三層のための3つのユニークな環境を提供するために、エレクトロスピニング法を適応させます

Bioengineering
 

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Bridge, J. C., Aylott, J. W., Brightling, C. E., Ghaemmaghami, A. M., Knox, A. J., Lewis, M. P., Rose, F. R. A. J., Morris, G. E. Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall. J. Vis. Exp. (101), e52986, doi:10.3791/52986 (2015).

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Abstract

Introduction

再生医療や組織工学の分野は​​急速に気管および腎臓再生にブレークスルー2つの注目すべき最近の成果で、進んでいます。組織工学で開発された生体材料は、以下の特殊な研究室にこのようなプロトコルを転送する機会を、より身近になってきています。生体材料の使用の増加を介して利益を得るためにプライミングされた1つのフィールドは体外診断です

インビトロ研究は、単一の細胞型内の細胞内シグナル伝達経路を調査するための重要なプラットフォームであり、多数の疾患の病態生理のメカニズムを描写役立っています。これらの研究は、一般的に組織培養プラスチック(TCP)上の単層として培養され、単一の細胞型に依存しています。はるかに少ない弾性多孔質の三次元(3D)環境の細胞よりも、二次元(2D)の剛性面は、組織または器官内に露出しています。動物モデルは、伝統的に電子されていますまた、全体の組織に変換インビトロで見出さ効果を確認するためにmployed、またヒト疾患を研究するために、前臨床のプラットフォームとして使用することができます。しかし、種間の差は、ヒト疾患の理解に動物モデルでこの信頼を弱体化させます- 。例えば、肺疾患、喘息の多くの理解が少し気道平滑筋束の肥満細胞の浸潤の証拠、又は動物内の自発的な病気の開発のための能力を含む人間の条件とこのモデル間の固有の違いにもかかわらず、マウスモデルに基づいていますモデル3,4。動物モデルの使用に関する倫理的配慮は、英国およびその他の国で奨励されている動物実験で「交換、洗練、および削減」の "3Rに「標準でもあります。

魅力的な代替手段は、 インビトロ作成構造ヒト組織の要約になりますSは、単一のユニットで成人ヒト細胞型の間の協力的な性質を調べました。細胞は、ユニークな微小環境内の各組織内の3D多細胞構造に存在しています。 TCP上の細胞の培養は、この環境を複製することができ、細胞単層の培養を可能にする、または多細胞培養のための容量を提供します。生体材料の進歩は、細胞培養のための天然および合成3Dの両方のプラットフォームを開発する機会を提供します。脱細胞化ECMは、幹細胞1を含む他の細胞型に再細胞化するとき、しかしながら、このようなプロトコルは限られた組織との大部分は非ヒト由来の利用可能で、複雑で時間がかかる可能性が3D細胞培養のために使用することができます。他のプロトコルは、ナノインプリント、ECM沈着、細胞シート技術、またはエレクトロスピニングとして作成された細胞環境をより細かく制御を可能にします。エレクトロスピニングは、r、ナノメートルからマイクロメートルの範囲の直径を有する繊維の不織布3D多孔質マットを作成します天然ECM寸法をeplicating。エレクトロ足場はますます3D細胞培養プラットフォームとして採用されています- 。エレクトロスピニング·パラメータの操作は、このような細孔径、繊維径、地形や配置、表面の化学的性質などの足場特性上の複雑な制御を可能にします。細胞を単独で培養したときにこのようなパラメータの変化は、直接、細胞接着および増殖に影響を与えることが示されています。

これらの利点は、モデルの3次元組織構造などの細気管支気道を用いて、単一の3次元組織構築物として、複数の細胞型の培養を可能にするために、本研究で利用されています。細気管支壁は、3つの主要な領域( 図1)で構成されています。気道上皮細胞は、外部環境への重要な障壁を提供し、気液界面(ALI)で座る場所粘膜です。彼らはしっかりとコンパクトECMは主collagの構成、網状基底膜(RBM)に常駐しますアンIV、perlecans、およびラミニン。サブ粘膜層を直接粘膜、疾患状態の下で、線維芽細胞、筋線維芽細胞および浸潤性白血球を含む複数の細胞型からなる複数の多孔質領域の下に見出されます。最後に、平滑筋束が螺旋状に気道の周りをラップし、気道平滑筋(ASM)の整列したシートで構成されています。これは、気道の緊張を制御する平滑筋の相対的な収縮状態です。肺系内のエレクトロ足場の使用は最近まで回生の目的に限定されていました。エレクトロ気管の交換が正常に移植されていると。成功した一方で、そのような治療は数に制限されており、組織の機能の相対的な単純な性質のために気管に焦点を当てています。 インビトロ診断に使用される気道モデルの限定例は存在し、主に平滑筋収縮の測定に焦点を当てています。非毒性なしn型分解性ポリマー、ポリエチレンテレフタレート(PET)は、以前に電界紡糸された、生成足場を確保するために、本研究で使用した劣化させずに長期間保存することができる(それらは「既製」を使用することを可能にする)、また、適切です長期間にわたって安定した細胞培養。我々のグループからの以前の研究は、基本的なエレクトロプロトコルの3つのバリエーションを用いて、3つの個別のPETのエレクトロ足場は分離21,22と気道の共培養中に気道上皮、線維芽細胞、および平滑筋細胞を培養するための最適なトポグラフィを提供するように製造することができることを示しました上皮細胞と線維芽細胞22。繊維径が大きく、上皮機能22に影響与えることが見出され、繊維配向は、平滑筋21の整列したシートの生成をさせました。これらの試験は、静的条件下で、互いに独立して行われました。本研究では、これらのdiffere完全に分化した成人ヒト細胞を含むヌクレオチド骨格は、気道間の細胞応答を調査するためにインビトロモデルにおける生理学的に適切に提供する、気道壁の3D部として市販のバイオリアクター中でALIで1週間共培養されました。このプロトコルは、モデル系として細気管支気道を使用している一方、それは他の器官からの粘膜部の3次元共培養のためのプラットフォームとして適合させることができます。

Protocol

前述したように、個人がグレンフィールド病院(レスター、UK)で、気管支生検から単離された非喘息からプライマリASM細胞。研究では、レスターシャー州倫理委員会によって承認され、患者は書かれ、インフォームドコンセントを与えました。

1.エレクトロPETの足場(図2)

  1. - トリフルオロ酢酸(TFA)溶液1ジクロロメタン(DCMro):1でドリンクボトルグレードPETの溶液(10 ml)を準備します。 8%、30%、10%重量/体積(重量/容量)のPET濃度はナノファイバー、マイクロファイバーのために必要な足場をそれぞれ整列し、PETが溶解すること、次いで、溶液を室温でO / N撹拌されています。
  2. シリンジにPET液を移し、注射器に針(マイクロファイバー揃え用)23-G(ナノファイバーの場合)または18-Gを接続し、電動シリンジポンプにシリンジを配置します。ニードルの先端が下に回転していることを確認します。
  3. MAを正確に位置決め針を確実に離れて針の先端からndrel 15センチメートルは、ドラムの中心に指摘されています。
  4. ワニクリップで針先への電力供給を接続し、地球に(バナナソケットを介して )マンドレルを接地してください。ナノファイバーとマイクロファイバー足場のためのマンドレルへの電源をオンにして(約13.2メートルに相当·分-1)を60rpmに速度を設定します。 (約440メートルに相当·分-1)2000回転のために整列足場に設定された速度。
  5. 0.5ミリリットルの流量にシリンジポンプを設定·時間-1ナノファイバーのランダムと整列足場または2.0ミリリットル用·時間-1マイクロファイバー足場のため。溶液を針で空気を除去するために、針の先端から押し出されるまで、ポンプの実行を許可します。その後、ポンプを停止します。
  6. シリンジポンプでは、溶液の総量が2ミリリットルに排出し、ポンプを起動するように設定します。
  7. 設定電圧14キロボルトに供給し、電源のスイッチサップLY。
  8. エレクトロスピニング溶液2mlを電界紡糸されるまで(ナノファイバと整列足場のための4時間、マイクロファイバー足場のための1時間)。
  9. マンドレルの幅に沿った刃で足場をカット。これは、(この場合は、長方形のシート22センチメートル×11 cm)の足場の2Dシートマンドレル表面領域のサイズ注意深くマンドレルを剥離することができる)を生成します。 )静電荷を減少させるためにアルミホイルで足場を保管してください。
    注:二相性足場はマイクロファイバー足場上に直接ナノファイバー足場をエレクトロスピニングシーケンシャルことによって製造されます。

細胞培養に使用する前に足場の2滅菌

  1. 足場シートから、直径0.8mmの生検のペンを使用して、二相または整列足場のディスクをパンチアウトし、非毒性の水槽の接着剤を使用してガスケットに固執します。
  2. 20に浸漬する前に、足場の各側に30分間紫外線照射を用いて足場を滅菌4℃での% 容量/容量 /抗真菌抗生物質溶液(2×10 5単位ml -1のペニシリンG、2,000ミリグラムml -1のストレプトマイシン硫酸塩との500μgml -1のアンホテリシンB)O / N。
  3. 使用するまで4℃でPBSを用いてPBS中のTCPウェルプレートで3回、その後、店舗足場を足場を洗います。

3.細胞培養培地成分

  1. 10% 容量/容量のウシ胎児血清(FCS)、2nMのL-グルタミン溶液、1% 体積/体積の抗生物質/抗真菌剤溶液(10,000単位ml -1のペニシリンG、100ミリグラムを添加したDMEM-F12培地中で培養CALU3上皮細胞ml -1のストレプトマイシン硫酸塩及び25μgのml -1のアンホテリシンB)。
  2. 10% 容量/容量のウシ胎児血清(FCS)、2nMのL-グルタミン溶液、1% 体積/体積の抗生物質/抗真菌剤溶液(10,000単位ml -1のペニシリンG、1を添加したDMEM培地中で培養MRC5線維芽細胞およびASM細胞00ミリグラムml -1のストレプトマイシン硫酸塩及び25μgのmlのアムホテリシンB -1)。
  3. 70:30 DMEM-F12での培養上皮線維芽細胞ASM細胞の共培養:DMEM培地混合物。

二相性足場の上に線維芽細胞および上皮細胞の4シード

  1. 組織培養プレートにおいて、DMEM-補充した培地中で足場を浸して、細胞播種前に37℃で1時間インキュベートします。
  2. 、DMEM-添加した培地を除去頂端側足場のマイクロファイバー相を配置し、DMEM添加培地の30μlに1.5×10 4 MRC5線維芽細胞を播種します。空気O / Nで37℃、5%CO 2のインキュベーターに出る前に、2時間オービタルシェーカー上でプレートを攪拌。
  3. その足場のナノファイバー相は頂端直面している上に足場のナノファイバー相にDMEM-F12添加培地の30μlに、シード3.0×10 4 CALU3上皮細胞を足場を回して、foをインキュベートR 70:30 DMEM-F12で足場を沈める前に、空気中で37℃で2時間、5%CO 2:DMEM添加培地のO / N前のバイオリアクターへの転送に。

アライン足場の上にASM細胞の5播種

  1. 組織培養プレートにおいて、DMEM-補充した培地中で足場を浸して、DMEM添加培地の30μlに2.5×10 4細胞を播種し、2時間インキュベートする前に、37℃で1時間インキュベート(37℃、5%CO空気中の2)。インキュベーターとOを残すためにDMEM添加培地リターンで足場を沈める/ Nバイオリアクターにトライ文化を設定する前に。

6.設定アップバイオリアクターシステムを使用してトライ文化(図7)

  1. 上皮相はチャンバー内に上に向けて1チャンバ内の溝に二相性の足場ガスケットを配置します。
  2. それはマイルに隣接しているので、(二相性の足場の下に位置合わせ足場を置きます二相性足場のcrofiber相)と一緒にバイオリアクターの2室をロックします。
  3. 蠕動ポンプを用いて約0.1ミリリットル/分で二つの回路約2培地のリザーバ(頂端側リザーバ内のDMEM-F12添加培地、基礎リザーバ内のDMEM-F12 / DMEM添加培地)とポンプメディアに接続された2つの灌流回路を組み立てます(40ミリリットルのメディアは、各回路を介してリサイクルされます)。ハウス37℃、空気中5%CO 2のインキュベーター内のシステムのすべての部分。
  4. 1週間後、分析の前にさらに一週間ALIで上皮細胞頂端チャンバからメディアを取り出し、培養。

Representative Results

スキャン脱細胞化気道組織または我々はエレクトロ足場トポグラフィに導入することを望んだ気道ECMの望ましい特性を同定し、気道の生検からの免疫組織学的画像の電子顕微鏡画像:ネイティブRBMマトリックスは、繊維で構成され、約153 nmの30.6 nmの±(平均±SD、N = 50の測定値)の直径( 図3A&5A)で、RBMを周囲のマトリックスは、( 図3C)自然の中で、より多孔質であった一方で。平滑筋束を介して免疫組織のセクションでは、セル21( 図3E)の整列シートなどASMの存在を示しています。この情報は、エレクトロ足場に導入された特性を導くために使用されました。回転マンドレルは、高速で安定して回転することができました(> 2000回転/ 440メートル·分-1)整列した繊維で足場を製造することができます。遅いマンドレル回転(60回転13.2メートルは·分-1)繊維配向に影響を与えませんでしたしかし、静的なプレート上にエレクトロスピニングする場合よりもより均一な厚さの足場を生成しました。エレクトロスピニング·パラメータ(PET濃度と液流量)を変えることにより、(エレクトロスピニング·パラメータを表1に記載されている)、数マイクロメートルまたは数百ナノメートルの直径を有する足場繊維を作成することが可能でした。

しかしながら、このような低濃度でPET RBM天然繊維(150 nm)の6%PET溶液を用いて製造した、と同等の繊維直径を有するエレクトロ繊維は、繊維のビーズは、( 図4A)が発生しました。これは、2.4ナノメートル±255ナノメートルの平均直径(平均±SEM)、および1.43ミクロン±0.02ミクロンの平均孔径( 図4B、図5AおよびB)を有する均一なナノファイバーを生産し、8%のPET溶液の濃度を増加させることによって除去しました。ナノファイバーをエレクトロスピニングするためには、より遅い流速を可能にする、23 G、18 Gの針サイズを小さくする必要があったwhilstはより高い流速を維持し、針の閉塞、大きい針で繰り返し発生する問題を低減します。高い溶液粘度に針の先端に複数の閉塞に加えて、繊維径( 図4F)における均一性の欠如に> 30%のPETのリードにPET液中のマイクロファイバーをエレクトロスピニング、増加。ミクロン±0.02μmで2.50の平均繊維径を有する均一なマイクロファイバーマットを2mL / hの流速で30% 重量/体積 PET溶液を電界紡糸時に生成され、10.45ミクロン±0.13ミクロンの平均孔径(平均±SEM) -1( 図4F、5A&B)。マイクロファイバー足場(まだマンドレルに取り付けられている)上に直接ナノファイバー足場の連続エレクトロスピニングは、二相性の足場( 図3D)を作成しました。平均繊維径は、それぞれ20 nmおよびナノファイバーと極細繊維相の2.30ミクロン±0.06ミクロン±280 nmでした個々のナノファイバーとマイクロファイバー足場の寸法に匹敵します。また、二相足場の厚さは、個々のナノファイバーとマイクロファイバー足場( 図5C)の和と同様でした。マンドレルの速度を増加し(2000回転/ 440メートル·分-1)、高度に整列ナノまたはマイクロファイバーの足場を作製しました。 8% 重量/容量の PETソリューションは、整列ナノファイバーと波状の形態( 図3F)を有する製造された繊維を製造するための最適ではなかったです。 10%の増加PETは、この効果を無効化、それでもランダムに整列ナノファイバー足場と比較して減少し、繊維径(2.2 nmの±216 nmの()平均±SEM)をもたらしました。繊維配向は、平均繊維角度から各繊維の角度のずれを決定することによって計算しました。整列ナノファイバー足場に繊維の79%がランダムに整列ナノファイバーscaff中の繊維の10.2%と比較して、(±10°、平均繊維角度)整列させましたオールズ( 図5D)。

8%のナノファイバー足場は、上皮細胞が常駐するRBMを再現するために使用された、そしてCALU3細胞(気道上皮細胞株)の培養を支持するために使用されました。自然の中で、より多孔質であること、30% 重量/容量のマイクロファイバー足場は、粘膜下の領域を模倣するために使用され、MRC5細胞(気道線維芽細胞株)で培養しました。 10% 重量/容量整列ナノファイバー足場は、ときに足場上で培養ASMセルの配置を確実にするために、トポロジカル参照を提供しました。 2週間の期間( 図6A)を介してそれらの個々の足場上で培養し、2週間の培養期間( 図6B、6C、および6D)後の細胞型特異的タンパク質を発現させたときすべての3つの細胞型は、生存率の増加を示しました。個々の細胞足場の相互作用のさらなる特徴付けは、21他の場所で報告されています。ナノファイバー足場の連続エレクトロスピニングマイクロファイバー足場の上にそれぞれのナノファイバーとマイクロファイバーのフェーズへCALU3上皮細胞およびMRC5線維芽細胞の共培養のための二相の足場を生成しました。一緒に静的な条件の下に2つの細胞の培養は、他の場所で22報告されています。他の細胞の層を追加したり、静的な条件下で2週間を超えて二相培養時間を延長しようとするさらなる研究(データは示されていない)不成功を証明しました。培養液に長期間にわたって三層モデルは、我々は灌流バイオリアクターを使用していました。 CALU3及びMRC5細胞は、二相性の足場上に播種し、ASM細胞を播種した足場上に整列し、両方が2日間別々に培養しました。 2足場は、その後、バイオリアクター内の気道壁( 図7)の三層モデルを形成するために一緒に購入されました。両室は頂端上皮チャンバーは、その培地を除去していた前に、7日間のメディアで灌流し、上皮細胞は、培養しましたさらに7日間ALI。足場は固定し、切片にし、染色のいずれか、または全体の足場は、細胞特異的なマーカーのために免疫染色したしました。三層培養による切片を共培養( 図8B)のすべての3つの層を介して配信細胞核を示しました。細胞は、細胞特異的なマーカーについて免疫染色した場合には、上皮細胞がコンフルエント細胞層として頂端ナノファイバー相を移入し、サイトケラチンについて陽性染色された( 図8C)、マイクロファイバーの位相に、線維芽細胞は、S100A4( 図8D)について陽性染色し、上整列し、10%の足場ASM細胞は、気道壁の3Dモデル内の各細胞型の良好な生存率を示し、SM22α( 図8E)に対して陽性に染色されました。

図1
図1.気道細気管支。重度の気管支生検間葉系細胞で占め下層の粘膜領域と網状基底膜(RBM)の上皮を示す喘息気道、および平滑筋α-アクチンについて染色平滑筋細胞に取り込ま周囲の平滑筋束(茶色)。スケールバーは200μmで示している。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図2
図2のエレクトロスピニング装置の概略図。(取り付けられた針を有する)ポリマー/溶媒溶液を含むシリンジをマンドレルに面したシリンジポンプ上に配置されます。電位は、繊維、針先端から吐出し、回転マンドレル上に堆積されることを引き起こす針とマンドレルとの間に確立されます。繊維は、大気を通過すると、マンドレル上のポリマー繊維の付着を引き起こす溶媒が蒸発。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図3
天然の気道ECMへエレクトロ足場の図3の比較。脱細胞化基底膜(A)、断面(C)および気道平滑筋束の組織学的切片細気管支脱細胞化気道の走査型電子顕微鏡画像は、(ヘマトキシリンおよびエオシン、スケールで染色しますナノファイバー(B)二相(D)と整列(F)PET足場と比較バーは40μm)(E)。 表示するにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版。

表1のパラメータは、マイクロファイバー、ナノファイバーをエレクトロスピニングのために使用され、個別に二相性の足場のための足場を整列します。

図4
PET濃度の図4.改変は、ファイバ特性、6%、8%、10%(AC)、25%、30%及び35%(EG)( 重量/体積 )PET溶液から紡糸されたエレクトロ足場の走査型電子顕微鏡画像に影響与え 。また、8%(D)および30%(H) 重量/容量の PETの溶液から製造足場を整列。5,000X倍率で撮像されたAD、EHは、1,000倍の倍率で撮像される示す。 拡大表示するにはここをクリックしてください。この図のバージョン。

図5
エレクトロPET足場の図5.プロパティ。網状基底膜細胞外マトリックス(RBM ECM)からの繊維直径分布を示す(A)分布曲線、ランダムに整列ナノ·マイクロファイバー足場、および整列ナノファイバー足場。 (B)ヒストグラムは、ナノ及びマイクロファイバー足場の相対細孔径分布を示します。 (C)ナノファイバー、マイクロファイバー、二相性と整列足場の平均厚さは、(平均値±標準偏差はn = 6)。 (D)足場繊維分析はImageJソフトウェアを用いて行ったランダムまたは整列されたナノファイバー足場の平均繊維配向からの偏差を示すヒストグラムプロットである。 Pリースこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6
整列足場上のASM細胞のための個々の足場上の個々の細胞型の文化6.図。(A)アラマーブルー細胞生存率アッセイの結果、マイクロファイバー足場上のナノファイバー足場およびMRC5細胞上CALU3細胞(平均±SEM、N = 3 20)。ナノファイバー、マイクロファイバーの走査電子顕微鏡像と整列繊維足場(B、CおよびDのそれぞれ)とSM22αについて染色ビンキュリン(赤)とASM細胞について染色し、E-カドヘリン(赤)について染色CALU3細胞、MRC5細胞の免疫蛍光画像(それぞれE、F及びG)は、すべての彼らの専門的な骨格上(赤)。ヘキストは、核(青)を染色するために使用された、スケールバーが示す40#181; M この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図7
三層気道壁モデル図7.灌流システム。蠕動ポンプと2倍メディアリザーバに接続されたバイオリアクター容器の(A)写真。 (B)三層足場の概略図。気道モデルが気液界面で開催された2バイオリアクター回路の(C)の回路図。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図8
図8.コンプリート3D気道壁モデル。(A)赤で強調表示粘膜層と気道壁の気管支生検は、粘膜下の領域は、緑色で強調表示、および平滑筋束が金に強調しました。 (B)2週間共培養した後に固定された上皮細胞、線維芽細胞および平滑筋細胞に取り込ま二相性と整列足場からなる三層気道壁の断面。細胞核を同時に撮像された足場の反射率(灰色)とDAPI(青色)で染色しました。足場はまた、サイトケラチン(緑色)について染色CALU3細胞(C)、S100A4()(D)、およびSM22α(赤)について染色した平滑筋細胞について染色MRC5細胞(と、固定され、2週間後に、細胞特異的マーカーのために免疫染色しましたE)。スケールバーは200μmで示している。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。


表1。

Discussion

天然 ECMに匹敵する構造特性を有するポリマー繊維をエレクトロスピニングする能力は、多数の天然または合成ポリマーにつながっている、またはポリマーブレンドは、これらの環境を再現するためのエレクトロスピニングされます。 (ポリマーの選択、ポリマー濃度、溶媒、針先端の距離、温度など)のプロセスパラメータができ、すべての影響足場特性の操作。しかし、いくつかのパラメータは他の25以上の足場特性に大きな影響を与える可能性があります。 PETの繊維径を変更する場合、我々は、重要なパラメータは、使用されるポリマーの濃度は、ポリマー溶液を電界紡糸されたときの速度、および針の直径であることが判明しました。整列した繊維をエレクトロスピニングするときの重要なパラメータは、(回転マンドレル)使用収集方法、および速度でマンドレル回転です。 60回転にマンドレル速度を低下を通じて、産ランダムに整列足場は大きな足場ユニを示したが見つかりましたフラット集電板上にエレクトロスピニングに比べformity。

脱細胞化気道組織の特性は、それぞれの気道細胞型の培養のために開発された様々な足場トポグラフィためのガイダンスを提供するために分析しました。電界紡糸ナノ繊維は、細胞の移動を制限しながら、増加した代謝産物の拡散を可能にする小さい孔サイズが、高い全体的な多孔性に起因する基底膜の構造を複製するための魅力的な足場である。9エレクトロスピニング·パラメータを最適化する一方で、PETの濃度および流速の範囲を試験しました。最も細い繊維は、以前に他のグループによって使用される6% 重量/容量の PET溶液を用いて達成されました。しかし、ビーズ、および均一性の欠如の高いレベルは、一定の問題がありました。ビーズを除去するための最初の試みは、表面張力を低下させるために溶液に、カチオン性界面活性剤、臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)を添加し、さまざまなソースをテスト含まPETの。界面活性剤の添加がなく、完全に、ビーズの量を減少させました。 TFA溶媒溶液:PETペレットの商業的供給源の数を試した後、食品用ドリンクボトルPETは、飲料ボトルを切断し、DCM中にこれらを溶解することにより、使用されました。 PET源としてこれを使用すると、繊維の均一性の増加および繊維ビーズの減少をもたらしました。 8% 重量/体積にわずかに溶液濃度を増加させ、針の直径(23Gと18G)を減少させることによって、我々は一貫して、約250nmの繊維径を有する欠陥のないナノ繊維を製造しました。エレクトロナノファイバー足場は、難しい足場の手動操作を行うことマンドレルから収集時に高静電することができます。これは、スピンし、使用前に70%IMS中に浸漬した後、アルミ箔で足場を格納することによって改善されました。これは、エレクトロスピニングプロセスの足場上に残っ残留静電荷を消散を助けるように見えました。

トップを提供するために、、ゆっくりと、ランダムに整列ナノファイバーが生成された低濃度PET溶液をエレクトロスピニングすることにより:ographies気道壁内の3つの主な気道細胞型で発生した個々の微小環境と同様に、基本的なエレクトロスピニングプロトコルは、これらの細胞型のための3つのユニークな足場を生成するように構成されましたその上に上皮細胞(RBMを模倣)に播種しました。速い速度で高濃度PET溶液をエレクトロスピニングすることにより、ランダムに整列マイクロファイバーは、(RBM直下のサブ粘膜領域を模倣する)、線維芽細胞を播種したその中に 、(より多くの多孔質足場を生成する)を作製しました。マンドレル整列ナノファイバーを回転高速に低濃度PET溶液をエレクトロスピニングすることによって細胞の位置合わせシートを製造する、平滑筋細胞は、繊維方向に配向し、その上に、作製しました。

増加した繊維直径は大きい細胞penetratioを可能に増加細孔サイズにつながりますnは足場にし、そうすることは真の3D環境を作成するのに役立ちます。マイクロファイバー足場は、細胞が足場内の複数の面上に置かことを確実にするための研究で、線維芽細胞の培養に使用しました。 30% 重量/容量のPET濃度を増加させることによって、2.5ミクロンの平均直径を有するPET繊維を製造しました。より大きな直径の繊維(≈4μm)を35% 重量/体積 PET溶液を用いて製造したが、足場の厚さの均一性が失われ、そして個々の繊維の間の高い変動性が明らかでした。マイクロファイバー足場の細孔(それぞれ1.43ミクロン対10.45μm)でナノファイバー足場に測定したものよりも7倍以上であったが、限られた細胞透過を提供する細胞の静止静的播種。これは、動的にオービタルミキサー、以前に有効であることが示された方法を用いて細胞を播種することによって改善されました。

高度に整列ナノファイバー足場は、10%をエレクトロスピニングによって作成されました2000回転(≈440メートル·分-1)で回転するマンドレル上に重量/容量の PETソリューション。 PETの濃度は、繊維が低濃度で発揮不規則な波のような形態を防ぐために、8%から増加しました。繊維を整列させる濃度の増加にもかかわらず(ランダム対整列216ナノメートル対255ナノメートル)の平均繊維直径を減少させました。それらが乾燥する前に、繊維を引き出すマンドレルの高速は、この効果を引き起こす可能性があります。繊維の配向は、ASM細胞のアラインメントに影響を与え、また、他の場所で21特徴付けされたASM細胞における他の生理学的効果を有します。

このプロトコルの主な制限は、サンプルを犠牲にすることなく決定することは不可能長時間にわたって初期細胞付着または分化を行う足場内/上の画像生細胞にできないことです。これは、ほとんどの最適化は、培養期間後に発生する手段、 すなわち、修正しますサンプルるし、その後、細胞培養は、細胞培養ではないの後に成功したかどうかを測定します。アラマーブルー(ピンクと青)でインキュベートした足場の色変化を観察する細胞が存在し、生存可能であることを示しますが、理想的ではありません。ゼラチンのようなエレクトロスピニングより透明ポリマーは、足場に細胞を可視化するのに役立つ可能性があります。我々のモデル内のナノファイバー足場のエレクトロスピニングは、同様に上皮細胞が置かれている高密度のナノ繊維からなる、気道RBMの複製を可能にしました。これは、以前に免疫細胞が(データは示していない)することが可能であるが、構造的な細胞は、ナノファイバー足場22を通って移動することができないことが示されています。 (例えば、上皮および内皮細胞など)は、3D表面の特定の細胞タイプの培養のために有利な一方、ナノ繊維構造を介した細胞遊走のこの防止は、他の細胞型の培養のために有害であり得ます。平滑筋は目を通って移動することができないように電子整列ナノファイバー足場は、我々は(2つの細胞型を分離整列足場に対向する面)互いに対向する平滑筋および線維芽細胞の層と三層共培養を組み立てます。これは、細胞が近い同格にすることを可能にする一方で、現在の研究では、一つの細胞型(線維芽細胞や平滑筋のいずれか)は、より長期の培養期間にわたって全層を追い越すことになるかどうかを結論付けることはできません。これらの制限にもかかわらず、気道壁の実行可能な三層モデルでは、これらの複数の細胞型の間の相互作用を研究するための別のプラットフォームを提供する開発されました。線維芽細胞は、平滑筋で私はヒドロゲル円筒状コラーゲンの中に埋め込 ​​まれた場所同様の三層の研究は、最近公開されている腔表面17内外面と上皮細胞上に播種しました。ここで開発されたエレクトロ足場の機械的安定性は、同様の管状のコンストラクトを形成することを可能にし、現在のままであろうreseaRCHは、当社グループ内で目指しています。研究は、本研究で強調、本体共有内のいくつかの器官、この基本的な粘膜の構造単位と、テナントの修正を通して気道に焦点を当ててきた一方で、同様のプラットフォームは、血管、膀胱を含む基底膜の単位を含有する組織のために開発することができコラーゲンベースの多層モデルが採用されている角膜。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyethylene terephthalate (PET) Lucozade (GSK) bottles N/A Source of PET for electrospinning. Cut into small pieces and weigh out as necessary
Dichloromethane (DCM) Solvent for PET
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma Solvent for PET
Rotating Mandrel Built in house Used to collect electrospun fibres. By rotating at different speeds, fibres can be aligned or randomly oriented
Syringe Pump Harvard apparatus used in the electrospinning process
DMEM-F12 Gibco Culture medium for CALU3 cells
DMEM Gibco Culture medium for HASM cells
MEM Gibco Culture medium for MRC5 cells
Antibiotic/ antimycotic solution Gibco Media supplement
FCS Gibco Media supplement
Orbital mixer (Orbital shake 503) Stuart Scientific For dynamic seeding of cells onto microfibre scaffolds
Peristaltic Pump  Watson Marlow For providing media flow through bioreactor
3DKube Kiyatec Bioreactor for 3D cell culture

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References

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