Entrega de Ácidos Nucleicos através de microinjeção de embriões na Worldwide Agrícola praga de insectos,
1Department of Biology and Biotechnology, University of Pavia

Published 10/01/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Gabrieli, P., Scolari, F. Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata. J. Vis. Exp. (116), e54528, doi:10.3791/54528 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

A mosca mediterrânica da fruta (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) é uma espécie de pragas com altíssima relevância agrícola. Isto é devido ao seu comportamento reprodutivo: as fêmeas danificar a superfície externa de frutas e vegetais quando eles põem ovos e as larvas se alimentam chocado em sua polpa. Selvagem C. populações capitata são tradicionalmente controlada através de inseticidas e / ou abordagens eco-friendly, sendo o mais bem sucedido da Técnica do Inseto Estéril (SIT). O SIT baseia-se em massa criação, esterilização à base de radiação e liberação de campo dos homens que mantêm sua capacidade para acasalar, mas não são capazes de gerar descendência fértil. O advento ea subsequente rápido desenvolvimento de ferramentas biotecnológicas, juntamente com a disponibilidade da sequência do genoma de mosca do mediterrâneo, impulsionou significativamente a nossa compreensão da biologia desta espécie. Isto favoreceu a proliferação de novas estratégias para a manipulação do genoma, que can ser utilizada para o controle da população.

Neste contexto, embrião microinjeção desempenha um duplo papel na expansão da caixa de ferramentas para o controle da mosca do mediterrâneo. A capacidade para interferir com a função dos genes que regulam processos biológicos fundamentais, de facto, se expande a nossa compreensão do mecanismo molecular subjacente a invasividade moscas mediterrânicas. Além disso, a capacidade de conseguir a transformação da linha germinal facilita a produção de múltiplas estirpes transgénicas que podem ser testados para futuras aplicações de campo em novas configurações de SIT. Com efeito, a manipulação genética podem ser usadas para conferir características desejáveis ​​que podem, por exemplo, ser utilizados para monitorizar o desempenho masculino estéril no campo, ou que podem resultar em letalidade fase precoce da vida. Aqui nós descrevemos um método para microinject ácidos nucleicos em embriões de mosca do mediterrâneo para atingir estes dois objetivos principais.

Introduction

A mosca da fruta Mediterrânea (medfly) Ceratitis capitata é uma espécie cosmopolita que extensivamente danos frutas e culturas cultivadas. Pertence à família Tephritidae, que inclui várias espécies de pragas, tais como aqueles que pertencem aos géneros Bactrocera e Anastrepha. A mosca do mediterrâneo é a espécie mais estudados desta família, e tornou-se um modelo não só para o estudo das invasões de insetos 1, mas também para otimizar as estratégias de gestão de pragas 2.

A mosca do mediterrâneo é uma espécie multivoltina que podem atacar mais de 300 espécies de plantas selvagens e cultivadas 3,4. O dano é causado por ambos os adultos e as fases larvares: fêmeas acasaladas perfurar a superfície do fruto para oviposição, permitindo que microorganismos de afectar a sua qualidade comercial, enquanto que as larvas se alimentam sobre a polpa de fruta. Depois de três estádios larvares, larvas emergem a partir do hospedeiro e pupate no solo. Ceratitiscapitata exibe uma distribuição quase todo o mundo, incluindo a África, Médio Oriente, Austrália Ocidental, Central e América do Sul, Europa e áreas dos Estados Unidos 5.

As estratégias mais comuns para limitar infestações mosca do mediterrâneo envolvem o uso de inseticidas (por exemplo, Malathion, Spinosade) e a favor do meio ambiente técnica do inseto estéril (SIT) 6. A última abordagem envolve a libertação no meio natural de centenas de milhares de homens prestados esterilizado por exposição a irradiação ionizante. O acasalamento de tais machos esterilizados para fêmeas selvagens resulta em nenhuma descendência, causando uma redução no tamanho da população, o que levou à erradicação. Embora SIT tem se mostrado eficaz em várias campanhas em todo o mundo, suas principais desvantagens incluem os altos custos de criação e de esterilização de milhões de insetos para ser liberado. Marcação de indivíduos liberados é necessário distinguir estéril de insetos selvagens capturados no campo durantemonitoramento das atividades e atualmente é conseguido usando pós fluorescentes. Estes procedimentos são caros e têm efeitos colaterais indesejáveis 7.

A fim de otimizar e / ou a desenvolver abordagens mais eficazes para o controle desta praga, biologia medfly e genética têm sido amplamente explorada por inúmeros pesquisadores em todo o mundo. A disponibilidade da sequência do genoma medfly 8,9, irá facilitar novas investigações sobre as funções dos genes. RNA de interferência é uma ferramenta poderosa para tais estudos e isto pode ser conseguido através da microinjecção de ARNdc (ARN de cadeia dupla) ou siARN (pequeno ARN interferente). Esta técnica tem sido usada, por exemplo, para demonstrar que a cascata molecular determinação do sexo em C. capitata é apenas parcialmente conservada em relação ao de 10 de Drosophila.

O desenvolvimento de protocolos para microinject embriões mosca do mediterrâneo permitidos C. capitata para ser o primeiro nãoespécies de moscas -Drosophilid ser geneticamente modificados. Como os ovos são semelhantes aos de Drosophila, quer em termos de morfologia e resistência à dessecação 11, o protocolo para a entrega do DNA do plasmídeo em embriões pré-blastoderme primeiro desenvolvidos para D. melanogaster 12,13 foi inicialmente adaptada para uso em C. capitata. Estas primeiras experiências permitiu transformação de linha de germe de moscas mediterrânicas com base no elemento transponível Minos 11. Subsequentemente, o sistema original foi modificado utilizando 14 outras abordagens baseada em transposões. Este é o caso de piggyBac da Lepidoptera Trichoplusia ni 15. O protocolo já foi ainda mais otimizado e isto permitiu a transformação de outras espécies de tefritídeos 16-21 e também de muitos outros Diptera 22-31. Todos estes sistemas se baseiam na utilização de um / sistema de transformação plasmídeo ajudante vector binário típico: artificial, transpo defeituosofilhos contêm genes desejados são montados em ADN de plasmídeo e integrado no genoma do insecto, fornecendo a enzima transposase 32. Um número de linhas de mosca do mediterrâneo transgênicos foram gerados, com vários recursos, incluindo estirpes que transportam um gene letal dominante condicional que induz letalidade, estirpes produtoras do sexo masculino somente descendentes e, portanto, não exigindo estratégias de sexagem adicionais e estirpes com esperma fluorescente, o que pode aumentar a precisão da fase de monitoramento SIT 33-37. Embora a libertação na natureza de organismos transgênicos ocorreu em testes-piloto contra os mosquitos única 38,39, pelo menos uma empresa está avaliando uma série de linhagens transgênicas mosca do mediterrâneo para a sua utilização no campo 40.

Embrião microinjeção também pode favorecer o desenvolvimento de novas ferramentas de edição de genoma, tais como transcrição nucleases ativador-like efetoras (TALENS), agrupados regularmente intercaladas repete palindr�icas curtas (CRISPR) / CRISPR proteína associada 9 nuclease (Cas9) e endonucleases homing genes (HEGs), o que permitirá novos estudos evolutivos e de desenvolvimento, bem como a expansão da caixa de ferramentas da biotecnologia disponível. De edição de genoma abordagens já permitiu a geração de sistemas gene-drive em mosquitos 41, e sua transferência para o medfly é iminente. Aqui nós descrevemos um protocolo universal para microinjecting ácidos nucleicos em embriões mosca do mediterrâneo que podem ser úteis para todas as aplicações acima mencionadas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Experimental Set-up

  1. requisitos insetário
    1. Manter todos C. vida capitata encena a 25 ° C, 65% de humidade e 12/12 horas de luz / fotoperíodo escuro.
    2. Coloque cerca de 1.500-2.000 pupas de mosca do mediterrâneo em um 6 L gaiola. Use uma gaiola com um latão malha em um lado com furos pequenos o suficiente para estimular a oviposição 42. Insira uma tira de esponja através de uma pequena abertura na base da gaiola para fornecer moscas com água por meio de ação capilar. Usar uma mistura de açúcar de levedura e (1:10) como fonte de alimento para os adultos (Figura 1A). Aumentar a quantidade de levedura (até 1: 3, fermento: açúcar) devem as fêmeas não conseguem pôr ovos.
    3. Colocar uma placa cheia de água abaixo da gaiola para recolher os ovos depositados através da malha. Como as fêmeas virgens podem ovipositam, aguarde até que as moscas são pelo menos 6-7 dias antes de coletar os ovos para os experimentos de microinjeção. Isto irá garantir que as fêmeas foram acasaladose que os ovos foram fertilizados.
    4. Recolher os ovos filtrando a água com um filtro net bem. Transferir os ovos a partir do filtro de uma caixa de plástico contendo alimento larval padrão (1,5 LH 2 O, 100 mL de HCl a 1%, 5 g de largo espectro antimicrobiano dissolvido em 50 ml de etanol, 400 g de açúcar, 175 g de levedura de cerveja desmineralizada, 1 kg de farelo de trigo mole) usando uma pipeta de Pasteur.
    5. Colocar cada caixa num contentor transparente, fechado com uma tampa de líquido para permitir a circulação do ar e contendo uma camada de farelo de favorecer a formação da pupa (Figura 1B).
    6. Após cerca de 10 dias, para verificar instar larvas que emergem do alimento larval e saltar para dentro da camada de farelo de pupation
    7. 24 horas depois, recolher as pupas em um pequeno copo usando uma escova macia e transferi-los para uma nova gaiola adulto. Adultos normalmente emergem 10 dias após pupation. A mosca emergente utiliza o ptilinum, uma bolsa inflável localizado em sua cabeça acima the base das antenas, para forçar para fora da extremidade do pupário. Após a emergência, o ptilinum cai permanentemente para dentro da cabeça.
  2. Preparação de 1 L alimento para larvas microinjectados
    1. Dissolve-se 2,5 g de ágar em 300 ml de H 2 O.
    2. Aquecer 500 ml de H 2 O em uma placa de agitação quente e dissolvem-se 4 g de benzoato de sódio, 4,5 ml de HCl a 37%, 42 g de extracto de levedura e 115 g de cenoura desidratada em pó.
    3. Adicionar à mistura uma solução de 2,86 g de agente antimicrobiano de largo espectro dissolvido em 10 ml de etanol absoluto.
    4. Distribuir o meio em 15 cm rodada placas de Petri e deixe esfriar. Se necessário, armazenar a 4 ° C.
  3. preparação da lâmina
    1. Coloque um 2 centímetros tira de fita dupla face em uma lâmina de microscópio (75 x 26 mm2) e marcar as bordas com um marcador de porcelana, para impedir a propagação do petróleo e consequente desidratação dos embriões injetados.
  4. Isolamento de DNA usando kits disponíveis comercialmente 34. Precipitar o plasmídeo usando etanol e re-suspensão em tampão de injecção (0,1 mM de tampão fosfato de pH 7,4, 5 mM de KCl) na concentração desejada.
  5. Purificar in vitro sintetizado longo dsRNA utilizando fenol-clorofórmio, precipitar utilizando isopropanol e re-suspensão em tampão de injecção 43.

2. Embrião Preparação

  1. Coloque uma bandeja cheia de água sob uma gaiola contendo 6-7 dia adultos de idade.
  2. Permitir que as fêmeas para oviposição por 30 min e depois recolher os embriões filtrando a água através de um filtro fino. Sempre mantenha o filtro em água para evitar a dessecação dos embriões.
  3. Dechorionate os embriões por imergindo o filtro durante 5 segundos numa solução de lixívia comercial a 50%.
  4. Lavar os embriões cuidadosamente por imergindo repetidamente o filtro em água ultrapura limpa (pelo menos4-5 vezes). Por último, coloque o filtro em água ultrapura limpo. Use os embriões dentro de no máximo 2 horas.
    NOTA: O tempo de microinjeção está relacionada com a necessidade de injetar embriões pré-blastoderme, durante uma fase de divisões nucleares antes celularização. Isto permite que o ADN injectado a tomar-se nos núcleos, especificamente para os núcleos de células germinativas primordiais que originaram os gâmetas. Em Drosophila, as células celularização no pólo começa a cerca de 90 minutos após a fertilização (a 25 ° C), com a formação de blastoderme ocorrendo cerca de 30 minutos mais tarde, 44, ao passo que no celularização medfly ocorre entre 9 e 12 horas 45,46.
  5. Orientação embrião em linhas
    1. Usando um pincel fino, recolher cerca de 50 embriões e colocá-los em um disco de papel de filtro preto encharcado com água.
    2. Sob um microscópio estereoscópico de dissecação, organizar os embriões em uma fileira na superfície superior da fita dupla face ema lâmina de microscópio utilizando um pincel fino (000) (Figura 1C).
      NOTA: Alinhar os embriões todos com a mesma orientação, como a injecção é executada no polo posterior, onde de linha germinal originam; pólo posterior é oposta à região da micrópila.
    3. Cobrir os embriões com uma camada de óleo clorotrifluoroetileno certificando-se de que o óleo não se derrame sobre a China fronteiras marcador (ver 1.3).
      NOTA: Antes de cobrir os embriões com óleo, um passo adicional pode ser realizada: os embriões podem ser dessecada durante alguns minutos para reduzir o seu teor de líquido e, assim, facilitar a entrada da solução de ADN injectado. Isto pode ajudar a evitar a rotura do embrião durante a injecção ou vazamento excessivo da solução injetadas, como uma consequência da pressão líquida de alta resolução.

Microinjeção 3. Embryo

  1. Encha uma agulha (1-2 ul) com ADN de plasmídeo ou solução ARNcd (1-2 mg / mL) utilizando uma micropipeta.
  2. Realizar microinjecção sob um microscópio estereoscópico, utilizando um micromanipulador para controlar os movimentos da agulha (Figura 1D). Utilizar a platina do microscópio para mover a corrediça.
    1. Coloque o slide no palco do escopo.
    2. Inserir a ponta da agulha no pólo posterior do embrião (Figura 1E).
    3. Injectar a solução ativando o sistema de microinjeção com o pedal. O líquido injectado induz um aumento da pressão interna, resultando em um ligeiro movimento do embrião.
    4. Solte o pedal e imediatamente, mas com cuidado, retire a agulha do embrião.
    5. Observar um pouco de fuga citoplasmática no local da injecção.
      NOTA: Para discriminar entre potenciais efeitos letais de DNA / dsRNA / siRNA e mortalidade devido à pro microinjeçãoprocedimento em si, experiências de controlo devem ser executadas. Estes compreendem a injecção de apenas tampão, ou, no caso das experiências de genética inversa, de uma proteína fluorescente verde (GFP) -derived ARN de cadeia dupla (ARNcd-GFP), ou ARNsi.
  3. Após a injecção incubar os embriões a 25 ° C.

4. Procedimentos de Pós-injeção

  1. Dois dias após a injecção, verifique as lâminas para larvas eclodidas (Figura 1F) sob um microscópio estereoscópico. As larvas podem mover-se no óleo, mas precisa de ser transferido para alimentar larvas o mais rapidamente possível. Por esta razão, verifique as lâminas várias vezes ao dia.
  2. Usando um pincel fino (000), gentilmente transferir as larvas eclodiram ao alimento larval à base de cenoura. Transfira até um máximo de 200 larvas por cada placa de Petri.
  3. Incubar as larvas a 65% de humidade (25 ° C). Certifique-se de que a tampa não se ater ao prato, prejudicando a troca de ar.
  4. Mantenha as placas de Petri com a tampaprincipalmente fechado de modo que ainda existe fluxo de ar para as larvas. Para evitar a secagem excessiva, verifique os pratos diariamente e, se necessário, adicione água para compensar a evaporação.
  5. Coloque as placas de Petri em um recipiente clara fechada por uma tampa-net e contendo uma camada de farelo de favorecer pupation. Quanto à criação insetário rotina, instar larvas salto para fora do alimento larval e pupate no farelo.
  6. Recolher o pupas e colocá-los em uma gaiola pequena para a criação de adultos e triagem (isto é Geração 0, G0). Traseira da progênie em alimento larval padrão.
  7. No caso de experimentos de transformação em células germinais, verificar possíveis indivíduos transformados na próxima geração (G1), como indivíduos injetados geralmente são quimeras. eventos de transposição, de facto, pode ter ocorrido em qualquer um dos núcleos do sincício embrionário, os quais irão formar, quer a da linha germinal ou a soma.
    1. Logo após a emergência, anestesiar indivíduos G1 usando CO 2 e verifique se transfeventos ormação sob um microscópio estereoscópico epifluorescência. Para rastrear a presença de fluorescência vermelha, use um filtro DsRedwide (Ext 546/12;.. Emm 605/75), enquanto para a tela de fluorescência verde usar o filtro EYFP (Ext 500/20;.. Emm 535/30) .
    2. Coloque indivíduos transformadas em uma pequena gaiola com adultos de tipo selvagem do sexo oposto e originam uma nova, inicialmente heterozigotos, tensão.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Aqui relatamos duas aplicações de microinjecção de embriões dirigido para a caracterização funcional de um gene de interesse (caso 1), e na geração de estirpes transgénicas (Processo 2), respectivamente.

Entrega de dsRNA em embriões para desvendar a função do gene.

O gene innexin-5 codifica uma lacuna-junção que, em insectos, é expresso especificamente na gónadas femininas 43,47,48 e macho. Com base na informação disponível para espécies estreitamente relacionadas, era esperado que o silenciamento de genes induzido por ARNcd de provocar a ablação da linha germinal moscas mediterrânicas fêmeas e machos. Um número total de 2.400 embriões foram injectados com A / ul mistura ARNdc ug 2, a partir da qual 548 larvas eclodidas e 216 adultos sobreviveram (dados não publicados). Em cerca de 75% dos adultos, testículos e ovários aparentou ser de sub-desenPED ou totalmente ausente (Figura 2). Quantificação de innexin-5 abundância de transcritos nos abdómens de indivíduos de ambos os sexos confirmou a expressão significativamente mais baixa do gene, em comparação com os controlos.

Geração de estirpes transgénicas com espermatozóides fluorescente.

Medfly linhagens transgênicas com esperma marcado fluorescentemente foram gerados por Scolari e seus colegas 34 por injecção de embriões com DNA plasmídeo. A mistura continha dois plasmídeos misturados em percentagens relativas fixos: um, o "ajudante plasmídeo", codificou a transposase piggyBac; o outro, o "plasmídeo Dador de", continha o transposão artificial e realizado dois marcadores fluorescentes, uma expresso no soma de machos e fêmeas, a outra especificamente nos testículos. O promotor do gene da beta-tubulina 2, responsável pela tEstes expressão específica do, foi fundido no ATG com as sequências de codificação das proteínas fluorescentes turboGFP (construo # 1260) ou DsRedExpress (construo # 1261), respectivamente. Um total de 821 embriões foram injetados, da qual 205 larvas eclodiram e 37 adultos sobreviveram. 9 do sexo feminino e 8 do sexo masculino cruzamentos foram set-up, 6 dos quais deu progênie fluorescente 34 (Licença para reutilizar esses dados obtidos a partir Elsevier - Licença Número 3796240759880). A transformação bem sucedida levou ao desenvolvimento de estirpes com testículos fluorescentes verdes e vermelhos, respectivamente (Figura 3).

figura 1
Figura 1. Equipamento Insetário e embriões. (A) Padrão criação gaiola contendo 1.500-2.000 adultos. As fêmeas põem ovos através da malha de latão na parte da frente da gaiola. Os ovos são colocados na água. À esquerdalado da gaiola, o filtro utilizado para filtrar os ovos é visível. (B) Duas caixas de conter larvas de alimento larval padrão. As caixas são colocadas em uma caixa de plástico transparente contendo farelo maior para facilitar pupation; o líquido que cobre a caixa foi removida. (C) Os embriões dispostas em filas. Os bordos da fita dupla revestida sobre a lâmina ter sido marcado com um marcador de porcelana branca. Ovos alinhados sobre a fita irá ser coberta com óleo de clorotrifluoroetileno. Dispositivo (D) microinjecção (esquerda) ligado a um estereomicroscópio equipado com um micromanipulador (à direita). (E) pólos de embriões; A seta vermelha indica o pólo posterior (o local de injecção), enquanto que a seta preta indica o pólo anterior (onde o micrópilo está localizado). Barra de escala = 500 pm. (F) larva chocado se movendo no óleo. Barra de escala = 500 mm. Please, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Macho e fêmea com gônadas sub-desenvolvidos. Feminino (esquerda) e do sexo masculino (direita) dissecados trato reprodutivo. Acima: wild-type indivíduos com gônadas normais. Abaixo: interferiu indivíduos com gônadas sub-desenvolvidos. MAG: Masculino Acessório glândulas; Sp: espermatecas. Barra de escala = 500 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Transgenic machos com testículos fluorescentes e machos adultos do esperma. Transformadas com construção # 1260 e # 1261, respectivamente. As setas indicam o fluotestículos rescent. # 1.260 homens mostram corpo e verdes testículos vermelhas, enquanto # 1261 homens mostram testículos vermelhos e corpos verdes. Barra de escala = 2 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Microinjecção de ácidos nucleicos em embriões de insetos é uma técnica universal que facilita tanto a análise da função dos genes e das aplicações biotecnológicas.

A publicação recente de sequências do genoma de um número crescente de espécies de insectos leva a uma necessidade urgente de ferramentas para a caracterização funcional de genes de função ainda desconhecida. ARN de interferência tem provado ser um dos métodos mais valiosos para inferir funções moleculares 49 e facilita a microinjecção de embriões esses estudos.

A injecção de DNA de plasmídeo pode ser utilizado para modificar os genomas de insectos que utilizam a inserção de genes mediada por transposase, e, mais recentemente, as ferramentas de edição genoma (por exemplo, TALEN, CRISPR / Cas9, HEGs). Estas técnicas já têm permitido o desenvolvimento de estirpes de espécies de insectos múltiplos que poderiam ser utilizados para programas de controlo de pragas, com vista tanto na erradicação ou na substituição de população selvagem Wom insetos com características biológicas modificadas. Neste protocolo, descrevemos um método otimizado para microinjeção de embriões de mosca do mediterrâneo ou com DNA plasmídeo ou dsRNA.

A disponibilidade de bem estabelecida e rentável forma larval semi-seco para a criação de mosca do mediterrâneo, bem como a informação molecular extensa alcançado ao longo dos anos por pesquisadores que estudam a determinação do sexo e do processo celularização nesta espécie, facilitar enormemente o estabelecimento de uma confiança Protocolo microinjecção de embriões. Em particular, o protocolo de criação foi optimizada para garantir o máximo de fertilidade e a vitalidade dos embriões. Isto é importante para maximizar a probabilidade de obtenção de adultos viáveis, com o menor número de embriões injectados possíveis. Diferentes protocolos estão disponíveis para a criação de moscas mediterrânicas, tais como o alimento larval à base de cenoura que descrevemos a traseira as larvas injectadas. No entanto, este método é mais caro e a sua preparação é mais demorada do queoutros meios utilizados para a criação de rotina.

Um obstáculo importante à utilização de microinjecção é o dano não específica causada pela manipulação mecânica dos embriões. Este inclui várias variáveis que influenciam a sobrevivência de embriões, tais como a perfuração das membranas do embrião com o pincel utilizadas para orientar os embriões, os volumes injectados, o local de injecção e um tampão, e o tipo de agulha utilizada 50. Alguns destes parâmetros foram optimizados, tal como os volumes injectados e o tampão. No caso de agulhas, que também pode ser produzido internamente utilizando um extractor, e isto requer um passo de optimização para determinar o protocolo ideal.

Entre as principais desvantagens no procedimento de microinjeção é também dechorionation: embora este passo é essencial para tornar os ovos mais fácil de manipulador (ou seja, menos escorregadio) e para facilitar a injeção, a exposição prolongada a água sanitária pode afectar fortemente a vitalidade embrionária. for este motivo, o protocolo aqui descrito relata o uso de um tempo muito curto dechorionation (5 segundos), o qual tem sido estabelecido como um bom compromisso entre a taxa de remoção do cório e sobrevivência.

Os protocolos utilizados para a retaguarda do palco vida subseqüente também são relevantes. As larvas nascidas de embriões injectados tem que ser removida do óleo tão rapidamente quanto possível. O petróleo é de fato essencial para evitar a dessecação dos embriões, mas pode ser nocivo para as larvas. O método utilizado para remover as larvas, o tempo gasto no óleo, e o tipo de alimento usado são todas variáveis ​​importantes que têm de ser considerados, uma vez que podem comprometer a taxa de sobrevivência final.

Quando o rastreio adultos e larvas, os métodos de imobilização pode ser também crítica. Medfly adultos pode ser imobilizada utilizando gelo ou CO 2, mas a exposição prolongada pode ser prejudicial para a sobrevivência de pacientes adultos. Como uma alternativa para microinjecção de embriões, a administração oral provouser um método menos invasivo e, potencialmente, de alto rendimento para realizar ensaios de ARNi. Pode ser particularmente eficazes em espécies que não são passíveis de micro-injecção, bem como para o controlo de pragas mediada por ARNi em populações de campo.

Neste papel, dois casos foram relatados como exemplos das aplicações possíveis do protocolo descrito: Em primeiro lugar, a transformação bem sucedida através da inserção de genes mediada por transposase do genoma de moscas mediterrânicas, o que levou ao estabelecimento de múltiplas estirpes com testículos fluorescentes. Utilizando um procedimento semelhante microinjecção, é também possível injectar ARNcd, com os efeitos do knockdown ser visível até à fase adulta.

O estabelecimento de um protocolo de microinjeção de confiança para os embriões mosca do mediterrâneo abriu o caminho para considerar linhagens geneticamente modificados como uma ferramenta para controle de moscas em estado selvagem, como estratégias alternativas ou complementares para abordagens clássicas, incluindo o inseto estérilTécnica. Finalmente, os recentes avanços na tecnologia de microinjeção automatizado em embriões de peixe zebra pode potencialmente auxiliar no desenvolvimento de sistemas de entrega de alto rendimento com importante relevância para a criação de linhagens transgênicas da mosca do mediterrâneo e outras pragas relevantes 51.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 x injection Buffer 0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5 mM KCl
Construct Plasmid
Helper Plasmid
dsRNA Phenol-Chloroform purified
Standard Larval food 1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer's yeast, 1 kg soft wheat bran
Carrot Larval Food 2.5 g agar, 4 g sodium benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1 L
Adult Food yeast extract and sugar (1:10)
Microscope slides Sigma-Aldrich Z692247
Injection needles  Eppendorf 5242956000
Microloaders Eppendorf 5242956003
Double slided tape
Whatman Black circle paper Sigma-Aldrich Z695505
Bleach Diluite 1:2 before use
Paintbrush (000)
Micromanipulator Narishige MN-153
Microinjector Eppendorf Femtojet
Adult cages
Chlorotrifluoroethylene oil Sigma-Aldrich H8898
Ceratitis capitata The strain used is ISPRA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Diamantidis, A. D., Carey, J. R., Nakas, C. T., Papadopoulos, N. T. Population-specific demography and invasion potential in medfly. Ecol. Evol. 1, 479-488 (2011).
  2. Augustinos, A. A., et al. Exploitation of the Medfly Gut Microbiota for the Enhancement of Sterile Insect Technique: Use of Enterobacter sp. in Larval Diet-Based Probiotic Applications. PLoS ONE. 10, e0136459 (2015).
  3. Liquido, N., Shinoda, L., Cunningham, R. Host plants of Mediterranean fruit fly: an annotated World review. Ann Entomol Soc Am. 77, 1-52 (1991).
  4. Szyniszewska, A. M., Tatem, A. J. Global assessment of seasonal potential distribution of Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). PLoS ONE. 9, e111582 (2014).
  5. Malacrida, A. R., et al. Globalization and fruitfly invasion and expansion: the medfly paradigm. Genetica. 131, 1-9 (2007).
  6. Dyck, V. A., Hendrichs, J., Robinson, A. S. Sterile Insect Technique: Principles and practice in Area-wide Integrated Pest Management. Springer. (2005).
  7. Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
  8. i5k Genome Sequencing Initiative for Insects and Other Arthropods. Available from: http://arthropodgenomes.org/wiki/i5K (2016).
  9. Handler, A. Medfly Genome Annotation Groups. Available from: https://www.hgsc.bcm.edu/arthropods/medfly-genome-annotation-groups (2016).
  10. Pane, A., Salvemini, M., Delli Bovi, P., Polito, C., Saccone, G. The transformer gene in Ceratitis capitata provides a genetic basis for selecting and remembering the sexual fate. Development. 129, 3715-3725 (2002).
  11. Loukeris, T. G., Livadaras, I., Arcà, B., Zabalou, S., Savakis, C. Gene transfer into the medfly, Ceratitis capitata, with a Drosophila hydei transposable element. Science. 270, 2002-2005 (1995).
  12. Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
  13. Hoy, M. Insect Molecular Genetics. An Introduction to Principles and Applications. 3rd edn, Academic Press. (2013).
  14. Christophides, G. K., Livadaras, I., Savakis, C., Komitopoulou, K. Two medfly promoters that have originated by recent gene duplication drive distinct sex, tissue and temporal expression patterns. Genetics. 156, 173-182 (2000).
  15. Handler, A. M., McCombs, S. D., Fraser, M. J., Saul, S. H. The lepidopteran transposon vector, piggyback, mediates germ-line transformation in the Mediterranean fruit fly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 7520-7525 (1998).
  16. Handler, A. M., Harrell, R. A. 2nd Transformation of the Caribbean fruit fly, Anastrepha suspensa, with a piggyBac vector marked with polyubiquitin-regulated GFP. Insect Biochem Mol Biol. 31, 199-205 (2001).
  17. Koukidou, M., et al. Germ line transformation of the olive fly Bactrocera oleae using a versatile transgenesis marker. Insect Mol Biol. 15, 95-103 (2006).
  18. Condon, K. C., et al. Germ-line transformation of the Mexican fruit fly. Insect Mol Biol. 16, 573-580 (2007).
  19. Raphael, K. A., et al. Germ-line transformation of the Queensland fruit fly, Bactrocera tryoni, using a piggyBac vector in the presence of endogenous piggyBac elements. Genetica. 139, 91-97 (2011).
  20. Meza, J. S., Nirmala, X., Zimowska, G. J., Zepeda-Cisneros, C. S., Handler, A. M. Development of transgenic strains for the biological control of the Mexican fruit fly, Anastrepha ludens. Genetica. 139, 53-62 (2011).
  21. Schetelig, M. F., Handler, A. M. Strategy for enhanced transgenic strain development for embryonic conditional lethality in Anastrepha suspensa. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9348-9353 (2012).
  22. Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
  23. Allen, M. L., O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. Stable, germ-line transformation of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 38, 701-710 (2001).
  24. Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem Mol Biol. 32, 1211-1220 (2002).
  25. Nolan, T., Bower, T. M., Brown, A. E., Crisanti, A., Catteruccia, F. piggyBac-mediated germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi using the red fluorescent protein dsRED as a selectable marker. J Biol Chem. 277, 8759-8762 (2002).
  26. Rodrigues, F. G., Oliveira, S. B., Rocha, B. C., Moreira, L. A. Germline transformation of Aedes fluviatilis (Diptera:Culicidae) with the piggyBac transposable element. Mem Inst Oswaldo Cruz. 101, 755-757 (2006).
  27. Terenius, O., Juhn, J., James, A. A. Injection of An. stephensi embryos to generate malaria-resistant mosquitoes. J Vis Exp. e216 (2007).
  28. Jasinskiene, N., Juhn, J., James, A. A. Microinjection of A. aegypti embryos to obtain transgenic mosquitoes. J Vis Exp. e219 (2007).
  29. Concha, C., et al. Efficient germ-line transformation of the economically important pest species Lucilia cuprina and Lucilia sericata (Diptera, Calliphoridae). Insect Biochem Mol Biol. 41, 70-75 (2011).
  30. Takken, W., Scott, T. W. Ecological Aspects for Application of Genetically Modified Mosquitoes. Springer. Netherlands. (2003).
  31. Handler, A. M., James, A. A. An Introduction to the History and Methodology of Insect Gene Transfer. Insect transgenesis: methods and applications. CRC Press. 3-26 (2000).
  32. Handler, A. M. A current perspective on insect gene transformation. Insect Biochem Mol Biol. 31, 111-128 (2001).
  33. Gong, P., et al. A dominant lethal genetic system for autocidal control of the Mediterranean fruitfly. Nat. Biotechnol. 23, 453-456 (2005).
  34. Scolari, F., et al. Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae). N Biotechnol. 25, 76-84 (2008).
  35. Schetelig, M. F., et al. Site-specific recombination for the modification of transgenic strains of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18171-18176 (2009).
  36. Schetelig, M. F., Caceres, C., Zacharopoulou, A., Franz, G., Wimmer, E. A. Conditional embryonic lethality to improve the sterile insect technique in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). BMC Biol. 7, 4 (2009).
  37. Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochem Mol Biol. 43, 1-8 (2013).
  38. Lacroix, R., et al. Open field release of genetically engineered sterile male Aedes aegypti in Malaysia. PLoS ONE. 7, e42771 (2012).
  39. Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 30, 828-830 (2012).
  40. Leftwich, P. T., et al. Genetic elimination of field-cage populations of Mediterranean fruit flies. Proc. Biol. Sci. 281, (2014).
  41. Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, E6736-E6743 (2015).
  42. Economopoulos, A. P., Judt, S. Artificial Rearing of the Mediterranean Fruit Fly (Diptera: Tephritidae): Size of Oviposition Holes. J. Econ. Entomol. 82, 668-674 (1989).
  43. Thailayil, J., Magnusson, K., Godfray, H. C., Crisanti, A., Catteruccia, F. Spermless males elicit large-scale female responses to mating in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 13677-13681 (2011).
  44. Gilbert, L. Insect Development. Morphogenesis, Molting and Metamorphosis. Academic Press. (2009).
  45. Schetelig, M. F., Horn, C., Handler, A. M., Wimmer, E. A. Area-Wide control of insect pests. From research to field implementation. Vreysen, M. J., Robinson, A., Hendrichs, J. Springer. 85-93 (2007).
  46. Gabrieli, P., et al. Sex and the single embryo: early development in the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Dev Biol. 10, 12 (2010).
  47. Tazuke, S. I., et al. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
  48. Gabrieli, P., Marois, E., Catteruccia, F. Transgenic insects: techniques and applications. Benedict, M. Q. CABI. 188-207 (2014).
  49. Scolari, F., et al. How functional genomics will impact fruit fly pest control: the example of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Genet. 15, Suppl 15 2. S11 (2014).
  50. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
  51. Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats