मॉडल प्रोटीन एक का उपयोग करने में noncanonical एमिनो एसिड के अवशेषों से विशिष्ट निगमन

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Worst, E. G., Exner, M. P., De Simone, A., Schenkelberger, M., Noireaux, V., Budisa, N., Ott, A. Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System. J. Vis. Exp. (114), e54273, doi:10.3791/54273 (2016).

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Abstract

एमिनो एसिड की विहित सेट प्रोटीन कार्यक्षमता की एक असाधारण व्यापक रेंज की ओर जाता है। फिर भी, अवशेषों के सेट अभी भी संभावित प्रोटीन आवेदनों पर सीमाओं लगाता है। noncanonical अमीनो एसिड के समावेश इस दायरे के विस्तार कर सकते हैं। वहाँ noncanonical अमीनो एसिड के समावेश के लिए दो पूरक दृष्टिकोण हैं। साइट विशेष समावेश के लिए, अंतर्जात विहित translational मशीनरी के अलावा, एक orthogonal अमीनोएसिल-tRNA-synthetase-tRNA जोड़ी है कि विहित लोगों के साथ बातचीत नहीं करता है प्रदान की जानी चाहिए। नतीजतन, एक कोडोन कि एक विहित एमिनो एसिड है, आमतौर पर एक रोकने के कोडोन को नहीं सौंपा है, यह भी आवश्यक है। यह आनुवंशिक कोड विस्तार प्रोटीन के भीतर एक एकल, दिया साइट पर एक noncanonical एमिनो एसिड के समावेश सक्षम बनाता है। यहाँ प्रस्तुत काम अवशेषों से विशिष्ट समावेश जहां आनुवंशिक कोड अंतर्जात translational प्रणाली के भीतर फिर नियत किया जाता है वर्णन करता है। अनुवाद मशीनरी एकएक किराए की शास्त्रीय विधि निर्धारित स्थानों, यानी इसे शामिल करने के लिए के रूप में noncanonical एमिनो एसिड ccepts, प्रोटीन में एक विहित एमिनो एसिड की सभी घटनाओं noncanonical एक से बदल रहे हैं। noncanonical अमीनो एसिड के समावेश प्रोटीन संरचना को बदल सकते हैं, भौतिक और रासायनिक गुणों काफी संशोधित कारण। Noncanonical एमिनो एसिड analogs अक्सर अभिव्यक्ति मेजबान टीम के लिए सेल के विकास अवरोधकों के रूप में कार्य के बाद से वे अंतर्जात प्रोटीन, संशोधित करने, विवो प्रोटीन के उत्पादन में सीमित। प्रोटीन में विषाक्त noncanonical अमीनो एसिड के vivo समावेश विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण बनी हुई है। इधर, noncanonical अमीनो एसिड एल canavanine द्वारा एल arginine की एक पूरी प्रतिस्थापन के लिए एक सेल मुक्त दृष्टिकोण प्रस्तुत किया है। यह इन विवो अभिव्यक्ति के निहित कठिनाइयों में गतिरोध उत्पन्न। इसके अतिरिक्त, जन वर्णक्रम विश्लेषण के लिए लक्ष्य प्रोटीन तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल शामिल है। यह दिखाया गया है कि एल एल लाइसिन हाइड्रोक्सी लाइसिन द्वारा बदला जा सकता है,कम क्षमता के साथ यद्यपि। सिद्धांत रूप में, किसी भी noncanonical एमिनो एसिड अनुरूप जब तक अंतर्जात इन विट्रो अनुवाद प्रणाली इसे पहचानता के रूप में प्रस्तुत विधि का उपयोग शामिल किया जा सकता है।

Introduction

आनुवंशिक कोड जीवमंडल के लिए सार्वभौमिक है। यह 20 विहित अमीनो एसिड का एक सेट है, जो कभी कभी selenocysteine ​​1 या 2 pyrrolysine द्वारा बढ़ाया है के लिए कोड। यह राइबोसोम कि एमिनो एसिड की श्रृंखला है कि प्रोटीन में गुना में tRNAs की मदद से जेनेटिक कोड में तब्दील हो गया है। विहित अमीनो एसिड के कार्य समूहों, posttranslational संशोधनों के साथ संयोजन में, प्रोटीन समारोह 3,4 की एक असाधारण विस्तृत श्रृंखला के लिए योगदान करते हैं। सिद्धांत रूप में, विहित अमीनो एसिड के सीमित सेट के कारण कार्यात्मक सीमाओं आगे को शामिल करके दूर किया जा सकता है, noncanonical अमीनो एसिड (ncAAs) कि नए chemistries और नए कार्यक्षमताओं 3,4 सक्षम करें।

साइट- या छाछ-विशिष्ट समावेश: वहाँ ncAAs के समावेश के लिए दो पूरक दृष्टिकोण हैं। पूर्व विधि काफी तकनीकी कठिनाइयों पर जोर देता है, अमीनोएसिल-tRNA-synth के विहित सेट के बाद सेetases (Aars) और tRNAs एक orthogonal Aars-tRNA जोड़ी है कि अंतर्जात अनुवाद मशीनरी के साथ बातचीत नहीं करना चाहिए द्वारा विस्तारित किया जाना चाहिए। सावधान इंजीनियरिंग के आधार पर, इस दृष्टिकोण वांछित प्रोटीन साइटों पर एकल बिंदु उत्परिवर्तन के रूप में शामिल किया गया है ncAAs। NcAAs की साइट विशिष्ट समावेश आनुवंशिक रूप से एक कोडोन कि एक विहित एमिनो एसिड (सीएए), आम तौर पर 5-9 कोडोन एक रोकने के लिए नहीं सौंपा है के द्वारा इनकोडिंग है। इस विधि को नहीं बल्कि पूरे प्रोटीन 10-13 भर से एक दिया साइट पर समारोह में परिवर्तन पर जोर देता।

इसके विपरीत, छाछ-विशिष्ट समावेश विहित अनुवाद मशीनरी द्वारा noncanonical अमीनो एसिड की गलत मान्यता पर निर्भर करता है। समावेश Aars की सब्सट्रेट विशिष्टता की कमी के कारण होता है। NcAAs के अवशेषों से विशिष्ट समावेश, कोहेन और सहकर्मियों 14 के काम पर बनाया गया है, महत्वपूर्ण अनुप्रयोगों 3,10, उन के बीच में प्रोटीन की जैव orthogonal लेबलिंग 15-17 के लिए प्रेरित कियाया संरचना एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी 18 में प्रोटीन की व्याख्या।

प्राकृतिक Aars आम तौर पर एक isostructural एनसीएए पर उनके आत्मीय अमीनो एसिड, विवो अवशेषों से विशिष्ट समावेश में कुशल पसंद करते हैं जैसा कि आमतौर पर एक auxotrophic अभिव्यक्ति मेजबान एनसीएए का विहित अनुरूप synthesizing करने में सक्षम नहीं की आवश्यकता है। मेजबान कोशिकाओं मध्यम विकास है कि केवल अनुरूप CAA के एक कम एकाग्रता उद्धार में खेती कर रहे हैं। एनसीएए के साथ लगातार पूरकता के साथ संयोजन में अपनी थकावट अभिव्यक्ति मेजबान एकाधिक, शास्त्रीय विधि निर्धारित स्थलों पर मॉडल प्रोटीन में एनसीएए शामिल करने के लिए मजबूर करता है। साइट विशेष दृष्टिकोण के विपरीत, यह आम तौर पर पूरे प्रोटीन संरचना पर गहरा प्रभाव पड़ता है, अग्रणी काफी प्रोटीन 19,20 के भौतिक और रासायनिक गुण संशोधित करने के लिए है। हालांकि, ncAAs के सबसे अभिव्यक्ति मेजबान 3 के लिए विकास निरोधक, के रूप में वे कई अन्य prot में शामिल कर रहे हैंपुनः संयोजक जीन अभिव्यक्ति के दौरान ब्याज के उन लोगों के अलावा Eins। यह स्पष्ट रूप से इन विवो दृष्टिकोण को सीमित करता है। अमीनो एसिड होता है जो विषाक्त कर रहे हैं या प्रोटीन संरचना पर मजबूत प्रभाव है की इन विवो समावेश विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण बनी हुई है। हालांकि, इन अणुओं असाधारण कार्यों के साथ प्रोटीन इंजीनियर को सबसे होनहार में से एक हैं।

एक उदाहरण विषैले, noncanonical, स्वाभाविक रूप से होने वाली एल canavanine (कर सकते हैं), एल arginine (ARG) के एक अनुरूप है। यह प्रभावित करता है और ब्लॉक संबंधित विनियामक और उत्प्रेरक प्रतिक्रिया रास्ते ARG, और जीवित कोशिका में अपनी उपस्थिति को तत्काल मौत 3,21-23 के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। Arginine पदों पर प्रोटीन में अपने शामिल प्रोटीन स्थिरता 21-23 को कम कर सकते हैं। जिसके परिणामस्वरूप विषाक्तता के कारण, कोलाई (ई कोलाई) और अन्य आम अभिव्यक्ति मेजबान में प्रोटीन युक्त canavanine की अभिव्यक्ति के लिए एक चुनौती बनी हुई है। इन कारणों के लिए, पूरा विवो मैंसभी Arg पदों पर कर सकते हैं की ncorporation उचित रूप से केवल एक बार 24 पुष्टि की गई है, एक सविस्तार एकल प्रोटीन के उत्पादन प्रणाली का उपयोग कर। हालांकि, कर सकते हैं एक कैंसर विरोधी एजेंट 25-27 के रूप में प्रस्तावित किया गया है, और मनुष्यों के 28 में स्व-प्रतिरक्षित बीमारियों के लिए एक उत्तेजक के रूप में। इसके अतिरिक्त, यह अपने विरोधी चयापचय, जीवाणुरोधी रोधी पर विभिन्न अध्ययनों और एंटीवायरल गुण 25 का विषय है। इन गुणों के लिए एक मांग बढ़ाने के कुशल और आसान करने के लिए प्रदर्शन को व्यक्त करने के pharmaceutic, चिकित्सा और कार्यात्मक अध्ययन के लिए प्रोटीन युक्त सकते हैं तरीकों।

हालांकि कई समस्या है कि इन विवो उत्पादन से जुड़े हैं सेल मुक्त अभिव्यक्ति सिस्टम का उपयोग कर उन्हें धोखा दिया जा सकता है, इन विट्रो अवशेषों से विशिष्ट दृष्टिकोण में ही खराब पता लगाया गया है। एक एल tryptophan अनुरूप 29 और कई ncAAs 30 की सेल मुक्त अवशेषों से विशिष्ट समावेश सूचना दी गई है। इन तरीकों में अत्यधिक effic के आधार पर कर रहे हैंient T7 शाही सेना पोलीमरेज़। T7 शाही सेना पोलीमरेज़ जीवाणुभोजी की तरह प्रतिलेखन जरूरत पर जोर देता है, जिससे अंतर्जात प्रतिलेखन की तुलना में आनुवंशिक कार्यक्षमता को कम करने।

पूरा अवशेषों से विशिष्ट सब Arg पदों पर एक मॉडल प्रोटीन में कर सकते हैं का समावेश हाल ही में 31 की सूचना मिली थी, एक सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करते हुए 32। एक ही सिस्टम की एक मामूली संशोधन दमन 33 कोडोन रोक के माध्यम से एक मॉडल के प्रोटीन में सक्षम अलग pyrrolysine analogs की साइट विशेष समावेश। नियोजित सेल मुक्त प्रणाली 31 - 33 एक सब पर आधारित है कोलाई प्रतिलेखन अनुवाद प्रणाली। - (पुनः संयोजक प्रोटीन की 1 मिलीग्राम / एमएल 0.5) 32 मूल प्रतिलेखन अनुवाद प्रतिरूपकता के ज्यादा बनाए रखते हुए फिर भी, यह कुशलता के रूप में वर्तमान जीवाणुभोजी प्रणालियों में के रूप में प्रोटीन अभिव्यक्ति सक्षम बनाता है।

इस काम में, एक विस्तृत प्रोटोकॉल पर कैसे Resid प्रदान की गई हैncAAs की UE-विशिष्ट समावेश महसूस किया जा सकता है, यह सब का उपयोग कर कोलाई सेल मुक्त प्रणाली 32। इसके अतिरिक्त, एचपीएलसी-ईएसआई जन स्पेक्ट्रोस्कोपी के माध्यम से उचित मूल्यांकन के लिए व्यक्त प्रोटीन तैयार करने के लिए आगे कदम का प्रस्ताव है। इस सेल मुक्त प्रणाली के गुणों का विस्तार करने के लिए, इस काम ही कर सकते हैं 31 की प्रकाशित समावेश का उल्लेख नहीं है, लेकिन यह भी noncanonical एल Lysine अनुरूप एल हाइड्रोक्सी लाइसिन से संबंधित नए डेटा प्रस्तुत करता है।

NcAAs के अवशेषों से विशिष्ट शामिल करने के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल एक प्रोटोकॉल हाल ही में जौव 34 में प्रकाशित का रूपांतरण है। बाद के प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे मानक एमिनो एसिड के साथ अत्यधिक कुशल सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रदर्शन करने के लिए। इसके अलावा, यह कच्चे तेल की सेल मुक्त निकालने की तैयारी, अमीनो एसिड समाधान, ऊर्जा शेयर समाधान और ऊर्जा इस दृष्टिकोण में इस्तेमाल बफर प्रस्तुत करता है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल पिछले पी की तुलना में संशोधित कदम पर केंद्रितआदेश में rotocol ncAAs के अवशेषों से विशिष्ट समावेश कर सकें। कैलिब्रेटेड pipets, कम बाध्यकारी पिपेट सुझावों और सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब तैयारी के लिए सिफारिश कर रहे हैं। बाद में, अमीनो एसिड के लिए IUPAC संक्षिप्त किया जाता है।

Protocol

सावधानी! कृपया उपयोग करने से पहले सभी प्रासंगिक सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (MSDS) से परामर्श करें। प्रयुक्त रसायनों के कई तीव्रता से विषाक्त कर रहे हैं। व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों की आवश्यकता है (Eyeshield, धूल मास्क, दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, पैंट पूरी लंबाई, बंद पैर के जूते) के साथ ही एक धूआं हुड में काम कर रहे हैं।

1. एमिनो एसिड समाधान तैयारी

  1. एनसीएए के शेयर समाधान की तैयारी (168 मिमी)
    नोट: एनसीएए का जायजा समाधान तैयारी कर सकते हैं एक उदाहरण के रूप Arg एनालॉग के लिए वर्णित है। तदनुसार अन्य ncAAs के लिए मूल्यों को अनुकूलित।
    1. एक Microbalance पर एक 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब रखें। एक 168 मिमी समाधान के 1 मिलीलीटर की तैयारी के लिए प्रतिक्रिया ट्यूब के अंदर कर सकते हैं की 46.1 मिलीग्राम वजन। एक बाँझ microspatula का प्रयोग करें। एनसीएए का एक racemic मिश्रण के लिए, शेयर समाधान की एकाग्रता दोगुना है।
    2. बाँझ DDH 2 ओ के 977 μl जोड़े अच्छी तरह से भंवर तक कर सकते हैं मैं हैn पूरा विघटन।
      नोट: 1 मिलीलीटर की कुल समाधान मात्रा के लिए, भंग एमिनो एसिड की मात्रा शारीरिक मुआवजा दिया जाना है। अमीनो एसिड से किसी के लिए, μl में इसी मात्रा में वृद्धि के रूप में मिलीग्राम ठोस मास के अनुमान से आधे 35 (100 मिलीग्राम ठोस समाधान में 50 μl की एक मात्रा ले जाएगा)। अधिकांश अमीनो एसिड इस एकाग्रता में भंग किया जा सकता है। यदि नहीं, तो पूरा विघटन तक एकाग्रता कम।
    3. सीधे तरल नाइट्रोजन में इसे फ्रीज और -20 डिग्री सेल्सियस। चेतावनी पर दुकान खंड 1.2 या फ्लैश में अमीनो एसिड समाधान की तैयारी के लिए एनसीएए शेयर समाधान का उपयोग करें! सुरक्षा के लिए, एक Eyeshield और क्रायो दस्ताने पहनना तरल से संरक्षित किया जाना नाइट्रोजन की बौछार।
  2. एमिनो एसिड समाधान की तैयारी
    नोट: एमिनो एसिड समाधान की तैयारी, अलग स्टॉक में 20 सीएएएस के एल isomers उपलब्ध कराने एमिनो एसिड नमूना का उपयोग करेंसमाधान 168 मिमी की एकाग्रता में, प्रत्येक (1.5 मिलीलीटर, HEPES / Koh, <0.1% NaN 3, पीएच 7.5 के साथ बफर), एल Leucine (140 मिमी) के लिए छोड़कर। इन स्टॉक समाधान के एक घर का बना तैयारी (KOH के साथ बफर) के लिए, इस प्रोटोकॉल 35 का पालन करें।
    1. 20 सीएएएस के शेयर समाधान गला लें (अमीनो एसिड नमूना या 35 के अनुसार तैयार) और एनसीएए के आरटी पर (धारा 1.1 में तैयार)।
    2. विगलन के बाद, अक्सर किसी भी उपजी अमीनो एसिड redissolve करने के लिए स्टॉक समाधान भंवर। जैसा कि कुछ अमीनो एसिड भंग करने के लिए कठिन हैं, पूरा विघटन तक 37 डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग ब्लॉक में उन्हें सेते हैं। Cys पूरी तरह से भंग नहीं कर सकता है। बर्फ पर सभी अमीनो एसिड की जगह Asn, पीएचई और Cys के लिए छोड़कर, - आरटी पर इन रख वर्षा से बचने के लिए।
    3. पूरी किट की एक सातवें उपयोग करने के निम्न मान का प्रयोग करें।
      नोट: उचित रूप से नीचे पैमाने छोटे संस्करणों के साथ काम करने के लिए और आगे के प्रयोगों के लिए किट के कुछ हिस्सों को बचाने के लिए। incorporat के लिए ऊपर स्केलएक बड़े पैमाने पर मॉडल प्रोटीन में ncAAs के आयन। लगातार विगलन, जो एमिनो एसिड की स्थिरता को कम करने की संभावना है को रोकने के लिए, 200 μl की मात्रा में व्यक्तिगत अमीनो एसिड स्टॉक समाधान विभाज्य। यह 200 μl विभाज्य मात्रा और विभाज्य pipetting की वजह से नुकसान के लिए कदम 1.2.4.1 खाते में इस्तेमाल किया संस्करणों।
    4. सबसे पहले, एक एमिनो एसिड मास्टर मिश्रण समाधान है कि कदम 1.2.4.3 में विभाजित किया जाएगा 3 अलग ढंग से बना एमिनो एसिड समाधान (- 1.2.7 वर्गों 1.2.5) की तैयारी को अंतिम रूप देने के लिए तैयार करते हैं। इन समाधान में, 6 मिमी पर सभी एमिनो एसिड ध्यान, लियू (5 मिमी) के लिए छोड़कर।
      1. एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में बाँझ DDH 2 हे के स्थानांतरण 1.4 मिलीलीटर। बर्फ पर रखो। प्रत्येक अमीनो एसिड स्टॉक समाधान के 175 μl जोड़ें। एक के बाद एक CAA के शेयर समाधान (जैसे, Arg) एनसीएए द्वारा प्रतिस्थापित किया जा करने के लिए (जैसे, कर सकते हैं) के लिए छोड़कर जोड़ें। अच्छी तरह से प्रत्येक इसके बाद भंवर और समाधान बर्फ पर वापस डाल दिया।
        ध्यान दें:लियू अन्य अमीनो एसिड के लिए 6 मिमी की तुलना में, 3 अलग ढंग से बना अमीनो एसिड समाधान में 5 मिमी पर है। कम एकाग्रता अभिव्यक्ति क्षमता को कम नहीं करता। 6 मिमी तक स्केलिंग के रूप में अच्छी तरह से उपयुक्त है।
      2. निम्न क्रम वर्षा से बचने के लिए एमिनो एसिड स्टॉक समाधान स्थानांतरण: आला, Arg, Asn, एएसपी, Gln, ग्लू, Gly, उनकी, इले, लिस, मौसम विभाग, पीएचई, प्रो, सेवा, thr, वैल, टीआरपी, Tyr, लियू, और Cys। नहीं (सकते हैं उदाहरण के लिए) CAA (जैसे, Arg) कि एनसीएए के अनुरूप है के शेयर समाधान जोड़ने के लिए याद रखें। अंत में, अच्छी तरह से भंवर। 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं संभव के रूप में समाधान के रूप में स्पष्ट करने के लिए।
      3. 1.35 मिलीलीटर के तीन बराबर मात्रा में इस एमिनो एसिड मास्टर मिश्रण समाधान विभाजित। 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूबों में विभाजित संस्करणों में से प्रत्येक के स्थानांतरण। उन्हें बर्फ पर रखें।
    5. एक एमिनो एसिड समाधान है कि 6 मिमी प्रत्येक की एकाग्रता में सभी 20 सीएएएस के होते हैं, लियू 5 मिमी है कि के लिए छोड़कर तैयार करें। पहली मात्रा ओ कोच 1.35 मिलीग्राम, कदम 1.2.4.3 में विभाजन, का एक परिणाम के रूप में CAA के 168 मिमी शेयर समाधान (जैसे, Arg) कि एनसीएए के अनुरूप है के 50 μl (जैसे, कर सकते हैं) जोड़ें। अच्छी तरह से भंवर।
      1. बर्फ पर वापस रख दिया। इस 1.4 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूबों में 16 μl की मात्रा में समाधान विभाज्य। ध्यान दें कि यह समाधान मात्रा लगभग 85 aliquots की ओर जाता है। इन aliquots "+ CAA" (जैसे, + Arg) लेबल।
      2. फ्लैश -80 डिग्री सेल्सियस। सावधानी तरल नाइट्रोजन और दुकान में aliquots फ्रीज! सुरक्षा के लिए, पहनना एक Eyeshield और क्रायो दस्ताने तरल नाइट्रोजन की बौछार से संरक्षित किया जाना है।
    6. एक एमिनो एसिड समाधान है कि CAA (जैसे, Arg) कि एनसीएए के अनुरूप है (उदाहरण के लिए, कर सकते हैं) के अलावा 19 सीएएएस से बना है तैयार करें। लियू (5 मिमी) के अलावा 6 मिमी की एकाग्रता के लिए प्रत्येक अमीनो एसिड जोड़ें।
      1. विभाजन का एक परिणाम के रूप में, 1.35 मिलीलीटर का दूसरा खंड के लिए बाँझ DDH 2 हे के 50 μl जोड़ेकदम 1.2.4.3 में। अच्छी तरह से भंवर और बर्फ पर वापस डाल दिया। इस 1.4 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूबों में 16 μl की मात्रा में समाधान विभाज्य। ध्यान दें कि यह समाधान मात्रा लगभग 85 aliquots की ओर जाता है। इन aliquots लेबल "- CAA" (जैसे, - Arg)।
      2. फ्लैश -80 डिग्री सेल्सियस। सावधानी तरल नाइट्रोजन और दुकान में aliquots फ्रीज! सुरक्षा के लिए, पहनना एक Eyeshield और क्रायो दस्ताने नाइट्रोजन की बौछार से संरक्षित किया जाना है।
    7. एक एमिनो एसिड मिश्रण है कि 19 सीएएएस में शामिल है और एनसीएए (जैसे, कर सकते हैं) कि विहित एक विकल्प (जैसे, Arg) तैयार करें। लियू (5 मिमी) के अलावा 6 मिमी की एकाग्रता के लिए प्रत्येक अमीनो एसिड जोड़ें। पिछले 1.35 मिलीलीटर मात्रा करने के लिए, कदम 1.2.4.3 में विभाजन, का एक परिणाम के रूप में एनसीएए का 168 मिमी स्टॉक समाधान के 50 μl (जैसे, कर सकते हैं) जोड़ें। लेबल "+ एनसीएए" (जैसे, + सकते हैं)। अच्छी तरह से भंवर और बर्फ पर वापस डाल दिया।
      1. 16 & # की मात्रा में इस 1.4 एमएल समाधान विभाज्य181; प्रतिक्रिया ट्यूबों में एल। ध्यान दें कि यह समाधान मात्रा लगभग 85 aliquots की ओर जाता है। इन aliquots "+ एनसीएए" (जैसे, + कर सकते हैं) लेबल।
      2. फ्लैश -80 डिग्री सेल्सियस। सावधानी तरल नाइट्रोजन और दुकान में aliquots फ्रीज! सुरक्षा के लिए, पहनना एक Eyeshield और क्रायो दस्ताने नाइट्रोजन की बौछार से संरक्षित किया जाना है।
        नोट: 16 μl विभाज्य कदम 1.2.5.1, 1.2.6.1 और 1.2.7.1 में इस्तेमाल संस्करणों की तुलना में pipetting की वजह से नुकसान के लिए खाते में करने के लिए आवश्यक थोड़ा अधिक है।

2. ऊर्जा बफर तैयारी

नोट: कच्चे तेल निकालने के प्रत्येक बैच अद्वितीय है और अनुकूलित Mg- की सांद्रता और कश्मीर ग्लूटामेट 34 की आवश्यकता है। कच्चे तेल निकालने विभाज्य मात्रा प्रोटीन एकाग्रता 34 पर निर्भर करता है। विभिन्न मूल्यों के लिए प्रदान की गणना टेम्पलेट (पूरक सामग्री 1) का प्रयोग करें। पूरक सामग्री 1 आंकड़ा कथा, expla में आगे के निर्देश खोजेंकैसे इस टेम्पलेट को रोजगार के लिए ining।

  1. असंशोधित प्रोटोकॉल 34 के अनुसार तैयार है और -80 डिग्री सेल्सियस पर दुकान 14x ऊर्जा समाधान और कच्चे तेल निकालने aliquots। अनुकूलित अभिव्यक्ति दक्षता 34 के लिए Mg- और कश्मीर ग्लूटामेट सांद्रता के आधार पर कच्चे तेल निकालने जांचना।
    नोट: 14x ऊर्जा समाधान की अंतिम रचना है: 700 मिमी HEPES (पीएच 8), 21 मिमी एटीपी, 21 मिमी जीटीपी, 12.6 मिमी सीटीपी, 12.6 मिमी UTP, 2.8 मिलीग्राम / एमएल tRNA, 3.64 मिमी सीओए, 4.62 मिमी NAD, 10.5 मिमी शिविर, 0.95 मिमी folinic एसिड, 14 मिमी spermidine, 420 मिमी 3-पीजीए।
  2. बर्फ पर पिघलना 100 मिमी मिलीग्राम ग्लूटामेट शेयर समाधान, 3 एम कश्मीर ग्लूटामेट शेयर समाधान, 14x ऊर्जा समाधान और 40% खूंटी-8000 मास्टर मिश्रण तैयार करने के लिए। उन्हें बर्फ पर रखें।
  3. 100 मिमी मिलीग्राम ग्लूटामेट स्टॉक समाधान के 9.18 μl, 3 एम कश्मीर ग्लूटामेट स्टॉक समाधान के 3.06 μl, 14x ऊर्जा समाधान की 21.86 μl, 40% खूंटी-8000 के 15.3 μl और 1.6 μl बाँझ DDH 2 हे एक प्रतिक्रिया ट्यूब में मिलाएं। अच्छी तरह से इस मस्तूल भंवरएर के बाद इसके अलावा मिश्रण है, और यह बर्फ पर रहते हैं।
  4. मास्टर मिश्रण (51 μl) प्रतिक्रिया ट्यूबों में 16 μl (3 aliquots) की मात्रा में विभाज्य। अक्सर पूछे जाने वाले aliquoting दौरान मास्टर मिश्रण भंवर। फ़्लैश तरल नाइट्रोजन में aliquots फ्रीज।
    नोट: 16 μl विभाज्य मात्रा के साथ ही मास्टर मिश्रण की मात्रा की तुलना में pipetting की वजह से नुकसान के लिए खाते में करने के लिए आवश्यक थोड़ा अधिक है।
  5. ऊर्जा बफर नलियों इकट्ठा करने के लिए एक झरनी का प्रयोग करें। -80 पर नलियों स्टोर डिग्री सेल्सियस। चेतावनी! पहनें एक Eyeshield और क्रायो दस्ताने नाइट्रोजन की बौछार से संरक्षित किया जाना है।

3. तैयारी और सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं का निष्पादन ncAAs के अवशेषों से विशिष्ट निगमन के लिए

  1. सबसे पहले, DDH 2 ओ में डीएनए वेक्टर समाधान तैयार
    1. अत्यधिक कुशल प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए, अभिव्यक्ति वेक्टर pBEST-or2-OR1 पीआर-UTR1-deGFP-T500 32 का उपयोग करें। जीन क्लोन है कि इस सदिश 36,37 में मॉडल प्रोटीन के लिए कोड </ Sup>।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, अन्य प्रमोटरों कि रूप में अच्छी तरह σ 70 द्वारा मान्यता प्राप्त हैं उपयोग करते हैं, लेकिन ध्यान दें कि अभिव्यक्ति क्षमता कम हो सकती है।
    2. 37,38 में वेक्टर रूपांतरण कोलाई तनाव केएल 740 32 (येल CGCs # 4382), वेक्टर डीएनए 37,39 प्रवर्धित और डीएनए समाधान 40-42 की एकाग्रता यों को शुद्ध। -20 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए समाधान स्टोर या सीधे सेल शुल्क प्रतिक्रिया तैयार करने के लिए इसका इस्तेमाल (कदम 3.4.1, 3.4.2 और 3.4.3)।
  2. असंशोधित प्रोटोकॉल 34 के अनुसार इस्तेमाल किया वेक्टर निर्माण एकाग्रता के आधार पर सेल मुक्त अभिव्यक्ति दक्षता जांचना। इष्टतम एकाग्रता है कि सेल मुक्त प्रतिक्रिया तैयार करने के लिए उच्चतम प्रोटीन पैदावार (कदम 3.4.1, 3.4.2 और 3.4.3) की ओर जाता है का प्रयोग करें।
    नोट: सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं की तैयारी एक 90 एनएम वेक्टर डीएनए शेयर समाधान है कि सेल मुक्त में 10 एनएम के एक अंतिम वेक्टर एकाग्रता की ओर जाता है का उपयोग कर उदाहरण हैप्रतिक्रिया और निकालने विभाज्य मात्रा Mg- और कश्मीर ग्लूटामेट के ऊपर इष्टतम मूल्यों के साथ-साथ इस प्रकार है। विभिन्न मूल्यों के लिए गणना टेम्पलेट का उपयोग करें।
  3. बर्फ 3 कच्चे तेल निकालने aliquots पर पिघलना 30 μl मात्रा में से प्रत्येक के, 1 अमीनो एसिड समाधान विभाज्य लेबल "+ CAA" (जैसे, + Arg), 1 अमीनो एसिड समाधान विभाज्य लेबल (तैयार असंशोधित प्रोटोकॉल 34 के अनुसार) "- CAA" (जैसे - Arg) और 1 अमीनो एसिड समाधान विभाज्य लेबल "+ एनसीएए" (जैसे, +) (वर्गों में तैयार कर सकते हैं 1.2.5 - 1.2.7), 3 ऊर्जा बफ़र्स aliquots (धारा 2 में तैयार) और वेक्टर डीएनए समाधान ( धारा 3.1 में तैयार)।
    ध्यान दें: कच्चे तेल निकालने थोड़ा चिपचिपा है और यह हवा के बुलबुले हो सकती है। 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के लिए 10,000 XG पर centrifuging द्वारा हवाई बुलबुले निकालें। बर्फ पर वापस कच्चे तेल निकालने aliquots रखो।
  4. कच्चे तेल निकालने (33.33%), ऊर्जा मिश्रण से 3 अलग ढंग से बना सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं (प्रत्येक 90 μl अंतिम मात्रा) तैयारबफर (16.67%), 3 अलग ढंग से बना अमीनो एसिड समाधान aliquots (16.67%) और वेक्टर डीएनए समाधान के 1। वैकल्पिक रूप से, आगे biomolecules (डीएनए, प्रोटीन, tRNA, आदि) जोड़ने के लिए, लेकिन उचित रूप से DDH 2 ओ की मात्रा को कम
    1. संदर्भ सेल मुक्त प्रतिक्रिया (90 μl) असंशोधित मॉडल प्रोटीन व्यक्त तैयार करें।
      1. 2 हे कच्चे तेल के 30 μl करने के लिए ऊर्जा बफर के 15 μl, अमीनो एसिड समाधान विभाज्य लेबल "+ CAA" (जैसे, + Arg), 90 एनएम वेक्टर डीएनए समाधान के 10 μl और बाँझ DDH के 20 μl के 15 μl जोड़े निकाल सकते हैं। ऊपर प्रत्येक घटक के अलावा के बाद नीचे और धीरे भंवर pipetting द्वारा मिक्स।
      2. 6 μl के 15 बराबर मात्रा में सेल मुक्त प्रतिक्रिया के 90 μl विभाज्य। एक अलग प्रतिक्रिया ट्यूब में 15 खंडों में से प्रत्येक के स्थानांतरण। ट्यूब बंद करें और बर्फ पर उन्हें वापस डाल दिया। के रूप में "सीएफआर (+ CAA)" (जैसे, सीएफआर (+ Arg)) सभी प्रतिक्रिया ट्यूबों लेबल।
    2. (जैसे, Arg) और न ही noncanonical अनुरूप (जैसे, कर सकते हैं) जोड़ रहे हैं तैयार।
      1. "- CAA" (जैसे, - Arg), कच्चे तेल के 30 μl के लिए 90 एनएम वेक्टर डीएनए समाधान के 10 μl और बाँझ DDH 2 हे के 20 μl ऊर्जा बफर के 15 μl, अमीनो एसिड समाधान विभाज्य के 15 μl लेबल जोड़े निकाल सकते हैं। ऊपर प्रत्येक घटक के अलावा के बाद नीचे और धीरे भंवर pipetting द्वारा मिक्स।
      2. 6 μl के 15 बराबर मात्रा में सेल मुक्त प्रतिक्रिया के 90 μl विभाज्य। एक अलग प्रतिक्रिया ट्यूब में 15 खंडों में से प्रत्येक के स्थानांतरण। ट्यूब बंद करें और बर्फ पर उन्हें वापस डाल दिया। के रूप में सभी प्रतिक्रिया ट्यूबों लेबल "सीएफआर (-cAA)" (जैसे, सीएफआर (-Arg))।
    3. सेल मुक्त प्रतिक्रिया (90 μl) कि (जैसे, कर सकते हैं) व्यक्त मॉडल प्रोटीन में अवशेषों से विशेष रूप से करने के लिए एनसीएए को शामिल माना जाता है तैयार करें।
      1. 15 जोड़ेऊर्जा बफर के μl, अमीनो एसिड समाधान विभाज्य लेबल "+ एनसीएए" के 15 μl (जैसे, + सकते हैं), 90 एनएम डीएनए समाधान के 10 μl और बाँझ DDH के 20 μl 2 कच्चे तेल निकालने के 30 μl के लिए हे। ऊपर प्रत्येक घटक के अलावा के बाद नीचे और धीरे भंवर pipetting द्वारा मिक्स।
        ध्यान दें: अभिव्यक्ति दक्षता मानक एमिनो एसिड के साथ अभिव्यक्ति की तुलना में कम किया जा सकता है। यदि आवश्यक हो, बस सेल मुक्त प्रतिक्रिया मात्रा पैमाने पर।
      2. 6 μl के 15 बराबर मात्रा में सेल मुक्त प्रतिक्रिया के 90 μl विभाज्य। एक अलग प्रतिक्रिया ट्यूब में 15 खंडों में से प्रत्येक के स्थानांतरण। ट्यूब बंद करें और बर्फ पर उन्हें वापस डाल दिया। वृद्धि की प्रतिक्रिया की मात्रा के लिए, तदनुसार 6 μl के आगे के संस्करणों में विभाज्य। के रूप में "सीएफआर (+ एनसीएए)" (जैसे, सीएफआर (+ कर सकते हैं)) सभी प्रतिक्रिया ट्यूबों लेबल।
  5. 29 ° सीओ / एन में सभी ट्यूबों को सेते हैं।
    नोट: केवल छोटे प्रतिक्रिया की मात्रा पर्याप्त ऑक्सीजन रचनाकार सक्षमप्रतिक्रिया है कि अत्यधिक कुशल प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए महत्वपूर्ण है में usion। रिएक्शन 10 μl से अधिक से अधिक मात्रा में आंदोलन 34 के माध्यम से सक्रिय ऑक्सीजन की आवश्यकता होती है। बड़ी मात्रा के लिए, 15 μl की तुलना में छोटे खंडों में विभाजित प्रतिक्रिया।
  6. सेल मुक्त अभिव्यक्ति के बाद, पूल सभी हूबहू 6 μl के विभाजन सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं की रचना की। सबसे पहले, पूल "सीएफआर (+ CAA)" लेबल 6 μl के सभी 15 विभाजन सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं (जैसे, सीएफआर (+ Arg))। फिर, पूल लेबल 6 μl के सभी 15 विभाजन सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं "सीएफआर (-cAA)" (जैसे, सीएफआर (-Arg))। अंत में, पूल लेबल 6 μl के सभी 15 विभाजन सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं "सीएफआर (+ एनसीएए)" (जैसे, सीएफआर (+ कर सकते हैं))। वृद्धि की प्रतिक्रिया की मात्रा के लिए, तदनुसार 6 μl के आगे खंडों पूल।
  7. , सभी तीन जमा में मॉडल प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर की जाँच अलग ढंग से denaturing एसडीएस पृष्ठ 43,44 (धारा 4.1) के प्रदर्शन से सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं की रचना की।
    नोट: इस metho का प्रयोग करें समावेश प्रयोग का एक प्रारंभिक मूल्यांकन के लिए डी।
  8. एचपीएलसी-ईएसआई जन स्पेक्ट्रोस्कोपी (धारा 4.4) के माध्यम से एक उचित विश्लेषण के लिए सेल मुक्त व्यक्त मॉडल प्रोटीन तैयार करें। सबसे पहले, 45 उन्हें शुद्ध (धारा 4.2)। अंत में, जन स्पेक्ट्रोस्कोपी के दौरान उच्च पृष्ठभूमि शोर से बचने के लिए बफर (धारा 4.3) का आदान-प्रदान।
    नोट: वर्गों 3.4.1, 3.4.2 और 3.4.3 ठेठ सेल मुक्त प्रतिक्रिया की स्थिति 34 करने के लिए नेतृत्व 8.9 - 9.9 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीन (कच्चे तेल निकालने से), 4.5 - 10.5 मिमी मिलीग्राम ग्लूटामेट, 40 - 160 मिमी कश्मीर ग्लूटामेट, leucine को छोड़कर प्रत्येक अमीनो एसिड की 1 मिमी, 0.83 मिमी leucine, 50 मिमी HEPES, 1.5 मिमी एटीपी और जीटीपी, 0.9 मिमी CTP और UTP, 0.2 मिलीग्राम / एमएल tRNA, 0.26 मिमी सीओए, 0.33 मिमी NAD, 0.75 मिमी शिविर , 0.068 मिमी folinic एसिड, 1 मिमी spermidine, 30 मिमी 3-पीजीए, 2% खूंटी-8000 और 10 एनएम pBEST-or2-OR1 पीआर-UTR1-gene_of_model_protein-T500। अगर वांछित, सेल मुक्त प्रतिक्रिया तैयार करने के लिए एक अलग प्रक्रिया आयोजित किया जा सकता है कि उपरोक्त प्रतिक्रिया की स्थिति की ओर जाता है।
Le "> 4। एसडीएस पृष्ठ 43,44 के माध्यम से प्रारंभिक मूल्यांकन और एचपीएलसी-ईएसआई मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए सेल मुक्त व्यक्त मॉडल प्रोटीन की तैयारी

  1. सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं के एसडीएस पृष्ठ
    नोट: किसी भी आगे की शुद्धि या निकासी के बिना व्यक्त प्रोटीन की एक त्वरित और प्रारंभिक विश्लेषण के लिए denaturating एसडीएस पृष्ठ को पूरा करें, और निम्न चरणों निष्पादित।
    1. बर्फ पर प्रोटीन मानक गला लें। सुनिश्चित करें कि यह जेल पर अपने स्थानीयकरण (कदम 4.1.13) के लिए व्यक्त की मॉडल प्रोटीन के समान आणविक वजन के साथ प्रोटीन के होते हैं।
      नोट: 212 केडीए, माल्टोज़ बाध्यकारी प्रोटीन-β-galactosidase: 158 केडीए, β-galactosidase: 116 केडीए, phosphorylase बी: 97 केडीए, सीरम albumin इधर, इस्तेमाल मानक आणविक भार (मायोसिन की एक विस्तृत श्रृंखला पर प्रोटीन प्रदान करता है : 66 केडीए, glutamic डिहाइड्रोजनेज: 56 केडीए, माल्टोज़ बाध्यकारी प्रोटीन: 43 केडीए, thioredoxin reductase: 35 केडीए, triosephosphate आइसोमेरेस: 27 केडीए, trypsin अवरोध: 20 केडीए, LYsozyme: 14 केडीए, aprotinin: 7 केडीए, इंसुलिन एक: 3 केडीए, बी श्रृंखला: 2 केडीए)।
    2. पहले एसडीएस पृष्ठ 10 बार उचित जेल प्रवास सुनिश्चित करने के लिए और धुंधला के बाद संतृप्ति से बचने के लिए - चूंकि सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं उच्च प्रोटीन एकाग्रता की वजह से थोड़ा चिपचिपा रहे हैं, उन्हें बाँझ DDH 2 हे 5 पतला। आदेश में बहुत ज्यादा नमूना बर्बाद करने के लिए नहीं, बाँझ DDH 2 ओ के 4 μl में सेल मुक्त प्रतिक्रिया के 1 μl पतला में , अच्छी तरह से भंवर प्रतिक्रिया ट्यूबों में कमजोर पड़ने को तैयार है और शीघ्र ही के लिए 2 एक मिनी सेंट्रीफ्यूज के साथ तरल नीचे स्पिन - 3 सेकंड में 2,000 x जी।
    3. पतला सेल मुक्त प्रतिक्रिया के 5 μl के लिए 2x लोड हो रहा है बफर के 5 μl जोड़ें। अच्छी तरह से भंवर और 2 के लिए एक मिनी सेंट्रीफ्यूज के साथ नीचे स्पिन - 2000 में 3 सेकंड x जी।
      नोट: यहाँ, इसके बाद, biomolecules 62.5 मिमी Tris / सीएल में भंग कर रहे हैं - 10% ग्लिसरॉल, 2% एसडीएस, और 0.0025% bromophenol नीले पीएच 6.8 पर, एक ठेठ रचना। अन्य लोड करने वाले रंगों से थोड़ा अलग है कि कमजोर पड़ने सह करने के लिए नेतृत्व का प्रयोगnditions के रूप में अच्छी तरह से उपयुक्त हो सकता है।
    4. अच्छी तरह से प्रोटीन मानक भंवर और एक प्रतिक्रिया ट्यूब में से 15 μl हस्तांतरण।
      नोट: जेल आकार पर और अन्य प्रोटीन मानकों के लिए निर्भर करता है, की सिफारिश की मात्रा के ऊपर से अलग कर सकते हैं।
    5. प्रतिक्रिया ट्यूबों एक हीटिंग ब्लॉक में रखें। जाँच करें अगर ट्यूबों के पलकों को ठीक से बंद हो जाती हैं। 5 मिनट - 100 के लिए 3 डिग्री सेल्सियस - 95 पर गर्मी। इस प्रोटीन denature और प्रोटीन रीढ़ की हड्डी के चारों ओर एसडीएस लपेटकर सक्षम करने के लिए करें।
      नोट: कुछ प्रोटीन मानकों गर्म नहीं होना चाहिए, सप्लायर निर्देश देखें।
    6. इस बीच, जेल वैद्युतकणसंचलन कक्ष में चल रहे बफर हस्तांतरण। 1x चल बफ़र की सामग्री 25 मिमी Tris, 192 मिमी ग्लाइसिन, 8.3 पीएच (एचसीएल के साथ) में 0.1% एसडीएस है।
    7. वैद्युतकणसंचलन चैम्बर के लिए 20% ढाल Tris ग्लाइसिन-एसडीएस जेल (10 सेमी x 10 सेमी x 1 मिमी) - मिल में बना हुआ 4 को ठीक करें। कंघी निकालें और एक सिरिंज बफर चलाने के साथ लोड के साथ कुओं कुल्ला।
      नोट: जेल एकाग्रता strongly आकार और मॉडल व्यक्त प्रोटीन की प्रकृति पर निर्भर करता है। ऊपर एकाग्रता को अलग ई कोलाई कच्चे तेल निकालने प्रोटीन के साथ-साथ कम आणविक भार मॉडल प्रोटीन। स्व डाली जैल के रूप में अच्छी तरह से उपयुक्त हैं।
    8. हीटिंग ब्लॉक से ट्यूबों निकालें। 3 सेकंड में 2,000 x जी - 2 के लिए एक मिनी सेंट्रीफ्यूज के साथ तरल स्पिन। पर 2,000 x जी 3 सेकंड - शीघ्र ही भंवर और 2 के लिए नीचे कताई दोहराएँ।
    9. कुओं में प्रत्येक नमूने की - (22 माइक्रोग्राम प्रति प्रोटीन 11) और वैद्युतकणसंचलन शुरू - (48 माइक्रोग्राम प्रति प्रोटीन 24) और 10 μl प्रोटीन मानक के 15 μl स्थानांतरण। लगभग 90 मिनट, एक ठेठ प्रोटोकॉल के लिए 40 मा - यहाँ, एसडीएस पृष्ठ 125 वी और 20 पर किया जाता है।
    10. ध्यान से कैसेट से जेल निकाल सकते हैं। फिक्सिंग समाधान (50% मेथनॉल, 10% एसिटिक एसिड, 40% DDH 2 हे) 30 मिनट के लिए में हस्तांतरण। चेतावनी! मेथनॉल साँस लेना द्वारा और त्वचा के संपर्क में विषैला होता है। एक धूआं हुड के तहत सुरक्षा दस्ताने और काम पहनें।
    11. धुंधला समाधान (0.025% Coomassie खूब ब्लू जी 250, 10% एसिटिक एसिड, 90% DDH 2 हे) में जेल स्थानांतरण। 60 मिनट के लिए दाग।
    12. 120 मिनट - 60 के लिए destaining समाधान (10% एसिटिक एसिड, 90% DDH 2 हे) में जेल स्थानांतरण।
      नोट: फिक्सिंग, धुंधला और दृढ़ता destaining आकार और प्रोटीन व्यक्त की प्रकृति पर निर्भर करते हैं। इस प्रोटोकॉल बल्कि छोटे आणविक भार 46 से प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू होता है।
    13. एक सफेद पृष्ठभूमि है कि दाग प्रोटीन बैंड के लिए एक उपयुक्त विपरीत उत्पन्न पर एक मैट पारदर्शिता पर जेल विस्थापित।
  2. सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं से उनकी टैग 45 मॉडल प्रोटीन की शुद्धि
    नोट: प्रोटीन शुद्धि के लिए, कई तरीके मौजूद हैं कि इसी तरह के परिणाम देने के लिए। इस प्रोटोकॉल सेल मुक्त व्यक्त मॉडल प्रोटीन एक सी टर्मिनल polyhistidine-टैग (उनकी टैग) है शुद्ध। यह प्रोटीन है कि विस्तार कर रहे हैं के लिए उपयुक्त एक शुद्धि किट का उपयोग करता हैसेल मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति की छोटी मात्रा में प्रतिक्रिया ressed। यह देशी या संशोधित मॉडल प्रोटीन की शुद्धि के लिए समान है। इस प्रकार, यह आम तौर पर एक ही सेल मुक्त प्रतिक्रिया के आधार पर वर्णित है।
    1. एक उचित एचपीएलसी-ईएसआई बड़े पैमाने स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए, निकालने के लिए और सेल मुक्त प्रतिक्रिया से मॉडल प्रोटीन को शुद्ध और निम्न चरणों निष्पादित।
      1. उनका बाध्यकारी बफर के 150 μl और 90 - - सेल मुक्त प्रतिक्रिया के 150 μl 90 के बराबर मात्रा मिलाई। पिपेट और नीचे, कोमल vortexing द्वारा पीछा किया।
        नोट: उनके बाध्यकारी बफर का उपयोग की सिफारिश की है। 8, imidazole / उसकी एकाग्रता है <10 मिमी, मजबूत एजेंटों को कम करने की एकाग्रता 15 मिमी और कोई धातु है <- हालांकि, सेल मुक्त प्रतिक्रिया मध्यम एक प्रारंभिक सामग्री के रूप में लंबे समय तक जा सकता है मॉडल प्रोटीन के रूप में घुलनशील है, पीएच 7.5 के बीच है chelating एजेंट मौजूद हैं। अपने मिश्रण की मात्रा 300 μl से अधिक है, यह बराबर मात्रा में विभाजित है और विभाज्य अलग r में मात्रा में शोध करेनिम्नलिखित शुद्धि चरणों के लिए eaction ट्यूबों।
      2. स्तंभ प्रणाली तैयार करें। पूरी तरह अपने आत्मीयता जेल के शेयर समाधान भंवर जब तक जेल राल पूरी तरह से भंग कर रहा है। स्तंभ में जेल राल के 250 μl स्थानांतरण। चिपचिपा जेल राल के लिए एक 1 मिलीलीटर पिपेट टिप का उपयोग करें। स्तंभ एक संग्रह ट्यूब में रखें।
      3. 15,000 एक्स जी - कम से 13,000 10 सेकंड - 5 के लिए अपकेंद्रित्र स्तंभ / संग्रह ट्यूब। सुनिश्चित करें कि जेल राल पूरी तरह से सूखा है। यदि नहीं, तो द्वारा अतिरिक्त 5 centrifugation समय का विस्तार - 10 सेकंड है, लेकिन ध्यान देना है कि आत्मीयता के जेल से अधिक सूखे नहीं है। तदनुसार कदम 4.2.1.5, 4.2.1.7 और 4.2.1.9 में centrifugation समय का विस्तार।
        ध्यान दें: जेल राल पूरी तरह से सूखा है अगर यह कड़ा हो जाता है और कोई सतह पर तैरनेवाला शीर्ष पर बनी हुई है।
      4. स्तंभ के लिए सेल मुक्त प्रतिक्रिया / उसकी बाध्यकारी बफर के 300 μl - 150 स्थानांतरण। मिश्रण की मात्रा की सिफारिश की मात्रा अधिक हो जाती है, तो कई स्पिन स्तंभों पर विभाजित। सोमवार से जेल राल Resuspendequent दोहन और कम से कम 2 मिनट की एक ऊष्मायन समय के दौरान कोमल vortexing। 2 मिनट - 200 μl से अधिक से अधिक मात्रा के लिए, अतिरिक्त 1 के लिए सेते हैं।
        नोट: पर्याप्त ऊष्मायन समय जेल राल के लिए मॉडल प्रोटीन की बाइंडिंग के लिए महत्वपूर्ण है।
      5. 15,000 एक्स जी - कम से 13,000 10 सेकंड - 5 के लिए अपकेंद्रित्र स्तंभ / संग्रह ट्यूब। प्रवाह के माध्यम से त्यागें और स्तंभ संग्रह ट्यूब में वापस जगह है।
      6. उनका धोने बफर के 250 μl जोड़ें। दोहन ​​और कोमल vortexing द्वारा जेल राल Resuspend।
      7. 15,000 एक्स जी - कम से 13,000 10 सेकंड - 5 के लिए अपकेंद्रित्र स्तंभ / संग्रह ट्यूब। प्रवाह के माध्यम से त्यागें और स्तंभ संग्रह ट्यूब में वापस जगह है। 15,000 एक्स जी - कम से 13,000 10 सेकंड - 5 के लिए दोहराएँ चरण 4.2.1.6 और सेंट्रीफ्यूज फिर से।
      8. स्तंभ एक मानक 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में रखें। क्षालन बफर के 150 μl जोड़ें और दोहन और कोमल vortexing द्वारा जेल राल resuspend। उच्च शुद्ध मॉडल प्रोटीन चुनाव के लिए 100 μl के लिए मात्रा में कमीअगले कदम 4.2.1.9 में क्षालन के बाद centrations।
        नोट: शुद्ध मॉडल प्रोटीन की कुल बहुतायत है, सब जेल राल बाध्य प्रोटीन के संभावित अधूरा क्षालन के कारण कम किया जा सकता है, तो क्षालन बफर मात्रा कम हो जाता है।
      9. अपकेंद्रित्र स्तंभ / प्रतिक्रिया ट्यूब 5 के लिए - 13,000 से कम 10 सेकंड - 15,000 XG क्षालन बफर में शुद्ध प्रोटीन को कमजोर करने के लिए। तो पहले विभाजित है, एक शेयर समाधान में सभी समाधान पूल।
      10. बफर विनिमय क्रियान्वित करने से पहले, मानक तरीकों, जैसे का उपयोग प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण, ब्रैडफोर्ड 47,48 परख।
        नोट: - 50 μl एक उपयुक्त एचपीएलसी-ईएसआई जन स्पेक्ट्रोस्कोपी (धारा 4.4) के लिए, इष्टतम प्रोटीन सांद्रता है कि आमतौर पर 20 की आवश्यक मात्रा के साथ लगभग 0.5 मिलीग्राम / एमएल का उपयोग करें। एकाग्रता 0.2 मिलीग्राम से नीचे है / एमएल, एक कताई वैक्यूम concentrator का उपयोग बफर विनिमय के बाद प्रोटीन समाधान ध्यान केंद्रित। इस मामले में, पहले उचित रूप से आदान प्रदान के शौकीन अनुकूल करने के लिए खंड 4.3.8 पढ़इंजी।
  3. एचपीएलसी-ईएसआई जन स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए बफर विनिमय
    नोट: imidazole (> 150 मिमी) और इस तरह नः 2 के रूप में अन्य लवण की उच्च एकाग्रता पीओ 4 (> 300 मिमी) या सोडियम क्लोराइड (> 50 मिमी) की वजह से बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण में उच्च पृष्ठभूमि शोर से बचने के लिए उनकी टैग क्षालन बफर विनिमय 49। निम्नलिखित बफर विनिमय प्रोटोकॉल एक prehydrated जेल निस्पंदन स्पिन स्तंभ प्रणाली का उपयोग करता है। यह हूबहू देशी या संशोधित मॉडल प्रोटीन के लिए मार डाला है। इस प्रकार, यह आम तौर पर एक ही सेल मुक्त प्रतिक्रिया के आधार पर वर्णित है। ध्यान दें कि वहाँ अन्य आसान करने के लिए प्रदर्शन बफर विनिमय तरीकों, जैसे, मिनी डायलिसिस कारतूस हैं।
    1. प्रोटीन भंडारण बफर (50 मिमी Tris-सीएल पीएच 8, 100 मिमी NaCl, और 10% ग्लिसरॉल) की 100 मिलीलीटर की तैयारी। एक autoclavable 100 में वजन 605.7 मिलीलीटर मिलीग्राम Tris आधार, 584.4 मिलीग्राम सोडियम क्लोराइड की बोतल और ग्लिसरॉल के 10 मिलीलीटर जोड़ें। लगभग 80 मिलीलीटर तक भरें और एक से 8 तक पीएच मान को समायोजितdding NaOH। तेजी से एक पीएच मीटर के साथ पीएच मान की जाँच करें। अंत में, 100 मिलीलीटर निशान से ऊपर भरें।
      नोट: मॉडल प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला को स्थिर नहीं है और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण परेशान करने के लिए, के रूप में लंबे समय के रूप में बड़े पैमाने एचपीएलसी स्पेक्ट्रोस्कोपी माप से पहले किया जाता है करने के लिए इस बफर का प्रयोग करें। हालांकि, व्यक्त मॉडल प्रोटीन की प्रकृति पर निर्भर करता है, अन्य बफ़र्स कि बेहतर उपयुक्त हो सकता है का उपयोग करें। अपने लक्ष्य प्रोटीन 8 पीएच पर स्थिर नहीं है, तो पीएच तदनुसार समायोजित करें। उच्च सांद्रता ग्लिसरॉल का प्रयोग न करें।
    2. आरटी के लिए कम से कम 15 मिनट के लिए जेल निस्पंदन स्पिन स्तंभों गर्म।
    3. कोमल दोहन या vortexing द्वारा prehydrated जेल Resuspend और हवा के बुलबुले को हटा दें।
    4. प्रथम तल टोपी को हटा दें, और उसके बाद शीर्ष टोपी ले जाओ। स्तंभ एक धोने ट्यूब (कम से कम 2 मिलीलीटर) में रखें। सेंट्रीफ्यूज में स्तंभ / धोने ट्यूब स्थानांतरण। प्रत्येक स्तंभ एक अभिविन्यास निशान के पास। 2 मिनट के लिए 1,000 XG पर अपकेंद्रित्र जेल भंडारण बफर हटा दें। डिस्कप्रवाह के माध्यम से अर्द।
      नोट: ध्यान दें इस क्रम में आगे बढ़ने के लिए। सुनिश्चित स्तंभ सब आगे centrifugation चरणों में एक ही रुख है।
    5. ऊपर प्रोटीन भंडारण बफर के 400 μl जोड़ें। पर 1,000 x जी 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। इस दोहराएँ पूरी तरह से जेल में प्रोटीन भंडारण बफर लोड करने के लिए। ध्यान से शुद्ध मॉडल प्रोटीन के समाधान के 100 μl को जोड़ें। पिपेट सीधे जेल बिस्तर के केंद्र पर।
      नोट: शुद्ध प्रोटीन के समाधान की मात्रा, संशोधित प्रोटीन की विशेष रूप से, अधिक हो सकता है। कई बफर विनिमय स्तंभों पर इस तरह के समाधान विभाजित। प्रोटीन बफर विनिमय के इस तरह के लिए 5 केडीए की तुलना में अधिक आणविक भार होना चाहिए।
    6. एक संग्रह ट्यूब और अपकेंद्रित्र में स्तंभ पर 1,000 x जी 2 मिनट के लिए रखें।
      नोट: यह कदम प्रोटीन भंडारण बफर में शुद्ध मॉडल प्रोटीन के कमजोर पड़ने की ओर जाता है। तो पहले विभाजित है, एक शेयर समाधान में सभी समाधान पूल।
    7. फ्लैश फ्रीज वें-80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में ई प्रोटीन समाधान या सीधे एचपीएलसी-ईएसआई जन स्पेक्ट्रोस्कोपी 50 (धारा 4.4)। चेतावनी के माध्यम से यह विश्लेषण! पहनें एक Eyeshield और क्रायो दस्ताने नाइट्रोजन की बौछार से संरक्षित किया जाना है।
    8. प्रोटीन समाधान एक कताई शून्य concentrator है कि ध्यान से विलायक 51 उड का उपयोग करते हुए ध्यान केंद्रित करने के लिए प्रोटोकॉल के निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन।
      नोट: यदि प्रोटीन एकाग्रता एचपीएलसी-ईएसआई जन स्पेक्ट्रोस्कोपी (<0.2 मिलीग्राम / एमएल) के लिए बहुत कम है ये कदम आवश्यक हैं। समाधान की मात्रा और मॉडल प्रोटीन एकाग्रता मोटे तौर पर पहले और बफर विनिमय के बाद एक ही है। एकाग्रता प्रक्रिया निम्न उदाहरण के माध्यम से वर्णन किया गया है: उनकी टैग शुद्धि के बाद, मॉडल प्रोटीन उनकी क्षालन बफर (कदम 4.2.1.9) μl 100 में भंग कर रहा है और 0.07 मिलीग्राम / एमएल (कदम 4.2.1.10) के एक एकाग्रता है ।
      1. यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रोटीन एकाग्रता और समाधान मात्रा में वाष्पीकरण बाद कर रहे हैंकम से कम 0.2 मिलीग्राम / एमएल और 20 μl, क्रमशः, बफर विनिमय, प्रोटीन भंडारण बफर में कम से कम तीन गुना कदम 4.3.1 में तैयार है, लेकिन सबसे अधिक पांचगुना से पहले पतला,। समान रूप से निम्नलिखित कम से कम दो तिहाई (66.67 μl) या ज्यादा से ज्यादा चार पांचवें (80 μl) में लुप्त हो जाना।
        नोट: प्रोटीन भंडारण बफर के कमजोर पड़ने से पहले बफर आदान प्रदान के लिए महत्वपूर्ण है कि इस खाते के बफर (कदम 4.3.1) की एकाग्रता मूल्यों अभी भी वाष्पीकरण के बावजूद महसूस कर रहे हैं में लेने के लिए। निम्नलिखित क्रियान्वित करने से पहले कदम 4.3.8.2 - प्रोटीन भंडारण बफर के कमजोर पड़ने के बाद, पहले बफर विनिमय प्रदर्शन (4.3.6 4.3.2 कदम) - 4.3.8.4।
      2. बफर आदान प्रदान के बाद, कताई शून्य concentrator में एक खुला ट्यूब में मॉडल प्रोटीन समाधान की पूरी 100 μl डाल दिया।
        ध्यान दें: मॉडल प्रोटीन पतला प्रोटीन भंडारण बफर में भंग कर रहा है। रोटेशन केंद्र की ओर से यह झुकाना रोटेशन के दौरान तरल-नुकसान से बचने के लिए। सुनिश्चित करें कि का एक ही मात्रा का एक खुला खालीएच 2 ओ संतुलित रूप से कताई प्रणाली को संतुलित करने के लिए रखा गया है।
      3. concentrator का ढक्कन बंद और रोटेशन शुरू करते हैं। प्रोटीन स्थिरता को आश्वस्त करने के लिए, आरटी पर या 30 डिग्री सेल्सियस तक कम तापमान पर ध्यान केंद्रित।
        ध्यान दें: इस्तेमाल किया concentrator स्वचालित रूप से 170 XG के लिए accelerates और वैक्यूम स्थापित करता है। निम्नलिखित में यह 240 x जी इसकी अधिकतम गति के लिए accelerates।
      4. अक्सर पूछे जाने वाले सर्वेक्षण करने के लिए तरल मात्रा एकाग्रता प्रक्रिया को बाधित। एकाग्रता बंद करो, जब शेष समाधान मात्रा 20 μl और 33 μl के बीच है।
        नोट: तदनुसार कदम 4.3.8.1 के लिए अनुकूल - 4.3.8.4 अन्य समाधान की मात्रा (कदम 4.2.1.9) और अन्य प्रोटीन सांद्रता (कदम 4.2.1.10) के लिए। फ्लैश -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में केंद्रित प्रोटीन समाधान फ्रीज, या सीधे एचपीएलसी-ईएसआई जन स्पेक्ट्रोस्कोपी 50 के माध्यम से यह विश्लेषण। सावधान! एक Eyeshield और क्रायो दस्ताने पहनें नाइट्रोजन की बौछार से संरक्षित किया जाना है।
  4. मॉडल प्रोटीन का एचपीएलसी-ईएसआई बड़े पैमाने पर spectrometric विश्लेषण 50
    1. 90% acetonitrile और 25 से अधिक फार्मिक एसिड के 0.1% - 20% की एक ढाल के साथ एक सी 5 रिवर्स चरण स्तंभ पर 15 μl प्रोटीन समाधान (धारा 4.3 में तैयार) (3 माइक्रोन, 100 x 2.1 मिमी) - 5 के एचपीएलसी जुदाई प्रदर्शन करना मिनट और 300 की रेंज में एक समय की उड़ान मास analysator पर पता लगाने के साथ बाद में ईएसआई मास स्पेक्ट्रोमेट्री - 3,000 मी / z।
      नोट: व्यक्त मॉडल प्रोटीन की प्रकृति पर निर्भर करता है, अन्य सॉल्वैंट्स या स्तंभों है कि बेहतर उपयुक्त हो सकता है का उपयोग करें।
    2. Deconvolute उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 52 शून्य प्रभारी जनता की गणना करने के लिए जन स्पेक्ट्रा मापा।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल मॉडल प्रोटीन में ncAAs की सेल मुक्त अवशेषों से विशिष्ट समावेश के माध्यम से गाइड। यह समावेश प्रयोग और एक उचित एचपीएलसी-ईएसआई बड़े पैमाने स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए मॉडल प्रोटीन तैयार करने के लिए आगे कदम की एक प्रारंभिक मूल्यांकन के लिए एसडीएस पृष्ठ का प्रस्ताव है।

इधर, Arg अनुरूप कर सकते हैं की सेल मुक्त अवशेषों से विशिष्ट समावेश है, साथ ही लिस अनुरूप एल हाइड्रोक्सी लाइसिन (HYL) के प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत कर रहे हैं। विभिन्न अमीनो एसिड समाधान, ऊर्जा बफर, मॉडल प्रोटीन और सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं के लिए वेक्टर डीएनए कोडिंग के रूप में ऊपर वर्णित तैयार हैं। संदर्भ सेल मुक्त प्रतिक्रिया अमीनो एसिड 20 सीएएएस से मिलकर समाधान के साथ प्रदान की जाती है। एक प्रयोग के लिए, एक नकारात्मक नियंत्रण सेल मुक्त प्रतिक्रिया अमीनो एसिड समाधान है कि प्रश्न में एनसीएए का विहित अनुरूप अभाव के साथ आपूर्ति की है। प्रत्येक appr के लिएoach, एक सेल मुक्त प्रतिक्रिया अमीनो एसिड समाधान, जहां CAA noncanonical अनुरूप द्वारा प्रतिस्थापित है की उपस्थिति में मॉडल प्रोटीन व्यक्त करता है। उनकी टैग शुद्धि, बफर विनिमय और एचपीएलसी-ईएसआई बड़े पैमाने पर spectrometric विश्लेषण ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार क्रियान्वित कर रहे हैं।

मॉडल प्रोटीन सी टर्मिनल उनकी टैग deGFP 32, EGFP 53 का एक छोटा संस्करण है। इसका एक पत्र अमीनो एसिड अनुक्रम में (पूरक सामग्री 2) पाया जा सकता है। यह मॉडल प्रोटीन 6 Arg और 18 लिस पदों शामिल हैं, क्रमशः। अभिव्यक्ति वेक्टर pBEST-or2-OR1 पीआर-UTR1-deGFP-T500 है।

एनसीएए का पूरा समावेश के मामले में, एक मान सकते हैं कि नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रिया deGFP व्यक्त नहीं करता है, 20 सीएएएस याद आ रही है एक के बाद से। विपरीत, deGFP अन्य दो प्रतिक्रियाओं में detectable होना चाहिए: refe में देशी एकसेल मुक्त प्रतिक्रिया और सेल मुक्त प्रतिक्रिया है कि एनसीएए के साथ प्रदान की जाती है में संशोधित प्रोटीन Rence।

चित्रा 1 ए सकते समावेश प्रयोग के प्रारंभिक एसडीएस पृष्ठ मूल्यांकन से पता चलता। संदर्भ सेल मुक्त प्रतिक्रिया उच्चतम deGFP अभिव्यक्ति स्तर है। सेल मुक्त प्रतिक्रिया है कि सकता है के साथ प्रदान की जाती है में, deGFP थोड़ा कम एकाग्रता में व्यक्त किया जाता है। कोई deGFP अभिव्यक्ति नकारात्मक नियंत्रण में पता लगाया जा सकता है। इस एसडीएस पृष्ठ परिणाम लक्ष्य प्रोटीन deGFP में कर सकते हैं की एक सफल शामिल करने के लिए एक अच्छा संकेत है।

दोनों शुद्ध मॉडल प्रोटीन, चित्रा 1 बी में कल्पना की deGFP में कर सकते हैं की धारणा पूरा समावेश साबित करने के लिए, एचपीएलसी-ईएसआई जन स्पेक्ट्रोस्कोपी के माध्यम से विश्लेषण कर रहे हैं। चित्रा 1C शुद्ध deGFP अणुओं के deconvoluted जन स्पेक्ट्रा से पता चलता है। Degf की deconvoluted बड़े पैमाने पर पी है कि संदर्भ सेल मुक्त प्रतिक्रिया में व्यक्त किया जाता है 26,192.8 दा है। deGFP के लिए सेल मुक्त प्रतिक्रिया 26,202.5 दा के एक बड़े पैमाने प्रतीत होता युक्त सकते में व्यक्त किया। मूल निवासी deGFP6Arg और Arg के साथ संशोधित deGFP6Can के लिए उम्मीद की जनता पूरी तरह से Can से प्रतिस्थापित किया जा रहा 26,193 दा और 26,204 दा, क्रमशः रहे हैं। deGFP6Can के लिए 1.5 दा की बड़े पैमाने पर अंतर स्पेक्ट्रम deconvolution की त्रुटि के भीतर है। इस प्रकार, पूर्ण सभी 6 Arg पदों पर deGFP में कर सकते हैं के समावेश की पुष्टि की है।

कम हो तीव्रता के दो चोटियों मूल निवासी deGFP6Arg और संशोधित deGFP6Can कि उनके परिपक्व fluorophore प्राप्त नहीं किया था के अनुरूप हैं। Fluorophore autocatalytically एक एच 2 ओ अणु के उन्मूलन के द्वारा उत्पन्न की, ऑक्सीकरण द्वारा पीछा किया जाता है। यह एक बड़े पैमाने पर 20 दा की वृद्धि हुई है, तो इस प्रक्रिया को आगे नहीं करता है की ओर जाता है।

पीजी "/>
चित्रा 1. समावेश कर सकता प्रयोग और सेल मुक्त व्यक्त की और शुद्ध deGFP अणुओं के एचपीएलसी-ईएसआई जन स्पेक्ट्रोस्कोपी के एसडीएस पृष्ठ मूल्यांकन। (ए) समावेश कर सकता एसडीएस पृष्ठ का उपयोग कर प्रयोग के प्रारंभिक मूल्यांकन। बाएं से दाएं: प्रोटीन मानक, संदर्भ सेल मुक्त प्रतिक्रिया है, नकारात्मक नियंत्रण और सेल मुक्त प्रतिक्रिया उपलब्ध कराने Arg के बजाय कर सकते हैं। (बी) उनकी टैग शुद्धि के बाद एसडीएस पृष्ठ और व्यक्त deGFP अणुओं के आदान प्रदान के बफर। प्रोटीन मानक, संदर्भ प्रतिक्रिया से शुद्ध deGFP, कर सकते हैं युक्त प्रतिक्रिया से शुद्ध deGFP: से सही करने के लिए छोड़ दिया है। (सी) एचपीएलसी-ईएसआई जन स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा सकता है की पूर्ण समावेश की पुष्टि। मूल निवासी deGFP और Arg के साथ संशोधित deGFP की उम्मीद है और आम जनता पूरी तरह से कर सकते हैं द्वारा प्रतिस्थापित 26,193 दा और 26,204 दा, क्रमशः रहे हैं। प्रत्येक स्पेक्ट्रम अपने उच्चतम तीव्रता (मायने रखता है) सामान्यीकृत है। शिखर पदों संकेत कर रहे हैंदा में। दृश्य प्रयोजनों के लिए, जेल गलियों जेल चित्रों से निकाले जाते हैं, एक साथ शामिल हो गए, ग्रे स्केल प्रारूप में परिवर्तित कर रहे हैं, आकार अनुकूलित है और इसके विपरीत के साथ ही चमक बढ़ा रहे हैं। मूल जेल गलियों से पूरक सामग्री 3. में प्रस्तुत कर रहे हैं यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2A HYL समावेश प्रयोग के प्रारंभिक एसडीएस पृष्ठ मूल्यांकन से पता चलता। सेल मुक्त प्रतिक्रिया है कि HYL के साथ उपलब्ध कराया जाता है, deGFP व्यक्त की है। पहला प्रयोग के विपरीत, एक कमजोर deGFP बैंड नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रिया में मनाया जा सकता है। यह सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं में लिस अवशेषों की वजह से हो सकता है। यह नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रिया है, जहां न तो है और न ही लिस HYL जोड़ रहे हैं में एक बेहोश deGFP अभिव्यक्ति सक्षम बनाता है।

ज के लिए PLC-ईएसआई जन स्पेक्ट्रोस्कोपी, सेल मुक्त प्रतिक्रिया के deGFP अणुओं HYL के साथ प्रदान की शुद्ध कर रहे हैं और बफर का आदान-प्रदान किया जाता है (चित्रा 2 बी)।

चित्र 2
चित्रा 2 एसडीएस पृष्ठ HYL समावेश प्रयोग के मूल्यांकन (ए) बाएं से दाएं:। नकारात्मक नियंत्रण सेल मुक्त प्रतिक्रिया, सेल मुक्त HYL और प्रोटीन युक्त मानक प्रतिक्रिया। (बी) उनकी टैग शुद्धि के बाद एसडीएस पृष्ठ और व्यक्त deGFP अणुओं के आदान प्रदान के बफर। HYL से शुद्ध deGFP प्रतिक्रिया और प्रोटीन युक्त मानक: से सही करने के लिए छोड़ दिया है। दृश्य प्रयोजनों के लिए, जेल गलियों जेल चित्रों से निकाले जाते हैं, एक साथ शामिल हो गए, ग्रे स्केल प्रारूप में परिवर्तित कर रहे हैं, आकार अनुकूलित है और इसके विपरीत के साथ ही चमक बढ़ा रहे हैं। मूल जेल गलियों से पूरक सामग्री 3 में प्रस्तुत कर रहे हैं।च = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig2large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3 शुद्ध deGFP अणुओं के deconvoluted जन स्पेक्ट्रम से पता चलता है। चित्रा 3 ए सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं में पहले से ही मौजूद लिस अवशेषों की परिकल्पना की पुष्टि करता है। स्पेक्ट्रम के प्रमुख शिखर मूल निवासी deGFP (: ​​26,193 दा की उम्मीद मास) से मेल खाती है। फिर, एक 20 दा उच्च द्रव्यमान है कि उनके fluorophore विकसित नहीं किया की deGFP अणुओं का पता लगाया जा सकता है। लिस अवशेषों preferentially lysyl-tRNA-synthetase मूल निवासी deGFP18Lys के एक उच्च अभिव्यक्ति के स्तर के लिए अग्रणी द्वारा tRNA लिस पर लोड कर रहे हैं।

HYL और लिस के बीच बड़े पैमाने पर अंतर 16 दा है। HYL की उपस्थिति लिस अवशेषों सभी संभव deGFP प्रजातियों उत्पन्न कर रहे हैं करने के लिए प्रतिस्पर्धा में है कि (deGFP18Hyl के कारण,deGFP17Hly + 1Lys, ..., deGFP16Hyl + 2Lys) (चित्रा 3 बी)। वैसे, deGFP1Hyl + 17Lys के शिखर मूल निवासी deGFP कि इसके fluorophore (चित्रा 3 ए) और कुछ चोटियों की बड़े पैमाने पर होने की उम्मीद है जन से अधिक से अधिक 2 दा अलग है उत्पादन नहीं किया था के चोटी के साथ overlaps। ये बड़े पैमाने पर मतभेद deGFP प्रजातियों की कम मात्रा के कारण उच्च शोर करने के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। हालांकि, आम तौर पर HYL सेल मुक्त प्रणाली द्वारा शामिल किया है। आगे सुधार सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं में लिस अवशेषों को समाप्त करने के लिए किया जाना है।

चित्र तीन
(:, Fluorophore 26,193 दा के साथ परिपक्व fluorophore 26,213 दा बिना उम्मीद जनता) चित्रा 3. एचपीएलसी-ईएसआई बड़े पैमाने पर सेल मुक्त HYL युक्त प्रतिक्रिया का शुद्ध deGFP अणुओं के स्पेक्ट्रोस्कोपी (ए) के मूल निवासी deGFP18Lys मुख्य रूप से पाया जाता है। (बी)बढ़ाई सभी संभव deGFP प्रजातियों (deGFP18Hyl, deGFP17Hly + 1Lys, deGFP16Hyl + 2Lys, ..., deGFP1Hyl + 17Lys) के अस्तित्व का पता चलता है। 26193 उनकी उम्मीद जनता कर रहे हैं दा + N x 16 दा (एन = 1, ..., 18)। स्पेक्ट्रम अपने उच्चतम तीव्रता (मायने रखता है) सामान्यीकृत है। शिखर पदों दा में संकेत कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आकृति 1

पूरक सामग्री 1. गणना टेम्पलेट। धारा 2 में, ऊर्जा बफर मास्टर मिश्रण की तैयारी 30 μl का इष्टतम Mg- कच्चे तेल निकालने aliquots और क्रमश: 3 मिमी की कश्मीर ग्लूटामेट सांद्रता और 30 मिमी का उपयोग कर उदाहरण है। यह उदाहरण एक मास्टर मिश्रण की मात्रा है कि पैदावार 3 ऊर्जा बफर aliquots की ओर जाता है। सेकंड मेंtion 3, सेल मुक्त प्रतिक्रिया की तैयारी एक 90 एनएम डीएनए शेयर समाधान सेल मुक्त प्रतिक्रिया में 10 एनएम के एक इष्टतम वेक्टर डीएनए एकाग्रता के लिए अग्रणी का उपयोग कर उदाहरण है। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

कच्चे तेल निकालने की मात्रा: 28 μl, इष्टतम मिलीग्राम ग्लूटामेट: 2 मिमी, इष्टतम कश्मीर ग्लूटामेट: 40 मिमी, नंबर एक उपयुक्त पता लगाने की क्षमता के लिए, गणना टेम्पलेट का उपयोग इन विशिष्ट मूल्यों है कि ऊपर के उदाहरण से अलग की प्रविष्टि द्वारा उदाहरण है 100, सेल मुक्त प्रतिक्रिया में इष्टतम वेक्टर एकाग्रता: 8 एनएम, डीएनए वेक्टर शेयर समाधान: 150 एनएम वांछित बफर aliquots की।

सबसे पहले पहली टेम्पलेट अनुभाग के नारंगी क्षेत्र में कच्चे तेल निकालने मात्रा के रूप में 28 μl दर्ज करें। फिर, दूसरी टेम्पलेट अनुभाग में 2 मिमी एक दर्जडी 40 मिमी के रूप में इष्टतम Mg- और नारंगी खेतों में कश्मीर ग्लूटामेट सांद्रता। खाते में ले रहा इष्टतम Mg- और कश्मीर सांद्रता, एक 15 μl ऊर्जा बफर की संरचना, साथ ही एक इसी, ऊपर पहुंचा 16 μl विभाज्य गणना की जाती है। नीचे, उसके अनुसार ऊर्जा बफर aliquots की वांछित संख्या (16 μl) के रूप में 100 दर्ज करें। 100 मिमी मिलीग्राम ग्लूटामेट स्टॉक समाधान के 204 μl, 3 एम कश्मीर ग्लूटामेट स्टॉक समाधान के 136 μl, 14x ऊर्जा समाधान की 728.73 μl, 510 μl: टेम्पलेट 1,700 μl मास्टर मिश्रण के लिए अलग बफर घटकों की मात्रा इस प्रकार के रूप adapts 40% की खूंटी-8000 और 121.27 μl बाँझ DDH 2 ओ अंत में, तीसरे टेम्पलेट अनुभाग में, 8 एनएम और सेल मुक्त प्रतिक्रिया में इष्टतम वेक्टर एकाग्रता के रूप में 150 एनएम और क्रमश: वेक्टर डीएनए शेयर समाधान एकाग्रता दर्ज करें। टेम्पलेट विभिन्न घटकों है कि कच्चे तेल निकालने के 28 μl में जोड़ा जाना चाहिए की मात्रा adapts एक 90 μl की तैयारी को अंतिम रूप देने के लिएसेल मुक्त प्रतिक्रिया इस प्रकार है: ऊर्जा बफर के 15 μl, 3 अलग ढंग से बना एमिनो एसिड समाधान में से एक के 15 μl, वेक्टर डीएनए समाधान (150 एनएम) की 4.80 μl, और बाँझ DDH 2 ओ के 27.20 μl

चित्र 2
पूरक सामग्री 2. एक पत्र एमिनो एसिड मॉडल प्रोटीन deGFP के अनुक्रम। यह मॉडल प्रोटीन 6 Arg और 18 लिस पदों में शामिल है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
पूरक सामग्री 3. पूर्ण लंबाई और असंशोधित जेल गलियों कि जेल चित्रों के अनुरूप प्रस्तुत चित्रा 1 और 2 जेल गलियों प्रत्येक व्यक्ति के एस में प्रस्तुत ubfigure ही एसडीएस polyacrylamide जेल से निकाले जाते हैं। चित्रा 1 और 2 इन गलियों में प्रस्तुति प्रयोजनों के लिए एक साथ जुड़े हुए थे। प्रोटीन मानक बैंड की आणविक भार आंकड़े बगल में संकेत कर रहे हैं। (ए .1) चित्रा 1 ए के काटे जेल गलियों। बाएं से दाएं: प्रोटीन मानक, संदर्भ सेल मुक्त प्रतिक्रिया है, नकारात्मक नियंत्रण और सेल मुक्त प्रतिक्रिया उपलब्ध कराने Arg के बजाय कर सकते हैं। (.2) चित्रा 1 बी के काटे जेल गलियों। प्रोटीन मानक, संदर्भ प्रतिक्रिया से शुद्ध deGFP, कर सकते हैं युक्त प्रतिक्रिया से शुद्ध deGFP: से सही करने के लिए छोड़ दिया है। (B.1) चित्रा 2A के काटे जेल गलियों। नकारात्मक नियंत्रण सेल मुक्त प्रतिक्रिया, सेल मुक्त HYL और प्रोटीन युक्त मानक की प्रतिक्रिया: बाएं से दाएं। (B.2) चित्रा 2 बी के काटे जेल गलियों। HYL से शुद्ध deGFP प्रतिक्रिया और प्रोटीन युक्त मानक: से सही करने के लिए छोड़ दिया है।डी / 54273 / 54273supfig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

एक-आसान करने के लिए एक व्यवहार्य रणनीति अवशेषों से विशेष रूप से प्रोटीन में ncAAs को शामिल करने के रूप में सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करें, प्रस्तुत किया है। यह अंत करने के लिए, कच्चे तेल निकालने ब्याज की प्रोटीन, ऊर्जा बफर और इसी अमीनो एसिड के लिए वेक्टर डीएनए कोडिंग के साथ पूरक है। ध्यान दें कि कच्चे तेल निकालने विभाज्य मात्रा कच्चे तेल निकालने प्रोटीन एकाग्रता 34 पर निर्भर करता है। सेल मुक्त अभिव्यक्ति दक्षता वेक्टर डीएनए निर्माण एकाग्रता के आधार पर अनुकूलित है। ऊर्जा बफर घटकों की मात्रा क्रम में सेल मुक्त व्यक्त मॉडल प्रोटीन की उच्च पैदावार सक्षम करने के लिए अनुकूलित Mg- और कश्मीर ग्लूटामेट सांद्रता के समारोह के रूप में बदलती हैं।

समावेश प्रयोग का एक प्रारंभिक मूल्यांकन unpurified सेल मुक्त प्रतिक्रिया माध्यम से एसडीएस पृष्ठ के प्रदर्शन से प्राप्त किया जा सकता है। एक अधिक विस्तृत विश्लेषण के लिए, एचपीएलसी-ईएसआई जन स्पेक्ट्रोस्कोपी पूरा, छाछ-विशिष्ट incor जांच करने के लिए एक साधन के रूप में प्रस्तावित किया गया हैएनसीएए की poration। बाद के लिए एक तैयारी के रूप में, स्पिन स्तंभ प्रणालियों उनकी टैग शुद्धि सक्षम और छोटी मात्रा में है कि हम इस प्रोटोकॉल में उपयोग के साथ विनिमय बफर करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।

एचपीएलसी-ईएसआई जन स्पेक्ट्रोस्कोपी सहित पूरे प्रोटोकॉल 2 दिनों के भीतर किया जा सकता है। यह किसी भी विशेष रूप से महत्वपूर्ण कदम शामिल नहीं है। हालांकि, Mg- और कश्मीर ग्लूटामेट की एकाग्रता अनुकूलन के रूप में अच्छी तरह से वेक्टर के रूप में डीएनए क्रम में मॉडल प्रोटीन की उच्च पैदावार को व्यक्त करने में महत्वपूर्ण हैं। अत्यधिक कुशल अभिव्यक्ति वेक्टर के उपयोग pBEST-or2-Or1 पीआर-UTR1-gene_of_model_protein-T500 पुरजोर सिफारिश की है। उनकी टैग प्रोटीन की क्षालन पीओ 4 (> 300 मिमी) या सोडियम क्लोराइड (> 50 मिमी) है कि बड़े पैमाने स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण 49 में उच्च पृष्ठभूमि शोर उत्पन्न imidazole के उच्च एकाग्रता (> 150 मिमी) और इस तरह नः 2 के रूप में अन्य लवण के कारण आमतौर पर है । एक उपयुक्त प्रोटीन भंडारण बफर के साथ इस तरह क्षालन buffers की एक्सचेंज स्थिर मॉडल proteमें और तेजी से बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के दौरान पृष्ठभूमि शोर कम कर देता है।

नतीजतन, मॉडल प्रोटीन के भीतर सभी छह पदों पर Arg की जगह कर सकते हैं। अभिव्यक्ति प्रणाली में, कोई Arg अवशेषों का पता लगाया जा सकता है। यह अन्य अभिव्यक्ति प्रणाली है कि आगे की कमी रणनीतियों 29,30 की आवश्यकता की तुलना में Arg analogs के अवशेषों से विशिष्ट समावेश सरल करता है। प्रस्तुत सेल मुक्त दृष्टिकोण कर सकते हैं कि विषाक्तता के कारण हैं विवो दृष्टिकोण में निहित सीमाओं, या एकल प्रोटीन के उत्पादन रणनीतियों 24,31 में mRNA अनुक्रम पर मजबूत निर्भरता में गतिरोध उत्पन्न। इन विट्रो प्रणाली में कार्यरत है के विपरीत, कर सकते हैं की इन विवो दरार homoserine करने और hydroxyguanidine 31 होती है।

हालांकि, सेल मुक्त प्रणाली लिस के लिए पर्याप्त मात्रा में इस तरह के रूप में HYL analogs के साथ प्रतिस्पर्धा करने के लिए बरकरार रखती है। एचपीएलसी-ईएसआई बड़े पैमाने स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण से पता चलता है कि मॉडल प्रोटीन दोनों, सी होता हैanonical के साथ ही विभिन्न अनुपात में noncanonical अनुरूप। लिस के अवशेषों से विशिष्ट समावेश सामान्य रूप से संभव है, लेकिन पूरी प्रतिस्थापन, आगे कमी रणनीतियों, या विशेष रूप से इंजीनियर Aars और tRNA ncAAs की मान्यता के लिए अनुकूलित के लिए विकसित किए जाने की जरूरत है।

हम विहित लोगों के रूप में एक ही एकाग्रता में एनसीएए जोड़कर सेल मुक्त व्यक्त की, संशोधित मॉडल प्रोटीन का उत्कृष्ट पैदावार हासिल की। समावेश दक्षता एनसीएए की प्रकृति शामिल होने पर निर्भर करता है। यहां तक ​​कि उच्च पैदावार अभी भी एनसीएए की एकाग्रता के अनुकूलन के द्वारा वसूली योग्य हो सकता है।

प्रस्तुत परिणाम के रूप में लंबे समय के रूप में वे विहित अंतर्जात translational प्रणाली द्वारा स्वीकार किए जाते हैं ncAAs के अवशेषों से विशिष्ट शामिल करने के लिए कार्यरत प्रणाली के लागू प्रदर्शित करता है। विशिष्ट ncAAs के अवशेषों से विशिष्ट शामिल करने के लिए, एक आगे की जरूरतों की जांच करने के लिए अगर अनुरूप CAA distur के अवशेषोंअभिव्यक्ति सिस्टम बी।

सेल मुक्त प्रतिलेखन अनुवाद प्रणाली विभिन्न मांगों को 54 पर प्रतिक्रिया के लिए विभिन्न जीवों से इंजीनियर जा सकता है। सभी ई कोलाई यहाँ प्रस्तुत सेल मुक्त प्रणाली के प्रतिलेखन अनुवाद मशीनरी जीवाणुभोजी और के प्रयोग को सक्रिय कोलाई प्रमोटरों, और वे समानांतर में या लगातार झरने 55 में कार्य कर सकते हैं। सामान्य प्रयोज्यता और प्रयोज्य विधि एमिनो एसिड विषाक्तता और चिकित्सीय आवेदन में आगे अनुसंधान के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनाते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protective eyewear Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z758841
Nitrile gloves (size S) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z768960 Catalog numbers other sizes: Z768979 for M, Z768987 for L and Z768995 for XL
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 ml (PCR clean) Eppendorf, Hamburg, Germany 30123.328
Microbalance Discovery DV114CM Ohaus, Greifensee, Switzerland 80104140
Microspatula (L 6 5/8 in., stainless steel, rod diam. 0.09 in.) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z243213
L-Canavanine Sigma-Aldrich, St. Louis, USA C9758 Acute toxicity: wear eyeshields, dust mask, protective gloves
Hydroxylysine (racemic mixture) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA H0377
Cryo-gloves (size S, water resistent) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z183490 Catalog numbers other sizes: Z183512 for M, Z183520 for L and Z183539 for XL
RTS Amino Acid Sampler Biotechrabbit, Hennigsdorf, Germany BR1401801 For homemade preparation of amino acid stock solutions, follow this protocol35 and use the solid amino acid kit LAA21-1KT, L-proline (81709-25G), L-cysteine (30089-25G), L-histidine (53319-25G) and L-lysine (L5501-5G)  (all from Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)
HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, USA H6147
ATP Sigma-Aldrich, St. Louis, USA A8937
CTP Affymetrix, Santa Clara, USA 14121
GTP Affymetrix, Santa Clara, USA 16800
UTP Affymetrix, Santa Clara, USA 23160
tRNA (from E. coli, pack size 100 mg) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 10109541001 Catalog number for pack size of 500 mg is 10109550001
CoA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA C4282
NAD (from yeast ) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA N6522
cAMP Sigma-Aldrich, St. Louis, USA A9501 
Folinic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, USA F7878
3-PGA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P8877
Mg-glutamate Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 49605
K-glutamate Sigma-Aldrich, St. Louis, USA G1149
pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 Addgene, Cambridge, USA Plasmid #40019
4-20% precast Tris-Glycine Gels (10 cm x 10 cm x 1 mm, 10 courses) Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany TG 81610
SDS running buffer (10 x concentrate, 5,000 ml) Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany TG 50001
SDS loading buffer (2 x concentrate, 50 ml) Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany TG 05002
Unstained protein marker, broad range (2-212 kDa) New England Biolabs, Ipswich, USA P7702S
Methanol Merck, Darmstadt, Germany 1060091011 Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed: wear protective gloves and work under fume hood
Acetic acid (99.8%) VWR International, Darmstadt, Germany 20104.447
Coomassie Blue G-250 (10 g) Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 902120
His-Spin Protein Miniprep kit Zymo Research Europe, Freiburg, Germany P2002 Product also distributed by Zymo Research Corporation, Irvine, USA 
Trizma Base Sigma-Aldrich, St. Louis, USA T1503
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich, St. Louis, USA H1758
Glycerol, 99% VWR International, Darmstadt, Germany 24397.296DB
CentriPure Z25 mini spin columns Genaxxon bioscience, Ulm, Germany CP-0205-Z100
Sodium chloride Sigma-Aldrich, St. Louis, USA S9888
Concentrator 5301 Eppendorf, Hamburg, Germany 5301 000.210
2xYT MP biomedicals, Santa Ana, USA 113012032
Bacto-Agar BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA 214010
Bead-beating tubes (polypropylene microvials) Biospec, Bartlesville, USA 522S
Beads, 0.1 mm dia. Biospec, Bartlesville, USA 11079101
BL21 Rosetta 2 E. coli strain Merck, Darmstadt, Germany 71402
Bradford BSA protein assay Kit Bio-Rad, München, Germany 500-0201
Chloramphenicol Sigma-Aldrich, St. Louis, USA C1919
Cuvettes, 1.5 ml Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 14-955-127
DTT Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D0632
Micro Bio-Spin Chromatography Columns Bio-Rad, München, Germany 732-6204
Nunc 384-well optical bottom plates Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 142761
Nunc sealing tape Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 232701
PEG-8000 Promega, Madison, USA V3011
Potassium phosphate dibasic solution Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P8584
Potassium phosphate monobasic solution Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P8709
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes, 10k MWCO (Kit) Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 66382
Spermidine Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 85558
1 L centrifuge bottle Beckman-Coulter, Brea, USA A98813
4 L Erlenmeyer flask Kimble Chase, Vineland (NJ), USA 26500-4000
Avanti J-26XP centrifuge Beckman-Coulter, Brea, USA 393127 Or equivalent centrifuge able to centrifuge 1 L bottles.
Forma 480 orbital shaker Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 480 Or equivalent shaker able to shake chest-size 6 x 4 L .
JLA-8.1000 rotor Beckman-Coulter, Brea, USA 363688 Or equivalent 5,000 x g rotor for the centrifuge above, able to centrifuge 1 L bottles.
Mini-Beadbeater-1 Biospec, Bartlesville, USA 3110BX
Microfuge 22R refrigerated microcentrifuge Beckman-Coulter, Brea, USA 368831 Or equivalent centrifuge able to centrifuge 2 ml reaction tubes.
Heating block HLC HBT 130 Labexchange, Burladingen, Germany 24465 Or equivalent heating block able to heat samples in reaction tubes up to 100 °C.
Eppendorf MiniSpin centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany 5452000018 Or equivalent centrifuge able to centrifuge 2 ml reaction tubes.
IKA Vortex 3 (4 mm orbital shaker diameter, 0 - 2,500 rpm) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z654760 Or equivalent vortex.
Scotsman AF103 ice flaker machine Kälte-Berlin, Berlin, Germany AF103 Or equivalent ice flaker machine.
MyTemp mini digital incubator Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z763314 Or equivalent incubator able to heat samples at 29 °C.
EcoCell electrophoresis cell / chamber Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany AN12005 Or equivalent electrophoresis chamber able to perform vertical gel electrophoresis with the above precast gels or other gels used.
Power-phor power supply for electrophoresis cell / chamber Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany AN12001 Or equivalent power supply able to supply above used electrophoresis cell / chamber with power
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 1 VWR International, Darmstadt, Germany 613-5278 Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 2 VWR International, Darmstadt, Germany 613-5279 Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision
Pipetman Tips Diamond D10ST (0.1 - 10 µl) Gilson, Middleton, USA F171101 Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision
Pipetman Tips Diamond D200ST (2 - 200 µl) Gilson, Middleton, USA F171301 Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision
Pipetman Tips Diamond D1000ST (100 - 1,000 µl) Gilson, Middleton, USA F171501 Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision
50 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) VWR International, Darmstadt, Germany 50-0156
15 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) VWR International, Darmstadt, Germany 525-0150
14 ml polypropylene tubes (round bottom, two-position vent stopper, sterile) Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 187262
Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC Column (3 µm particle size, L x I.D. 10 cm x 2.1 mm) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 567227-U
Agilent 1260 HPLC machine Agilent Technologies, Santa Clara, USA G1312B
6500 Series Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) LC/MS Agilent Technologies, Santa Clara, USA G6530BA
Acetonitrile  Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 270717
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech, Ortenberg, Germany 415-101 Or equivalent microplate reader able to measure the fluorescence of the expressed model protein
Hanna Checker pH meter Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z351091 
Formic acid eluent additive for LC-MS Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 56302

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