차 인간 간세포의 분리 및 비 실질 간 세포의 주요 집단 대응을위한 프로토콜

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Kegel, V., Deharde, D., Pfeiffer, E., Zeilinger, K., Seehofer, D., Damm, G. Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells. J. Vis. Exp. (109), e53069, doi:10.3791/53069 (2016).

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Abstract

실질 간세포 옆에, 간은 비 실질 세포 (NPC) 즉 쿠퍼 세포 (KC), 간 내피 세포 (LEC)와 간 성상 세포 (HSC)로 구성되어 있습니다. 차 인간 간세포 (PHH)의 두 차원 (2D) 문화는 여전히 약물 대사 및 간독성의 시험관 테스트를위한 "골드 표준"으로 간주됩니다. 그것은 PHH의 2 차원 단일 문화는 탈분화 및 기능의 상실을 앓고 것으로 잘 알려져있다. 최근이 간 NPC 간 (병리) 생리학의 중심 역할과 PHH 기능의 유지 보수를 재생 것으로 나타났다. 현재의 연구는 2 차원 단일 재배의 한계를 극복하기 위해 3D- 공동 배양 모델에 의해 생체 내 조직 구조의 복원에 초점을 맞추고있다. 이전에, 우리는 인간 간 세포를 분리하는 방법을 발간 실험 생물학 및 의학 1 세포 배양 물에서의 사용을위한 이들 세포의 적합성을 연구 하였다. 이 테의 폭 넓은 관심을 바탕으로이 문서의 목적을 chnique하는이 기술을 쉽게 재생 허용하는 비디오를 포함하는 간 세포 분리 방법에 대한 상세한 프로토콜을 제공하는 것이다.

인간 간세포는 두 단계 EGTA / 콜라게나 제 P 관류 기술에 의해 수술 개입 인간의 간 조직 샘플로부터 분리 하였다. PHH 50 x g에서 초기 원심 NPC로부터 분리 하였다. 밀도 구배 원심 분리 단계 사균의 제거를 위해 사용 하였다. 개인 간 세포 집단은 특정 세포 성 및 세포 선별 방법을 사용하여 농축 된 NPC 분획으로부터 분리 하였다. PHH 격리 옆에 우리는 더 재배 KC, LEC와 HSC를 분리 할 수​​ 있었다.

함께, 제시된 프로토콜은 한 기증자의 조직 샘플에서 높은 품질과 수량에 PHH 및 NPC의 분리를 할 수 있습니다. 정제 간 세포 집단에 대한 접근은 인간의 리 같은 생체의 생성을 허용 할 수 있습니다버전 모델.

Introduction

인간의 간 조직은 매우 복잡하고 여러 개의 셀 엔티티 실질 세포 및 비 실질 세포 (NPC)로 구성된다. 실질 간 세포는 간세포와 담관을 포함한다. 간세포는 전체 간세포의 60 ~ 70 %를 차지하며 대사성 간 기능의 대부분을 차지하고, 예를 들면, 담즙산 및 인자 합성, 생물 전환 및 에너지 대사 2,3- 보완.

작은 NPC 분획 총 간세포 30-40 %로 구성한다. NPC는 서로 다른 세포 집단, 즉 쿠퍼 세포 (KC), 간 내피 세포 (LEC)와 간 성상 세포 (HSC)를 포함한다. 이 이종의 세포 분획 간의 생리적 과정에서 중요한 역할을한다. 또한, NPC는 예를 들어, 약물 - 유도 간 손상 (딜리)뿐만 아니라 만성 간 손상, 간경화 4 급성 간 손상을 중재에 참여한다.

최근, H잃어버린 간 세포는 간 질환에 점점 더 중요한 연구 및 약물 검사, 약물 개발 및 새로운 생화학 적 경로의 식별 개발되고있다. 시험관 테스트를 위해 PHH의 단일 재배는 여전히 "황금 표준"으로 간주됩니다 5. 현재 동형 간 모델의 주요 제한은 수일 내에 4 탈분화 및 간세포의 기능의 상실이다. 3 차원 (3D) 배양 기술의 확립이 제한 4,6- 보상 될 수 있다는 것을 보여 주었다. 그러나, 현대 3D 배양 기술 액션 7 모두 간독성 모드를 표시 할 수 없다. 기존의 체외 모델에서 누락 NPC 인구는 생체 내 상황이 차이에 대한 가능한 이유로 설명합니다. 또한 pathophy의 다른 간세포 집단의 세포 간 통신 생리적 항상성에서 중심 역할을하는 것으로 밝혀졌다siologic 8을 처리합니다. 따라서 과학주의는 NPC 및 세포 - 세포 상호 작용에 점점 더 초점을 맞추고있다. 공동 문화 및 조직 설계 시스템에서 그들의 목적 사용 가능한 생체 내 상황에 가까운 있습니다 체외 간 모델 8,9의 높은 수요에 대한 해결책이 될 수 있습니다.

현재의 주요 과제는 PHH 및 NPC의 명확하게 정의 부분을 포함하는 표준화 된 인간 간 공동 배양 모델의 개발이다. 결과적으로, 매우 이종의 간 세포 분리 기술이 필요하고 그 순수한 세포 집단을 얻기 위해 최적화 될 필요가있다. PHH 격리를위한 표준화 된 프로토콜 10 존재하지만, 인간의 NPC의 표준화 분리는 아직 개발 중입니다. 대부분의 출판 NPC 분리 프로토콜은 비 - 인간 세포 11,12 실험에 기초한다. 불과 몇 간행물은 인간의 NPC의 분리 과정을 설명하고 대부분은 커버단일 세포의 분리 방법은 11 ~ 16을 입력합니다. 세포 분리 무력화 된 전지의 가장 중요한 특성은 크기, 밀도, 부착 거동 및 표면 단백질을 발현한다. 이러한 특성을 바탕으로 우리는 실험 생물학 및 의학 1 년 이전에 출판 된 PHH, KC, LEC와 HSC를 분리하는 간단한 프로토콜을 개발했다. 때문에이 기술의 광범위한 관심이 문서의 목적은보다 용이하게 재생 기술을 허용하는 비디오를 포함하는 간 세포 분리 방법에 대한 상세한 프로토콜을 제공하는 것이다. 이 프로토콜은 또한 수율과 생존의 평가뿐만 아니라 특정 immunostainings를 사용하여 식별 및 순도 평가를위한 품질 관리 방법을 포함한다.

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Protocol

참고 : 모든 세포가 기본 또는 보조 간 종양 부분 간 절제술 후 남아 절제된 비 종 양성 인간의 간 조직에서 분리 하였다. Universitätsmedizin 베를린 - 환자의 동의는 샤리 테의 윤리적 지침에 따라 얻었다.

재료 및 솔루션 1. 준비

  1. 분리 과정 중에 박테리아 오염을 방지하기 위해 미리 모든 장비 및 재료 멸균.
  2. 갓 제조 소화 용액 제외 간 조직 샘플 간세포 비 실질 간세포의 단리 공정 및 표 12에 따른 차 인간 간세포의 배양 관류에 필요한 용액을 준비 사용 전에. 모든 솔루션은 4 ° C에 저장할 수 있습니다 준비 후 4 주 이내에 사용할 것을 권장합니다.
  3. 소독하다0.22 μm의 병 상단 필터를 사용하여 모든 솔루션을 제공합니다.

관류 장비 2. 준비

  1. 도 1a에 도시 된 바와 같이 간 조직 샘플의 관류 및 소화 장치를 설정한다.
  2. 관류 및 소화하는 동안 최적의 콜라게나 P 활동을 보장하기 위해 39 ° C의 물 목욕 온도를 조정합니다.

간 조직 샘플 3. 관류 및 소화 (1.5 시간)

  1. 절제 간 조직에서 그대로 Glisson의 캡슐과 조직 샘플을 선택합니다. 조직 샘플을 절단하는 경우, 좋은 가시 용기와 작은 절단면을 수득보십시오. 수송 및 관류 때까지 얼음에 간 조직 샘플을 처리하여 따뜻한 허혈 시간을 피하십시오.
  2. 무균 조건 하에서 조직의 무게를 가지고 층류 공기 흐름에 페트리 접시에 간 조직 샘플을 배치합니다. 재로부터 무균 압축과 조직 샘플의 표면을 청소피를 maining 모든 정맥이 투과되었는지 확인하기 위해 1 배 관류-솔루션 I을 사용하여 정맥 세트를 세척합니다.
  3. 일부 큰 혈관의 캐 뉼러의 올리브를 해결하기 위해 조직 접착제를 사용합니다. 간 조직 샘플의 크기 및 표면의 혈관의 수에 따라 3 내지 8 뉼러 설정 캐뉼라를 사용한다. 관류를 테스트하고 누출을 확인합니다. 조직 접착제 맑은 1 배 관류-솔루션 I를, 누출 모든 닫기 혈관,.
  4. 그 구멍 필터 디스크 (그림 1A)의 흡인 여과기로 유관 간 조직 샘플을 놓습니다.
  5. 7.5 ㎖ / 분으로 이용 캐 뉼러의 수 및 간 조직의 저항에 따라 14.6 ml / 분의 연동 펌프의 유량을 설정한다. 현재 그러나 느린 관류가되도록 유량 매번 조정한다. 전혈은 플러시하지만 20 분 이상까지 조직을 관류. 좋은 perfusi와 지역에 밝은 될 조직을 관찰에.
    주 : 일부 경우에, 플라스틱 클램프와 캐 뉼러 중 하나를 고정 할 필요가있을 수도 있고, 관류 최적화 간 캡슐 대하여 주걱으로 부드럽게 눌러 영역의 내부 압력을 증가시키기 위해. 밝은 갈색 컬러에 밝은 노란색에 전체 색상 변경은 좋은 관류를 나타냅니다.
  6. 콜라게나 제 P (표 1)를 포함 소화-솔루션으로 관류 액을 변경합니다.
  7. 소화 단계의 설치 (그림 1A)를 재 배열. 따라서 최대 15 분 동안 그림 1B에 따라 소화 - 솔루션의 순환 흐름을 수행합니다.
    주 : 간 조직 샘플을 충분히 분해 할 때 즉시 재관류 중단하는 것이 중요하다. 좋은 소화가 주걱으로 밀어 경우, 캡슐 변형의 유지 보수에 의해 평가로 조직 탄성의 흔적을 보여줍니다 때, 관찰 할 수있다.

간세포 4. 단열 (1 시간)

  1. 티오프 연동 펌프를 항아리와 유리 접시에 간 조직 샘플을 배치합니다. 차가운 얼음 스톱 솔루션 (표 1)과 조직 샘플의 외부를 헹군다. 간 조직 샘플에서 캐 뉼러를 제거합니다. 캐뉼라가 부착 된 영역의 중앙에 절개하여 간 조직 샘플을 열 메스를 사용한다. Glisson's 캡슐은 그대로 유지 치료를 유지합니다.
  2. 조직 샘플의 내부를 씻어 후 차가운 얼음 스톱 솔루션을 통해 전체 조직 샘플을 커버합니다. 조직에서 세포를 분리 부드럽게 조직을 흔들어.
  3. 세포 현탁액을 수집하고 50 ML의 플라스틱 튜브로 시선 깔때기 (가제 압축 늘어서 플라스틱 깔때기)를 통해 필터링합니다. 500 ml의 최종 부피가 소모 될 때까지 간 조직 샘플 더 스톱 용액을 첨가.
  4. 50 XG, 5 분, 4 ℃에서 세포 현탁액을 원심 분리기. 나중에 비 실질 세포 분리를위한 뜨는을 수집합니다. PBS (그림 2와 세포 펠렛을 씻으십시오A).
  5. 50 XG, 5 분, 4 ℃에서 다시 세포 현탁액을 원심 분리기. 상층 액을 수집하고 간세포 배양 배지에서 펠렛 (표 2, 그림 2B)를 다시 일시 중지합니다.
  6. 트리 판 블루 염색을 이용하여 생성 된 세포 현탁액 중의 세포 수 및 생존력을 결정한다. 노이 바 우어 계산 실에서 산 자와 죽은 세포를 계산합니다. 아래의 공식을 사용 PHH의 세포 수, 생존 능력 및 수율을 계산합니다.

    세포 현탁액 (ML)의 수율 (세포 계수) = 카운트 셀 X 희석 인자 X 부피는 10,000 X

    수율 (간세포 / (g 간 조직 샘플)) = (세포 현탁액 (ML)의 수율 (간세포 / (ML 매체)) × 양) / (간 조직 샘플의 중량 (g))

    생존율 (%) = 100 % × (생균 수) / (전체 세포 수)

간세포 5. 정제 (1 시간)

참고 : 생존 경우 정제 단계가 좋습니다70 %보다 낮다.

  1. 얼음의 모든 단계를 수행합니다. 5 ㎖ 밀도 구배 용액의 밀도 구배 원심 분리는 15 mL의 PBS을 혼합하여 25 %의 농도 구배를 준비한다.
  2. 양 층의 명확한 분리 (도 2C)을 확보하기 위해 25 %의 농도 구배 층의 상부에 조심스럽게 천천히 간세포 풍부한 세포 현탁액에서 총 50 미오 셀의 최대 넣는다. 1250 XG, 20 분, 브레이크없이 4 ° C (그림 2D)에서 원심 분리기 원심 분리기로 조심스럽게 튜브를 넣습니다.
  3. 나머지 세포 현탁액 및 계면에있는 죽은 세포를 대기음. 지방 함량 하나에 따라 또한 밀도 구배-솔루션을 대기음 수 있습니다.
    주 : PHH 낮은 지질 함량은 치밀한 펠릿 및 밀도 구배가 완전히 흡입 수를 형성한다. 높은 지질 함량 PHH 펠릿 위 밀도 구배 용액에 남아있을 수보다 확산 펠릿 생세포 많이 형성한다.
  4. 50 XG, 5 분, 4 ° C에서 다시 PBS와 원심 분리기와 간세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 펠릿 수영장, PBS로 다시 씻어 ​​간세포 배양 배지에서 정제 PHH 다시 일시 중지합니다. 단계 4.6에 설명 된대로 셀 계산을 수행합니다.

간세포의 6 재배

  1. 예 래트 꼬리 콜라겐 (콜라겐 타입 I)를 들면, 세포 외 기질로 코팅함으로써 PHH의 시딩을위한 세포 배양 접시를 준비한다. 라잔 등에 의해 설립 된 프로토콜에 따라 쥐의 꼬리 콜라겐을 준비합니다. (17)
  2. 쥐의 꼬리 콜라겐 원액 1을 희석 : (200)을 PBS에. 표면 전체가 포함 된 배양 접시에 전송 100 μL / 쥐 꼬리 콜라겐 솔루션, 돌보는. 실온에서 20 분 동안 세포 배양 플라스틱 인큐베이션. 나머지 쥐의 꼬리 콜라겐 솔루션을 대기음.
  3. 문화 dishe에 간세포 배양 배지에서 종자 15 × 104 간세포 / cm 2쥐의 꼬리 콜라겐으로 코팅 s의. 적어도 4 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2의 가습 된 배양기에서 세포를 배양. 4 시간 후, 간세포 부착하고 배지를 변경할 수있다.
  4. 실험 설정에 따라 조사를 수행합니다. 48 시간의 배양 시간은 세포 분리 과정에서 복구 할 것을 권장한다.

비 실질 간 세포의 7 격리 (1.5 시간)

  1. 원심 분리기 (72) XG, 5 분, 4 ° C에서 수집 된 뜨는 (단계 4.5 및 4.6) 남은 적혈구와 간세포를 제거합니다. 상층 액을 수영장과 두 개의 세포 펠렛을 얻기 위해 두 번을 원심 분리기 : 300 XG, 5 분, HSC, LEC 부분적 KC 650 XG, 7 분, 나머지 KC의 침강 4 ° C의 침강 4 ° C를.
  2. 풀 펠릿 모두 HBSS에서 그들을 다시는 일시 중지합니다. 25 % 및 밀도 구배 centrif 믹싱 밀도 구배 용액 및 PBS에 의해 50 %의 농도 구배를 준비ugation (25 % 밀도 구배 용액 5 ml의 밀도 구배 용액을 15 ml의 PBS 50 % 밀도 구배 용액을 10 ml의 밀도 구배 용액 10 ㎖ PBS,도 2 참조). 50 % 밀도 구배 용액 층의 상부에 조심스럽게 25 % 밀도 구배 용액을 놓는다.
  3. 양 층의 명확한 분리가 달성되는 방식으로 25 %의 밀도 구배 용액 층의 상부에 조심스럽게 천천히 NPC 현탁액을 넣어.
  4. 원심 분리기 1800 XG, 20 분, 브레이크없이 4 ° C (그림 2.2)의 농도 구배에 세포 현탁액.
  5. 대기음 사균과 최상층으로부터 세포 파편. 전인대는 25 %와 50 % 밀도 구배 층 (그림 2) 사이의 계면에 있습니다. HBSS와 원심 분리기와 상기 이중 원심 분리 단계 적용 세포 현탁액을 씻어 NPC를 수집한다 (단계 7.2.).

쿠퍼 세포의 분리 제 (준수분리 단계) (1 시간)

  1. 단계 4.6에 기재된 바와 같이 NPC 분획의 KC하는 세포 수를 수행한다. (현탁액 KC의 모양은 그림 (b) 참조). 원심 분리기 상기 이중 원심 분리 단계 (단계 7.2) 및 NPC 쿠퍼의 셀 시드 매체 (표 2)를 다시 일시 중지와 NPC의 일부.
  2. 5 × 5 KC / ㎠의 밀도로 플라스틱 세포 배양 용기에 KC 함유 분획을 시드. 37 ° C에서 가습 인큐베이터에서 20 분 동안 KC 문화를 품어, 5 % CO 2. 기본 KC 단시간 (도 23) 내에서 세포 배양 플라스틱에 부착.
  3. 주로 LEC와 HSC로 구성하지 부착 된 NPC를 포함하는 상층 액을 수집합니다. LEC 이후 분리를위한 상층 액을 풀 (섹션 9 참조) HSC는 (10 항 참조). HBSS로 부착 KC를 세척하고 37 ℃, 5 % CO에서 쿠퍼 세포 배양 배지 (표 2)에서 그들을 육성가습 인큐베이터에서 2.

내피 세포의 9 분리 (1.5 시간)

  1. 원심 분리기 300 XG, 5 분, 4 ° C에서 수집 된 뜨는 (단계 8.5.). PBS와 펠렛을 씻으십시오. 300 × g으로 5 분, 39 ° C를 성상 세포 / 내피 세포 분리 배지에서 세포를 다시 정지 단계 4.6에 기재된 바와 같이 나머지 모든 세포에 대한 세포 수를 수행 한 후 원심 분리.
  2. immunolabeling의 MACS-KIT에서 솔루션을 차단 20 μL와 CD31 마이크로 비즈의 20 μl를 추가, 1 ml의 성상 세포 / 내피 세포 분리 배지에서 1 × 10 7 미오 셀을 다시 중단하고 4에서 15 분 동안 생성 된 현탁액을 품어 ° C 온도 (그림 2.4).
  3. 자화 활성 세포 선별 시스템 MACS (그림 2.5)에 대한 제조자의 프로토콜에 설명 된대로 HSC에서 별도의 LEC. 자기 유지 CD31 양성 LEC을 용출 및 성상 C에서 그들을 중지엘 / 내피 세포 배양 배지 (표 2).
  4. 단계 4.6에 설명 된대로 LEC에 대한 계산 셀을 수행합니다. 1.25 × 105 세포를 쥐 꼬리 콜라겐으로 코팅 된 세포 배양 용기에서 / ㎠의 밀도 시드 LEC (단계 6.1 참조). 가습 인큐베이터에서 37 ℃로, 5 % CO 2에서 세포 배양.

성상 세포 (10) 분리 (0.5 시간)

  1. 레이블이없는 HSC는 MACS 과정에서 분리 컬럼을 전달합니다. HSC 분율 (그림 2.5 단계 9.5 참조)를 수집합니다. 단계 4.6에 설명 된대로 셀 계산을 수행합니다.
  2. 래트 꼬리 콜라겐으로 코팅 된 세포 배양 용기에 5 × 104 세포 / ㎠의 밀도로 시드 HSC는 성상 세포 / 내피 세포 배양 배지 (표 2)에서 (단계 6.1 참조), 37 ° C, 5 %을 육성 가습 인큐베이터에서 CO 2.

"표 표 1 : 관류 및 격리 솔루션입니다.

표 2
표 2 : 문화 절연 매체.

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Representative Results

준수의 특성과 맥의 사용과 결합 정리 절차로 밀도 기울기 원심 분리를 이용하여 실질이 아닌 실질 부분에 분리는 성공 PHH 및 NPC 분리로 연결됩니다. PHH 및 NPC는 높은 품질과 수량에 고립 될 수있다. (1) 간 관류 및 소화 용 장비의 대표 설정을 보여줍니다. 프로테아제 단백질 분해 활성을 감소시키는 대가로 콜라게나 제 P 활성 안정화 용액 II - 10 % FCS 관류를 함유하는 콜라게나 제 P로 하였다. NPC 분리에 필요한 결과 이​​상 소화 시대 PHH의 생존 능력에 부정적인 영향없이 적용 할 수있다.

그림 1
그림 1. 관류 소화 설치 제 관류 공정 순으로 하였다 수행r은 잔여 혈액을 제거하고 조직을 따뜻하게하고 1 배 관류 솔루션 I (PI) (A)를 사용하여 세포 - 세포 - 연결을 용해 칼슘을 제거합니다. 소화 용액 (DG)의 재순환 관류 단계 II (B) 중에 간 조직의 분해에 대하여 수행된다.

그림 2
그림 2 :.. 전체 PHH 및 NPC 분리 공정의 단순화 된 개략도는 실험 생물학 및 의학의 허가 파이퍼 1, 2014에서 수정. 우선, 간 조직 샘플 관류 두 단계 EGTA / 콜라게나 제 P 관류 법 (A)에 의해 분해된다. 음이온의 세포 현탁액 50 XG, 5 분, 39 ° C (B), 작은 NPC 분률에서 큰 PHH 분률 (펠렛)을 분리 (supern에서 처음 원심atant). 70 % 이하 PHH 생존의 경우, 가능한 PHH 분획 죽은 반면, 상기 튜브의 하단에 PHH 침강 결과 1,250 × g으로 20 분, 39 ° C (C)에서 밀도 구배 원심 분리에 의해 농축 될 수있다 / 세포 파편 세포는 밀도 구배 층 (D)의 상단에 위치하고 있습니다. 1) 300 XG, 5 분, 4 ° C, 2) 650 XG, 7 분, 4 °의 C : 초기 원심 분리 (1)의 수집 된 상층 액은 두 단계를 사용하여 원심 분리된다. 첫 번째 원심 분리 후 KC는 부분적으로 상층 액에 있습니다. 이러한 맥락에서, 제 2 격리 공정이 필요하다. 얻은 세포 펠렛을 풀링하고 HBSS에 다시는 탁. 이어서, 세포 현탁액을 조심스럽게 두 층 (25 % / 50 %) 밀도 구배의 상부에 적층된다. 적층 밀도 구배 튜브를 1,800 × g으로 20 분간 4 ℃에서 원심 분리 (2). 25 % 밀도 구배 층의 상부에 죽은 세포는 삭제됩니다. NPC 25 % 인 계면 및 50 % (D) 사이에 위치ensity 구배 층을 수집하고, 풀링된다. NPC를 분획 코팅 세포 배양 플라스틱에 파종한다. 20 분의 인큐베이션 시간을 사용 (부착 분리 단계) KC 다른 간세포 집단에서 분리된다 (3). LEC와 HSC는 MACS-키트를 사용하여 구분됩니다. 따라서, 상청액 수집 남은 간세포 300 XG, 5 분, 4 ℃에서 원심 분리하고, 공역 CD31 마이크로 비드 (4)으로 표시된다. 만 CD31 음성 HSC는 MACS 분리 컬럼 (5)를 전달합니다. 컬럼에 CD31 양성 LEC 스틱. 마지막으로 열이 자기 장치와 CD31 양성 LEC에서 제거가 열 (5)에서 용출된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

분리 된 PHH는 14.2 × 106 ± 6.6 × 10 6 가능한 PHH / g의 간 조직의 수율과 가능성을 보여 주었다 약 760.6 ± 4.2 % (표 3 1). 현미경으로 볼 기능은 일반적인 대형 세포질 지질 방울과 함께 볼륨과 1 사이 네 핵 (그림 3a는)이었다. 셀 크기는 정지 μm의 30-20 사이에 다릅니다.

KC는 NPC 분획에서 가장 일반적인 세​​포 유형이었다. 우리는 약 1.9 격리 × 106 ± 0.2 × 10 92.8 ± 3.5 % (표 3 1)의 생존과 6 가능한 KC / g의 간 조직. KC는 표면 (그림 3B)에 낮은 세포질 / 핵 비율과 일반적인 미세 융모와 아주 작은 세포 (약 5 μm의)입니다.

마지막으로 우리는 나머지 CD31 음성 HSC에서 CD31 양성 LEC를 분리하기 위해 MACS 분리 기술을 사용했다. LEC의 수율은 약 2.7 × 10 5 ± 0.1 × 10 5 가능한 LEC / g의 리브했다어 조직과 달성 가능성은 95.6 ± 2.8 % (표 3 1)이었다. 식별 기준은 여러 granulae 짧은 배양 시간 (도 3G) 후 약 10 μm의 세포 현탁액 (도 3C)뿐만 아니라 특징적인 스핀들 형상의 크기이다.

분리 공정은 89.6 ± 3.8 % (표 3 1)의 생존 약 4.7 × 10 5 ± 0.2 × 10 5 가능한 HSC / g 간 (N = 8) HSC 수율 결과. 현미경으로 식별 특성은 약 20 ㎛의 크기와 지질 방울 (그림 3D)의 다양한 양의 전형적인 과립 모양이었다.

1 번 테이블
표 3 : 수율, 생존 고립 PHH과 N의 순도PC. 세 가지 다른 기증자는 평가했다. 데이터는 평균 ± SD로 제공됩니다. 이 표는 파이퍼 등. 1, 2014 년 이전에 게시하고, 실험 생물학 및 의학의 허가 재판된다.

식별 및 세포 배양 순도의 결정을 위해, 모든 절연 세포 분획을 세포 형 특정 항원에 대한 항체로 처리 하였다. 세포를 형광 이차 항체로 처리하고 면역 형광 현미경으로 조사 하였다. 순도 훽스트 염색으로 가시화 총 세포 수에 관하여 긍정적 인 형광 염색 된 세포를 계수함으로써 측정 하였다.

재배 PHH의 24 시간은 특성 다각형 자주 배수성 (그림 3E)을 보여 주었다 후. PHH는 CK 18 (그림 3I)에 대한 긍정적이었고, 92.3 ± 3.2 %의 순도를 보였다(표 3 1).

KC는 세포 배양 플라스틱 표면에 20 분 이내에 부착. 눈에 띄는 라운드 세포 핵을 가진 24 시간 작은 원형 세포의 배양 시간이 관찰 한 후 (그림 3 층). 표면 단백질 CD68은 KC (도 3J)를 식별하는데 사용되었다. CD68 양성 세포의 순도는 81.0 ± 5.4 % (표 3 1)에 달했다.

NPC를 분리하는 동안 CD31 라벨을 사용하여 MACS 분리에도 불구하고 CD31에 고립 LEC를 염색하는 것은 여전히​​ 가능했다. 따라서 격리 재배 LEC는 식별 및 순도의 결정에 CD31으로 염색 하였다. 또한 LEC는 간엽 세포 마커 멘틴 (도 3K)에 대한 면역 반응을 나타내었다. 우리는 약 양성 염색 된 세포 (표 3 1)의 81.0 ± 1.7 %를 관찰했다. 일반적인 저명한 지질 방울과 HSC (그림 3H)는 GFAP (그림 3L)에 대한 면역 형광 염색법에 의해 표시되었다. HSC의 순도는 93.0 ± 1.7 % (표 3 1)이었다.

모든 세포 분획 다른 NPC 마커와 대조했다. 모든 세포 분획 간 다른 특정 세포 유형의 소수를 포함하지만, 간세포 마커 CK18 및 cholangiocyte 마커 CK19 부정적이었다.

그림 3
.도 3 : 인간 실질 현탁과 부착 한 후 비 실질 간 세포의 형태학 왼쪽 열 (A - D)는 격리 공정 후, 바로 다른 격리 된 간 세포 집단을 도시위상 콘트라스트 현미경보기 : PHH (A), KC (B), LEC (C)와 HSC (D). 중간 열 (E - H) 재배 (위상차 현미경)의 24 시간 후에 격리 재배 PHH (E), KC (F), LEC (G) 및 HSC (H)의 이미지를 제공합니다. 다른 세포 분획의 면역 형광 기반의 특성이 마지막 열에 표시됩니다 : PHH는 간세포 마커 CK18에 대한 긍정적 인 신호 (I가, 분리 후 24 시간이), KC는 마커 CD68 양성했다 보였다 (J를, 24 시간 격리 후) LEC는 멘틴 (K, 72 시간 격리 후)에 대한 긍정적 인 신호를 보여 HSC는 GFAP (L, 분리 후 72 시간)에 양성이었다. 세포 핵은 훽스트으로 염색 하였다; 배율 : 400X. EXPER의 허가 파이퍼 등. 1, 2014 년 수정imental 생물학 및 의학. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

게시 된 프로토콜은 동시에 인간의 간 조직의 동일한 샘플에서 높은 품질과 순도, 순수 PHH 및 NPC, 즉 KC, HSC와 LEC를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. 간세포 아이솔레이션 다루는 문헌의 대부분은 인간 조직 수행 그 세포 집단 18-20 및 분리 절차들 중 하나 (21) (당국이 외. 검토) 희소 커버. 인간의 간을 동물 조직 (예를 들면, 쥐의 간) 설립 방법의 적응력 동물과 인간의 세포 집단 사이의 셀 속성에서 몇 가지 차이점을 밝혔다. 다른 간세포 집단을 덮는 간 세포 분리 방법의 확립은 실질 비 실질 세포 분리를 조합하여 인해 최적의 결과를 위해 요구되는 소화 시간차에 중요한 단계 인 것으로 나타났다. 이 도전에 직면 우리는 다른 기술을 결합 간 세포 격리 프로토콜을 개발하고 적응우리 PHH 분리 프로토콜 10 SE.

용액 II를 함유하는 콜라게나 제 P로 10 % FCS를 첨가하여 우리는 프로테아제의 단백질 가수 분해 활성을 감소시킬 수 있었다. 이 수정 NPC의 높은 숫자를 얻기 위해 필요한 이상 소화 시간을 허용했다. 결과적으로 우리는 좋은 품질의 NPC로 높은 양뿐만 아니라 PHH를 분리 할 수​​ 있었다. 성공적인 간세포 분리 초기 조직의 품질에 크게 의존한다. 도너 데이터 병력 셀의 질과 양에 영향을 미칠 수있다. 우리의 경험에서 기증자 특정 요인과 상관 관계가 없습니다 또한 매우 경험이 풍부한 직원은 실패 세포 분리에 직면 할 수 있습니다. 공여 조직의 품질이 중요한 포인트이기 때문에, 조직의 품질이 저하 될 수있는 모든 외부 소스는 최소화되어야한다.

가장 중요한 요소는 조직 (T)의 반송시 수술 개입 냉 허혈 시간 후에 온 허혈 배실험실 오. 또한 세균 감염에 대한 소스는 피해야한다. 때때로 장기 자체 담즙 요로 질환의 경우, 예를 들어 세균 오염을 포함 할 수 있음에 유의해야한다. 분리 과정 내에서 중요한 단계는 재관류 시간 및 밀도 구배 원심 분리 단계를 포함. 첫 번째 관류 단계는 20 ~ 30 분을 지속한다. 짧은 관류 시간은 얻은 세포 현탁액 중의 세포의 클러스터의 경우에서 생성 된 세포 - 세포 접촉의 완전 박리가 발생할 수있다. 장기화 제 관류는 세포 생존을 감소 의한 칼슘 고갈 세포 스트레스를 유발한다.

조직 효소 분해에 대해 수행 된 두번째 관류 단계는 오른쪽 시점에서, 단백질 분해 반응을 중지에 대한 결정을내어 최적의 분해 정도를 결정하기 위해 약간의 경험을 요구한다. 짧은 소화 시간은 스트레스와 세포 손상을 셀에 낮은 금리와 장기 소화 시간에 이어집니다.우리의 경험에서 소화 동안 소화되지 않은 조직과 손상된 조직 사이의 시간 프레임은 종종 1 ~ 3 분의 창 내에 자리 잡고 있습니다. 불완전한 관류 캐뉼라를 핀칭 클램프를 사용하여 다른 영역으로 조직 내의 압력 변화에 의해 상쇄 될 수있다. 조직 샘플을 향해 주걱 또한 부드러운 압력 조직 관류의 변화를 이끈다. 티슈는 압축되고 내부 압력이 증가한다. 이어서, 혈관은 압축 및 반경이 감소한다. 반경이 감소하면, 저항이 증가 (하겐-Poiseuille 법칙) 및 관류 용액으로 관류 최소 저항 및 다른 지역의 방법을 선호한다. Baccarani 및 동료에 따라 우리는 섬유 성 또는 간경변 조직 세포 생존율 (22)을 낮출 선도 이상 소화 기간이 필요하다는 것을 관찰했다. 이러한 이유로 우리는 간 섬유증 또는 간경변 환자의 조직을 방지하는 것이 좋습니다.

준비 및그라디언트 중 밀도 구배의 처리뿐만 아니라 수확 세포 (5 단계 7 참조) 또한 중요한 단계를 다룹니다. 상이한 밀도 구배 층과 세포 현탁액 날카로운 interphases 생성하는 천천히 신중하게 전송할 수있다. 또한 세포를 수확 특히 동안 취급 중에 구배 손상의 위험이 항상있다. NPC를 분리하는 동안 부착 된 분리 공정은 모든 NPC 분획 이상 수율 및 순도 중요하다. 하지 부착 된 NPC의 세포 수와 KC의 순도를 높이기 위해 추가 세척 단계는 도움이 될 수 있습니다. 이 단계의 세정액은 또한 NPC를 분리하여 상층 액을 모으고있다. 세균에 의한 오염을 방지하기 위해 곰팡이 균이나 바이러스의 엄격한 조건 (23)을 확보해야한다.

필요한 세포 집단의 의존 프로토콜은 특정 단계를 건너 변경하고 조정할 수있다. 예를 들어 만 KC는 경우NPC 침강 용 이중 원심 분리 단계는 상기 초 원심 분리 단계로 감소 될 수 있고 HSC LEC 및 분리 단계가 제거 될 수있는 필수. 원심 분리에 대한 재관류 시간과 g-힘은 조직과 세포의 품질에 의존하여 변경 될 수있다. 섬유 성 조직 따라서 신중 조직 탄성을 제어 할 필요가있다, 소화 시간 연장 요구한다. 지방 간세포의 지질 방울의 축적은 세포 밀도를 감소하기 때문에 침강 특성을 변경합니다. 우리의 관찰에 따르면이 높은 PHH 수량이 필요한 PHH의 지질 함량에 따라 PHH 분리시 g-힘을 조정하는 데 유용 할 수 있습니다. 그것은 초기 원심 분리 공정의 변경은 질과 양 측면에서 NPC 분리에 영향을 미치는 부정적 것을 주목해야한다. 지금까지 우리는 50 XG (낮은 지방 함량과 간세포) 150 XG (지방 함량이 높은 간세포) 사이 g-힘을 권장합니다. 또한 지방 HEPAtocytes 밀도 구배 원심 분리 후의 적은 소형 세포 펠렛과 상기 세포를 수확 단계 5.5에 기재된 바와 같이 변경되어야을 형성하는 경향이있다.

일부 단계들은 동시에 수행 될 수있는 분리 과정을 가속화한다. 분리 된 간세포의 정제와 병렬로, 예를 들어 두 번째 사람은 NPC 분리로 시작할 수있다. 또한 밀도 구배 용액을 미리 준비 할 수있다. 둘 이상의 사람이있는 경우에도 그 이상의 단계가 동시에 수행 될 수있다.

실험 생물학 및 의학 1 이전에 발표 된 다른 사람의 간 세포 격리 프로토콜에 비해 우리의 결과는 비슷하거나 더 높은 세포 수율 및 생존율을 보여줍니다. KC 분리 Alabraba 및 동료에 필적 약 98 % (13)의 생존과 결합 2.3 × 10 6 가능한 KC / g 간 조직의 수율로 분리 결과를 보여 주었다 들어우리의 KC 결과 (세포 수 : 1.9 × 10 6 가능한 KC / g의 간 조직, 생존 약 93 %). 문서 LEC 분리 된 데이터의 대부분은 전 기관 15,24에서 아이솔레이션을 설명한다. 라흐와 동료뿐만 아니라 Lalor와 동료들은 10 및 10 6 세포 / 기관 15,24 사이에 세포 수를입니다. 이러한 데이터는 조직 샘플로부터의 아이솔레이션을 셀에 직접 비교 될 수 없다. 그러나, 우리의 프로토콜을 사용하여 우리는 전체 기관에서 추정 할 때 훨씬 더 큰 기준이다 2.7 × 10 5 가능한 LEC / g 간 조직의 LEC에 대한 수익률을 보였다. HSC는 90 %에 대해 약 4.7 × 10 5 가능한 HSC / g의 간 조직의 수율과 생존으로 분리 하였다. 프리드먼과 동료에 의해 ​​게시 된 기존 결과는 절반 낮은 세포 수율 (2.3 × 10 5 HSC / g의 간), 그러나 유사한 순도 (91 %) (14)을 보여 주었다. 우리의 프로토콜에 대해서는, 낮은 세포 수율 인해 1 배 관류 - Solutio의 낮거나없는 순환에 나쁜 관류하고 소화가 발생할 수 있습니다N I 및 조직 내에서 소화-솔루션. 또한 조직에 기포가 1 배 관류-솔루션 I 및 소화-솔루션의 내부 조직의 혈액 순환을 방해 할 수 있습니다. 이러한 경우, 관류 단일 캐 뉼러 클램핑 및 / 또는 조직 샘플에 대하여 가압하는 주걱을 사용하여 기포의 관류 압력 및 제거를 증가시킴으로써 향상 될 수있다. 불량 가능성은 대부분의 경우에 세포 스트레스의 결과이다. 장시간 허혈 시간, 칼슘 고갈과 막 단백질의 단백질 분해에 의한 손상은 세포막의 소포으로 표시 손상을 셀에 연결되어 있습니다. 우리의 관찰에서 매우 민감한 이들 세포가 전단 응력 대부분의 경우, 분리 과정 동안 죽는다. 요약하면, 성공적인 분리 및 실질 비 실질 간세포의 분리는, 피펫 팅 단계는 세포 분리 및 분리의 신중하게 그리고 일반적으로 시간이 수행되는 중요한 단계는 적절한 시간 프레임에서 수행되는 것을 필요hould 가능한 21 짧게 유지 될 수있다. 기술 된 프로토콜의 단점은 분리 조건 (예를 들어, 관류 시간) 완전히 표준화 수 없으며 조직의 품질에 개별적으로 적용 할 필요가 있다는 것이다. 또한, 얻은 세포군의 수율 및 순도는 티슈 품질과 소화의 결과에 의존하여 다양 할 수있다.

최근이 방법 (1)에 의해 각각 절연 NPC 세포 유형의 기능적 특성과 함께 배양 조건의 영향을 보여주는 연구를 발표했다. 가능성은 분리하고 간 별도의 서로 다른 세포 집단은 혁신적인 인간의 간 세포의 공동 문화와 조직 공학 체외 간 모델을 만들 수 있습니다. 이곳은 2D 모노 문화 PHH 재배는 탈분화 및 일반적인 세포 기능 (7)의 손실을 초래하는 것으로 알려져있다. 이러한 이유로 생체 조직 아키을 모방 할 필요가있다체외 간 모델 내에서 텍처. Kostadinova 및 동료 (2013 8,9)뿐만 아니라 메스너와 동료들 (2013 8,9) 성공적으로 간독성 효과의 검출을위한 기능 공동 문화 간 모델을 설립했다. 그러나, NPC 특성화되지 않은 특정 기능이 시스템에 조사되지 않았다.

따라서 앞으로의 연구는 공동 문화 내에서 NPC의 장기 생존에 대한 조사, 특정 특성과 상호 작용에 초점을 맞추어야한다. 그러한 연구의 경우, 또한, 담관의 분리를위한 프로토콜을 확립 관심사 일 수있다. 원시 간에 포함 된 모든 세포 유형을 포함하여 기능 시험 관내 공동 문화의 실현은 인간의 간 모델 같은 생체의 방향에 또 다른 단계가 될 수 있습니다.

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Acknowledgments

0315741 : 우리는 본 연구는 교육 및 연구 (BMBF) 프로젝트 가상 간의 독일 연방 교육부에 의해 지원되었다 그림 1의 생성에서의 지원 지아 리 리우에게 감사의 말씀을 전합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
General Equipment
PIPETBOY Eppendorf
pipettes Eppendorf
microscope Carl Zeiss
microscope Olympus
CO2-incubator Binder
Lamin Air Heraeus
Centrifuge Varifuge 3.0R Heraeus
Urine Beaker Sarstedt 2041101
perfusor syringe 50 ml B.Braun 12F0482022
Bottle Top Filter Nalgene 1058787
Falcon 50 ml Polypropylene Conical Tube BD Biosciences 352070
Falcon 15 ml Polypropylene Conical Tube BD Biosciences 352096
Tissue Culture plate BD Biosciences 533047 24 well
serological pipettes BD Biosciences 357525, 357551, 357543 25 ml, 10 ml, 5 ml
pipette tips SARSTEDT 0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011 100 µl, 200 µl, 1,000 µl
Name Company Catalog Number Comments
Isolation Equipment
water bath Lauda
peristaltic pump Carl Roth
circulation thermostat Lauda
pH meter Schott
fine scales Sartorius
stand
Büchner funnel Haldenwanger
plastic funnel
silicone tube
cannulae with olive tips
glass dish
forceps
scalpel Feather 12068760
Neubauer counting chamber Optic Labor
cell lifter Costar
Surgical Drape Charité Universitätsmedizin Berlin A2013027
compress Fuhrmann 40013331
sterile surgical gloves Gammex PF 1203441104
Tissue glue B. Braun 1050052
glass bottle VWR
Collagenase P Roche 13349524
Percoll Separating Solution Biochrom L6145 Density 1.124 g/ml
Hank’s BSS PAA H00911-3938
Dulbecco’s PBS PAA H15 - 002 without Mg/Ca
Ampuwa Plastipur  13CKP151 
Albumin Sigma-Aldrich A7906
NaCl Merck 1,064,041,000
KCl Merck 49,361,000
Hepes Pufferan  Roth 133196836
EDTA Sigma E-5134
Name Company Catalog Number Comments
Media Equipment 
DMEM PAA E15-005 Low Glucose (1 g/L) (without L-Glutamine)
HEPES Buffer Solution 1 M GIBCO 1135546
L-Glutamine GIBCO 25030-024 200 mM
MEM NEAA GIBCO 11140-035
penicillin/streptomycin GIBCO 15140-122
RPMI 1640 PAA E15 - 039 without L-Glutamine
Sodium Pyruvate GIBCO 1137663 100 mM
Trypan Blue Solution Sigma-Aldrich T8154 0.4%
William’s E   GIBCO 32551-020
with GlutaMAX™
EGTA Sigma-Aldrich 03780-50G
Fortecortin Merck 49367 8 mg/2 ml
Human-Insulin Lilly HI0210 100 I.E./ml
N-Acetyl cysteine Sigma-Aldrich A9165-5G
Fetal calf serum (FCS) PAA A15-101
Name Company Catalog Number Comments
Equipment for Immunostainings
CD 68 R&D Systems, USA monoclonal
CK 19 Santa Cruz D2309 polyclonal
CK18 Santa Cruz K2105 monoclonal
Vimentin Santa Cruz monoclonal
GFAP Sigma Aldrich monoclonal
Triton X-100 Sigma Aldrich 23.472-9
Goat anti-Mouse IgG1-PE Santa Cruz C0712
Goat anti-rabbit IgG-FITC Santa Cruz L0412
Methanol J.T.Baker 1104509006
Formaldehyde 4% Herbeta Arzneimittel 200-001-8
Bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich A7906-100G

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References

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