Un accidente cerebrovascular trombótico Basado En transitoria cerebral por hipoxia-isquemia Modelo

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Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. A Thrombotic Stroke Model Based On Transient Cerebral Hypoxia-ischemia. J. Vis. Exp. (102), e52978, doi:10.3791/52978 (2015).

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Abstract

Investigación Stroke ha sufrido muchos reveses en la traducción de las terapias neuroprotectoras en la práctica clínica. En contraste, la terapia del mundo real (tPA trombolisis) rara vez produce beneficios en modelos experimentales basados ​​en la oclusión mecánica, que dominan la investigación preclínica derrame cerebral. Esta división entre el banco y la cabecera sugiere la necesidad de emplear modelos tPA-sensibles en la investigación preclínica derrame cerebral. Para este fin, un modelo de accidente cerebrovascular trombótico simple y tPA-reactiva se inventó y se describe aquí. Este modelo consiste en la oclusión transitoria de la arteria carótida común unilateral y la entrega de 7,5% de oxígeno a través de una máscara facial en ratones adultos durante 30 min, manteniendo la temperatura rectal de los animales a 37,5 ± 0,5 ° C. Aunque la ligadura reversible de la arteria carótida unilateral o hipoxia cada suprime el flujo sanguíneo cerebral sólo transitoriamente, la combinación de ambos insultos causada duradera déficit de reperfusión, la fibrina y la deposición de plaquetas, y gran INFARct en el territorio de la arteria cerebral media suministrado. Es importante destacar que la cola de la vena inyección de tPA recombinante en 0,5, 1, o 4 horas después de la THI (10 mg / kg) proporcionó una reducción dependiente del tiempo de la tasa de mortalidad y el tamaño del infarto. Este nuevo modelo de accidente cerebrovascular es simple y puede ser estandarizado a través de laboratorios para comparar los resultados experimentales. Además, se induce la trombosis sin craniectomía o introducir émbolos preformadas. Teniendo en cuenta estas ventajas únicas, el modelo THI es una adición útil al repertorio de la investigación preclínica derrame cerebral.

Introduction

Trombolisis y recanalización es la terapia más eficaz de accidente cerebrovascular isquémico agudo en la práctica clínica 1. Sin embargo, la mayoría de la investigación preclínica neuroprotección se realizó en un modelo transitorio mecánico obstrucción (oclusión de la arteria cerebral media de sutura intraluminal) que produce la rápida recuperación del flujo sanguíneo cerebral después de la retirada de la oclusión vascular y muestra poco a ningún beneficio por tPA trombólisis. Se ha sugerido que la dudosa elección de los modelos de accidente cerebrovascular contribuyó, al menos en parte, a la dificultad en la traducción de la terapia neuroprotectora a los pacientes 2,3. Por lo tanto, hay una demanda creciente para el empleo de modelos de ictus tromboembólico tPA-respuesta en la investigación preclínica, pero estos modelos también tienen problemas técnicos (ver Discusión) 4-7. Aquí se describe un nuevo modelo basado en accidente cerebrovascular trombótico (THI) unilateral insulto hipóxico-isquémico transitorio y sus respuestas a la terapia intravenosa tPA 8.

El modelo de carrera THI fue desarrollado sobre la base del procedimiento de Levine (ligadura permanente de la arteria carótida común unilateral seguido por la exposición a la hipoxia transitoria en una cámara) que se inventó para los experimentos con ratas adultas en 1960 9. El procedimiento original Levine desvaneció en la oscuridad, porque sólo produce daño cerebral variable, pero el mismo insulto causado neuropatología consistente en crías de roedores cuando fue reintroducido por Roberto Vannucci y sus colegas como un modelo de neonatal encefalopatía hipóxico-isquémica (EHI) en 1981 10. En los últimos años, algunos investigadores re-adaptar el modelo Levine-Vannucci a ratones adultos mediante el ajuste de la temperatura en la cámara hipóxica 11. Es plausible que las lesiones cerebrales inconsistentes en el procedimiento original Levine pueden surgir de la fluctuación de las temperaturas corporales de roedores adultos en la cámara hipóxica. Para probar esta hipótesis, hemos modificado el procedimiento Levine mediante la administración de gas hipóxicoa través de una mascarilla, mientras se mantiene la temperatura del núcleo de roedores a 37 ° C sobre la mesa quirúrgica 12. Como era de esperar, el control estricto de la temperatura corporal aumenta considerablemente la reproducibilidad de la patología cerebral inducida por HI. El insulto HI también provoca la coagulación, la autofagia y grises y lesiones 13 la sustancia blanca. Otros investigadores también han utilizado el modelo HI para investigar después del accidente cerebrovascular respuestas inflamatorias 14.

Una característica única del modelo de accidente cerebrovascular HI es que sigue de cerca la tríada de la Virchow de la formación de trombos, incluida la estasis del flujo de sangre, lesión endotelial (por ejemplo, debido al estrés oxidativo inducido-HI), y la hipercoagulabilidad (activación de las plaquetas HI inducida) ( Figura 1 A) 15. Como tal, el modelo HI puede capturar algunos mecanismos fisiopatológicos relacionados con el accidente cerebrovascular isquémico en el mundo real. Con esta idea en mente, hemos perfeccionado aún más el modelo HI con ligadura reversible de la ONUarteria carótida común ilateral (por lo tanto, para crear un insulto HI transitorio), y se ensayó sus respuestas a tPA trombolisis con o sin edavarona. Edaravona es un eliminador de radicales libres ya aprobado en Japón para tratar el ictus isquémico dentro de las 24 horas de aparición 9. Nuestros experimentos mostraron que lo más breve 30 min transitoria HI desencadena el infarto trombótico, y que combinado tratamiento con tPA-edaravona confiere beneficios sinérgicos 8. Aquí se describen los procedimientos quirúrgicos detalladas y consideraciones metodológicas del modelo de THI, que pueden ser utilizados para optimizar los tratamientos de reperfusión de accidente cerebrovascular isquémico agudo.

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Protocol

Este protocolo ha sido aprobado por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad de Emory y sigue los Institutos Nacionales de la Salud Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Configuración

  1. Preparar el lecho quirúrgico en el cojín de calentamiento conectada con bomba de calor a 37 ° C durante al menos 15 minutos antes de la cirugía. Coloque un rollo de cuello con el cañón de 3 ml jeringa en el lecho quirúrgico. Preparar el gas de la anestesia con isoflurano 2% en el aire médica.
  2. Preparar fórceps tratado al autoclave, tijeras, tenedores micro agujas, pinzas hemostáticas, hisopos de algodón y suturas. Preparar adhesivo tisular y ungüento para los ojos.
  3. Configurar el sistema de hipoxia y controladores de temperatura con lámpara de calefacción y la sonda rectal. Preparar gas hipoxia con 2% de isoflurano en 7,5% de O 2 equilibrada por el 92,5% de N 2.
  4. Una hora antes de la cirugía, los ratones se analgesized por inyección subcutánea de una liberación lenta Meloxicam (4,0 mg / kg).
<p class = "jove_title"> 2. Transient cerebral hipoxia-isquemia (Figura 1B)

  1. Anestesiar C57BL macho 10-13 semanas de edad / 6 ratones con un peso de 22 a 30 g en la cámara de inducción de la anestesia con isoflurano 3% hasta que el animal no responde a la compresión de los pies, y luego quitar el pelo en el cuello derecha usando una máquina de afeitar electrónica.
  2. Coloca los ratones en el lecho quirúrgico conectado con 2% de isoflurano en el aire médica a un caudal de 2 l / min. Extremidades anteriores Secure estiradas a lo largo rollo de cuello a los lados con cinta médica.
  3. Limpie el sitio de la cirugía para la incisión con betadine seguido por el alcohol y luego hisopos de algodón.
  4. Bajo el microscopio de disección, hacer una incisión de 0,5 cm derecha del cuello uterino usando un fórceps rectos y un micro tijeras aproximadamente 0,2 cm lateral de la piel en la línea media.
  5. Use un par de pinzas dentadas finas de separar la fascia y el tejido para exponer la arteria carótida común derecha (RCCA). Separar cuidadosamente el RCCA desde el nervio vagal usando un par de pinzas lisas finas.
  6. Vivo nudo dos precortadas 5-0 sutura de seda (desmontable) del RCCA, y luego coser la piel utilizando 4-0 Nylon sutura monofilamento (Figura 1C).
  7. Aplicar pomada ocular en ambos ojos para evitar la sequedad.
  8. Transferir rápidamente los ratones al sistema de hipoxia y poner la nariz y la boca en la cara-máscara con 2% de isoflurano en 7,5% O 2 a un caudal de 0,5-1 L / min durante 30 min.
    1. Durante la hipoxia, utilizar reguladores de temperatura con lámparas de calor para controlar la temperatura rectal a 37,5 ± 0,5 ° C. Monitorear la frecuencia respiratoria en 80 a 120 respiraciones / min. El mantenimiento de la temperatura corporal por encima de 37 ° C durante la hipoxia es importante crear infarto cerebral coherente. Frecuencia respiratoria baja por lo general ocurre después de 20 min de hipoxia. Retire la mascarilla y permitir el suministro de aire normal si la frecuencia respiratoria cae por debajo de 40. Esto se lleva a 1-2 minutos y no cuenta en la duración hipoxia 30 min.
  9. Después de la hipoxia, transferirlos ratones a una cama quirúrgica y suelte las dos suturas de RCCA. Cierre la herida con pegamento tisular y, a continuación, volver a la jaula de los ratones. Excluir a los animales si tanto de dos nudos vivos se liberan de forma inesperada después de la hipoxia.
  10. Monitorear los ratones para 5-10 minutos para recuperarse de la hipoxia y la anestesia. Coloque la comida humedecida en la jaula y devolverlo al centro de cuidado de los animales.
    Nota: Los animales que presenten leves a comportamientos en circuito severa a las 24 horas después de THI se correlacionan con infracción cerebro. La mayoría de los animales con síntomas convulsivos mueren antes de que el punto de tiempo de 24 horas después de THI.

3. láser Speckle de contraste de imagen

Nota: Aunque este no es un procedimiento esencial del modelo THI, un láser speckle sistema de imágenes de contraste de dos dimensiones 16 puede ser utilizado para caracterizar los cambios de flujo sanguíneo cerebral (CBF) durante o después de la hipoxia transitoria-isquemia. Para documentar las alteraciones de la CBF bajo THI, ficha inmediatamente después del step 2.6. Alternativamente, para comparar la recuperación CBF después THI insulto, estos procedimientos se pueden realizar después de la etapa 2.10.

  1. Publicar un ratón anestesiado en decúbito prono y realizar una incisión de 1 cm de largo en el cuero cabelludo con el cráneo impresionados pero sin abrir.
  2. Monitorear CBF en ambos hemisferios cerebrales bajo un generador de imágenes del flujo sanguíneo de acuerdo con el protocolo del fabricante y empezar a grabar el flujo sanguíneo cerebral inmediatamente después de la cirugía CCAO (paso 2.6). Continuar durante 50 minutos.
  3. Mostrar imagen CBF con unidades arbitrarias en una paleta de 16 colores y analizar en tiempo real las regiones seleccionadas utilizando el software MoorFLPI siguiendo las instrucciones del fabricante (Figura 2).
  4. Después de grabar la imagen CBF, cierre el cuero cabelludo con adhesivo tisular y devolver el animal a la jaula.

4. Administración de tPA

  1. Inyectar animales en la vena de la cola con el disolvente o 10 mg / kg de tPA recombinante (220-300 y# 956; l de 1 mg / m tPA) a las 0,5, 1, o 4 horas después de tCCAo más hipoxia (Figura 4).

Detección de Daño 5. cerebro con varios diferentes opciones

Nota: Para recoger muestras de cerebro, la eutanasia a los ratones a los 1, 4 ó 24 horas después de THI.

  1. Realizar cuantificación del volumen de infarto por in vivo cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio método (TTC) a las 24 horas después de THI insulto como se describe anterior. 17
    1. Intraperitoneal inyectar animales con solución 1,4 M manitol (~ 0,1 ml / g de peso corporal) 30 minutos antes de la perfusión transcardial. Ratones perfundir transcardial con PBS seguido por 10 ml de 2% TTC.
    2. Retire el cerebro de los animales con los instrumentos quirúrgicos después de 10 minutos y colocar en paraformaldehído al 4% para la fijación durante la noche y en la sección 1 mm de espesor con un vibratome.
    3. Toma una serie de cuatro diapositivas cerebro seccionado por microscopio digital y quantify el volumen del infarto como la relación de la zona infartada (área blanca en el lado derecho) a la zona de la intacto, hemisferio contralateral usando el software ImageJ.
  2. Alternativamente, lleve a cabo la formación de trombosis por inmunofluorescencia en 1 hora después de THI insulto.
    1. Congelar el cerebro fija en compuesto OCT y la sección de los cerebros de 12 micras de espesor utilizando un criostato.
    2. Incubar el portaobjetos cerebro con anticuerpo de conejo anti-fibrinógeno (1: 100) siguiendo por cabra anti-conejo Alexa 488 Fluro colorante (1: 200) para observar la fluorescencia en un microscopio fluorescente.
  3. Alternativamente, realice la obstrucción buque por inyección en la vena de la cola de 100 l 2% colorante azul de Evans en 4 horas después de THI insulto.
    1. La eutanasia a los ratones y rápidamente cortar la cabeza para eliminar cerebros en paraformaldehído al 4% después de la inyección de azul de Evans. Nota: Se necesita 5-10 min para Evans circulación azul con el color azul de tanto delanteras y traseras extremidades.
    2. SECTIen cerebros fijos a 100 micras de espesor usando un micrótomo de deslizamiento y observar la fluorescencia utilizando un filtro de emisión de 680 nm en un microscopio fluorescente.

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Representative Results

Bidimensional de imágenes de contraste de moteado de láser (LSCI) 16 se utilizó para comparar las alteraciones del flujo sanguíneo cerebral (CBF) por la oclusión transitoria de la carótida 30 min unilateral (tCCAO), la exposición 30 min a la hipoxia (7,5% de oxígeno), y 30 min unilateral carotídea ligadura en condiciones de hipoxia (THI). Este experimento reveló que tCCAO bajo normoxia suprimió la CBF en el hemisferio carótida se ligó a ~ 50% del valor de línea de base, que se recuperó rápidamente a por encima de 85% después de la liberación de la oclusión de la carótida (R en la Figura 2A). La exposición a la hipoxia sistémica sola redujo la CBF a aproximadamente el 75% del valor de referencia, que transitoriamente rebote a ~ 130% después de regresar a la atmósfera normóxico (Figura 2B). En contraste ligadura de la carótida en condiciones de hipoxia (THI) redujo rápidamente CBF en el hemisferio ipsilateral a menos del 20% del valor basal alrededor de 10 min, que rara vez se recuperó hasta por encima de 30% a 20 min después de la liberación de la carótida ligation y volviendo a normoxia. CBF en el hemisferio contralateral (L), sin embargo, fluctuó entre 20 y 50% durante la hipoxia, y volvió rápidamente a por encima de 80% después de la lesión THI (Figura 2C).

A las 24 h después de tCCAo (30 min) o más tCCAO 30 min hipoxia (THI), se utilizó in vivo mancha TTC para detectar miocardio 17. Este análisis no mostró ninguna lesión evidente por el insulto tCCAO, pero de miocardio considerable en el territorio de la arteria cerebral media-suministrado siguiente THI insulto (Figura 3A). Anti-fibrina (fibrinógeno) inmunotinción se utilizó para comparar los cerebros lesionados-THI tCCAO- y en la recuperación de 1 hora y mostró deposición generalizada de fibrina (fibrinógeno), un indicador de la trombosis, en lesionada-THI el, pero no ratón tCCAO-desafió cerebros (Figura 3B, C). Inyección de Cola-vena de colorante azul de Evans también se utilizó para comparar la perfusión vascular del cerebro lesionadas-THI tCCAO- y en la recuperación de 4 horas. Este análisis mostró disminuyened perfusión cerebral e intenso extravasación del colorante azul de Evans en Thi-lesionado, pero no el cerebro-desafió tCCAO ratón (Figura 3D, E).

Por último, los resultados de THI insulto en ratones que recibieron la inyección de la vena de la cola de vehículo (en 0,5 hr recuperación) o tPA humana recombinante (Activase, 10 mg / kg, en 0,5, 1, o 4 horas post-THI) se compararon usando en Vivo mancha TTC en la recuperación hr 24 (Figura 4A). En los ratones tratados con vehículo, la tasa de mortalidad a las 24 horas post-THI fue 23,8% y sólo uno de cada 21 ratones con lesión THI estaba más allá de la media y 2 SD (el valor atípico). La tasa de mortalidad 24 horas en ratones que recibieron tratamiento con tPA en la recuperación de 0,5 hr se redujo a 8,3%, pero este efecto se perdió cuando tPA se administró a 1 o 4 horas después de la lesión THI (Figura 4B). Figura 4C representa el tamaño del infarto de todos sobrevivido ratones en los cuatro grupos de tratamiento. Es de destacar que tanto el 0,5 y el 1 hr tPA-administración significantly reducido el tamaño del infarto, cuando se compara con el tratamiento con vehículo. El grupo de tPA tratos 0,5 horas también mostró una reducción significativa del tamaño del infarto que el grupo de tPA tratos 4 h. Figura 4D mostró resultados representativos TTC-manchas después de cada tratamiento.

Figura 1
Figura 1:. Procedimiento de transitoria insulto cerebral hipoxia-isquemia (THI) en ratones adultos (A) La tríada de Virchow que impulsa la trombosis incluye la estasis del flujo de sangre, lesión endotelial, e hipercoagulabilidad de la sangre. (B) Un diagrama esquemático del procedimiento de accidente cerebrovascular THI. Dos nudos liberables fueron atados en la arteria carótida común derecha (CCA), y seguidas por la entrega de 7,5% de oxígeno a través de un cono de la nariz durante 30 min, mientras que la temperatura rectal del ratón se mantuvo a 37-38 ° C. Después de la transhipoxia sistémica ient, la ligadura de CCA fue lanzado por sacar un extremo de los nudos de sutura liberables. MCA, la arteria cerebral media; ICA, la arteria carótida interna; CEPA, la arteria carótida externa; CCA, la arteria carótida común. (C) Los procedimientos quirúrgicos para la derecha transitoria CCA oclusión. 1. Dos suturas precortadas (# 1 y # 2) se colocaron bajo un CAA aislado derecha. Se hicieron 2. Dos nudos liberables. 3. La línea de incisión se cerró mediante sutura # 3. Asegúrese de que los extremos de la sutura # 1 y # 2 eran accesibles fuera de la línea de incisión. 4. Tire con cuidado de sutura # 1 y # 2 desde fuera para liberar la CCA. Cuando se realiza suavemente, este procedimiento no causará laceración de la CCA.

Figura 2
Figura 2:. Análisis de las alteraciones del flujo sanguíneo cerebral durante y después de THI insulto (Una imagen de contraste de manchas de dos dimensiones con láser LSSe utilizó sistema CI) para evaluar el flujo sanguíneo cerebral (CBF). R (derecha) indica el hemisferio carótida ligados; L (izquierda) es el hemisferio contralateral. (A) tCCAO bajo normoxia suprimida CBF a ~ 50% del valor basal en el hemisferio carótida-ligada (R) durante al menos 30 min, que se recuperó por encima de 85% a menos de 3 min después de la liberación de la ligadura de la carótida. (B) En la hipoxia (7,5% de oxígeno, 30 min), sin ligadura de la arteria carótida, CBF declinó 76% del valor de referencia y transitoriamente se recuperó a alrededor del 130% después de volver a normoxia. (C) En ligadura de la carótida en condiciones de hipoxia transitoria (THI, 30 min), CBF en el (R) hemisferio carótida-ligado se redujo rápidamente a menos de 20% del valor de línea de base, y rara vez se recuperó hasta por encima de 30% después de la liberación de la carótida ligadura y volver a normoxia. En contraste, CBF en el contralateral (L) hemisferio fluctuó entre 20-50% durante la hipoxia, y volvió rápidamente a> 80% de la línea de basevalor después de la liberación de la ligadura de la carótida y volviendo a normoxia. Se muestran los trazados representativos CBF para n> 4 en cada grupo. Los puntos de tiempo para las fotos representativas LSCI estuvieron marcados por líneas grises en el trazado representativo.

Figura 3
Figura 3: infarto cerebral, trombosis espontánea y de los vasos después de la obstrucción insulto THI (A) En vivo TTC-mancha no mostró infarto visible a las 24 h después de 30 min ligadura transitoria de la arteria carótida común derecha (tCCAO), pero la adición de. 30 min de hipoxia (7,5% de oxígeno) para tCCAO produjo infarto considerable en el hemisferio ipsilateral (asterisco), principalmente en el área de la arteria cerebral media de suministro. (B, C) ​​Anti-fibrina (fibrinógeno) inmunotinción en 1 hora después de la lesión THI mostró depósitos generalizadas en elhemisferio ipsilateral. En contraste, no había depósitos de fibrina (fibrinógeno) en 1 hr después de la tCCAo (30 min) insulto (n> 4 para cada uno). (D, E) de perfusión cerebral se evaluó mediante la inyección de cola vena de Evans colorante azul a las 4 horas después de tCCAO (30 min) o THI (30 min) insulto. En el post-tCCAO cerebro, Evans colorante azul llena la mayor parte de los vasos sanguíneos en el hemisferio ipsilateral. En contraste, en post-THI cerebro, colorante azul de Evan llena menos vasos sanguíneos y se filtró en el parénquima (n> 3). Barra de escala: 250 m.

Figura 4
Figura 4: Efectos de tPA trombólisis en el modelo de accidente cerebrovascular THI (A) Esquema de experimentos para comparar los efectos de la administración intravenosa de tPA (10 mg / kg) a las 0,5, 1, o 4 horas después de la insulto THI.. (B) Resumen del número de animales operados, mortality en 24 hr después de los insultos, valores atípicos (el tamaño del infarto fuera de la media +/- 2 SD), y el número de animales incluido para comparación del tamaño del infarto. (C) Cuantificación mostró un volumen promedio de 32% del infarto en el grupo de vehículo y la reducción significativa de miocardio en el 0,5 hr (a 16%) y 1 hr (a 20%) grupos (mostrados son la media y la SEM para cada grupo). El p-valores se determinan mediante la prueba t. Cerebro (D) Representante TTC-manchada de animales que fueron impugnadas por el insulto THI y recibieron tratamiento con tPA en el punto de tiempo indicado después de la lesión. En la tinción de TTC, tejido vivo mostró el rojo; tejido del infarto estaba pálido.

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Discussion

El ictus es un problema de salud importante de creciente importancia para cualquier sociedad con una población que envejece. A nivel mundial, el accidente cerebrovascular es la segunda causa principal de la muerte con un estimado de 5.9 millones de eventos fatales en 2010, lo que equivale al 11,1% de todas las muertes 18. El accidente cerebrovascular es también la tercera causa de discapacidad años de vida ajustados (AVAD) perdidos a nivel mundial en 2010, pasando de la quinta posición en 1990 19. Estos datos epidemiológicos ponen de manifiesto la necesidad de terapias más efectivas de agudo ictus (isquémico). Sin embargo, a pesar de una intensa investigación en el tratamiento neuroprotector preclínica, tPA-trombolisis sigue siendo el único tratamiento específico de accidente cerebrovascular isquémico agudo que está aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos, mientras que numerosos agentes neuroprotectores vez prometedores en estudios con animales fallaron en los ensayos clínicos. La dificultad en la traducción de las terapias neuroprotectoras en pacientes tiene muchos factores, y el énfasis actual está en buenas practi laboratorioce, meta-análisis de múltiples conjuntos de datos, y la cooperación internacional para mejorar la investigación preclínica ictus 20,21. Sin embargo, existe una opinión minoritaria lo que sugiere que la dificultad de traslación es debido a una mala elección de los modelos mecánicos de oclusión vascular (por ejemplo sutura intraluminal oclusión de la ACM) en la mayoría de la investigación preclínica accidente cerebrovascular hasta la fecha 2,3. Debido a que los modelos de oclusión vascular mecánica raramente inducen trombosis y reperfusión cerebral ocurre demasiado rápido sobre la liberación de la obstrucción mecánica, estos modelos no responden a la terapia real-palabra (tPA fibrinolisis), ni proporcionan un margen terapéutico estrecho como los de los pacientes con ictus. En consecuencia, el remedio sugerido es de destacar, al menos incluyen, modelos ictus tromboembólico en preclínica de investigación de carrera 3.

Esta recomendación, sin embargo, tiene sus limitaciones porque los modelos ictus tromboembólicos actuales (entrega émbolos exógena, MCA-inyección de thrombin y photothrombosis) todos tienen ciertos inconvenientes técnicos 4. Para el modelo de émbolos exógena, la infusión intravascular de los resultados de émbolos en la variabilidad significativa en el tamaño del infarto y la ubicación, así como las respuestas impredecibles a tPA trombólisis debido a diferencias en la preparación coágulo de 4,5. La inyección directa de la trombina en la rama MCA requiere craniectomía, y su utilidad para la optimización de la terapia trombolítica aún no se ha demostrado 4,6. Químicamente iniciado tromboembolismo basado en la inyección sistémica de un tinte fotosensible (por ejemplo, Rosa de Bengala o eritrosina B) y la irradiación a través del cráneo expuesta a menudo produce agregados plaquetarios solamente que no responden a la trombolisis 4,7. Tomados en conjunto, hay una necesidad de simples y tPA que responden a modelos tromboembólicos para la investigación preclínica accidente cerebrovascular.

El paradigma THI tiene cuatro ventajas únicas como un modelo de ictus tromboembólico. En primer lugar, el insulto THI esgrimíacomponentes endógenos para formar trombos en situ sin la ayuda de productos químicos exógenos o émbolos pre-formadas. Por lo tanto, la formación de trombos en el modelo THI es más relevante a las condiciones fisiológicas. En segundo lugar, el modelo de THI responde favorable a un rápido tPA-tratamiento (en 0,5 y 1 hr después de la lesión), pero no al tratamiento retardado (en 4 h). Esta ventana terapéutica es similar a los observados en pacientes con accidente cerebrovascular. Así, el modelo THI se puede utilizar para la investigación orientada a mejorar la terapia de reperfusión en el accidente cerebrovascular isquémico agudo. En tercer lugar, los procedimientos quirúrgicos en el modelo de THI son simples y directas, en comparación con el modelo de oclusión de MCA sutura intraluminal. La duración de la hipoxia en el modelo de THI también es controlable. Estos atributos hacen que el modelo de THI menos susceptibles a las variaciones de procedimiento entre diferentes laboratorios. Por último, el modelo THI puede arrojar una visión de los mecanismos de la reperfusión incompleta a pesar recanalización de grandes arterias después de la trombolisis, que esun desafío único en terapia accidente cerebrovascular en comparación con isquemia cardíaca 1,22. Por lo tanto, el modelo de THI ofrece un sistema único para estudiar los mecanismos de la cama específica vascular cerebral desregulación de la hemostasia 23.

Todos los modelos experimentales de lesión cerebral tienen limitaciones, y el modelo de THI no es una excepción. Tres grandes limitaciones técnicas del modelo de carrera THI se han identificado en el experimento. En primer lugar, a diferencia de otros modelos de accidente cerebrovascular en el insulto se limita al cerebro, la combinación de la hipoxia y la oclusión de la carótida conduce a la vasodilatación periférica y una mayor demanda de gasto cardíaco 12. Por lo tanto, al comparar los efectos de las mutaciones de ratón o agentes neuroprotectores contra el insulto THI, sus impactos sobre las funciones cardiovasculares deberán también ser cuidadosamente comparados. En segundo lugar, hemos encontrado que diferentes cepas puras ratón tienen respuestas variables al modelo THI, que puede ser debido a la desigual permeabilidad del commun posteriorarteria icating 24, las funciones cardíacas diferentes, o una combinación de ambos. Por lo tanto, se recomienda que las cepas del sexo, la edad, el peso corporal, y el ratón entre dos grupos experimentales sean comparables en los estudios de neuroprotección. Por último, la carrera THI se basa en animales para respirar el gas hipóxico bajo una condición ligeramente anestesiado. Los efectos de la anestesia en los resultados de ictus deben ser minimizados y se mantiene constante entre los animales. No obstante, siempre que los investigadores están vigilantes de estos detalles técnicos y reducir las variables a partir de animales a los animales, el modelo de accidente cerebrovascular THI se puede establecer rápidamente para dar una alta consistencia de infarto cerebral.

En resumen, THI es un modelo de carrera sencilla y estandarizada que responde favorablemente a la terapia en el mundo real (tPA trombolisis) en una ventana temporal clínicamente relevante. Este nuevo modelo es una valiosa adición a la investigación preclínica derrame cerebral, y puede ayudar a mejorar la terapia de trombolisis en isquémico agudoaccidente cerebrovascular.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
adult male mice Charles River C57BL/6  10-13 weeks old (22-30 g)
Mobile Laboratory Animal Anesthesia System VetEquip 901807 anesthesia
Medical air (Compressed) air tank Airgas UN1002 anesthesia
Isoflurane Piramal Healthcare NDC 66794-013-25 anesthesia
Multi-Station Lab Animal AnesthesiaSystem Surgivet V703501 hypoxia system
7.5% O2 balanced by 92.5% N2 tank Airgas UN1956 hypoxia system
Temperature Controller with heating lamp  Cole Parmer  EW-89000-10 temperature controllers
Rectal probe Cole Parmer  NCI-00141PG temperature controllers
Dissecting microscope  Olympus  SZ40 surgical setup
Heat pump with warming pad Gaymar  TP700 surgical setup
Fine curved forceps (serrated) FST 11370-31 surgical instrument
Fine curved forceps (smooth) FST 11373-12 surgical instrument
micro scissors FST 15000-03 surgical instrument
micro needle holders FST 12060-01 surgical instrument
Halsted-Mosquito hemostats FST 13008-12 surgical instrument
5-0 silk suture  Harvard Apparatus 624143 surgical supplies
4-0 Nylon monofilament suture LOOK 766B surgical supplies
Tissue glue Abbott Laboratories NC9855218 surgical supplies
Puralube Vet ointment Fisher NC0138063  eye dryness prevention 
MoorFLPI-2 blood flow imager Moor 780-nm laser source Laser Speckle Contrast Imaging
Mannitol Sigma M4125 in vivo TTC
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)  Sigma T8877 in vivo TTC
Vibratome Stoelting 51425 brain section for in vivo TTC 
Digital microscope Dino-Lite AM2111 whole-brain imaging
O.C.T compound Sakura Finetek 4583
goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 Invitrogen A11008 Immunohistochemistry
Cryostat Vibratome ultrapro 5000 brain section for IHC
Evans blue Sigma E2129 Detecting vascular perfusion
Microtome Electron Microscopy Sciences 5000 brain section for histology
Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) Sigma T48402 euthanasia
Fluorescent microscope Olympus DP73
Meloxicam SR ZooPharm NSAID analgesia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Broderick, J. P., Hacke, W. Treatment of acute ischemic stroke: Part I: recanalization strategies. Circulation. 106, (12), 1563-1569 (2002).
  2. Hossmann, K. A. Pathophysiological basis of translational stroke research. Folia Neuropathol. 47, (3), 213-227 (2009).
  3. Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32, (7), 1310-1316 (2012).
  4. Macrae, I. M. Preclinical stroke research--advantages and disadvantages of the most common rodent models of focal ischaemia. Br. J. Pharmacol. 164, (4), 1062-1078 (2011).
  5. Niessen, F., Hilger, T., Hoehn, M., Hossmann, K. A. Differences in clot preparation determine outcome of recombinant tissue plasminogen activator treatment in experimental thromboembolic stroke. Stroke. 34, (8), 2019-2024 (2003).
  6. Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38, (10), 2771-2778 (2007).
  7. Watson, B. D., Dietrich, W. D., Prado, R., Ginsberg, M. D. Argon laser-induced arterial photothrombosis. Characterization and possible application to therapy of arteriovenous malformations. J. Neurosurgery. 66, (5), 748-754 (1987).
  8. Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9, e98807 (2014).
  9. Levine, S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am. J. Pathol. 36, 1-17 (1960).
  10. Rice, J. E. 3rd, Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals Neurol. 9, (2), 131-141 (1981).
  11. Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. J. Cereb. Blood Flow Metab. 21, (2), 52-60 (2001).
  12. Adhami, F., et al. Cerebral ischemia-hypoxia induces intravascular coagulation and autophagy. Am. J. Pathol. 169, (2), 566-583 (2006).
  13. Shereen, A., et al. Ex vivo diffusion tensor imaging and neuropathological correlation in a murine model of hypoxia-ischemia-induced thrombotic stroke. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, (4), 1155-1169 (2011).
  14. Michaud, J. P., Pimentel-Coelho, P. M., Tremblay, Y., Rivest, S. The impact of Ly6C low monocytes after cerebral hypoxia-ischemia in adult mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 34, (7), e1-e9 (2014).
  15. Zoppo, G. J. Virchow's triad: the vascular basis of cerebral injury. Rev. Neurol. Dis. 5, 12-21 (2008).
  16. Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging of cerebral blood flow. Annals Biomed. Eng. 40, (2), 367-377 (2012).
  17. Sun, Y. Y., Yang, D., Kuan, C. Y. Mannitol-facilitated perfusion staining with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) for detection of experimental cerebral infarction and biochemical analysis. J. Neurosci. Methods. 203, (1), 122-129 (2012).
  18. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380, (9859), 2095-2128 (2010).
  19. Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380, (9859), 2197-2223 (2012).
  20. Dirnagl, U., Macleod, M. R. Stroke research at a road block: the streets from adversity should be paved with meta-analysis and good laboratory practice. Br. J. Pharm. 157, (7), 1154-1156 (2009).
  21. Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44, (6), 1754-1760 (2013).
  22. Khatri, P., et al. Revascularization end points in stroke interventional trials: recanalization versus reperfusion in IMS-I. Stroke. 36, (11), 2400-2403 (2005).
  23. Rosenberg, R. D., Aird, W. C. Vascular-bed--specific hemostasis and hypercoagulable states. New Eng. J. Med. 340, (20), 1555-1564 (1999).
  24. Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31, (11), 2707-2714 (2000).

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