Ein kombiniertes 3D-Gewebezüchtungen * These authors contributed equally

Bioengineering

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Göttlich, C., Müller, L. C., Kunz, M., Schmitt, F., Walles, H., Walles, T., Dandekar, T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds. J. Vis. Exp. (110), e53885, doi:10.3791/53885 (2016).

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Abstract

In der vorliegenden Studie, kombiniert wir ein in vitro - 3D - Lungentumormodell mit einem in silico - Modell Vorhersagen der Arzneimittelreaktion zu optimieren basierend auf einem bestimmten Mutations - Hintergrund. Das Modell ist auf einem dezellularisierter Schweine Gerüst erzeugt, die gewebespezifische Eigenschaften in Bezug auf extrazelluläre Matrix-Zusammensetzung und Architektur einschließlich der Basalmembran wiedergibt. Wir standardisiert ein Protokoll, das innerhalb von 14 Tagen mit drei Tagen der medikamentösen Behandlung künstlichen Tumorgewebe Generation ermöglicht. Unser Artikel stellt einige detaillierte Beschreibungen von 3D - Auslese Screening - Techniken wie die Bestimmung des Proliferationsindex Ki67 - Färbung der Apoptose von Überständen von M30-ELISA und Beurteilung von epithelialen zu mesenchymale Transition (EMT), die hilfreiche Werkzeuge sind für die Bewertung der Wirksamkeit von therapeutischen Verbindungen. Wir konnten zeigen, eine Reduktion der Proliferation in unserem 3D-Tumormodell in 2D-Kultur verglichen, die relat isted der klinischen Situation. Trotz dieser geringeren Proliferation prognostiziert das Modell EGFR -targeted Droge Antworten korrekt entsprechend dem Status von Biomarkern wie durch einen Vergleich der Lungenkarzinomzelllinien HCC827 (EGFR -mutated, KRAS - Wildtyp) und A549 (EGFR Wildtyp - KRAS - mutiert mit der Tyrosin-Kinase - Inhibitor (TKI) Gefitinib behandelt). Um Drogen Antworten von fortgeschrittenen Tumorzellen zu untersuchen, wir EMT durch langfristige Behandlung mit TGF-beta-1 induziert, wie durch Vimentin / pan-Zytokeratin Immunfluoreszenzanfärbung beurteilt. Ein strömungs Bioreaktor wurde verwendet Kultur physiologischen Bedingungen einzustellen, die Gewebebildung verbessert. Darüber hinaus zeigen wir die Integration von Drogen Antworten auf Gefitinib Behandlung oder TGF-beta-1 - Stimulation - die Apoptose, Proliferationsindex und EMT - in ein Boolean in silico - Modell. Darüber hinaus erläutern wir, wie Arzneimittelreaktionen von Tumorzellen mit einem bestimmten Mutations-Hintergrund und Zählungerstrategies gegen Widerstand vorhergesagt werden. Wir sind zuversichtlich , dass unsere 3D - In - vitro - Ansatz vor allem mit seinen in silico Expansion für die präklinische Drogentests in realistischer Bedingungen als in 2D - Zellkultur einen zusätzlichen Wert liefert.

Introduction

Die pharmazeutische Industrie steht vor hohen Ausfallraten von bis zu 95% im Bereich der Krebstherapie in der klinischen Phase verursacht enorme Kosten 1-5. Ein Grund für diesen Mangel ist die Tatsache, dass zur Zeit die Wirksamkeit von potentiellen neuen Verbindungen bewertet wird in großem Maßstab Screenings auf 2D-Zellkulturen von Krebszelllinien, oder in Tiermodellen. Tiermodelle haben eine höhere Komplexität , aber es gibt entscheidende Unterschiede zwischen Mäusen und Menschen 6,7. In den letzten zehn Jahren Modelle 3D Krebs verschiedene Ansätze wurden erzeugt , um die Lücke zwischen 2D - Kultur von Krebszelllinien und einem Komplex in vivo Tumor 6,8,9 zu überbrücken. Die Auswirkungen der 3D - Umgebung auf die Zelldifferenzierung und auch Signalisierung in mehreren Studien wurde Jahren gezeigt (z. B. durch Mina Bissell) 10,11. Heute sind viele 3D - Zellkulturmodelle zur Verfügung, wie Sphäroid - Kulturen, Hydrogele oder Mikrofluidik - Chips 12-16. Obwohl these-Modelle Komplexität im Vergleich zu herkömmlichen 2D-Kultursystemen zu verbessern, sie eine Gewebemikroumgebung meist fehlen, die bekannt ist, Tumor-tragenden Effekte und hat auch Auswirkungen auf die Arzneimittelwirksamkeit zu haben.

Um dieses Problem zu beheben, haben wir einen ein 3D - Modell Tumor auf der Basis eines biologischen Gerüst SISmuc (small-Darm-Submukosa + Schleimhaut) genannt , die von einem dezellularisierter Schweine Jejunum abgeleitet wird. Dadurch werden die Gewebearchitektur und wichtige Komponenten der ECM wie verschiedene Kollagene sowie der Basalmembran Struktur 17 erhalten. Diese einzigartige Funktion ist für die Tumormodellgeneration von Karzinomen von entscheidender Bedeutung, die von Epithelien und umfassen etwa 80% von soliden Tumoren entstehen. Darüber hinaus wird die Proliferationsrate in unserem Tissue-Engineering-Tumormodell reduziert im Vergleich zu den künstlich hohen Raten in 2D-Kultur erreicht. Wie Proliferation bei der Beurteilung der Wirksamkeit von Medikamenten ist ein wichtiger Parameter, Drogentests ist in unserem Modell ermöglicht in ähnlicherBedingungen in vivo Tumoren 17.

Um das Potenzial unseres Modells zu bewerten Biomarker-abhängige Wirksamkeit von Medikamenten , korrekt vorherzusagen, wir hier vorliegenden Daten für zwei verschiedene Lungenkrebszelllinien , die in ihrem EGFR -biomarker Status unterscheiden. Dieser Mutationsstatus hat begonnen routinemßig in NSCLC-Patienten bestimmt werden. Gezielte Behandlungen mit TKI wie der EGFR -Inhibitor Gefitinib gegen Tumoren eine aktivierende EGFR - Mutation zeigen hervorragende Ergebnisse tragen im Vergleich zu denen mit einer platinbasierten Chemotherapie 18-21.

Wir stellten verschiedene Techniken Auslesen, die zur Bewertung der Wirksamkeit Verbindung relevant sind. Weiterhin wird nach TGF-beta-1 - Stimulation sind wir in der Lage Verbindung Aktionen in Tumorzellen zu untersuchen, die die EMT - Prozess gestartet, der angenommen wird , ein wichtiger Schritt in der malignen Transformation 22,23 zu sein , und die mit dem Drogen resistan verbunden istce 24.

Das 3D-Modell Tumor ermöglichen die Überwachung zellspezifische Antworten auf gezielte Behandlungen, Chemotherapie oder Medikamentenkombinationen mit guten Kontrasten. Zur weiteren Verbesserung und Drogen-Screening zu beschleunigen und Widerstand zu begegnen, wird dies durch eine in silico Simulation ergänzt. Basierend auf einigen Versuchen kann der Tumor - Antwort in silico vorhergesagt werden , in Bezug auf das Ergebnis für eine breite Palette von Medikamenten und deren Kombinationen.

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Protocol

1. Zweidimensionale (2D) Cell Culture

  1. Im Handel Tumorzelllinie HCC827 (DSMZ) zu erhalten. Kultur der Lunge Adenokarzinom - Zelllinie HCC827 (EGFR mutierten KRAS - Wildtyp) in RPMI-1640 mit 20% FCS ergänzt. Ändern Sie das Medium alle 2 - 3 Tage. Teilen die Zellen zweimal in der Woche. Zellen verwendet werden, bis Kanal 20 erreicht ist.
  2. Im Handel Tumorzelllinie A549 (DSMZ) zu erhalten. Kultur der Lungenkarzinomzelllinie A549 (EGFR Wildtyp - KRAS mutiert) in RPMI-1640 mit 10% FCS ergänzt. Führen Sie die Kultur wie oben angegeben. Zellen verwendet werden, bis Kanal 20 erreicht ist.
  3. Testen Sie die Zellen regelmäßig (alle 4 - 6 Wochen) für Verunreinigungen wie Mykoplasmen-Kontaminationen.
  4. Die Kultivierung A549 oder HCC827 Zellen auf Glasplättchen
    1. Platz 1 sterile Deckglas in jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte mit einer Pinzette verwenden.
    2. Seed 50.000 Tumorzellen von beiden Zelllinien in einem Volumen von 500 & mgr; l in den Wells mitdie Glasplättchen sind.
    3. Kultur die Zellen bis zum Erreichen einer Konfluenz von 70% unter Standardkulturbedingungen (37 ° C, 5% CO 2). Während dieser Zeit absaugen das alte Medium mit einer Pasteurpipette und fügen 500 ul frisches Medium alle 2 - 3 Tage der Kultur.

2. Erzeugung von Tumor-Testsysteme auf einem biologische Kollagengerüsts

  1. Statische Kulturbedingungen
    1. Generieren Sie die dezellularisierter kleinen Darm-Submukosa + Schleimhaut (SISmuc) und befestigen Sie es zwischen zwei Metallringen, die so genannten Zelle Kronen, wie 25 in einer früheren Veröffentlichung beschrieben.
    2. Seed 100.000 Zellen entweder HCC827 oder A549-Zellen in einem Gesamtvolumen von 500 & mgr; l auf die Seite des ehemaligen Lumens des Darms in Zellkronen befestigt.
    3. Erlauben Tumorzellen 2 Stunden lang bei 37 ° C, 5% CO 2 anhaften. 1 ml Medium innerhalb der Zelle Krone und 1 ml außen.
    4. Kultur der TumorModell unter statischen Bedingungen bei 37 ° C, 5% CO 2 im Inkubator für 14 Tage. Ändern Kulturmedium alle 2 - 3 Tage. Daher aspirieren das Medium mit einer Pasteurpipette und Pipette 1 ml frischem RPMI mit der entsprechenden Menge von FCS mit (A549: 10%, HCC827: 20%) innerhalb der Zelle Krone und 1,5 ml des gleichen Mediums außerhalb.
  2. Dynamische Kulturbedingungen
    1. Stellen Sie den Tumortestsystem mit der dezellularisierter Matrix innerhalb der Zelle Kronen und Zellaussaat auf, als nach Absatz 2.1.1 bis 2.1.3 beschrieben.
    2. Kultur der Tumormodell unter statischen Bedingungen 37 ° C, 5% CO 2 im Inkubator für 3 Tage.
    3. Montieren Sie den autoklaviert Bioreaktor und legen Sie die ausgesäten SISmuc wie zuvor 25 veröffentlicht.
    4. Pipette 45 ml RPMI mit der entsprechenden Menge von FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) in den Kolben und verbinden die nadelfreie Probenahmevorrichtung zu dem Rohrsystem zwischen dem Bioreaktor und derMedium Kolben.
    5. Setzen Sie den Bioreaktor in den Inkubator, schließen Sie es an die Pumpe und die Kultur der Tumormodell für weitere 14 Tage mit einer konstanten Mediumstrom (3 ml / min) bei 37 ° C, 5% CO 2.
    6. Ändern Sie den gesamten Kulturmedium nach 7 Tagen. Dazu bewegen Sie den Bioreaktor aus dem Inkubator unter einer Laminar-Flow-Haube. Saugen Sie das Medium in den Medien Kolben mit einer Pasteurpipette. Heben Sie den Bioreaktor, während Ansaugen des Mediums, in dem Schlauchsystem loszuwerden. Pipette 45 ml frisches Medium in den Kolben. Setzen Sie den Bioreaktor wieder in den Inkubator und verbinden Sie es mit der Pumpe.

3. Behandlung des statischen Tumormodell mit Gefitinib

  1. Kultur der Tumormodell wie in Abschnitt 2.1 beschrieben.
  2. Am Tag 11 der Kultur, RPMI / FCS mit 1 uM Gefitinib (2,5 ml für jede Zelle Krone) vorzubereiten. Saugen Sie das alte Medium aus den Vertiefungen mit einer Pasteurpipette und 1 ml vorbereitet RPMI / FCS / Gefitinib innen ter Zell Krone und 1,5 ml des gleichen Mediums außerhalb.
    HINWEIS: Die aufgetauten Gefitinib Stammlösung kann für eine Woche bei 4 ° C gelagert werden.
  3. Ändern Sie das Medium am Tag 13, wie unter Ziffer 3.2 beschrieben.

4. Die Stimulation des statischen Tumormodell mit TGF-beta-1 für EMT Induction

  1. Kultur der Tumormodell wie in Abschnitt 2.1 beschrieben.
  2. Am Tag 3 der Kultur, RPMI / FCS mit 2 ng / ml TGF-beta-1 mit dem Träger (2,5 ml für jede Zelle Krone) vorzubereiten. Saugen Sie das alte Medium aus den Vertiefungen mit einer Pasteurpipette und 1 ml vorbereitet RPMI / FCS / TGF-beta-1 im Inneren der Zelle Krone und 1,5 ml des gleichen Mediums außerhalb. 3 Tage bis zum Tag 14, wie unter 4.2 beschrieben - Änderungsmedium mit TGF-beta-1 alle 2 ergänzt.

5. Lesen-outs

  1. Entnahme von Proben für ELISA - Messungen
    1. Nehmen Sie Proben aus den Überständen von statischen (Abschnitt 2.1) und dynamisch (Abschnitt 2.2) Kultur währendBehandlung mit Gefitinib (Abschnitt 3) an den Tagen 11-14 der Kultur , wie in Abbildung 2 dargestellt. Zusätzlich nehmen eine Probe vor der Behandlung (T0).
    2. Unter statischen Kulturbedingungen, nehmen 100 ul Probe aus dem Inneren der Zelle Krone. Unter dynamischen Kulturbedingungen, schrauben Sie die Spritze an der Probenahmevorrichtung und nehmen Sie 1 ml Medium aus dem Bioreaktor-System. Speichern aller gesammelten Überstände bei -80 ° C, bis der ELISA durchgeführt wird.
  2. M30-ELISA für Apoptosis Quantifizierung
    1. Zur Quantifizierung der Apoptose in den Überständen der Zelltod-Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers durchzuführen. Alle Reagenzien RT zu erreichen, bevor der Test durchgeführt wird.
    2. Vortex alle Reagenzien. Man löst den Waschtablette in 500 ml frischem entionisiertem Wasser. Verdünnen HRP-Konjugat mit 9,2 ml Konjugat-Verdünnungspuffer und mischen. Pipette 25 ul Standard oder Probe pro Vertiefung.
    3. In 75 ul des verdünnten HRP ConjuGate-Lösung pro Vertiefung. Decken Sie die Platte und Inkubation auf einem Schüttler für 4 Stunden bei RT. Waschen Sie die Platte manuell, 5-mal mit 250 ul Waschlösung vorbereitet.
    4. In 200 ul 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) Substrat in jede Vertiefung. Inkubieren im Dunkeln bei RT für 20 min. In 50 ul Stopplösung in jede Vertiefung geben. Schütteln Sie die Mikrotiterplatte für 10 Sekunden und lassen Sie die Mikrotiterplatte für 5 min vor der Ermittlung der Absorption. Bestimmung der Extinktion bei 450 nm in einem Mikroplatten-Lesegerät. Berechnen Sie die Standardkurve und die Konzentrationen in den Proben ein geeignetes Programm für den Umgang mit ELISA-Typ Daten wie Herkunft.
  3. Beispiel Anfärben
    1. Befestigung, Paraffineinbettung und Schnittpräparation des 3D - Modells
      1. Befestigen Sie den ausgesäten SISmuc unter Verwendung von 2,5 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) pro Zelle Krone für 2 Stunden und binde sie in Paraffin
      2. Bereiten Sie 3 um Gewebeschnitte für die Färbung wie zuvor veröffentlicht25.
    2. Fixierung von Zellen gezüchtet in 2D Kulturbedingungen
      1. Bei 70% Konfluenz erreicht ist, waschen Sie die Zellen kultiviert auf Glasplättchen in 24-Well-Platte einmal mit PBS und fixieren Sie diese mit 500 ul 4% PFA / gut 10 min.
      2. Entfernen PFA und speichern die Deckgläser in der Well-Platte bedeckt mit PBS bei 4 ° C bis zur Färbung durchgeführt wird.
    3. H & E - Färbung
      1. Beflecken die rehydratisierten Schnitte mit Hematoxylin / Eosin als Übersicht Färbung nach Standardprotokollen.
    4. Immunfluoreszenzfärbung des 3D - Modells
      1. Für Immunfluoreszenzanfärbung, führen Sie eine Antigen-Retrieval die deparaffinierten und rehydriert Dias in einem Dampfgarer mit vorgewärmter Citratpuffer (pH 6,0) für 20 Minuten, indem.
        HINWEIS: Siehe Tabelle von Material und Ausrüstung, die für Citratpuffer vorbereitet.
      2. Die Objektträgerzu dem Waschpuffer (0,5 M PBS-Puffer + 0,5% Tween), Kreisabschnitte mit einem PAP Stift das erforderliche Volumen für Färbelösungen und Objektträger in einer Feuchtekammer zu minimieren.
      3. Block Gewebeschnitte mit 5% Serum von der Wirtsspezies der sekundären verwendeten Antikörper im Unterabschnitt 5.3.4.6 für 20 min bei RT.
      4. Entfernen Sie blockiert Serum vorsichtig die Folien zu einem Papiertuch klopfen und Anwendung der primären Antikörpers an die eingekreisten Abschnitte in einer Verdünnung gemäß den Anweisungen des Herstellers (Kaninchen anti Ki67 1: 100, Kaninchen anti Vimentin 1: 100, Maus anti pan-Zytokeratin 1 :100). Inkubieren O / N bei 4 ° C. Für double-Färbung muss primäre Antikörper aus verschiedenen Wirtsspezies verwendet werden.
      5. werden gründlich ungebundenen Antikörper mit Waschpuffer dreimal für 5 Minuten ab.
      6. Für den Nachweis von spezifischen Antigen-Antikörper-Bindungen gelten Sekundärantikörper in der Verdünnung 1: 400 zu den Abschnitten und für 1 h bei RT inkubiert.
      7. Abwaschen unbound Antikörper mit Waschpuffer dreimal 5 min.
      8. Montieren Sie die Folien mit einem wässrigen Medium DAPI haltigen Kerne Gegenfärben und lassen Sie sie trocknen O / N.
    5. Immunfluoreszenzanfärbung von 2D - kultivierten Zellen
      1. Entfernen PBS und decken die ausgesäten Glasplättchen mit 0,2% Triton-X100 in PBS für 5 min zur Permeabilisierung. Waschen der Glasdeckgläser mit Waschpuffer (0,5 M PBS-Puffer + 0,5% Tween) für 5 min.
      2. Führen Sie die Schritte 5.3.4.3 bis 5.3.4.7. Führen Sie alle Schritte in der Well-Platte auf einem Wippschüttler und entfernen Reagenzien durch Umdrehen der Platte.
      3. Zur Montage einen Tropfen wässrigen Medium vor Ort DAPI haltigen Kerne auf einem unbeschichteten Glasträger auf Gegenfärben und das Deckglas, um es mit den Zellen übertragen das Eindeckmedium mit einer Pinzette gegenüber. Lassen Sie es trocknen, bevor Bildgebung.
  4. Bestimmung der Proliferationsindex
    1. Führen Sie ImmunofluoreszenzAnfärbung gegen Ki67 gemäß Abschnitt 5.3.4. oder 5,3 5.
    2. Nehmen Fluoreszenzbilder der Gewebeschnitte oder 2D-kultivierter Zellen mit einem inversen Mikroskop. Verwenden Sie verschiedene Filter für Bilder von DAPI-Färbungen und von Ki67 Anfärbungen nehmen. Für die Quantifizierung verwenden 10 Bilder von 3D-Abschnitte oder 5 Bilder von 2D-Kulturen (Vergrßerung 20X) jeder Bedingung von nicht überlappenden Teilen der Probe.
    3. Bestimmen Sie Anzahl der Kerne und die Anzahl der Kerne positiv für Ki67 in 2D
      1. Graf Ki67 positive Kerne manuell über das Plugin Zellzähler der Software Fiji 26. Daher öffnen Sie das Bild und klicken Sie auf "Plugins" → "Analyze" → "Cell Counter". Drücken Sie auf "Initialisieren" und einen Zählertyp auswählen. Klicken Sie auf jedes Ki67 positiven Kern. Die Anzahl der Klicks ist neben dem ausgewählten Zählertyp gezeigt.
      2. Für die automatische Zellzählung der Gesamtzahl der Kerne mit einem Makro Fidschi 27,28 erstellen. Adjust das Makro für jede Färbung und Zelllinie. siehe folgenden wird ein Beispiel, wie ein Makro zu erstellen.
        1. Starten Sie Makro-Rekorder. Öffnen Sie eine DAPI-Bild und wandelt es in 8-Bit-Format, das von "Bild" → "Typ" → "8-Bit" klicken. Klicken Sie auf "Kontrast verbessern", stellen Sie "gesättigt" als "1" und "normalisieren".
        2. Set "Unscharf Maskieren", um das Bild zu schärfen. Verwenden Sie einen "Radius" von "1" und einer "Maske" von "0,60". Klicken Sie auf "Auto-Schwelle", wählen Sie Methode "RenyiEntropy" mit "weiße Objekte auf schwarzem Hintergrund 'das Bild zu binarise.
        3. Klicken Sie auf "Plugins" → "BioVoxxel" → "Watershed unregelmäßige Merkmale" mit einem Erosionsradius von "5", um die Zellen zu trennen. Klicken Sie auf "Analysieren" → "Analyze Particles" und stellen Sie die "Größe" auf "0,02-Infinity".
          HINWEIS: Die Anzahl der Partikel / Zellenin der Übersichtstabelle als Zählungen gezeigt.
        4. Klicken Sie auf "Erstellen" Makro für die Analyse weiterer Bilder zu speichern.
    4. Bestimmen Sie Anzahl der Kerne und die Anzahl der positiven Kerne für Ki67 in 3D manuell wie in Abschnitt 5.4.3.1 beschrieben.
    5. Berechne die mittlere Proliferationsindex (PI) entsprechend der folgenden Formel:
      Equation1
      n = Anzahl der Bilder (3D: 10, 2D: 5)

6. In Silico Tumormodellgenerierung und Simulation von Anti - EGFR - Therapie in HCC827 Zellen

  1. Netzwerk - Generation mit einer Netzwerkanalyse - Software
    1. Verwenden Sie unterschiedliche bekannte Datenbanken, um den Tumor-Netzwerk erzeugen, basierend auf den wichtigen experimentellen Ausleseparameter und die Mutations Hintergrund der HCC827 Zelllinie.
    2. Öffnen Sie die Netzwerk - Analyse - Software 21 zur Visualisierung derNetzwerk.
      1. Klicken Sie auf "Datei" → "Neu" → Typ 'JoVE_tumor Modelle' → klicken Sie auf "OK", um ein neues Netzwerk zu erzeugen. Klicken Sie auf "Platz Nahaufnahme Nord" → "OK", um den Rezeptor in einer Doppelmembran zu visualisieren. Klicken Sie auf "Generic Protein" zu visualisieren Knoten (= Proteine) als Rechtecke → Typ "EGFR" → klicken Sie auf "OK"; Wiederholen Sie das für jeden Knoten in dem Netzwerk.
      2. Beschriften Sie die Knoten im Netz: Rechtsklick → "Farbe ändern & Shape ..." → für Knoten EGFR und (EGF-EGFR) Farbcode "255,0,0" (Farbe rot); für Knoten c-MET und (c-MET) Farbcode "0,255,0" (Farbe grün); für Gefitinib Farbcode "255,255,0" (Farbe gelb); für PI3K-Inh Farbcode "204204204" (Farbe hellgrau); MEK-Inh Farbcode "102102102" (Farbe dunkelgrau); für alle anderen Knoten im Netzwerk auswählen Farbcode4; 255255255 "(Farbe weiß).
      3. Klicken Sie auf "Phänotyp" zu visualisieren Auslesen Parameter als Hexagone → Typ "Proliferation" → klicken Sie auf "OK" → Rechtsklick → "Farbe ändern und Form ..." → Farbcode "255204204" (Farbe Lachs); Wiederholen Sie diesen Vorgang für den Parameter Apoptose → wählen Sie Farbcode "255,51,204" (Farbe violett).
      4. Visualisieren Kanten (= Wechselwirkungen): Klicken Sie auf "State Transition" für Aktivierungen (Pfeile), klicken Sie auf "Hemmung" für Hemmungen (abgestumpft Pfeile); wiederholen dies für jede Interaktion in dem Netzwerk.
    3. Klicken Sie auf "Datei" → "Speichern unter ..." → Typ 'JoVE_tumor models.xml' → klicken Sie auf "Speichern", um die erzeugte Signalisierungsnetz als .xml-Format speichern.
  2. In Silico Simulation mit SQUAD
    HINWEIS: SQUAD repräsentiert the Netzwerktopologie als diskrete logische Boolesche System (AND, OR, NOT) und führt eine Steady-State-Analyse. Die stationäre Analyse spiegelt das System das Gleichgewicht und die Verantwortung auf Signalisierungs Reize (z. B. Medikamentenapplikation oder Mutation).
    1. Offene SQUAD 17 Software, klicken Sie auf "Load Network" → Upload 'JoVE_tumor models.xml' Datei. Klicken Sie auf "Run-Analyse":
      HINWEIS: Als nächstes gilt SQUAD Exponentialfunktion der Booleschen Netzwerk-Konnektivität zu interpolieren, die dynamische Simulation des Netzwerkverhaltens über die Zeit erlaubt (farbige sigmoid Aktivitätskurven).
    2. Klicken Sie auf "Erweitert" → "Perturbator", um ein Simulationsprotokoll schreiben. Simulieren anti- EGFR Widerstand: Klicken Sie auf "Edit Protocol"
      1. Klicken Sie auf "Störung" → Standard verwenden "initial = SS-4" (steady state 4) → Klicken Sie auf "Hinzufügen" hinzufügen "neue Constant Pulse '→ Select Parameter "Zustand" → Ziel wählen "FLIP" → Wählen Sie Zeit "0" → Wählen Sie Wert "0,4" → Klicken Sie auf "OK".
      2. Wiederholen Sie diesen Vorgang: Klicken Sie auf "Hinzufügen" → Parameter "Zustand" → Ziel "c-MET" → Wählen Sie Zeit "0" → Wählen Sie Wert "0,4" → Klicken Sie auf "OK"; Klicken Sie auf "Hinzufügen" → Parameter "Zustand" → Ziel wählen "Gefitinib" → Wählen Sie Zeit "0" → Wert "1" → Klicken Sie auf "OK".
      3. Stellen Sie einen Zustandswert aktiven Knoten (EGF-EGFR): Klicken Sie auf "activenode" → Klicken Sie auf "Bearbeiten" → Zustand "0.8" → Klicken Sie auf "OK"; für alle anderen Knoten: Klicken Sie auf "Bearbeiten" → Wählen Zustand "0" → "OK" klicken. Klicken Sie auf "OK", um das Protokoll zu speichern.
      4. Bestimmte Kurven: Zum Panel "Optionen" → "(EGF-EGFR)", "* (EGF-EGFR)", "* MEK", "Caspasen", "(c-MET)", "PI3K", "Gefitinib", "Apoptose", "Proliferation", "MEK-Inh" und "PI3K-Inh" für die grafische Darstellung. Klicken Sie auf "initialisieren" → "Ausführen" eine vollständige Simulation der Reaktion des Systems zu starten. Klicken Sie auf "Reset", um eine neue Simulation starten.
    3. Simulieren kombiniert PI3K und MEK-Inhibitor-Behandlung: Klicken Sie auf "Edit Protocol"
      1. Verwenden Sie Parameter demselben Knoten wie unter 6.2.2.1 beschrieben - 6.2.2.3. Klicken Sie auf "Störung" → Klicken Sie auf "Hinzufügen" hinzufügen "neue Constant Pulse '→ Parameter" Zustand "→ Ziel wählen" PI3K-Inh "→ Wählen Sie Zeit" 0 "→ Wählen Sie Wert" 1 "→ Klicken Sie auf" OK "; Klicken Sie auf "Hinzufügen"'Neue Constant Pulse' → Parameter "Zustand" → Ziel wählen "MEK-Inh" → Wählen Sie Zeit "0" → Wert "1" hinzufügen → Klicken Sie auf "OK".
      2. Klicken Sie auf "OK", um das Protokoll zu speichern. Zum Panel "Optionen": Verwenden Sie denselben Knoten für die grafische Darstellung, wie unter 6.2.2.4 beschrieben. Klicken Sie auf "initialisieren" → "Ausführen" eine vollständige Simulation der Reaktion des Systems zu starten. Klicken Sie auf "Reset", um die Simulation zu beenden.

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Representative Results

Auf der Grundlage des SISmuc Gerüst (2A bis C), haben wir ein standardisiertes Betriebsprotokoll für die Erzeugung, Stimulierung und Behandlung eines Testsystems 3D - Tumor (2D). Dieses Modell ermöglicht die Bestimmung des Proliferationsindex und die Quantifizierung der Apoptose unter Verwendung von M30-ELISA , wie jeweils in Figur 1 und Figur 3 gezeigt. 3 zeigt repräsentative H & E - Färbung von A549 und HCC827 Modelle und einem Vertreter apoptosis Messung mit Gefitinib. Die hier vorgestellten Modell ist das Beispiel von EGFR -mutated NSCLC verwendet , die erfolgreich mit gezielten Inhibitoren in der Klinik behandelt wird. Entsprechend nur -mutated die EGFR HCC827 Zellen und nicht auf die A549 - Zellen zu EGFR Hemmung durch die TKI Gefitinib in unserem Modell reagieren , wie durch den Anstieg von Apoptose untersucht. Abbildung 4 5C und D gezeigt. Auch unter dynamischen Kulturbedingungen Gefitinib hat eine starke Wirkung auf EGFR -mutated HCC827 (5D).

Abbildung 6 zeigt die Netzwerktopologie (6A) und detaillierter in silico Simulationen von anti- EGFR Therapieresistenz in HCC827 Zellen (6B, C). Das Signalisierungsnetz wurde nach bekannten Literaturdatenbanken wie HPRD, KEGG und QIAGEN (Genes & Pathways) erzeugt, was zu einer Topologie von 42 Knoten und 55 Kanten, visualisiert mit CellDesigner Software 26. Die Simulation der bekannten Treiber Mutation EGFR (in rot) und c-MET Koaktivierung (in grün, Wert ca. 0,7) zeigt eine erhöhte proliferation Rate (Lachs - Kurve) und eine verringerte Apoptoserate (violette Kurve) über die Zeit Gefitinib reflektiert (in gelb) Widerstand in HCC827 Zellen zusammen mit einer Aktivierung von MEK und PI3K (6B, dunkelgrün und Cyan) gehen. Modellierung des kombinierten PI3K und MEK - Inhibitor (dunkel und hellgrauen Kurven) führt zu einer Umkehrung des anti- EGFR Widerstandseffekt, reduziert die Proliferation und induziert Apoptose (6C).

Abbildung 1
Abbildung 1. Proliferationsrate wird in 3D reduziert , im Vergleich zu 2D - Zellkultur. Ki67-positive HCC827 Zellen (rot in A und B) wurden in 2D Zellkultur (A) und 3D - Zellkultur auf SISmuc (B) gefärbt. HCC827 Zellen und A549 - Zellen wurden gezählt und der Proliferationsindex (Prozentsatz der Ki67 - positiven Zellen) wurde (C bestimmt </ Strong>, ein Vertreter von fünf zu zählen). Maßstabsbalken in A und B:. 100 & mgr; m Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. SISmuc Scaffold Morphologie und Behandlungsschema mit der TKI Gefitinib Zellen auf der SISmuc ausgesät werden , die Dünndarm - Submukosa besteht aus (SIS) + mucosa (A:. Hellfeld-, B: DAPI gefärbte Zellen auf der Oberseite des SISmuc, C: overlay von A und B) und wird in der Zelle Kronen am Tag 0. Die Behandlungsschema ist in D gezeigt festgelegt: Medium Änderungen (MC) werden durchgeführt , alle 2 bis 3 Tage. Am Tag 11 der Behandlung beginnt. Die Überstände werden für M30-ELI gesammelt und verwendetSA , um die Apoptose über die Zeit (Blaue Pfeile und Boxen) zu quantifizieren. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Gefitinib Behandlung Änderungen Zellwachstum auf der SISmuc und induziert Apoptose in HCC827, aber nicht in A549 3D - Tumormodelle. Ohne Behandlung bilden beide Zelllinien eine Monoschicht auf der SISmuc (A und B) und auch ehemalige Krypta Strukturen regeln. Während das Wachstumsmuster von Zellen A549 nicht nach der Behandlung mit Gefitinib (C) geändert wird, wird die Anzahl der HCC827 Zellen durch eine Änderung an einem länglichen Zellform (D) begleitet reduziert. Apoptosis wird durch Gefitinib in HCC827 Modelle induziert , wie durch M30-ELISA - Messungen aus Kulturüberständen gesehen (E D:. 100 & mgr; m für A bis D Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. TGF-beta-1 induziert die EMT in HCC827 Zellen auf der SISmuc. HCC827 Zellen, die in 3D zeigen Gesamtausdruck der pan-Zytokeratin (PCK) (grün in A, a1) , sondern nur einzelne Zellen exprimieren Vimentin (rot in A, a2). Stark erhöht wird (rot in B, b2), während die Expression von PCK gehalten wird (grün in B, B1) nach TGF-beta-1 Stimulation Zellen ihre Morphologie zu einer länglichen Form und die Expression von Vimentin ändern. Maßstabsbalken in B: 100 & mgr; m für A B. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Dynamische Zellkultur Steigert Gewebebildung. Wenn unter 3D Bedingungen in einem Bioreaktor (B) kultiviert, die Monoschicht aus dem statischen Modell (A, H & E - Färbung) ändert sich von einer Monoschicht (A) zu einem mehrlagigen Gewebe (C, H & E - Färbung ). HCC827 Zellen zeigen eine starke Droge Reaktion auf Gefitinib Behandlung (D, H & E - Färbung). Maßstabsbalken in D:. 100 & mgr; m für A, C, und D Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Feige. 6. In Silico Tumormodellgenerierung und Simulation von Anti - EGFR - Therapie Widerstand. Netzwerktopologie eines Zelltumor mit Schlüssel - Signalknoten in rot (EGFR - Weg) und grün (c-MET) und ihre Downstream - Knoten. Die charakteristische Tumorauslese Parameter Proliferation (in Lachs) und Apoptose (in violett) als Sechseck dargestellt. Die Pfeile zeigen die Aktivierung, stumpfe Pfeile Hemmung. Therapeutische Ziele dargestellt werden durch dunkle und helle graue Rechtecke, die Hemmung von Gefitinib ist in gelb (A) gezeigt. Dynamical Simulation per E-Funktionen (farbige Kurven) interpoliert die Boolesche Netzwerk - Konnektivität (AND, OR, NOT). EGFR und c-MET Co-Expression verursacht Gefitinib Widerstand wie durch eine Zunahme der Proliferation (Lachs - Kurve) und Anzeige angegebenecrease der Apoptose (violette Kurve) nach etwa beliebigen Zeitpunkt 8 (B). Potenzielle Therapie befasst sich beide PI3K und MEK durch Inhibitoren (unter gelben Kurve; gleiche Aktivierung, siehe Protokoll). (C) Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Wir haben eine in vitro kombiniert etabliert / in silico Tumortestsystem für die Biomarker-gestützte Behandlung Vorhersagen. Die in - vitro - Modell bewertet verschiedene wichtige Aspekte der Verbindung Maßnahmen wie beispielsweise Veränderungen der Tumorzellproliferation und Apoptose auf einer spezifischen Mutations Hintergrund, der auch 17 in silico simuliert werden können. Hier präsentieren wir das standardisierte Protokoll für die 3D - Tumormodell Erzeugung und Verbindung Tests einschließlich Quantifizierung der Proliferation und Apoptose und die Einrichtung eines prädiktiven in silico - Modell. Das 3D-Modell Tumor basiert auf Tumorzelllinien tragen spezifische Mutationen. Die Zellen werden auf einer dezellularisierten Gewebematrix in Zell Kronen gezüchtet. Matrix Dezellularisierung, Fixierung zwischen den beiden Metallringe (Zell Kronen), des Bioreaktorsystems Zusammenbauen sowie seeding des Gerüsts wurden , bevor 25 in JoVE visualisiert.

in vitro 3D - Tumormodell
Die Übersetzung der hier erzielten Ergebnisse in die Klinik erfordert eine sorgfältige Auswahl geeigneter Tumorzellen Mutationen von Interesse, um Lager Patienten für ausgewählte zielgerichtete Medikamente nach Biomarkern zu klassifizieren. Für geschichtete Medizin, die Identifizierung von druggable Fahrer Mutationen durch Sequenzierung der nächsten Generation ist ein wichtiges Anliegen vor allem in NSCLC und wird hoffentlich neue genetische Marker in der Zukunft 29 offenbaren. Für in - vitro - Tests, sollte die Verbindung von Interesse zielen auf eine Website , die sehr aktiv in der gewählten Zelllinie oder in Primärzellen ist. Hierbei wurden die Zelllinien HCC827 und A549 ausgewählt aufgrund ihrer Differenz in EGFR - Mutationsstatus und berichtet Überempfindlichkeit (HCC827 Zellen) und Zwischen Empfindlichkeit (A549 - Zellen) in Richtung der TKI Gefitinib in 2D Kultur 30-32. In dem ersten Schritt der Modellerzeugungs 3D Tumorzellzahl und die Kulturdauer des ausgewählten Tumor-Zellen werden ADJUsted wenn Zellen unterscheiden sich von den hier genannten verwendet werden. Um die optimale Konzentration der Verbindung zu finden, ist es ratsam, den IC50-Wert mit Hilfe eines handelsüblichen Lebensfähigkeitstest in 2D zu bestimmen. Basierend auf diesem Test, sollte die Verbindung in der IC50-Konzentration und der nächst höheren Konzentration in den 3D-Modellen verwendet werden. Wir haben drei Tage der Behandlung auf die um einerseits gewählt, um Ergebnisse innerhalb von zwei bis drei Wochen erhalten und für einen einfachen Vergleich zu 2D-Tumor-Testsysteme auf der anderen Seite. Behandlungszeiten kann jedoch verlängert werden, Langzeitwirkungen zu untersuchen. Dennoch sollte beachtet werden, dass die Langzeitbehandlung oder hohen Dosierungen der getesteten Verbindung vollständigen Zellverlust verursachen kann, wodurch die Bewertung der Proliferation oder anderen immunhistochemischen Marker verhindern.

Für eine zuverlässige Signalnetzwerkanalyse, haben die Tumorreaktionen bei der Behandlung mit einer bestimmten Verbindung zu analysierenden Unterscheidung zwischen Proliferation und apoPtosis. Diese Ablesungen werden unterschiedlich in das Signalisierungsnetz angeschlossen. So unverwechselbare Analyse beider Parameter ermöglicht, ein besseres Verständnis der Arzneimittelwirkung und anschließende Ziel Vorhersage. Wie bereits erwähnt, wird die Proliferation von Tumorzellen im 3D-Modell im Vergleich zu 2D-Kulturbedingungen reduziert, und somit sollten falsch-positive Ergebnisse der getesteten zytostatischen Verbindungen reduzieren. Zur Bestimmung des Proliferationsindex, die Gesamtzahl der Kerne und die Anzahl der Kerne positiv für Ki67-Färbung haben, um die Software Fiji beispielsweise quantifiziert. Dies kann durch die Verwendung von Makros in 2D Kulturen von Tumorzellen vereinfacht werden, das ist jedoch nicht möglich, wenn die Zellen eng Aggregate bilden, wie dies in geringeren oder höheren Anzahl von Kernen führt, respectively. In allen Fällen haben die Makroeinstellungen für jede Zelllinie und Färbung sorgfältig eingestellt werden. Apoptosis können aus den Überständen Messung Caspase-gespaltenen Cytokeratin-18, quantifizierte nicht-invasiv sein which auf Zellen mit epithelialen Eigenschaften beschränkt, M30-ELISA. Dies hat mehrere Vorteile: I) Es ermöglicht die Wirksamkeit der Behandlung über die Zeit zu überwachen und den Ausgangspunkt der wirksame Behandlung zu identifizieren. II) Die Proben werden nicht zerstört und kann für andere Auslesetechniken verwendet werden. III) Epithelial-Zell-Apoptose kann aus mesenchymalen Apoptose zu unterscheiden, die in Kokultur Einstellungen optimal ist. Diese Technik könnte jedoch für Tumorzellen ungeeignet sein, die EMT unterzogen, wodurch ihre epithelialen Phänotyp zu verlieren. Somit ist es durch Immunhistochemie nachgewiesen werden die Expression von Cytokeratin 18 jeder Tumorzelllinie verwendet werden, sollten vor diese Technik angewendet wird. Testen von Verbindungen können auch in einer Tumorstammzell-Phänotyp durchgeführt werden. Normalerweise in Drogentests verschiedene invasive Stadien werden vernachlässigt, obwohl die meisten der gezielten Medikamente wie TKI sind in fortgeschrittenen Tumorstadien angewendet. Unser Modell ermöglicht die Untersuchung von invasiven oder nichtn-invasive Tumorzellen, die aufgrund der erhaltenen Basalmembran 17 , die die Zellen während des Invasionsprozess zu überqueren. Ein entscheidender Schritt zur Zellmotilität und Invasivität ist EMT , die in verschiedenen Lungenkrebsmodell durch Stimulation mit TGF-beta-1 17,33 induziert werden kann. Dies verringert jedoch die Proliferation und dadurch die Zellzahl auf dem Gerüst. Diese negative Nebenwirkung kann durch die Anwendung von dynamischen Kulturbedingungen umgangen werden, die stark Tumorzelldichte in den 3D-Modellen erhöht. Auch wenn der Bioreaktor - Kultur auf physiologische Bedingungen einstellt, muss berücksichtigt werden , dass die Zelleigenschaften und Signalisierung kann durch die Belichtung beeinflußt werden Stress 25 abzuscheren.

In Silico Simulationen Testing zu beschleunigen Zellen--line-spezifischen Drug
Obwohl nur semi-quantitativ ist , wird die Folge von Ereignissen die von unserem in silico - Modell modelliert Sorgfaltvollständig unter Berücksichtigung der für jede spezifische Zelllinie bekannten Mutationen. Dazu gehören Zelllinie spezifische Modifikationen der verschiedenen Rezeptoraktivierung Ebenen beteiligt das Ausmaß, in dem Kinasen aktiviert werden und wann und wie lange Netzausgang wie Apoptose oder Proliferation zu erwarten ist. Zum Beispiel kann eine klinisch bekannten c-MET - Amplifikationen berücksichtigen , die in etwa 20% der erworbenen Anti - EGFR - Therapie Widerstand 30 auftreten , werden gedacht. Anschließend wird die in - silico - Modell , um die entsprechenden Netzwerkverhalten über die Zeit berechnet, z. B. Entwicklung Gefitinib Widerstand erhöhte Proliferation dargestellt und verringerte Apoptose. In unserem Modell haben wir festgestellt MEK und PI3K als die vielversprechendsten Zielkandidaten. Folglich neue potentielle therapeutische Kombination kann schnell in silico vorab ausgewertet, die für weitere in - vitro - Tests als Grundlage dient. Darüber hinaus können die Ausgangsdaten von in vitro Experimentenverwendet werden , die in silico - System durch die Netzeinstellungen zu verfeinern, die die experimentellen Ergebnisse am besten passen. Semi-quantitative in silico Strategien haben einige Einschränkungen in Bezug auf die Netzwerkgröße (ca. 100 Protein-Protein - Wechselwirkungen betrachtet werden kann). Darüber hinaus ist es wichtig, alle wichtigen Protein-Knoten in der Netzwerktopologie zu integrieren, um realistische Ergebnisse zu erhalten. Die in silico - Modell gibt also nur eine Annäherung an das bestehende Netzwerk in der lebenden Tumorzelle. Allerdings wird dieser fokussierte Sicht ermöglicht es uns , spezifische Änderungen von Interesse zu simulieren, z. B. die Wirkung von Medikamenten - Kombinationen auf verschiedenen Mutationshintergründe in der Zell-Linie. Dies hilft uns, systematisch die Komplexität solcher Krebssignalnetzwerke zu verstehen, sowie neue therapeutische Strategien abzuleiten.

Abschließend sind wir überzeugt , dass wir eine hilfreiche Gewebezüchtungen in vitro - Tool entwickelt , das leicht in precli integriert werden könntennische Prüfung auf Wirksamkeit einzelner Arzneimittelverbindungen und deren Kombinationen. Um Kosten und Zeit bei der Prüfung zu reduzieren, wird dieses Tumormodell weiterhin ergänzt durch ein in silico Vorhersage - Tool ermöglicht die Daten zu erweitern , um eine zelltypspezifische Vorhersage von Drogen- und Medikamentenkombination Effekte einschließlich Klinik orientierte zielgerichtete Therapien oder neue Spieler gesammelt zu betrachten (z. B. miRNAs).

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde durch das Zentrum für Interdisziplinäre Klinische Forschung (IZKF, Zuschuss BD247) der Universitätsklinik Würzburg und der Bayern Fit-Programm (erteilt Heike Walles) gefördert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioreactors Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) Bioreactor setup
BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji) Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox
Cell crowns Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) for static 3D culture
CellDesigner http://www.celldesigner.org/ - This software was used for drawing the network.
Citrate buffer stock solution (10x) in house production 42 g/L Citric acid monohydrate, 17.6 g/L Sodium hydroxide pellets in deionized water, pH 6.0, stored at RT. 
Citrate buffer working solution in house production 10% Citrate buffer stock solution in demineralized water, stored at RT.
Citric acid monohydrate VWR, Darmstadt (GER) 1002441000 used for the citrate buffer
Cover slips VWR, Darmstadt (GER) 631-1339
DAPI Fluoromount-GTM SouthernBiotech, Birmingham (USA) SBA-0100-20
Databases such as KEGG, HPRD and QIAGEN (Genes & Pathways) http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ - Different known literature databases were used for generating the network topology.
Female Luer Lug Style Tee Mednet, Münster (GER) FTLT-1 Bioreactor setup
Female Luer Thread Style with 5/16" Hex to 1/4-28 UNF Thread Mednet, Münster (GER) SFTLL-J1A  Bioreactor setup
Fetal Calf Serum Bio&SELL, Feucht (GER) FCS.ADD.0500 not heat-inactivated
Gefitinib Absource Diagnostics GmbH, München (GER) S1025-100 mg 100 mM stock solution with DMSO
Glas flask (Schott, GER) provided with glas hose connection Weckert, Kitzingen (GER) custom made
Histofix 4% (Paraformaldehyd) Carl Roth, Karlsruhe (GER) P087.1
Hose coupling Mednet, Münster (GER) CC-9 Bioreactor setup
Incubator for bioreactors Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) Bioreactor setup
M30 CytoDeathTM ELISA Peviva, Bromma (SWE) 10900
Male Luer Integral Lock Ring Mednet, Münster (GER) MTLL230-J1A Bioreactor setup
Moisture chamber custom made
Mouse anti Pan-Cytokeratin Sigma-Aldrich, Munich (GER)   C2562-2ML Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3 +M20+A53-B/A2, used 1/100 for immunofluorescence
Needlefree Swabable Valve Female Luer Mednet, Münster (GER) NVFMLLPC Bioreactor setup, for sampling, gamma-sterilized
O-Ring MVQ 10 red 37 x 3 mm Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) 21444 O-ring large, Bioreactor setup
O-Ring MVQ 70 red 27 x 2.5 mm Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) 19170 O-ring small, Bioreactor setup
PAP pen Dako, Hamburg (GER) S002
Paraffin Carl Roth, Karlsruhe (GER) 6642.6
Peristaltic pump Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER) Bioreactor setup
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich, Munich (GER)   D8537-6x500ml
Pump tubing cassette Ismatec, Wertheim (GER) IS 3710 Bioreactor setup
Rabbit anti Ki67 Abcam, Cambridge (UK) ab16667 Clone SP6, used for 1/100 for IF
Rabbit anti Vimentin Abcam, Cambridge (UK) ab92547 used 1/100 for IF
RPMI-1640 medium Life technologies, Darmstadt (GER) 61870-044 warm in 37 °C waterbath before use
Silicone tube Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER) HC66.1 Bioreactor setup
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich, München (GER) 30620-1KG-R used for the citrate buffer
SQUAD http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm - This software was used for performing the semiquantitative simulations.
Sterile air filter, pore size 0.2 µm Sartorius Stedium Biotech, Göttlingen (GER) 16596-HYK Bioreactor setup
Syringe Luer Lok 5 ml BD Biosciences, Heidelberg (GER) 309649 for bioreactor sampling
Tissue culture test plates: 6-,      12-, 24-, 96- well TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER) 92006, 92012, 92024, 92048 
Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) with carrier Cell Signaling, Frankfurt (GER) 8915LC stock solution in sterile citrate buffer pH 3.0
Triton X-100 Sigma-Aldrich, München (GER) X100-1L
Tween-20 Sigma-Aldrich, München (GER) P7949-500ml for washing buffer of immunofluorescent staining

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