Um Modelo de acidente vascular cerebral trombótico Baseado em Transient isquemia-hipoxia cerebral

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Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. A Thrombotic Stroke Model Based On Transient Cerebral Hypoxia-ischemia. J. Vis. Exp. (102), e52978, doi:10.3791/52978 (2015).

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Abstract

Pesquisa derrame tem sofrido muitos contratempos em traduzir terapias neuroprotetoras para a prática clínica. Em contraste, a terapia do mundo real (tPA trombólise) raramente produz benefícios em modelos experimentais à base de oclusão mecânica, os quais dominam a investigação pré-clínica acidente vascular cerebral. Esta divisão entre o banco e cabeceira sugere a necessidade de empregar modelos tPA-responsivos em pesquisa pré-clínica acidente vascular cerebral. Para este fim, um modelo de acidente vascular cerebral trombótico simples e de tPA-reactivo é inventado e descrito aqui. Este modelo consiste de oclusão transiente da artéria carótida comum unilateral e entrega de 7,5% de oxigénio através de uma máscara facial em ratos adultos, durante 30 min, enquanto se mantinha a temperatura rectal dos animais a 37,5 ± 0,5 ° C. A ligadura reversível da artéria carótida unilateral ou hipóxia cada suprimido o fluxo sanguíneo cerebral apenas transitoriamente, a combinação de ambos os insultos causada duradoura défices de reperfusão, a fibrina e a deposição de plaquetas, e grande INFARCT no território fornecido pelo artéria cerebral média. Importante, a injecção de tPA recombinante a 0,5, 1, ou 4 h pós-THI (10 mg / kg) da veia da cauda proporcionou uma redução tempo-dependente do tamanho do enfarte e mortalidade. Este novo modelo de acidente vascular cerebral é simples e pode ser padronizado em laboratórios para comparar os resultados experimentais. Além disso, induz a trombose sem craniectomia ou a introdução de êmbolos pré-formadas. Tendo em conta estes méritos exclusivos, o modelo Thi é uma adição útil para o repertório de pesquisa do curso pré-clínico.

Introduction

Trombólise e recanalização é a terapia mais eficaz de AVC isquêmico agudo na prática clínica 1. No entanto, a maioria da investigação pré-clínica foi realizada a neuroprotecção num modelo transiente mecânico obstrução (oclusão da artéria cerebral média sutura intraluminal) que produz uma recuperação rápida de fluxo sanguíneo cerebral após a remoção da oclusão vascular e mostra pouca ou nenhuma benefícios por tPA trombólise. Tem sido sugerido que a escolha duvidosa de modelos de acidente vascular cerebral contribui, pelo menos em parte, da dificuldade em traduzir terapia neuroprotectora para pacientes 2,3. Assim, há um crescente apelo para o emprego de modelos de AVC tromboembólica tPA-responsivos em pesquisa pré-clínica, mas tais modelos também têm problemas técnicos (ver Discussão) 4-7. Aqui nós descrevemos um novo modelo de acidente vascular cerebral trombótico com base em (ITU) insulto hipóxico-isquêmica transitória unilateral e suas respostas à terapia tPA intravenosa 8.

O modelo de acidente vascular cerebral Thi foi desenvolvido com base no procedimento de Levine (ligadura permanente da artéria carótida comum unilateral seguida por exposição a hipoxia transitória numa câmara) que foi inventado para experiências com ratos adultos em 1960 9. O procedimento Levine inicial desapareceu na obscuridade porque ele só produziu danos cerebrais variável, mas o mesmo insulto causado neuropatologia consistente em filhotes de roedores quando foi re-introduzido por Robert Vannucci e seus colegas como um modelo de neonatal encefalopatia hipóxico-isquêmica (HIE) em 1981 10. Nos últimos anos, alguns investigadores re-adaptado ao modelo Levine-Vannucci para ratinhos adultos por ajustamento da temperatura na câmara hipóxica 11. É plausível que as lesões cerebrais inconsistentes no procedimento Levine original pode surgir a partir de temperaturas flutuantes do corpo de roedores adultos na câmara hipóxica. Para testar esta hipótese, nós modificamos o procedimento Levine pela administração de gás hipóxicoatravés de uma máscara facial, enquanto se mantinha a temperatura interna a 37 ° roedor C na mesa cirúrgica 12. Como esperado, o controlo rigoroso da temperatura corporal aumentou significativamente a reprodutibilidade da patologia cerebral induzida por HI. O insulto HI também provoca a coagulação, a autofagia, e grisalhos e branco-matéria lesão 13. Outros pesquisadores também usaram o modelo HI para investigar pós-AVC respostas inflamatórias 14.

Uma característica única do modelo de acidente vascular cerebral HI é que ele segue de perto tríade de Virchow de formação de trombos, incluindo a estase do fluxo de sangue, lesão endotelial (por exemplo, devido ao estresse oxidativo induzido por HI), e hipercoagulabilidade (ativação plaquetária induzida pelo HI) ( Figura 1A) 15. Como tal, o modelo HI pode capturar alguns mecanismos fisiopatológicos relevantes para AVC isquêmico no mundo real. Com esta ideia em mente, nós refinou ainda mais o modelo HI com ligadura reversível da ONUartéria carótida comum ilateral (portanto, para criar um insulto HI transitória), e testou suas respostas ao tPA trombólise com ou sem edaravona. Edaravona é um captador de radicais livres já aprovado no Japão para tratar AVC isquêmico dentro de 24 horas do início 9. As nossas experiências mostraram que tão breve quanto 30 min transiente HI desencadeia enfarte trombótico, e que o tratamento com tPA-edaravona combinada confere benefícios sinérgicos 8. Aqui nós descrevemos os procedimentos cirúrgicos detalhadas e considerações metodológicas do modelo Thi, que podem ser utilizados para otimizar tratamentos reperfusão de AVC isquêmico agudo.

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Protocol

Este protocolo é aprovado pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Universidade de Emory e segue os Institutos Nacionais de Saúde Guia para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório.

1. Setup

  1. Prepare o leito cirúrgico na almofada de aquecimento ligado com bomba de calor a 37 ° C durante pelo menos 15 minutos antes da cirurgia. Coloque um rolo de pescoço usando o barril de 3 ml seringa no leito cirúrgico. Prepara-se o gás a anestesia com isoflurano a 2% em ar medicinal.
  2. Prepare fórceps autoclavada, tesouras, porta-agulhas, micro pinça hemostática, cotonetes e suturas. Prepare a cola de tecido e pomada.
  3. Configure o sistema de hipóxia e controladores de temperatura com lâmpada de aquecimento e sonda retal. Prepare gás hipoxia com 2% de isoflurano em 7,5% de O2 em relação 92,5% de N2.
  4. Uma hora antes da cirurgia, os ratos são analgesized por injecção subcutânea de uma de libertação lenta O meloxicam (4,0 mg / kg).
<p class = "jove_title"> 2. Transient-hipoxia cerebral isquemia (Figura 1B)

  1. Anestesiar 10-13 semanas de idade C57BL masculino / 6 ratos pesando 22 a 30 g na câmara de indução anestésica com 3% de isoflurano até que o animal está respondendo a uma compressão de pé, e depois remover o cabelo no pescoço direita usando um barbeador eletrônico.
  2. Coloque ratinhos no leito cirúrgico conectado com isoflurano a 2% em ar medicinal a um caudal de 2 L / min. Forelimbs seguros estendeu ao longo do rolo pescoço em lados usando fita adesiva médica.
  3. Limpe o local da cirurgia para a incisão com betadine seguido de álcool e, em seguida, cotonetes.
  4. Sob microscópio de dissecação, fazer uma incisão 0,5 centímetros direita-cervical utilizando uma pinça reta e uma tesoura micro cerca de 0,2 cm lateral da pele na linha média.
  5. Utilizar um par de fórceps finos serrilhada para separar a fáscia e tecido para expor a artéria carótida comum direita (RCCA). Cuidadosamente separar a RCCA do nervo vagal, usando um par de fórceps finos lisas.
  6. Vivo nó dois pré-cortada 5-0 sutura de seda (destacável) na RCCA, e depois costurar a pele usando 4-0 sutura de monofilamento de nylon (Figura 1C).
  7. Aplicar pomada olho em ambos os olhos para prevenir o ressecamento.
  8. Transferir rapidamente os ratos a hipoxia sistema e colocá nariz e boca na máscara facial com 2% de isoflurano em 7,5% de O 2 a uma taxa de fluxo de 0,5-1 L / min durante 30 min.
    1. Durante a hipóxia, utilizar controladores de temperatura com lâmpadas de aquecimento para controlar a temperatura rectal em 37,5 ± 0,5 ° C. Monitorar a freqüência respiratória em 80-120 ciclos / min. A manutenção da temperatura corporal acima de 37 ° C durante a hipóxia é importante para criar enfarte cerebral consistente. Frequência respiratória baixa geralmente acontece depois de 20 min hipóxia. Remova a máscara e permitir que o suprimento de ar normal se a freqüência respiratória cair abaixo de 40. Isso leva 1-2 min e não conta para a duração hipóxia 30 min.
  9. Depois de hipoxia, transferircamundongos para um leito cirúrgico e liberar as duas suturas de RCCA. Fechar a ferida usando cola de tecido e, em seguida, retornar os ratos para a jaula. Excluir os animais se ambos dois nós ao vivo são inesperadamente libertado depois hipoxia.
  10. Monitorar os ratos para 5-10 min para se recuperar de hipóxia e anestesia. Coloque o alimento molhado na gaiola e devolvê-lo à facilidade de cuidado animal.
    Nota: Os animais que apresentem leve a grave comportamento circular às 24 h após Thi estão correlacionados com infração cérebro. A maioria dos animais com sintomas de apreensão morrer antes do ponto de tempo de 24 horas depois de Thi.

3. Laser Speckle Contrast Imaging

Nota: Embora isso não é um processo essencial do modelo Thi, um salpico de laser sistema de imagiologia de contraste bidimensional 16 pode ser utilizado para caracterizar as alterações do fluxo sanguíneo cerebral (CBF) durante ou após a hipóxia-isquémia transiente. Para documentar as alterações da CBF sob Thi, ficha imediatamente após a step 2.6. Alternativamente, para comparar a recuperação CBF após insulto Thi, estes procedimentos podem ser realizados seguindo o passo 2.10.

  1. Inserir um rato anestesiado em decúbito ventral e executar a 1 cm de comprimento incisão na linha média no couro cabeludo com o crânio exposto, mas sem abrir.
  2. Monitorar CBF em ambos os hemisférios cerebrais sob um imager fluxo de sangue de acordo com o protocolo do fabricante e começar a gravar o fluxo sanguíneo cerebral imediatamente após a cirurgia CCAO (passo 2.6). Continue por 50 min.
  3. Mostrar imagem CBF com unidades arbitrárias em uma paleta de 16 cores e analisar em tempo real as regiões selecionadas usando o software MoorFLPI seguindo as instruções do fabricante (Figura 2).
  4. Depois de gravar a imagem CBF, feche o couro cabeludo com cola de tecido e devolver o animal para a jaula.

Administração 4. tPA

  1. Injectar animais na veia da cauda com o solvente ou 10 mg / kg de tPA recombinante (220-300 &# 956; ul de 1 mg / m tPA) a 0,5, 1, 4 ou mais horas após tCCAo hipoxia (Figura 4).

5. Dano Cerebral Detecção com vários diferentes opções

Nota: Para a coleta de amostras de cérebro, eutanásia os ratos de 1, 4 ou 24 horas após Thi.

  1. Execute quantificação do volume de enfarte in vivo por cloreto de 2,3,5-Trifeniltetrazólio método (TTC) em 24 horas após Thi insulto como descrito anterior. 17
    1. Injectar animais por via intraperitoneal com solução de manitol 1,4 M (~ 0,1 ml / g de peso corporal) 30 min antes da perfusão transcardial. Ratinhos perfundir transcardial com PBS, seguido por 10 ml de 2% de TTC.
    2. Remover o cérebro de animais com instrumentos cirúrgicos, depois de 10 minutos e colocar em paraformaldeído a 4% para a fixação durante a noite e em secção de 1 mm de espessura com um vibratome.
    3. Tire uma série de quatro lâminas do cérebro segmentado por microscópio digital e quantify o volume de enfarte como a razão da área de enfarte (área branca do lado direito) para a área do hemisfério não danificado, contralateral utilizando o software ImageJ.
  2. Como alternativa, realizar a formação de trombose por imunofluorescência em 1 hora após Thi insulto.
    1. Congelar o cérebro fixado em composto outubro e os cérebros na seção 12 mm de espessura utilizando um criostato.
    2. Incubar as lâminas do cérebro com anticorpo de coelho anti-f ibrinogénio (1: 100) seguido de anticorpo de cabra anti-coelho Alexa Fluro 488 corante (1: 200) para observar a fluorescência num microscópio fluorescente.
  3. Como alternativa, executar obstrução do vaso por injecção na veia da cauda de 100 ul 2% corante azul de Evans às 4 horas após Thi insulto.
    1. Euthanize os ratos e rapidamente cortar a cabeça para remover cérebros em paraformaldeído a 4% após injeção de azul de Evans. Nota: Demora 5-10 min para Evans azul circulação com cor azul de ambos previsão e pélvicos.
    2. Sectiem cérebros fixados a espessura de 100 um utilizando um micrótomo deslizante e observar a fluorescência usando um filtro de emissão de 680 nm num microscópio fluorescente.

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Representative Results

Bidimensional imagiologia de contraste salpico do laser (LSCI) 16 foi utilizado para comparar as alterações do fluxo sanguíneo cerebral (CBF) por oclusão da carótida 30 minutos transiente unilateral (tCCAO), 30 min de exposição a hipoxia (7,5% de oxigénio), e 30 min unilateral carótida ligadura sob hipóxia (ITU). Esta experiência revelou que tCCAO sob normoxia suprimiu a CBF no hemisfério carótida ligado a ~ 50% do valor da linha de base, o qual se recuperou rapidamente para acima de 85% após a libertação da oclusão da carótida (R na Figura 2A). A exposição a hipoxia sistémica sozinho reduziu o CBF para aproximadamente 75% do valor da linha de base, que transitoriamente recuperar a ~ 130% após o retorno para a atmosfera normóxica (Figura 2B). Em contraste ligadura carótida em condições de hipoxia (THI) rapidamente reduzida CBF no hemisfério ipsilateral para menos de 20% do valor da linha de base de cerca de 10 min, o que raramente recuperado para acima de 30%, a 20 min após a libertação da carótida ligation e voltando a normóxia. CBF sobre o hemisfério contralateral (G), no entanto, variou entre 20 e 50% durante a hipóxia, e rapidamente retornada para acima de 80% após o insulto Thi (Figura 2C).

Em 24 horas após tCCAo (30 min) ou tCCAO mais 30 min hipoxia (Thi), in vivo TTC mancha foi utilizado para detectar enfarte 17. Esta análise não mostrou qualquer lesão óbvia pelo insulto tCCAO, mas infarto considerável no território fornecido pelo artéria cerebral média Thi insulto seguinte (Figura 3A). Anti-fibrina (ogen) immunostaining foi utilizado para comparar os cérebros tCCAO- e Thi-feridos em 1 hora e mostrou recuperação generalizada da deposição de fibrina (ogen), um indicador de trombose, no Thi-ferido, mas não rato tCCAO-desafiado cérebros (Figura 3B, C). Injeção cauda-veia do corante azul de Evans também foi utilizado para comparar a perfusão vascular do cérebro tCCAO- e Thi-feridos em 4 horas de recuperação. Esta análise mostrou diminuemed perfusão cerebral e intenso extravasamento do corante azul de Evans em Thi-ferido, mas não o cérebro do rato tCCAO-desafiados (Figura 3D, E).

Finalmente, os resultados de Thi insulto em ratinhos que receberam veia da cauda de injecção de veículo (em 0,5 horas de recuperação) ou tPA humano recombinante (Activase, 10 mg / kg, a 0,5, 1, ou 4 horas pós-Thi) foram comparados utilizando em vivo mancha TTC às 24 horas de recuperação (Figura 4A). Em camundongos tratados com o veículo, a taxa de mortalidade às 24 h pós-THI foi de 23,8% e apenas um em cada 21 ratos Thi-ferido foi além da média e 2 DP (o outlier). A taxa de mortalidade 24 horas em ratinhos que receberam tratamento tPA a recuperação de 0,5 h caiu para 8,3%, mas este efeito perdeu-se quando o tPA foi administrada em uma ou quatro horas após o insulto Thi (Figura 4B). Figura 4C representados graficamente o tamanho do enfarte de todos sobreviveu ratinhos em quatro grupos de tratamento. De nota, tanto 0,5 e 1 hr tPA-administração significantly reduziu o tamanho do enfarte, quando comparado com tratamento com veículo. A 0,5 hr grupo tPA-tratamento também mostrou uma dimensão do enfarte significativamente reduzido do que o grupo 4 horas tPA-tratamento. Figura 4D mostrou resultados representativos TTC-mancha depois de cada tratamento.

Figura 1
Figura 1:. Procedimento de transiente isquemia-hipoxia cerebral (ITU) insulto em ratos adultos (A) A tríade de Virchow que impulsiona trombose inclui estase do fluxo de sangue, lesão endotelial e hipercoagulabilidade do sangue. (B) Um diagrama esquemático do processo de acidente vascular cerebral Thi. Dois nós libertáveis ​​foram amarrados para a artéria carótida comum direita (CCA), e seguido por entrega de 7,5% de oxigénio através de um cone de nariz durante 30 minutos, enquanto a temperatura rectal do rato foi mantida a 37-38 ° C. Depois da transhipóxia sistêmica tário, a ligadura CCA foi lançado puxando uma extremidade dos nós de sutura libertáveis. MCA, artéria cerebral média; ICA, artéria carótida interna; ECA, artéria carótida externa; CCA, artéria carótida comum. (C) Os procedimentos cirúrgicos para a direita transitória oclusão CCA. 1. Duas pré-cortada sutura (# 1 e # 2) foram colocados sob uma CAA direito isolado. 2. Dois nós libertáveis ​​foram feitas. 3. A linha de incisão foi fechada por sutura # 3. Certifique-se de que as extremidades da sutura # 1 e # 2 foram acessível fora da linha de incisão. 4. Retire cuidadosamente sutura # 1 e # 2 do lado de fora para liberar o CCA. Quando realizada com cuidado, este procedimento não irá causar laceração do CCA.

Figura 2
Figura 2:. Análise de alterações de fluxo sanguíneo cerebral durante e após Thi insulto A bidimensional a laser speckle contraste de imagem (LSSistema de IC) foi utilizado para avaliar o fluxo sanguíneo cerebral (CBF). R (direita) indica que o hemisfério ligados-carotídea; L (esquerda) é o hemisfério contralateral. (A) tCCAO sob normoxia suprimida CBF para ~ 50% do valor de base sobre o hemisfério ligado-carótida (R) durante pelo menos 30 min, o que se recuperou para acima de 85% dentro de 3 minutos após a libertação da ligação da carótida. (B) Em hipóxia (7,5% de oxigênio, 30 min) sem ligação da artéria carótida, a CBF se recusou a 76% do valor da linha de base e transitoriamente se recuperou para cerca de 130% após o retorno à normoxia. (C) A ligadura carótida sob hipóxia transitória (Thi, 30 min), no CBF (R) ligado hemisfério-carótida rapidamente caiu para menos de 20% do valor da linha de base, e é raramente recuperado para acima de 30% após a libertação do carótida ligação e voltar a normóxia. Em contraste, a CBF no contralateral (G) no hemisfério flutuou entre 20-50% durante a hipóxia, e rapidamente retornada a> 80% da linha de basevalor após o lançamento de ligadura de carótida e retornando a normoxia. São mostrados os traçados representativos CBF para n> 4 em cada grupo. Os pontos de tempo para fotografias representativas LSCI foram marcados por linhas cinzentas no traçado representativo.

Figura 3
Figura 3: enfarte cerebral, trombose espontânea e obstrução vaso após o insulto Thi (A) in vivo TTC-mancha não mostrou enfarte visível em 24 horas após 30 min de ligação transiente da artéria carótida comum direita (tCCAO), mas a adição de. 30 min hipóxia (7,5% de oxigênio) para tCCAO produzido infarto considerável no hemisfério ipsilateral (asterisco), principalmente na área de fornecimento de artéria cerebral do meio. (B, C) ​​Anti-fibrina (ogen) imunocoloração em 1 hora após o insulto THI mostraram depósitos generalizadas nohemisfério ipsilateral. Em contraste, não houve depósitos de fibrina (ogénio) em 1 hora após a tCCAo (30 min) insulto (n> 4 para cada). (D, E) de perfusão cerebral foi avaliada através da veia da cauda de injecção de corante azul de Evans em 4 h após tCCAO (30 min) ou THI (30 min) insulto. No pós-tCCAO cérebro, corante Evans Blue preenchido a maioria dos vasos sanguíneos no hemisfério ipsilateral. Em contraste, no pós-Thi cérebro, corante Evan azul encheu-se menos vasos sanguíneos e vazou para o parênquima (n> 3). Barra de escala: 250? M.

Figura 4
Figura 4: Efeitos de tPA trombólise no modelo de acidente vascular cerebral Thi (A) Esquema de experiências para comparar os efeitos da administração intravenosa de tPA (10 mg / kg) a 0,5, 1 ou 4 horas após o insulto Thi.. (B) Síntese de o número de animais operados, MOrtality em 24 horas após insultos, valores aberrantes (o tamanho do enfarte do lado de fora a média +/- DP 2), e o número de animais incluídos para comparação do tamanho do enfarte. (C) Quantificação mostrou uma média de 32% do volume de enfarte no grupo de veículo e redução significativa de enfarte no 0,5 h (a 16%) e 1 hora (a 20%) os grupos (mostrados são a média e SEM para cada grupo). Os valores de p são determinadas por teste t. (D) Representante TTC-corada cérebro de animais que foram desafiados pelo insulto Thi e receberam tratamento tPA no ponto-tempo indicado após a lesão. Na coloração TTC, tecido vivo mostraram cor vermelha; tecido infarto estava pálido.

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Discussion

O AVC é um importante problema de saúde de crescente importância para qualquer sociedade com o envelhecimento da população. Globalmente, o AVC é a segunda principal causa de morte com um número estimado de 5,9 milhões de eventos fatais em 2010, o equivalente a 11,1% de todas as mortes 18. O AVC é também a terceira maior causa de anos de vida ajustados por incapacidade (DALYs) perdidos globalmente em 2010, elevando-se a partir da quinta posição em 1990 19. Esses dados epidemiológicos apontam para a necessidade de terapias mais eficazes de aguda (isquêmico) acidente vascular cerebral. No entanto, apesar de intensa pesquisa em tratamento neuroprotector pré-clínico, tPA-trombólise continua sendo a única terapia específica de acidente vascular cerebral isquêmico agudo, que é aprovado pela Food and Drug Administration nos Estados Unidos, enquanto numerosos agentes neuroprotectores uma vez promissores em estudos com animais falharam em testes clínicos. A dificuldade em traduzir terapias neuroprotetoras em pacientes tem muitos fatores, ea ênfase atual é em boa practi laboratórioce, meta-análise de vários conjuntos de dados, ea cooperação internacional para melhorar a investigação pré-clínica acidente vascular cerebral 20,21. No entanto, existe uma opinião minoritária sugerindo que a dificuldade de translação é devido a uma má escolha de modelos mecânicos de oclusão vascular (por exemplo, fio de sutura intraluminal oclusão MCA) na maior parte da investigação pré-clínica acidente vascular cerebral até à data 2,3. Porque os modelos de oclusão vascular mecânica raramente induzir trombose e reperfusão cerebral ocorre muito rápido em cima da liberação de obstrução mecânica, estes modelos não respondem à terapia-palavra real (tPA fibrinólise), nem fornecer uma janela terapêutica estreita como aqueles em pacientes com AVC. Consequentemente, o remédio sugerido é enfatizar, pelo menos, incluir, modelos de AVC acidente vascular cerebral tromboembólico em pesquisa pré-clínica 3.

Essa recomendação, no entanto, tem suas limitações porque os modelos de AVC tromboembólicos atuais (entrega êmbolos exógena, MCA-injeção de thrombin, e fototrombose), todos têm algumas desvantagens técnicas 4. Para o modelo de embolia exógeno, infusão intravascular de coágulos em resultados variabilidade significativa da dimensão do enfarte e local, bem como respostas imprevisíveis para tPA trombólise devido a diferenças na preparação coágulo 4,5. Injeção direta de trombina para o ramo MCA requer craniotomia, e sua utilidade para otimizar a terapia trombolítica ainda está para ser provado 4,6. Quimicamente tromboembolismo iniciado com base em injecção sistémica de um corante fotossensível (por exemplo, Rosa Bengala, eritrosina B) e irradiação através do crânio expostos muitas vezes produz agregados só de plaquetas que não respondem à trombólise 4,7. Tomados em conjunto, existe uma necessidade de modelos tromboembólicos mais simples e de tPA-responsivos para a investigação pré-clínica acidente vascular cerebral.

O paradigma Thi tem quatro vantagens únicas como um modelo de acidente vascular cerebral tromboembólico. Em primeiro lugar, o insulto Thi empunhadacomponentes endógenos para formar trombos em situ, sem a ajuda de substâncias químicas exógenas ou êmbolos pré-formado. Assim, a formação de trombos no modelo THI é mais relevante para as condições fisiológicas. Em segundo lugar, o modelo Thi responde favorável ao tPA-tratamento rápido (a 0,5 e 1 h após a lesão), mas não para o tratamento tardio (cerca de 4 horas). Esta janela terapêutica é semelhante à observada em pacientes com AVC. Assim, o modelo Thi pode ser utilizado para investigação destinada a melhorar a terapia de reperfusão no AVC isquémico agudo. Em terceiro lugar, os procedimentos cirúrgicos no modelo Thi são simples e direto, quando comparado com o modelo de oclusão MCA sutura intraluminal. A duração de hipoxia no modelo Thi também é controlável. Estes atributos fazem do modelo Thi menos suscetíveis a variações processuais entre diferentes laboratórios. Finalmente, o modelo Thi pode lançar insights sobre os mecanismos de reperfusão incompleta, apesar de recanalização das grandes artérias após trombólise, que éum desafio único em terapia acidente vascular cerebral quando comparado com isquemia cardíaca 1,22. Assim, o modelo Thi fornece um sistema único para estudar os mecanismos da desregulação específicos do leito vascular cerebral de hemostasia 23.

Todos os modelos experimentais de lesão cerebral têm limitações, eo modelo Thi não é excepção. Três importantes limitações técnicas do modelo de derrame em THI foram identificados no experimento. Em primeiro lugar, ao contrário de outros modelos tempos em que o insulto é limitado ao cérebro, a combinação de hipóxia e oclusão carotídea leva à vasodilatação periférica e uma maior demanda por débito cardíaco 12. Assim, ao comparar os efeitos das mutações do mouse ou agentes neuroprotectores contra o insulto Thi, seus impactos sobre as funções cardiovasculares também devem ser cuidadosamente comparados. Em segundo lugar, verificou-se que diferentes estirpes de ratinhos consanguíneos têm respostas variáveis ​​no modelo de THI, o que pode ser devido a permeabilidade irregular do comum posterioricating artéria 24, funções cardíacas dissimilares, ou uma combinação de ambos. Por isso, recomenda-se que os, idade, peso corporal, e mouse estirpes do sexo entre dois grupos experimentais ser comparáveis ​​em estudos de neuroproteção. Finalmente, o curso conta com Thi animais para respirar o gás hipóxico sob uma condição ligeiramente anestesiados. Os efeitos da anestesia sobre os resultados do curso precisa ser minimizado e mantido consistente entre animais. No entanto, desde que pesquisadores estão vigilantes desses detalhes técnicos e reduzir as variáveis ​​a partir de animais a animais, o modelo de acidente vascular cerebral Thi podem ser rapidamente estabelecidos para dar consistência elevada de infarto cerebral.

Em resumo, Thi é um modelo de acidente vascular cerebral simples e padronizado que responde favoravelmente à terapia do mundo real (trombólise tPA) numa janela temporal, clinicamente relevante. Este novo modelo é uma adição valiosa para a investigação pré-clínica acidente vascular cerebral, e pode ajudar a melhorar a terapia trombólise no isquêmico agudoacidente vascular cerebral.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
adult male mice Charles River C57BL/6  10-13 weeks old (22-30 g)
Mobile Laboratory Animal Anesthesia System VetEquip 901807 anesthesia
Medical air (Compressed) air tank Airgas UN1002 anesthesia
Isoflurane Piramal Healthcare NDC 66794-013-25 anesthesia
Multi-Station Lab Animal AnesthesiaSystem Surgivet V703501 hypoxia system
7.5% O2 balanced by 92.5% N2 tank Airgas UN1956 hypoxia system
Temperature Controller with heating lamp  Cole Parmer  EW-89000-10 temperature controllers
Rectal probe Cole Parmer  NCI-00141PG temperature controllers
Dissecting microscope  Olympus  SZ40 surgical setup
Heat pump with warming pad Gaymar  TP700 surgical setup
Fine curved forceps (serrated) FST 11370-31 surgical instrument
Fine curved forceps (smooth) FST 11373-12 surgical instrument
micro scissors FST 15000-03 surgical instrument
micro needle holders FST 12060-01 surgical instrument
Halsted-Mosquito hemostats FST 13008-12 surgical instrument
5-0 silk suture  Harvard Apparatus 624143 surgical supplies
4-0 Nylon monofilament suture LOOK 766B surgical supplies
Tissue glue Abbott Laboratories NC9855218 surgical supplies
Puralube Vet ointment Fisher NC0138063  eye dryness prevention 
MoorFLPI-2 blood flow imager Moor 780-nm laser source Laser Speckle Contrast Imaging
Mannitol Sigma M4125 in vivo TTC
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)  Sigma T8877 in vivo TTC
Vibratome Stoelting 51425 brain section for in vivo TTC 
Digital microscope Dino-Lite AM2111 whole-brain imaging
O.C.T compound Sakura Finetek 4583
goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 Invitrogen A11008 Immunohistochemistry
Cryostat Vibratome ultrapro 5000 brain section for IHC
Evans blue Sigma E2129 Detecting vascular perfusion
Microtome Electron Microscopy Sciences 5000 brain section for histology
Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) Sigma T48402 euthanasia
Fluorescent microscope Olympus DP73
Meloxicam SR ZooPharm NSAID analgesia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Broderick, J. P., Hacke, W. Treatment of acute ischemic stroke: Part I: recanalization strategies. Circulation. 106, (12), 1563-1569 (2002).
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