Leverans av nukleinsyror genom Embryo mikroinjektion i Worldwide Agricultural Pest Insekt,
1Department of Biology and Biotechnology, University of Pavia

Published 10/01/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Gabrieli, P., Scolari, F. Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata. J. Vis. Exp. (116), e54528, doi:10.3791/54528 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Medelhavsfruktflugan (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) är en skadedjur med extremt hög jordbruks relevans. Detta beror på dess reproduktiva beteende: kvinnor skadar den yttre ytan av frukt och grönsaker när de lägger ägg och kläckta larverna livnär sig på deras massa. Wild C. capitata populationer traditionellt kontrolleras genom insekts sprutning och / eller miljövänliga metoder, den mest framgångsrika är den sterila Insect Technique (SIT). SIT bygger på massuppfödning, strålningsbaserad sterilisering och fält frisättning av män som bibehåller sin förmåga att para sig men inte kan generera fertila avkomma. Tillkomsten och den efterföljande snabba utvecklingen av biotekniska verktyg, tillsammans med tillgången på medfly genomsekvensen, har i hög grad ökat vår förståelse av biologin av denna art. Detta gynnade spridningen av nya strategier för genom manipulation, vilket can appliceras på befolkningskontroll.

I detta sammanhang spelar embryo mikroinjektion en dubbel roll i att utöka verktygslåda för medfly kontroll. Förmågan att störa funktionen av gener som reglerar viktiga biologiska processer, ja, expanderar vår förståelse av den molekylära maskiner underliggande medfly invasiv. Dessutom, förmågan att uppnå bakterielinjetransformation underlättar produktionen av flera transgena stammar som kan testas för framtida fältapplikationer i nya SIT inställningar. I själva verket kan genetisk manipulation kan användas för att ge önskvärda egenskaper som kan till exempel användas för att övervaka sterila manliga prestanda i fält, eller som kan leda till tidig etapp i livet dödlighet. Här beskriver vi en metod för att mikroinjicera nukleinsyror i medfly embryon för att uppnå dessa två huvudmål.

Introduction

Medelhavsfruktflugan (medfly) Ceratitis capitata är en kosmopolitisk art som i stor utsträckning skadar frukt och odlade grödor. Det tillhör Tephritidae familjen, som omfattar flera skadedjur, såsom de som tillhör släktena Bactrocera och Anastrepha. Den medfly är de mest studerade arterna av denna familj, och det har blivit en modell inte bara för studier av insekts invasioner 1, men också för att optimera växtskydd strategier 2.

Den medfly är en multivoltine art som kan angripa mer än 300 arter av vilda och odlade växter 3,4. Skadan orsakas av både vuxna och larvstadier: parade honor hål i fruktens yta för äggläggning, så mikroorganismer att påverka deras kommersiella kvalitet, medan larverna foder på fruktkött. Efter tre larvstadier, larver fram ur värden och förpuppas i jorden. Ceratitiscapitata visar en nästan global distribution, inklusive Afrika, Mellanöstern, Western Australia, Central- och Sydamerika, Europa och delar av USA 5.

De vanligaste strategier för att begränsa medfly angrepp innebära användning av insekticider (t.ex. malation, spinosad) och miljövänliga Steril Insect Technique (SIT) 6. Den senare metoden innebär utsläpp i naturen av hundratusentals män utförda steril genom exponering för joniserande strålning. Parningen av sådana steriliserade hanar till vilda kvinnor resulterar i någon avkomma, vilket leder till en minskning av befolkningsstorlek, så småningom leder till utrotning. Även SIT har visat sig effektiv i flera kampanjer runt om i världen, dess stora nackdelar innefattar de höga kostnaderna för uppfödning och sterilisering miljontals insekter att släppas. Märkning av utsatta fiskar är nödvändigt att skilja steril från vilda insekter fångas i fältet underövervakningsverksamhet och det är för närvarande uppnås med hjälp av fluorescerande pulver. Dessa förfaranden är kostsamma och har oönskade bieffekter 7.

För att optimera och / eller att utveckla mer effektiva metoder för kontroll av denna skadegörare, har medfly biologi och genetik i stor utsträckning utforskats av många forskare världen över. Tillgängligheten av medfly genomsekvensen 8,9, kommer att underlätta nya undersökningar på genfunktioner. RNA-interferens är ett kraftfullt verktyg för sådana studier och det kan uppnås genom mikroinjektion av dsRNA (dubbelsträngat RNA) eller siRNA (små störande RNA). Denna teknik har använts, till exempel för att visa att könsbestämning molekyl kaskad i C. capitata endast delvis bevarad med avseende på den av Drosophila 10.

Utvecklingen av protokoll för att mikroinjicera medfly embryon tillåts C. capitata att vara den första icke-Drosophilid Gylf arter som skall genetiskt modifierade. Som dess ägg liknar dem av Drosophila, både vad gäller morfologi och motståndskraft mot uttorkning 11, till protokollet leverera plasmid-DNA i pre-BLASTODERM embryon först utvecklats för D. melanogaster 12,13 ursprungligen anpassad för användning i C. capitata. Dessa första försök tillåts medfly bakterielinjetransformation baserat på det transponerbara elementet Minos 11. Därefter det ursprungliga systemet modifierade 14 användning av andra transposonbaserade baserade metoder. Detta är fallet med piggyBac från Lepidoptera Trichoplusia ni 15. Protokollet har därefter ytterligare optimeras och detta har gjort det möjligt att omvandla andra tephritid arter 16-21 och även många andra Diptera 22-31. Alla dessa system förlitar sig på användningen av en typisk binär vektor / hjälparplasmid transformationssystem: artificiell, defekt transposöner innehållande önskade gener sätts samman till plasmid-DNA och integreras i genomet hos insekten genom att tillföra nämnda transposas enzymet 32. Ett antal transgena medfly linjer har genererats, med flera funktioner, inklusive stammar som bär en villkorlig dominant letal gen som inducerar letalitet, stammar som producerar han-bara avkomma och därmed inte kräver ytterligare könsbestämning strategier, och stammar med fluorescerande spermier, vilket kan förbättra noggrannheten av SIT övervakningsfasen 33-37. Även utsläpp i naturen av transgena organismer har skett i pilottester mot mygg endast 38,39, är åtminstone ett företag utvärderar ett antal transgena medfly stammar för deras användning i fält 40.

Embryo mikroinjektion kan också främja utvecklingen av nya genomet redigeringsverktyg, såsom transkriptionsaktivator liknande effektor nukleaser (Talens), klustrade regelbundet mellanrum korta palindromiska upprepningar (CRISPR) / crispr associerat protein 9 nukleas (Cas9) och homing-endonukleaser gener (HEGs), som gör det möjligt nya evolutionära och utvecklingsstudier, samt expanderar den tillgängliga biotekniska verktygslådan. Genome-redigering metoder redan tillät genereringen av genen-drivsystem i myggor 41, och deras överföring till medfly är nära förestående. Här beskriver vi en universell protokoll för microinjecting nukleinsyror i medfly embryon som kan vara användbara för alla de ovan nämnda ansökningarna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. försöksuppställningen

  1. insectary krav
    1. Bibehålla alla C. capitata levnadsstadier vid 25 ° C, 65% luftfuktighet och 12/12 h ljus / mörker fotoperiod.
    2. Häll ca 1,500-2,000 medfly puppor i en 6 L bur. Använd en bur med en mässings mesh på ena sidan med hål tillräckligt små för att stimulera äggläggning 42. Sätt en svamp remsa genom en liten öppning i buren bas för att ge flugor med vatten med hjälp av kapillärkraften. Använd en blandning av jäst och socker (01:10) som födokälla för vuxna (Figur 1A). Öka mängden jäst (upp till 1: 3, jäst: socker) bör honorna misslyckas med att lägga ägg.
    3. Placera en platta fylld med vatten under buren för att samla ägg deponerade genom nätet. Som jungfru honor kan oviposit, vänta tills flugorna är minst 6-7 dagar gammal innan insamling av ägg för mikroinjektion experiment. Detta kommer att säkerställa att honorna kommer att ha paratoch att äggen har kommer befruktats.
    4. Samla äggen genom att filtrera vattnet med en fint nät sil. Överför ägg från silen i en plastlåda som innehåller standardlarv mat (1,5 LH 2 O, 100 ml HCl 1%, 5 g brett spektrum antimikrobiella medlet löst i 50 ml etanol, 400 g socker, 175 g avmineraliserat öljäst, en kg mjukt vetekli) med användning av en pasteurpipett.
    5. Placera varje låda i en genomskinlig behållare stängd med en netto lock för att tillåta luftcirkulation och som innehåller ett lager av kli att gynna förpuppning (Figur 1B).
    6. Efter ungefär 10 dagar, kontrollera om 3: e stadiet larver som dyker upp från larver mat och hoppa ner i kli skikt för förpuppning.
    7. 24 timmar senare, samla puppor i en liten kopp med en mjuk borste och överföra dem till en ny vuxen bur. Vuxna fram normalt 10 dagar efter förpuppning. Den framväxande fluga använder ptilinum, en uppblåsbar ficka belägen på huvudet ovanför the basen av antenner, för att tvinga bort i slutet av den puparium. Efter uppkomst, kollapsar ptilinum permanent tillbaka inne i huvudet.
  2. Framställning av ett L mat för injiceras larver
    1. Lös 2,5 g agar i 300 ml H2O
    2. Varm 500 ml H2O på en varm omrörning platta och lös upp 4 g Natriumbensoat, 4,5 ml 37% HCl, 42 g jästextrakt och 115 g dehydratiserad morotspulver.
    3. Lägg till blandningen en lösning av 2,86 g med brett spektrum antimikrobiella medlet löst i 10 ml absolut etanol.
    4. Distribuera det medium i 15 cm runda petriskålar och låt svalna. Om nödvändigt, förvara vid 4 ° C.
  3. glaspreparering
    1. Placera en 2 cm remsa av dubbelhäftande tejp på ett objektglas (75 x 26 mm 2) och markera kanterna med en porslins markör, för att förhindra att olja sprids och den därav uttorkning av de injicerade embryon.
  4. Isolera plasmid-DNA med användning av kommersiellt tillgängliga kit 34. Fälla ut plasmiden med användning av etanol och återsuspendera i injektionsbuffert (0,1 mM fosfatbuffert, pH 7,4, 5 mM KCl) vid den önskade koncentrationen.
  5. Rena in vitro syntetiseras långa dsRNA med hjälp av fenol-kloroform, utfällning med isopropanol och återsuspendera i injektionsbuffert 43.

2. Embryo Framställning

  1. Placera en bricka fylld med vatten under en bur innehållande 6-7 dagar gamla vuxna.
  2. Låt kvinnor att oviposit under 30 minuter och sedan samla embryon genom att filtrera vattnet med hjälp av en fin sil. alltid hålla silen i vatten för att undvika uttorkning av embryona.
  3. Dechorionate embryon genom immerging silen under 5 sekunder i en kommersiell 50% blekmedel lösning.
  4. Tvätta embryon noggrant genom att upprepade gånger immerging silen i rent ultrarent vatten (åtminstone4-5 gånger). Slutligen, placera silen i rent ultrarent vatten. Använd embryon inom högst två timmar.
    OBS: Tidpunkten för mikroinjektion är relaterad till behovet av att injicera i före BLASTODERM embryon, under en fas av kärn divisioner före cellularization. Detta gör det injicerade DNA tas upp i kärnan, särskilt i de ursprungliga könsceller kärnor som har sitt ursprung i könsceller. I Drosophila, cellularization vid polsk cellerna börjar vid ca 90 min efter befruktning (vid 25 ° C), med BLASTODERM bildning inträffar ca 30 min senare 44, medan i det medfly cellularization sker mellan 9 och 12 tim 45,46.
  5. Embryo orientering i rader
    1. Med hjälp av en fin pensel, samla ca 50 embryon och placera dem på en skiva av svart filterpapper indränkt med vatten.
    2. Under en dissekera stereomikroskop, ordna embryona i en rad på den övre ytan av den dubbelsidiga tejpen påobjektglas med användning av en fin pensel (000) (Figur 1C).
      OBS: Rikta in embryon i samma riktning, som injektion utförs i den bakre stolpen, där bakterie linjen kommer ursprung; den bakre polen är motsatt den micropyle regionen.
    3. Täck embryon med ett lager av klortrifluoreten olja att se till att oljan inte spiller över Kina markör gränserna (se 1.3).
      OBS: Innan täcka embryon med olja, ett ytterligare steg kan utföras: embryona kan torkas under några minuter för att minska deras flytande innehåll och därmed underlätta införandet av det injicerade DNA-lösningen. Detta kan bidra till att undvika embryo spricker under injektion eller överdrivet läckage av den injicerade lösningen, som en följd av det höga vätsketrycket.

3. Embryo Mikroinjektion

  1. Fyll en nål (1-2 l) med plasmid-DNA eller dsRNA lösning (1-2 mikrogram / l) med en mikropipett.
  2. Utför mikroinjektion under ett stereomikroskop, med användning av en mikromanipulator för att styra rörelserna hos nålen (figur 1D). Använd mikroskop scenen för att flytta bilden.
    1. Placera bilden på scenen av tillämpningsområdet.
    2. In spetsen av nålen i den bakre polen av embryot (Figur 1E).
    3. Injicera lösningen genom att aktivera mikroinjektion systemet med pedalen. Den injicerade vätskan inducerar en ökning av inre tryck, vilket resulterar i en liten rörelse av embryot.
    4. Släpp pedalen och omedelbart, men försiktigt, ta bort nålen från embryot.
    5. Observera en liten cytoplasmatiskt läckage vid injektionsstället.
      OBS: För att skilja mellan potentiella dödliga effekter av DNA / dsRNA / siRNA och dödlighet på grund av mikroinjektion proförfarandet själv, måste kontrollexperiment utföras. Dessa består av injektion av enbart buffert, eller, i fallet med omvänd genetik experiment, av ett grönt fluorescerande protein (GFP) härlett dubbelsträngat RNA (dsRNA-GFP), eller siRNA.
  3. Efter injektion inkubera embryona vid 25 ° C.

4. Post-injektion procedurer

  1. Två dagar efter injektionen, kontrollera bilderna för kläckta larverna (figur 1F) under ett stereomikroskop. Larver kan röra sig i oljan utan att behöva överföras till larv mat så snart som möjligt. Av denna anledning, ta glasen flera gånger om dagen.
  2. Med hjälp av en fin pensel (000), försiktigt överföra kläckta larverna till morot baserade larver mat. Överför upp till maximalt 200 larver per varje petriskål.
  3. Inkubera larverna vid 65% fuktighet (25 ° C). Se till att locket inte fastnar i skålen, försämrar luftväxling.
  4. Håll petriskålar med lockmestadels stängd, så att det fortfarande finns luftflödet till larver. Att undvika överdriven torkning, ta disken dagligen och, om det behövs, tillsätt vatten för att kompensera för avdunstning.
  5. Placera petriskålar i en klar behållare stängd av en netto lock och innehåller ett lager av kli att gynna förpuppning. När det gäller rutin insectary uppfödning, 3: e stadiet larver hoppa ur larver mat och förpuppas i kliet.
  6. Samla puppor och placera dem i en liten bur för vuxna uppfödning och screening (detta är Generation 0, G0). Bakre avkomman på standard larver mat.
  7. När det gäller bakterielinjetransformationsexperiment, kontrollera eventuella transformerade individer i nästa generation (G1), som injicerade individer är oftast chimärer. Transpositionshändelser, faktiskt kan ha inträffat i någon av kärnorna i den framväxande syncytium, som kommer att bilda antingen bakterielinjen eller soma.
    1. Strax efter uppkomst, söva G1 individer med hjälp av CO2 och kontrollera transfFörnyelsen händelser i en epifluorescence stereo. För att screena för närvaro av röd fluorescens, använd en DsRedwide filter (Ext 546/12,.. Emm 605/75), medan till skärmen för grön fluorescens använder EYFP filtret (Ext 500/20,.. Emm 535/30) .
    2. Placera transformerade personer i en liten bur med vildtyp vuxna av det motsatta könet och har sitt ursprung en ny, initialt heterozygot, stam.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Här rapporterar vi två tillämpningar av embryomikroinjektion riktas mot den funktionella karakteriseringen av en gen av intresse (Case 1), och vid generering av transgena stammar (Fall 2), respektive.

Leverans av dsRNA till embryon för att riva upp genfunktion.

Den innexin-5-genen kodar för ett gap-junction att i insekter, uttrycks specifikt i manliga och kvinnliga könskörtlar 43,47,48. Baserat på den information som finns tillgänglig för närbesläktade arter, var dsRNA-inducerad geners uttryck förväntas leda till ablation av medfly kvinnliga och manliga könsceller-line. Totalt antal 2400 embryon injicerades med en 2 ug / ul dsRNA blandningen, från vilken 548 larver kläcks och 216 vuxna överlevde (opublicerade data). I omkring 75% av de vuxna, testiklar och äggstockar verkade vara antingen under-utvped eller helt frånvarande (Figur 2). Kvantifiering av innexin-5 transkriptet överflöd i de bakkroppen av individer från båda könen bekräftade signifikant lägre expression av genen, i jämförelse med kontrollerna.

Generering av transgena stammar med fluorescerande spermier.

Medfly transgena stammar med fluorescensmärkt sperm genererades genom Scolari och kollegor 34 genom att injicera embryon med plasmid-DNA. Blandningen innehöll två plasmider blandas i fasta relativa procentsatser: en, den "Helper plasmid", kodade piggyBac transposas; den andra, "Donor plasmid", innehöll det artificiella transposonet och genom två fluorescerande markörer, ett uttryck i soma av hanar och honor, den andra specifikt i testiklarna. Promotorn av beta 2-tubulin-genen, som ansvarar för tEstes specifikt uttryck, fuserades vid ATG med de kodande sekvenserna för de fluorescerande proteinerna turboGFP (konstrukt # 1260) eller DsRedExpress (konstrukt # 1261), respektive. Ett totalt antal av 821 embryon injicerades, från vilket 205 larver kläcks och 37 vuxna överlevde. 9 kvinnor och 8 män korsningar sattes upp, varav 6 gav fluorescerande avkomma 34 (licens att återanvända dessa data som erhållits från Elsevier - licensnummer 3796240759880). Den framgångsrika omvandlingen lett till utvecklingen av stammar med gröna och röda fluorescerande testiklar, respektive (Figur 3).

Figur 1
Figur 1. insectary utrustning och embryon. (A) Standard uppfödning bur innehållande 1,500-2,000 vuxna. Honorna lägger ägg genom mässing mesh på framsidan av buren. Ägg samlas i vatten. Till vänstersidan av buren, är silen användas för att filtrera äggen synliga. (B) Två lådor av standard larver livsmedel som innehåller larver. Rutorna är placerade i en större klar plastlåda som innehåller kli för att underlätta förpuppning; nätet täcker lådan har tagits bort. (C) Embryon arrangeras i rader. Kanterna på dubbelsidig tejp på bilden har markerats med en vit porslin markör. Ägg inriktade på bandet kommer att täckas med klortrifluoretylen olja. (D) Mikroinjektion apparat (till vänster) som är ansluten till ett stereomikroskop utrustat med en mikromanipulator (höger). (E) Embryo poler; den röda pilen anger den bakre polen (injektionsstället), medan den svarta pilen indikerar ögonglobens främre del (där micropyle är belägen). Skalstreck = 500 | j, m. (F) kläckt larv rör sig i oljan. Skalstreck = 500 | j, m. GrundenSE klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Manliga och kvinnliga med underutvecklade könskörtlarna. Kvinna (till vänster) och hane (höger) dissekeras reproduktiva områden. Ovan: vildtyp personer med normal könskörtlar. Nedan: störde personer med underutvecklade könskörtlarna. MAG: Man tillbehör Förskruvningar; Sp: spermathecae. Skalstreck = 500 nm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Transgen hanar med fluorescerande testiklar och vuxna hanar spermier. Transformerade med konstruktion # 1260 och # 1261, respektive. Pilarna anger fluorescent testiklar. # 1260 hanar visar röd kropp och gröna testiklar, medan # 1261 män visar röda testiklar och grönkroppar. Skalstreck = 2 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikroinjektion av nukleinsyror i insektsembryon är en universell teknik som underlättar både analysen av genfunktion och biotekniska tillämpningar.

Den senaste publiceringen av genomsekvenser från ett ökande antal insektsarter leder till ett akut behov av verktyg för funktionell karakterisering av gener av ännu okänd funktion. RNA-interferens har visat sig vara en av de mest värdefulla metoder för att sluta molekylära funktioner 49 och embryomikroinjektion underlättar dessa studier.

Injektion av plasmid-DNA kan användas för att modifiera insektsRing med transposas-medierad geninsättning, och, mer nyligen, genom-redigeringsverktyg (t.ex. talen, crispr / Cas9, HEGs). Dessa tekniker har redan möjliggjort utvecklingen av stammar av flera insekter arter som kan användas för bekämpning av skadedjur program, som syftar både till att utrota eller byte av vilda populationen wed insekter med modifierade biologiska egenskaper. I detta protokoll, beskriver vi en optimerad metod för medfly embryo mikroinjektion med antingen plasmid-DNA eller dsRNA.

Tillgången på väletablerade och kostnadseffektiva halvtorr larv medium för medfly uppfödning, liksom den omfattande molekylär information uppnås under åren av forskare som studerar könsbestämning och cellularization processen i denna art, i hög grad underlätta upprättandet av en tillförlitlig embryomikroinjektion protokoll. I synnerhet har uppfödning protokoll har optimerats för att säkerställa maximal fertilitet och livskraft embryona. Detta är viktigt för att maximera sannolikheten för att erhålla livsdugliga vuxna med minst antal injicerade embryon möjliga. Olika protokoll finns tillgängliga för medfly uppfödning, såsom morot baserade larver mat som vi beskriver bakåt den injicerade larver. Emellertid är denna metod dyrare och dess framställning är mer tidskrävande änandra medier som används för rutin uppfödning.

Ett viktigt hinder för användningen av mikroinjektion är den ospecifika skador orsakade av mekanisk manipulation av embryon. Detta inkluderar flera variabler som påverkar överlevnaden av embryon, såsom piercing av embryot membran med penseln som används för att orientera embryona, de injicerade volymerna, injektionsstället och buffert, och vilken typ av nål som används 50. Vissa av dessa parametrar har optimerats, såsom de injicerade volymerna och bufferten. I fallet med nålar, kan de också framställas i-huset med hjälp av en avdragare, och detta kräver en optimeringssteg för att bestämma den ideala protokollet.

Bland de största nackdelarna i mikroinjektion förfarande är också dechorionation: även om detta steg är viktigt att göra äggen lättare att föraren (dvs mindre hala) och underlätta injektion, kan långvarig exponering för blekmedel kraftigt påverka embryonala vitalitet. for detta skäl protokoll beskriver vi här rapporterar användningen av en mycket kort dechorionation tid (fem sekunder), som har etablerats som en bra kompromiss mellan avlägsnande av chorion och överlevnad.

De protokoll som används för att bak den efterföljande stadiet är också relevant. Larver kläckts från injicerade embryon måste avlägsnas från oljan så fort som möjligt. Olja är verkligen viktigt att förhindra uttorkning av embryon, men kan vara skadliga för larverna. Den metod som används för att ta bort larver, den tid som tillbringas i oljan, och den typ av livsmedel som används är alla viktiga variabler som måste beaktas eftersom de kan äventyra den slutliga överlevnad.

När screening vuxna och larver kan immobilisering metoder också vara kritisk. Medfly vuxna kan immobiliseras antingen is eller CO2, men långvarig exponering kan vara skadlig för vuxna överlevnad. Som ett alternativ till embryomikroinjektion, har oral avgivning visat sigvara en mindre invasiv och potentiellt hög genomströmning metod för att utföra RNAi analyser. Det kan vara särskilt effektiv i arter som inte är mottagliga för mikroinjektion, liksom för RNAi-medierad skadedjursbekämpning i fältpopulationer.

I detta dokument har två fall rapporterats som exempel på möjliga tillämpningar av det protokoll som beskrivs: först, den framgångsrika omvandlingen genom transposas-medierad gen införande av medfly genomet, vilket ledde till upprättandet av flera stammar med fluorescerande testiklar. Användning av en liknande mikroinjektion förfarande är det även möjligt att injicera dsRNA, med effekterna av knockdown blir synlig tills vuxna stadiet.

Inrättandet av en tillförlitlig mikroinjektion protokoll för medfly embryon öppnade vägen att överväga genetiskt modifierade stammar som ett verktyg för att kontrollera flugor i naturen, som alternativa eller kompletterande strategier för att klassiska metoder, inklusive Steril InsectTeknik. Slutligen kan de senaste framstegen inom tekniken för automatiserad mikroinjektion i zebrafisk embryon potentiellt bidra till utvecklingen av hög genomströmning leveranssystem med viktig betydelse för att skapa transgena stammar av medfly och andra relevanta skadedjur 51.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 x injection Buffer 0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5 mM KCl
Construct Plasmid
Helper Plasmid
dsRNA Phenol-Chloroform purified
Standard Larval food 1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer's yeast, 1 kg soft wheat bran
Carrot Larval Food 2.5 g agar, 4 g sodium benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1 L
Adult Food yeast extract and sugar (1:10)
Microscope slides Sigma-Aldrich Z692247
Injection needles  Eppendorf 5242956000
Microloaders Eppendorf 5242956003
Double slided tape
Whatman Black circle paper Sigma-Aldrich Z695505
Bleach Diluite 1:2 before use
Paintbrush (000)
Micromanipulator Narishige MN-153
Microinjector Eppendorf Femtojet
Adult cages
Chlorotrifluoroethylene oil Sigma-Aldrich H8898
Ceratitis capitata The strain used is ISPRA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Diamantidis, A. D., Carey, J. R., Nakas, C. T., Papadopoulos, N. T. Population-specific demography and invasion potential in medfly. Ecol. Evol. 1, 479-488 (2011).
  2. Augustinos, A. A., et al. Exploitation of the Medfly Gut Microbiota for the Enhancement of Sterile Insect Technique: Use of Enterobacter sp. in Larval Diet-Based Probiotic Applications. PLoS ONE. 10, e0136459 (2015).
  3. Liquido, N., Shinoda, L., Cunningham, R. Host plants of Mediterranean fruit fly: an annotated World review. Ann Entomol Soc Am. 77, 1-52 (1991).
  4. Szyniszewska, A. M., Tatem, A. J. Global assessment of seasonal potential distribution of Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). PLoS ONE. 9, e111582 (2014).
  5. Malacrida, A. R., et al. Globalization and fruitfly invasion and expansion: the medfly paradigm. Genetica. 131, 1-9 (2007).
  6. Dyck, V. A., Hendrichs, J., Robinson, A. S. Sterile Insect Technique: Principles and practice in Area-wide Integrated Pest Management. Springer. (2005).
  7. Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
  8. i5k Genome Sequencing Initiative for Insects and Other Arthropods. Available from: http://arthropodgenomes.org/wiki/i5K (2016).
  9. Handler, A. Medfly Genome Annotation Groups. Available from: https://www.hgsc.bcm.edu/arthropods/medfly-genome-annotation-groups (2016).
  10. Pane, A., Salvemini, M., Delli Bovi, P., Polito, C., Saccone, G. The transformer gene in Ceratitis capitata provides a genetic basis for selecting and remembering the sexual fate. Development. 129, 3715-3725 (2002).
  11. Loukeris, T. G., Livadaras, I., Arcà, B., Zabalou, S., Savakis, C. Gene transfer into the medfly, Ceratitis capitata, with a Drosophila hydei transposable element. Science. 270, 2002-2005 (1995).
  12. Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
  13. Hoy, M. Insect Molecular Genetics. An Introduction to Principles and Applications. 3rd edn, Academic Press. (2013).
  14. Christophides, G. K., Livadaras, I., Savakis, C., Komitopoulou, K. Two medfly promoters that have originated by recent gene duplication drive distinct sex, tissue and temporal expression patterns. Genetics. 156, 173-182 (2000).
  15. Handler, A. M., McCombs, S. D., Fraser, M. J., Saul, S. H. The lepidopteran transposon vector, piggyback, mediates germ-line transformation in the Mediterranean fruit fly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 7520-7525 (1998).
  16. Handler, A. M., Harrell, R. A. 2nd Transformation of the Caribbean fruit fly, Anastrepha suspensa, with a piggyBac vector marked with polyubiquitin-regulated GFP. Insect Biochem Mol Biol. 31, 199-205 (2001).
  17. Koukidou, M., et al. Germ line transformation of the olive fly Bactrocera oleae using a versatile transgenesis marker. Insect Mol Biol. 15, 95-103 (2006).
  18. Condon, K. C., et al. Germ-line transformation of the Mexican fruit fly. Insect Mol Biol. 16, 573-580 (2007).
  19. Raphael, K. A., et al. Germ-line transformation of the Queensland fruit fly, Bactrocera tryoni, using a piggyBac vector in the presence of endogenous piggyBac elements. Genetica. 139, 91-97 (2011).
  20. Meza, J. S., Nirmala, X., Zimowska, G. J., Zepeda-Cisneros, C. S., Handler, A. M. Development of transgenic strains for the biological control of the Mexican fruit fly, Anastrepha ludens. Genetica. 139, 53-62 (2011).
  21. Schetelig, M. F., Handler, A. M. Strategy for enhanced transgenic strain development for embryonic conditional lethality in Anastrepha suspensa. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9348-9353 (2012).
  22. Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
  23. Allen, M. L., O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. Stable, germ-line transformation of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 38, 701-710 (2001).
  24. Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem Mol Biol. 32, 1211-1220 (2002).
  25. Nolan, T., Bower, T. M., Brown, A. E., Crisanti, A., Catteruccia, F. piggyBac-mediated germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi using the red fluorescent protein dsRED as a selectable marker. J Biol Chem. 277, 8759-8762 (2002).
  26. Rodrigues, F. G., Oliveira, S. B., Rocha, B. C., Moreira, L. A. Germline transformation of Aedes fluviatilis (Diptera:Culicidae) with the piggyBac transposable element. Mem Inst Oswaldo Cruz. 101, 755-757 (2006).
  27. Terenius, O., Juhn, J., James, A. A. Injection of An. stephensi embryos to generate malaria-resistant mosquitoes. J Vis Exp. e216 (2007).
  28. Jasinskiene, N., Juhn, J., James, A. A. Microinjection of A. aegypti embryos to obtain transgenic mosquitoes. J Vis Exp. e219 (2007).
  29. Concha, C., et al. Efficient germ-line transformation of the economically important pest species Lucilia cuprina and Lucilia sericata (Diptera, Calliphoridae). Insect Biochem Mol Biol. 41, 70-75 (2011).
  30. Takken, W., Scott, T. W. Ecological Aspects for Application of Genetically Modified Mosquitoes. Springer. Netherlands. (2003).
  31. Handler, A. M., James, A. A. An Introduction to the History and Methodology of Insect Gene Transfer. Insect transgenesis: methods and applications. CRC Press. 3-26 (2000).
  32. Handler, A. M. A current perspective on insect gene transformation. Insect Biochem Mol Biol. 31, 111-128 (2001).
  33. Gong, P., et al. A dominant lethal genetic system for autocidal control of the Mediterranean fruitfly. Nat. Biotechnol. 23, 453-456 (2005).
  34. Scolari, F., et al. Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae). N Biotechnol. 25, 76-84 (2008).
  35. Schetelig, M. F., et al. Site-specific recombination for the modification of transgenic strains of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18171-18176 (2009).
  36. Schetelig, M. F., Caceres, C., Zacharopoulou, A., Franz, G., Wimmer, E. A. Conditional embryonic lethality to improve the sterile insect technique in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). BMC Biol. 7, 4 (2009).
  37. Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochem Mol Biol. 43, 1-8 (2013).
  38. Lacroix, R., et al. Open field release of genetically engineered sterile male Aedes aegypti in Malaysia. PLoS ONE. 7, e42771 (2012).
  39. Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 30, 828-830 (2012).
  40. Leftwich, P. T., et al. Genetic elimination of field-cage populations of Mediterranean fruit flies. Proc. Biol. Sci. 281, (2014).
  41. Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, E6736-E6743 (2015).
  42. Economopoulos, A. P., Judt, S. Artificial Rearing of the Mediterranean Fruit Fly (Diptera: Tephritidae): Size of Oviposition Holes. J. Econ. Entomol. 82, 668-674 (1989).
  43. Thailayil, J., Magnusson, K., Godfray, H. C., Crisanti, A., Catteruccia, F. Spermless males elicit large-scale female responses to mating in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 13677-13681 (2011).
  44. Gilbert, L. Insect Development. Morphogenesis, Molting and Metamorphosis. Academic Press. (2009).
  45. Schetelig, M. F., Horn, C., Handler, A. M., Wimmer, E. A. Area-Wide control of insect pests. From research to field implementation. Vreysen, M. J., Robinson, A., Hendrichs, J. Springer. 85-93 (2007).
  46. Gabrieli, P., et al. Sex and the single embryo: early development in the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Dev Biol. 10, 12 (2010).
  47. Tazuke, S. I., et al. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
  48. Gabrieli, P., Marois, E., Catteruccia, F. Transgenic insects: techniques and applications. Benedict, M. Q. CABI. 188-207 (2014).
  49. Scolari, F., et al. How functional genomics will impact fruit fly pest control: the example of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Genet. 15, Suppl 15 2. S11 (2014).
  50. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
  51. Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats