증 동안 37 ° C 위의 체온 유지 일관된 뇌경색을 만드는 것이 중요하다. 저 호흡은 일반적으로 20 분 저산소증 후 발생합니다. 얼굴 마스크를 제거하고 호흡이 1-2 분 소요 30 분 저산소증 기간에 포함되지 않는다 (40) 이하로 떨어지면 정상 공기 공급을 할 수 있습니다.
  9. 저산소증 후, 전송수술 침대에 마우스와는 RCCA에서 두 개의 봉합을 놓습니다. 케이지에 마우스를 반환 한 후 조직 접착제를 사용하여 상처를 닫고. 이 라이브 노트의 모두가 예기치 않게 저산소증 이후에 출시되는 동물을 제외합니다.
  10. 저산소증과 마취에서 회복하기 위해 5 ~ 10 분 동안 마우스를 모니터링합니다. 케이지에 젖은 음식을 놓고 동물 보호 시설에 반환.
    참고 : 생 후 24 시간에서 심각한 돌고 행동에 가벼운 보여주는 동물이 뇌 위반와 관련된다. 발작 증상이있는 대부분의 동물은 생 후 24 시간 평가시기 전에 죽는다.

3. 레이저 스페 클 대비 이미징

주 : 이것은 THI 모델의 필수적인 절차는 아니지만, 이차원 레이저 스페 클 대비 이미징 시스템 (16) 동안 또는 일시적 저산소 허혈 뇌 혈류 (CBF)의 변화를 특징 짓는 데에 이용 될 수있다. 세인트 직후, 티에서 기록을 CBF의 변경을 문서에EP 2.6. 대안 적으로,이 절차는 다음 단계 2.10 행할 수 THI 비방 CBF 후 회복과 비교한다.

  1. 엎드린 자세에서 마취 마우스를 놓고 노출하지만 개봉 두개골과 두피에 1cm 길이의 중간 선 절개를 수행합니다.
  2. 제조사의 프로토콜에 따라 혈류 메이져 하에서 모두 대뇌 반구의 CBF를 모니터링하고 CCAO 수술 (단계 260) 후 즉시 뇌 혈류를 기록하기 시작한다. 50 분 동안 계속합니다.
  3. 16 색 팔레트의 임의 단위와 CBF 화상을 확인하고 실시간으로 분석하여 제조자의 지시 (도 2) 다음 MoorFLPI 소프트웨어를 사용하여 선택된 영역.
  4. CBF 이미지를 촬영 한 후, 조직 접착제와 두피를 닫고 케이지에 동물을 반환합니다.

4. 단자 위치 보장 관리

  1. (220-300 & KG 재조합 tPA의 / 용매 또는 10 mg의와 꼬리 정맥에서 동물을 주입# 956; 1 밀리그램 / M TPA)의 L, 0.5, 1, 또는 tCCAo 플러스 저산소증 후 4 시간에 (그림 4).

여러 다른 옵션 5. 뇌 손상 탐지

뇌 샘플을 수집하기 위해 생 후 1, 4, 24 시간에서 쥐를 안락사 :합니다.

  1. 기술 이전과 생의 모욕 후 24 시간에서 생체 2,3,5- 트리 페닐 테트라 졸륨 클로라이드에 의해 경색 볼륨의 정량화를 수행 (TTC) 방법. (17)
    1. 복강 내 1.4 M 만니톨 용액 (~ 0.1 ㎖ / g 체중) transcardial 관류 전에 30 분으로 동물을 주입. PBS와 Transcardial 관류 마우스는 2 % TTC 10 ㎖로 하였다.
    2. 10 분 후 수술 도구와 동물의 뇌를 제거하고 vibratome와 1mm 두께로 밤새 고정 및 섹션 4 % 파라 포름 알데히드로 배치합니다.
    3. 디지털 현미경과 퀀트 포 단면 한 뇌 슬라이드 일련의 스냅ImageJ에 소프트웨어를 사용하여, 손상, 반대쪽 반구의 면적에 대한 경색 영역 (오른쪽 흰색 영역)의 비율로 경색 량을 쓸어.
  2. 또한, 생 모욕 후 1 시간에서 면역에 의해 혈전 형성을 수행합니다.
    1. 10월 화합물 및 섹션 저온 유지 장치를 사용하여 12 μm의 두께 뇌에 고정 뇌 동결.
    2. 형광 현미경에 형광을 관찰 : 염소 항 - 토끼 알렉사 Fluro 488 염료 (200 1)에 의해 : (100 1) 다음 토끼 항 피브리노겐 항체와 뇌 슬라이드를 품어.
  3. 또한, 생의 모욕 후 4 시간에 100 μL 2 % 에반스 블루 염료의 꼬리 정맥에 주사하여 혈관 폐색을 수행합니다.
    1. 에반스 블루 주사 후 4 % 파라 포름 알데히드로 두뇌를 제거하기 위해 머리를 잘라 신속하게 쥐를 안락사합니다. 참고 : 두 ...의 앞에 푸른 색으로 에반스 블루 순환을 위해 5 ~ 10 분 소요 사지 뒷다리.
    2. 섹션에 ì100 ㎛ 두께로 고정 뇌에 슬라이딩 마이크로톰을 사용하여 형광 현미경에 680 nm의 방출 필터를 사용하여 형광을 관찰한다.

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Representative Results

이차원 레이저 스페 클 대비 이미징 (LSCI) 16을 30 분 과도 일방적 경동맥 폐색 (tCCAO), 저산소증에 30 분간 노출 (7.5 % 산소), 및 30 분 일방적으로 뇌 혈류 (CBF)의 변화를 비교하기 위해 사용 하였다 저산소증 (THI)에서 결찰을 경동맥. 이 실험은 tCCAO가 normoxia에서 경동맥 결찰 반구에서 CBF를 억제하는 것으로 나타났다에 ~ 빨리 경동맥 폐색 (그림 2A에서 R)의 출시 이후 85 % 이상으로 회복 초기 값의 50 %. 전신 저산소증에 노출 혼자 일시적으로 정상 산소 분위기 (그림 2B)로 복귀 한 후 130 ~ %로 반등 기준 값의 약 75 %에 CBF 감소. 빠르게 거의 경동맥 ligatio 릴리스 후 20 분에서 30 % 이상으로 회복되지 10 분, 주위 기준값의 20 % 이하로 동측 반구 CBF 감소 저산소증 하에서 콘트라스트 경동맥 결찰 (THI) 중N과 normoxia로 돌아. CBF는 반대쪽 반구 (L)에, 그러나, 저산소증 동안 20 % 사이 50 변동, 신속 티 모욕 (그림 2C) 후 80 % 이상에 돌려 보냈다.

tCCAo (30 분) 또는 tCCAO 후 24 시간에 30 분 저산소증 (THI)에서, 생체 TTC 염색은 경색 17를 검출하기 위해 사용 하였다. 이 분석은 티 모욕 (그림 3A) 다음 중간 대뇌 동맥 제공 영토에는 tCCAO 모욕에 의해 명백한 부상,하지만 상당한 경색을 보이지 않았다. 반대로 섬유소 (ogen) 면역 염색은 1 시간 복구에 tCCAO-와 티 - 부상 뇌를 비교하는 데 사용 및 섬유소 (ogen)의 대폭적인 증착을 보여 주었다, 혈전증의 지표를, 티 - 부상에,하지만 마우스를 tCCAO-도전되지 않았습니다 두뇌 (그림 3B, C). 에반스 블루 염료의 꼬리 정맥 주사는 4 시간 복구에 tCCAO-과 티 - 부상 뇌의 혈관 관류를 비교하는 데 사용되었다. 이 분석은 점감 나타났다에서 뇌 관류와 에반스 블루 염료의 강렬한 넘쳐 에드 tCCAO 장애인 마우스의 뇌 (그림 3D, E)를 티 - 부상,하지만.

마지막으로, 차량의 꼬리 정맥 주사를받은 쥐에서 티 모욕의 결과 또는 재조합 인간 tPA의 (Activase, 10 ㎎ / ㎏, 0.5, 1, 또는 4 시간 후에 티) (0.5 시간 복구에)에 사용하여 비교 하였다 24 시간 복구 (그림 4A)에서 TTC 얼룩을 생체 내. 비히클 - 처리 된 마우스에서, 24 시간 후의 생에서 사망률은 23.8 %이고, 하나의 21 THI-부상 마우스는 평균 2 SD (특이점)을 넘어 있었다. 0.5 시간 복구에 tPA의 치료를 받고 마우스에서 24 시간 사망률은 8.3 %로 떨어졌다, 그러나 tPA의가 티 모욕 (그림 4B) 후 1 ~ 4 시간 동안 투여했을 때이 효과는 분실되었다. 그림 4c는 모두의 경색 크기를 꾸몄다 네 개의 치료 그룹의 쥐를 살아 남았다. 참고로, 0.5 및 1 시간 TPA에 관리의 모두ignificantly 차량 처리에 비해 경색 크기를 감소시켰다. 0.5 시간 TPA에 처리 군은 또한 4 시간 TPA에 처리 군보다 현저히 감소 된 경색 크기를 나타내었다.도 4d는 각각의 처리 후의 대표 TTC 얼룩 결과를 보였다.

그림 1
그림 1 :. 성인 마우스에서 일시적인 대뇌 저산소증 - 허혈 (THI) 모욕의 절차 (A) Virchow의 트라이어드 혈전증을 추진 혈액의 혈액의 흐름, 내피 손상 및 과다 응고의 정체를 포함한다. (B) THI 스트로크 순서를 나타내는 개략도. 마우스 직장 온도가 37-38 ℃로 유지하면서 두 이형성 매듭은 우측 총 경동맥 (CCA) 상에 묶여, 30 분 동안 노즈콘을 통해 7.5 %의 산소의 전달에 의해 관찰 하였다. 트랜스 후ient 조직 저산소증은 CCA 결찰은 해제 봉합 매듭의 한쪽 끝을 잡아 당겨 릴리스되었습니다. MCA, 중대 뇌동맥; ICA, 내 경동맥; ECA, 외부 경동맥; CCA, 경동맥. (C) 과도 잘 CCA 폐쇄에 대한 외과 적 치료. 1. 두 개의 미리 절단 봉합사 (# 1, # 2)은 절연 오른쪽 CAA하에 넣었다. 2 개의 탈착 가능한 매듭을 제조 하였다. 3. 절개 라인은 봉합 # 3에 의해 폐쇄되었다. 봉합 # 1과 # 2의 끝이 절개 라인 외부 가까이했다 있는지 확인합니다. 4. 조심스럽게 CCA를 해제 외부에서 봉합 # 1과 # 2를 당깁니다. 부드럽게 수행하는 경우,이 절차는 CCA의 열상가 발생하지 않습니다.

그림 2
그림 2. 중이나 THI 비방 후 뇌 혈류 변화의 분석 이차원 레이저 스페 클 대비 이미징 (LSCI) 시스템은 뇌 혈류 (CBF)를 평가 하였다. R (오른쪽) 경동맥 결찰 반구를 나타냅니다; L (왼쪽) 반대쪽 반구입니다. (A)는 tCCAO normoxia 하에서 억제 CBF 행 ~ 경동맥의 결찰 해제시 3 분 이내에 85 % 이상을 회복 적어도 30 분 동안 경동맥 결찰 반구 (R)에 대한베이스 라인 값의 50 %. 경동맥을 결찰없이 저산소증 (7.5 % 산소, 30 분)에있어서 (B)는, CBF는베이스 라인 값은 76 %로 감소하고 일시적 normoxia로 복귀 한 후 약 130 %까지 회복. 저산소 상태 하에서 과도 경동맥의 결찰에 (C) (THI, 30 분), CBF는 경동맥 결찰 (R) 반구 신속 기준 값의 20 % 미만으로 떨어하고 거의의 릴리스에 따라 30 % 이상으로 회복되지 결찰 및 normoxia로 복귀를 경동맥. 대조적으로, 반대측 (L)에 반구 CBF는 저산소증 동안에 20-50% 사이에서 변동하고, 신속 기준선의> 80 % 반환경동맥 결찰의 출시 후 값과 normoxia로 돌아. 각 그룹 N> 4 대표 CBF 트레이싱이 보이고있는 바와 같다. 대표적인 LSCI 사진에서 타임 포인트는 대표적 추적 회색 선으로 표시 하였다.

그림 3
그림 3 : 뇌 경색, 자연 혈전증 및 선박 오른쪽 경동맥 (tCCAO)의 30 분 일시적 결찰 후 24 시간에 눈에 보이는 경색을 보이지 않았다 생체 TTC 얼룩 티 모욕 후 폐쇄 (), 그러나의 추가. tCCAO 30 분 저산소증 (7.5 % 산소) 미들 뇌동맥 - 공급 지역에, 동측 반구 (별표)에 상당한 경색을 일으켰다. 티 모욕 후 1 시간에서 면역 염색 (B, C) ​​항 섬유소 (ogen는)에 광범위하게 예금을 보여 주었다동측 반구. 반면, tCCAo 후 1 시간 (30 분) 모욕 (각 N> 4)에서 더 섬유소 (ogen) 예금 없었다. (D, E)는 tCCAO 대뇌 재관류 (30 분) 또는 티 (30 분) 모독 후 4 시간에서 에반스 블루 염료의 꼬리 정맥 주사에 의해 평가 하였다. 포스트 tCCAO 뇌에서, 에반스 블루 염료 동측 반구에서 혈관의 대부분을 채웠다. 대조적으로, 포스트 - 티 뇌에서, 에반 블루 염료 적은 혈관을 채우고 실질 (n은> 3)로 유출되었다. 스케일 바 : 250 μm의.

그림 4
도 4 : THI 뇌졸중 모델에서의 TPA 혈전 용해 효과 THI 비방 후 0.5, 1, 또는 4 시간에 정맥 내 tPA의 투여 (10 ㎎ / ㎏)의 효과를 비교하는 실험의 (A)의 개요.. 조작 동물의 수 (B)의 개요, MO욕설 후 24 시간에서 rtality은 이상치 (평균 +/- 2 SD 외부 경색 크기), 동물의 수는 경색 크기의 비교를 포함. (C) 정량화 기 (도시는 각 그룹에 대한 평균 및 SEM이다) (20 %) 비히클 그룹에서 평균 32 % 경색 량하고 0.5 시간 (16 %)에서 경색의 현저한 감소 및 1 시간을 보였다. P-값은 t 검정에 의해 결정됩니다. (D) 대표 생의 모욕에 의해 도전과 손상 후 지정된 시간 시점에서의 TPA 치료를받은 동물에서 뇌 TTC는 염색. TTC 염색에서, 살아있는 조직은 붉은 색을 보여 주었다; 경색 조직은 창백했다.

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Discussion

스트로크는 노화 인구 어떤 사회 중요성을 성장의 주요 건강 문제입니다. 전 세계적으로 뇌졸중이 사망 원인 (18)의 11.1 %에 해당하는 2010 년 추정 5,900,000 치명적인 이벤트와 사망의 두 번째 주요 원인이다. 스트로크는 장애 조정 생명 년의 세 번째 주요 원인이다 (DALYs)은 1990 (19)에 다섯 번째 위치에서 상승, 2010 년에 전 세계적으로 패했다.이 역학 데이터가 급성 (허혈성) 뇌졸중의보다 효과적인 치료의 필요성을 강조 표시합니다. 그러나, 임상 신경 치료에 강렬한 연구에도 불구하고, TPA에 혈전이 동물 실험에서 여러 번 약속 신경 에이전트가 임상 시험에 실패하면서, 미국 식품의 약국 (FDA)의 승인을 급성 허혈성 뇌졸중의 특정 치료 남아있다. 환자에게 신경 보호 요법을 번역하는 어려움은 많은 요소를 가지며, 현재 강조 좋은 실험실 practi에CE, 여러 데이터 세트의 메타 분석, 국제 협력 전임상 뇌졸중 연구 (20, 21)을 향상시킬 수 있습니다. 그러나, 번역의 어려움으로 인해 날짜 2,3에 전임상 행정 연구의 대부분의 기계 혈관 폐색 모델의 가난한 선택 (예 : 관내 봉합 중대 뇌동맥 폐색)에 있음을 시사 소수 의견이있다. 기계 혈관 폐색 모델은 거의 혈전증을 유발하지 않고 대뇌 재관류 기계적인 방해의 출시에 너무 빨리 발생하기 때문에,이 모델은 어느 쪽도 실제 단어 치료 (TPA의 섬유소 용해)에 응답하지 않고 뇌졸중 환자에서와 좁은 치료 창을 제공합니다. 따라서, 제안 된 구제는 적어도 혈전 색 전성 뇌졸중 모델 전임상 행정 연구 3에 포함 강조하는 것입니다.

이 권장 사항은, 그러나, 그것의 감금을 가지고 있기 때문에 T의 현재 혈전 색 전성 뇌졸중 모델 (외인성 색전 배달, MCA 주입hrombin 및 photothrombosis) 모든 특정 기술의 단점 4 있습니다. 외인성 색전 모델에 의한 혈전 제제 4,5- 차이에 경색 크기와 위치에 상당한 변동뿐만 아니라, 혈전 용해의 TPA에 예측할 반응에 색전 결과 혈관 내 주입. MCA 분기로 트롬빈의 직접적인 주입은 두개 절제술을 필요로하고, 혈전 용해 치료를 최적화하기위한 유틸리티 4,6- 입증 될 아직. 화학적으로 노출 된 두개골을 통해 전신 감광성 염료를 주입 (예를 들어, 로즈 벵갈 또는 에리트로의 B) 및 조사를 기반으로 혈전 색전증을 시작 종종 4,7을 혈전이 응답하지 않는 혈소판 만 집계를 생산하고 있습니다. 전임상 연구를 위해 스트로크 간단하고 TPA에 응답하여 혈전 모델의 필요성이 있고, 종합적.

생 패러다임은 혈전 색 전성 뇌졸중 모델 4 개의 고유 한 이점이있다. 첫째, 티 모욕이 녀석내생 구성 요소는 외인성 화학 물질이나 미리 형성된 색전의 도움없이 현장에서 혈전 형성한다. 따라서, THI 모델에서 혈전 형성은 생리 학적 조건에 더 적합하다. 둘째, 생 모델은 빠른 TPA에 치료에 유리한 반응하지만 지연 처리 (4 시간에서) (0.5 1 시간 후 부상에서). 이 치료 창은 뇌졸중 환자에서 관찰 된 것과 유사하다. 따라서, THI 모델은 급성 허혈성 뇌졸중의 재관류 요법을 개선하는 것을 목표로 연구에 이용 될 수있다. 관내 봉합 폐색 MCA 모델에 비해 셋째, THI 모델의 수술 절차가 단순하고 간단하다. THI 모델에서 저산소증의 기간도 제어 가능하다. 이러한 특성은 다른 실험실 간의 절차의 변화에​​ 티 모델은 덜 민감합니다. 마지막으로, THI 모델 인 혈전 용해 후 큰 동맥의 개통에도 불구하고 불완전 재관류의 메커니즘에 대한 통찰력을 흘리다 수 있습니다뇌졸중 치료에 고유 한 도전은 심장 허혈 1,22 비교할 때. 따라서, THI 모델 지혈 (23)의 대뇌 혈관계 특정 조절 곤란의 메커니즘을 연구하는 독특한 시스템을 제공한다.

모든 실험 뇌 손상 모델에는 한계가 있고, THI 모델도 예외는 아니다. 생 스트로크 모델의 세 가지 주요 기술적 인 제약이 실험에서 확인되었다. 먼저, 모독가 뇌에 한정되어 다른 행정 모델과 달리, 저산소증 및 경동맥 폐색의 조합은 주변 혈관 확장과 심 박출량 12 수요에 이르게. 마우스 돌연변이 또는 티 모욕에 대한 신경 보호제의 효과를 비교할 때 따라서, 심혈관 기능에 미치는 영향은 신중하게 비교해야한다. 둘째, 우리는 다른 마우스 근친 균주에 의한 후방 COMMUN의 고르지 개통을 할 수있는, 티 모델에 변수 응답이 발견icating 동맥 (24), 이종 심장 기능, 또는이 둘의 조합을 포함한다. 따라서, 두 개의 실험 그룹 간의 성별, 연령, 체중, 및 마우스 균주 신경 연구에서 비교하는 것이 권장된다. 마지막으로, 티 스트로크는 가볍게 마취 상태에서 저산소 가스에 숨을 동물에 의존한다. 스트로크 결과에 마취의 효과는 최소화과 동물 사이의 일관성을 유지해야합니다. 그럼에도 불구하고, 한 연구자는 이러한 기술적 인 세부 사항의 경계이며, 동물 동물에서 변수를 줄일 수로, 티 스트로크 모델은 신속하게 뇌 경색의 높은 일관성을 산출하기 위해 설립 할 수있다.

요약하면, 티는 임상 적으로 일시적인 창의 실제 치료 (TPA의 혈전)에 양호하게 반응하는 간단하고 표준화 된 뇌졸중 모델이다. 이 새로운 모델은 전임상 행정 연구에 귀중한 추가하고, 급성 허혈성에서 혈전 용해 치료를 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다스트로크.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
adult male mice Charles River C57BL/6  10-13 weeks old (22-30 g)
Mobile Laboratory Animal Anesthesia System VetEquip 901807 anesthesia
Medical air (Compressed) air tank Airgas UN1002 anesthesia
Isoflurane Piramal Healthcare NDC 66794-013-25 anesthesia
Multi-Station Lab Animal AnesthesiaSystem Surgivet V703501 hypoxia system
7.5% O2 balanced by 92.5% N2 tank Airgas UN1956 hypoxia system
Temperature Controller with heating lamp  Cole Parmer  EW-89000-10 temperature controllers
Rectal probe Cole Parmer  NCI-00141PG temperature controllers
Dissecting microscope  Olympus  SZ40 surgical setup
Heat pump with warming pad Gaymar  TP700 surgical setup
Fine curved forceps (serrated) FST 11370-31 surgical instrument
Fine curved forceps (smooth) FST 11373-12 surgical instrument
micro scissors FST 15000-03 surgical instrument
micro needle holders FST 12060-01 surgical instrument
Halsted-Mosquito hemostats FST 13008-12 surgical instrument
5-0 silk suture  Harvard Apparatus 624143 surgical supplies
4-0 Nylon monofilament suture LOOK 766B surgical supplies
Tissue glue Abbott Laboratories NC9855218 surgical supplies
Puralube Vet ointment Fisher NC0138063  eye dryness prevention 
MoorFLPI-2 blood flow imager Moor 780-nm laser source Laser Speckle Contrast Imaging
Mannitol Sigma M4125 in vivo TTC
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)  Sigma T8877 in vivo TTC
Vibratome Stoelting 51425 brain section for in vivo TTC 
Digital microscope Dino-Lite AM2111 whole-brain imaging
O.C.T compound Sakura Finetek 4583
goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 Invitrogen A11008 Immunohistochemistry
Cryostat Vibratome ultrapro 5000 brain section for IHC
Evans blue Sigma E2129 Detecting vascular perfusion
Microtome Electron Microscopy Sciences 5000 brain section for histology
Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) Sigma T48402 euthanasia
Fluorescent microscope Olympus DP73
Meloxicam SR ZooPharm NSAID analgesia

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References

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