Levering af nukleinsyrer gennem Embryo Mikroinjektion i Worldwide Agricultural Pest Insekt,
1Department of Biology and Biotechnology, University of Pavia

Published 10/01/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Gabrieli, P., Scolari, F. Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata. J. Vis. Exp. (116), e54528, doi:10.3791/54528 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Middelhavet bananfluen (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) er et skadedyr arter med ekstremt høj landbrugs relevans. Dette er på grund af sin reproduktive adfærd: hunner beskadige den udvendige overflade af frugt og grøntsager, når de lægger æg og udklækkede larver lever af deres pulp. Wild C. capitata befolkninger er traditionelt styret gennem insekticid sprøjtning og / eller miljøvenlige metoder, den mest succesfulde er den sterile Insect Teknik (SIT). Den SIT afhængig masse-opdræt, stråling-baserede sterilisation og felt frigivelse af mænd, der bevarer deres evne til at parre sig, men ikke er i stand til at generere frugtbare afkom. Fremkomsten og den efterfølgende hurtige udvikling af bioteknologiske værktøjer, sammen med tilgængeligheden af ​​medfly genomsekvens, har i høj grad styrket vores forståelse af biologien af ​​denne art. Dette begunstigede spredning af nye strategier for genom manipulation, hvilket can anvendes på befolkningskontrol.

I denne sammenhæng, embryo mikroinjektion spiller en dobbelt rolle i at udvide værktøjskassen for medfly kontrol. Evnen til at interferere med funktionen af ​​gener, der regulerer vigtige biologiske processer, ja, udvider vores forståelse af den molekylære maskineri, der understøtter medfly invasionsevne. Endvidere evnen til at opnå kimlinje-transformation letter produktionen af ​​multiple transgene stammer, der kan testes for fremtidige anvendelser i marken i hidtil ukendte SIT indstillinger. Faktisk kan genetisk manipulation kan anvendes til at bibringe ønskede træk, der kan for eksempel anvendes til at overvåge steril mandlige ydeevne i marken, eller som kan resultere i tidligt liv-fase letalitet. Her beskriver vi en metode til at microinject nukleinsyrer i Medfly embryoner til at nå disse to mål.

Introduction

Middelhavet bananfluen (medfly) Ceratitis capitata er en kosmopolitisk art at det ekstensive skader frugter og dyrkede afgrøder. Det hører til Tephritidae familien, som omfatter flere skadedyr arter, såsom dem, der tilhører slægterne Bactrocera og Anastrepha. Den medfly er de mest undersøgte arter af denne familie, og det er blevet en model, ikke kun for studiet af insekt invasioner 1, men også til optimering skadedyrsbekæmpelse strategier 2.

Den medfly er en multivoltine arter, der kan angribe mere end 300 arter af vilde og dyrkede planter 3,4. Skaden er forårsaget af både voksne og larvestadier: parret hunner gennembore overfladen af ​​frugt til æglægning, så mikroorganismer til at påvirke deres kommercielle kvalitet, mens larver lever på pulp. Efter tre larvestadier, larver emerge fra værten og forpupper i jorden. Ceratitiscapitata viser en næsten verdensomspændende distribution, herunder Afrika, Mellemøsten, Western Australia, Central- og Sydamerika, Europa og områder i USA fem.

De mest almindelige strategier til begrænsning Medfly parasitære indebærer brug af insekticider (f.eks Malathion, spinosad) og miljøvenlige Steril Insekt Teknik (SIT) 6. Sidstnævnte fremgangsmåde omfatter frigivelse i naturen af ​​hundredtusindvis af mænd ydede steril ved udsættelse for ioniserende stråling. Parringen af ​​sådanne steriliserede hanner til vilde hunner resulterer i ingen afkom, hvilket medfører en reduktion i befolkningens størrelse, i sidste ende fører til udryddelse. Selv SIT har vist sig effektiv i flere kampagner over hele verden, dens store ulemper omfatter de høje omkostninger ved opdræt og sterilisering millioner af insekter til at blive frigivet. Mærkning af genudsatte individer er nødvendigt at skelne sterile fra vilde insekter fanget i området underovervågningsaktiviteter og det er i øjeblikket opnås ved hjælp af fluorescerende pulvere. Disse procedurer er dyre og har uønskede bivirkninger 7.

For at optimere og / eller for at udvikle mere effektive metoder til bekæmpelse af dette skadedyr, har medfly biologi og genetik blevet bredt udforsket af mange forskere verden over. Tilgængeligheden af medfly genomsekvens 8,9, vil lette hidtil ukendte undersøgelser på genfunktioner. RNA-interferens er et kraftfuldt værktøj til sådanne undersøgelser, og det kan opnås gennem mikroinjektion af dsRNA (dobbeltstrenget RNA) eller siRNA (lille interfererende RNA). Denne teknik er blevet anvendt, for eksempel for at vise, at kønsbestemmelse molekylære kaskade i C. capitata er kun delvist bevaret i forhold til den for Drosophila 10.

Udviklingen af protokoller til microinject Medfly embryoner tilladt C. capitata at være den første ikke-Drosophilid Fluearter at være genetisk modificeret. Som sine æg ligner dem af Drosophila, både med hensyn til morfologi og modstand mod udtørring 11, til protokollen levere plasmid DNA i præ-blastoderm embryoer først udviklet til D. melanogaster 12,13 blev oprindeligt indrettet til brug i C. capitata. Disse første forsøg tilladt medfly kimlinje-transformation baseret på det transposerbare element Minos 11. Efterfølgende blev det oprindelige system modificerede 14 ved anvendelse af andre transposon tilgange. Dette er tilfældet for piggyBac fra Lepidoptera Trichoplusia ni 15. Protokollen er siden blevet yderligere optimeret og dette har tilladt omdannelsen af andre tephritid arter 16-21 og også for mange andre Diptera 22-31. Alle disse systemer er baseret på anvendelsen af ​​en typisk binære vektor / hjælper-plasmid transformation systemet: kunstig, defekt transposønner indeholdende ønskede gener samles til plasmid-DNA og integreres i genomet af insektet ved at give transposaseenzymet 32. En række transgene Medfly linjer er blevet genereret, med flere funktioner, herunder stammer, der bærer en betinget dominant letal gen, der inducerer letalitet, stammer, der producerer mandlige kun afkom og dermed ikke kræver yderligere kønsbestemmelse strategier, og stammer med fluorescerende sperm, der kan forbedre nøjagtigheden af SIT overvågningsfasen 33-37. Selv udgivelsen i naturen af transgene organismer er sket i pilotforsøg mod myg kun 38,39, er mindst én virksomhed evaluere en række transgene Medfly stammer for deres anvendelse i marken 40.

Embryo mikroinjektion kan også fremme udviklingen af ​​nye genom-redigeringsværktøjer, såsom transskription aktivator-lignende effektor nukleaser (Talens), grupperet regelmæssigt spatierede korte palindrome gentagelser (CRISPR) / CRISPR protein 9 nuklease (Cas9) og målsøgende endonukleaserne gener (HEGs), som vil sætte nye evolutionære og udviklingsmæssige undersøgelser, samt udvide den tilgængelige bioteknologiske værktøjskasse. Genom-redigering tilgange allerede tilladt generation af gen-drivsystemer i myg 41, og deres overførsel til medfly er nært forestående. Her beskriver vi en universel protokol for mikroinjektion nukleinsyrer i Medfly embryoner, der kan være nyttige for alle de ovennævnte programmer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Eksperimentel Set-up

  1. insektbetingelser krav
    1. Bevar alle C. capitata livsstadier ved 25 ° C, 65% fugtighed og 12/12 timers lys / mørke fotoperiode.
    2. Placer omkring 1.500-2.000 medfly pupper i en 6 L bur. Brug et bur med en messing mesh på den ene side med huller små nok til at stimulere æglægning 42. Indsæt en svamp strimmel gennem en lille åbning i buret base for at tilvejebringe fluer med vand ved hjælp af kapillarvirkning. Anvende en blanding af gær og sukker (1:10) som fødekilde for voksne (figur 1A). Øge mængden af ​​gær (op til 1: 3, gær: sukker) bør hunnerne ikke lægge æg.
    3. Placer en plade fyldt med vand under buret til at indsamle æggene deponeret gennem nettet. Som jomfruelige hunner kan lægge æg, vente, indtil fluerne er mindst 6-7 dage gammel, før indsamling af æg for mikroinjektion eksperimenter. Dette vil sikre, at hunnerne vil have parretog at æggene er blevet befrugtet.
    4. Saml æggene ved at filtrere vandet med et fint net si. Overfør æg fra sien i en plastik kasse med standard larve mad (1,5 LH 2 O, 100 ml HCI 1%, 5 g bredspektret antimikrobielt middel opløst i 50 ml ethanol, 400 g sukker, 175 g demineraliseret ølgær, en kg blød hvede klid) under anvendelse af en Pasteur-pipette.
    5. Placer hver boks i en gennemsigtig beholder lukket med en netto låg for at tillade luftcirkulation og indeholdende et lag af klid at favorisere pupation (figur 1B).
    6. Efter omkring 10 dage, så tjek for 3. stadiums larver, der kommer ud af larve mad og hoppe ned i klid lag til pupation.
    7. 24 timer senere, indsamle pupper i en lille kop med en blød børste og overføre dem til en ny voksen bur. Voksne normalt dukke 10 dage efter pupation. Den nye flue bruger ptilinum, en oppustelig lomme placeret på hovedet over the bunden af ​​antenner, for at tvinge fra slutningen af ​​puparium. Efter fremkomsten, den ptilinum permanent kollapser tilbage inde i hovedet.
  2. Fremstilling af 1 L fødevarer til mikroinjiceres larver
    1. Opløs 2,5 g agar i 300 ml H2O
    2. Varm 500 ml H2O på en varm omrøring plade og opløses 4 g natriumbenzoat, 4,5 ml 37% HCI, 42 g gærekstrakt og 115 g dehydreret gulerod pulver.
    3. Tilføj til blandingen en opløsning af 2,86 g bredspektret antimikrobielt middel opløst i 10 ml absolut ethanol.
    4. Fordel mediet i 15 cm rundt petriskåle og lad det køle af. Hvis det er nødvendigt, opbevares ved 4 ° C.
  3. forberedelse Slide
    1. Placer en 2 cm strimmel af dobbeltsidet tape på et objektglas (75 x 26 mm 2) og markere kanterne med en Kina markering, for at forhindre olie spredning og deraf følgende udtørring af de injicerede embryoner.
  4. Isoler plasmid-DNA under anvendelse af kommercielt tilgængelige kits 34. Præcipitere plasmidet under anvendelse af ethanol og resuspender i injektion puffer (0,1 mM, pH 7,4, 5 mM KCI) i den ønskede koncentration.
  5. Rens in vitro syntetiseret lang dsRNA hjælp phenol-chloroform, udfældes bruge isopropanol og re-suspendere injektion buffer 43.

2. Embryo Forberedelse

  1. Placer en bakke fyldt med vand under et bur, der indeholder 6-7 dage gamle voksne.
  2. Tillad hunnerne at lægge æg i 30 minutter og derefter indsamle embryoner ved filtrering af vand under anvendelse af en fin si. Hold altid sien i vand for at undgå udtørring af fostrene.
  3. Dechorionate embryoner ved immerging sien i 5 sek i en kommerciel 50% blegemiddel løsning.
  4. Vask embryoner omhyggeligt ved gentagne gange immerging sien i rent ultrarent vand (mindst4-5 gange). Endelig placere sien i rent ultrarent vand. Brug embryoner inden maksimum 2 timer.
    BEMÆRK: Timingen af ​​mikroinjektion er relateret til behovet for at tilføre pre-blastoderm embryoner, i en fase af nukleare divisioner før cellularization. Dette tillader den injicerede DNA, der skal optages i kernerne, specielt i de primordiale kønsceller kerner, der vil oprindelse gameterne. I Drosophila, cellularization på pole celler begynder ved omkring 90 min efter befrugtningen (ved 25 ° C), med blastoderm dannelse forekommer omkring 30 min senere 44, mens der i medfly cellularization finder sted mellem 9 og 12 timer 45,46.
  5. Embryo orientering i rækker
    1. Ved hjælp af en fin pensel, indsamle omkring 50 embryoner og placere dem på en skive af sort filterpapir vædet med vand.
    2. Under en dissekere stereomikroskop, arrangere fostrene i træk på oversiden af ​​den dobbeltklæbende tape påmikroskopobjektglasset med en fin pensel (000) (figur 1C).
      BEMÆRK: Juster embryoner alle i samme retning, som injektion udføres i den bageste pol, hvor kim-linje vil stamme; den bageste pol er modsat micropyle region.
    3. Dæk embryoner med et lag af chlortrifluorethylen olie at sikre, at olien ikke løber over hele Kina markør grænser (se 1.3).
      BEMÆRK: Før dækker embryoner med olie, et yderligere skridt kan udføres: embryonerne kan udtørret i et par minutter for at reducere deres flydende indhold og dermed gøre det lettere for den injicerede DNA-opløsning. Dette kan bidrage til at undgå embryo brister under injektion eller overdreven udsivning af den injicerede opløsning, som følge af det høje væsketryk.

3. Embryo Mikroinjektion

  1. Fyld en nål (1-2 pi) med plasmid-DNA eller dsRNA-opløsning (1-2 pg / pl) under anvendelse af en mikropipette.
  2. Udfør mikroinjektion under et stereomikroskop ved hjælp af en mikromanipulator at styre bevægelserne af nålen (figur 1D). Brug mikroskop scenen for at flytte dias.
    1. Placer dias på scenen af ​​anvendelsesområdet.
    2. Sæt spidsen af nålen i den bageste pol af embryoet (fig 1E).
    3. Injicer opløsningen ved at aktivere mikroinjektion systemet med pedalen. Den indsprøjtede væske inducerer en stigning i indre tryk, hvilket resulterer i en lille bevægelse af embryoet.
    4. Slip pedalen og straks, men forsigtigt, fjernes kanylen fra embryoet.
    5. Overhold lidt cytoplasmatisk lækage på injektionsstedet.
      BEMÆRK: For at skelne mellem potentielle dødelige virkninger af DNA / dsRNA / siRNA og dødelighed på grund af mikroinjektion proprocedure selv, skal der udføres kontrolforsøg. Disse omfatter injektion af puffer alene, eller, i tilfælde af omvendt genetik eksperimenter, af et grønt fluorescerende protein (GFP) afledt dobbeltstrenget RNA (dsRNA-GFP), eller siRNA.
  3. Efter injektion inkubere fostrene ved 25 ° C.

4. Post-injektion Procedurer

  1. To dage efter injektion, kontrollere dias til udklækkede larver (figur 1F) under et stereomikroskop. Larver kan bevæge sig i olie, men skal overføres til larvernes fødevarer så hurtigt som muligt. Af denne grund, kontrollere objektglassene flere gange om dagen.
  2. Ved hjælp af en fin pensel (000), forsigtigt overføre udklækkede larver til gulerod-baserede larve mad. Overfør op til et maksimum på 200 larver pr hver petriskål.
  3. Inkuber larverne ved 65% fugtighed (25 ° C). Sørg for, at låget ikke holde sig til fadet, forringer luftskifte.
  4. Hold petriskåle med lågethovedsagelig lukket så at der stadig er luftstrømmen til larver. For at undgå overdreven udtørring, kontrollere retterne dagligt og, hvis det er nødvendigt, tilsæt vand til at kompensere for fordampning.
  5. Placer petriskåle i en klar beholder lukket af en net-låg og indeholder et lag af klid at favorisere pupation. Som for rutinemæssig insektbetingelser opdræt, 3. stadiums larver hoppe ud af larve mad og forpupper sig i klid.
  6. Saml pupper og placere dem i et lille bur for voksne opdræt og screening (dette er Generation 0, G0). Rear afkommet på standard larver mad.
  7. I tilfælde af kimlinje-transformationsforsøg, kontrollere for eventuelle transformerede individer i den næste generation (G1), som injicerede individer sædvanligvis er kimærer. Transpositionshændelser faktisk kan være forekommet i nogen af ​​kernerne i den embryoniske syncytium, som vil danne enten kimlinjekonfiguration eller soma.
    1. Kort efter fremkomsten, bedøver G1 individer ved hjælp af CO 2 og tjekke for transfsninger begivenheder under en epifluorescens stereomikroskop. For at screene for tilstedeværelsen af ​​røde fluorescens, bruge et DsRedwide filter (Ext 546/12;.. Emm 605/75), mens at screene for grøn fluorescens bruge EYFP filter (Ext 500/20;.. Emm 535/30) .
    2. Placer forvandlet individer i et lille bur med vildtype-voksne af det modsatte køn, og stammer en ny, i første omgang heterozygote, stamme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her rapporterer vi to anvendelser af embryo mikroinjektion rettet mod den funktionelle karakterisering af et gen af ​​interesse (Case 1), og ved generering af transgene stammer (sag 2), hhv.

Levering af dsRNA i embryoner at udrede genfunktion.

Den innexin-5-genet koder for et gap-junction, at i insekter, udtrykkes specifikt i de mandlige og kvindelige gonader 43,47,48. Baseret på den tilgængelige for nært beslægtede arter oplysninger blev dsRNA-induceret gen silencing forventes at resultere i ablation af medfly kvindelige og mandlige kim-line. Der er i alt 2.400 embryoer blev injiceret med en 2 pg / pl dsRNA blanding, hvorfra 548 larver udklækkes og 216 voksne overlevede (upublicerede data). I omkring 75% af de voksne, testikler og ovarier syntes at være enten under-udvikped eller helt fraværende (figur 2). Kvantificering af innexin-5 transkript overflod i abdomen individer fra begge køn bekræftede signifikant lavere ekspression af genet, sammenlignet med kontrollerne.

Frembringelse af transgene stammer med fluorescerende spermatozoer.

Medfly transgene stammer med fluorescensmærket sæd blev genereret af Scolari og kolleger 34 ved at injicere embryoner med plasmid-DNA. Blandingen indeholdt to plasmider blandet i faste relative procenter: én, de "Helper plasmid", kodede for piggyBac transposasen; den anden, den "donor plasmid", indeholdt den kunstige transposon og gennemføres to fluorescerende markører, én udtrykt i soma af hanner og hunner, den anden specifikt i testiklerne. Promotoren af beta 2-tubulin gen, der er ansvarlig for tEstes ekspression, blev fusioneret ved ATG med de kodende sekvenser af de fluorescerende proteiner turboGFP (konstrukt # 1260) eller DsRedExpress (konstrukt # 1261), henholdsvis. Der er i alt 821 fostre blev injiceret, hvorfra 205 larver klækket og 37 voksne overlevede. 9 kvindelige og 8 mandlige krydsninger blev set-up, seks af som gav fluorescerende afkom 34 (Licens til at genbruge disse data fra Elsevier - Licens nummer 3796240759880). Den vellykkede transformation førte til udviklingen af stammer med grønne og røde fluorescerende testikler, henholdsvis (figur 3).

figur 1
Figur 1. insektbetingelser udstyr og embryoner. (A) Standard opdræt bur indeholder 1.500-2.000 voksne. Hunnerne lægger æg gennem messing mesh på forsiden af ​​buret. Æg opsamles i vand. Til venstreside af buret, sien bruges til at filtrere æggene er synlig. (B) To kasser af standard larver fødevarer, der indeholder larver. Boksene er placeret i en større klar plast boks med klid at lette pupation; nettet dækker boksen er blevet fjernet. (C) Embryoner arrangeret i rækker. Kanterne af dobbelt-belagte bånd på diaset er blevet markeret med en hvid porcelæn markør. Æg justeret på båndet vil blive dækket med chlortrifluorethylen olie. (D) Mikroinjektion apparat (venstre) forbundet til et stereomikroskop udstyret med en mikromanipulator (højre). (E) Embryo poler; den røde pil angiver bageste pol (injektionsstedet), hvorimod den sorte pil viser den forreste pol (hvor micropyle er placeret). Scale bar = 500 um. (F) Skraveret larve bevæger sig i olien. Scale bar = 500 um. Anbringendese klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Mandlige og kvindelige med under-udviklede gonader. Kvinde (til venstre) og mandlige (højre) dissekeret reproduktive skrifter. Ovenfor: vildtype personer med normal gonader. Herunder: blandede personer med under-udviklede gonader. MAG'er: Mand Accessory Kabelforskruninger; Sp: spermathecae. Scale bar = 500 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Transgene hanner med fluorescerende testikler og sæd. Voksne hanner transformeret med konstrukt # 1260 og # 1261, hhv. Pile angiver fluospare- testikler. # 1260 mænd viser røde krop og grønne testikler, mens # 1261 hanner viser røde testikler og grønne organisationer. Scale bar = 2 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikroinjektion af nukleinsyrer i insekt embryoer er en universel teknik, der fremmer såvel analysen af ​​genfunktion og bioteknologiske anvendelser.

Den nylige offentliggørelse af genom-sekvenser fra et stigende antal insektarter fører til et presserende behov for værktøjer til funktionel karakterisering af gener af endnu ukendt funktion. RNA-interferens har vist sig at være en af de mest værdifulde metoder til at udlede molekylære funktioner 49 og embryo mikroinjektion letter disse undersøgelser.

Injektion af plasmid-DNA kan anvendes til at modificere insekt genomer under anvendelse transposase-medieret geninsertion, og på det seneste, genom-redigeringsværktøjer (f.eks Talen, CRISPR / Cas9, HEGs). Disse teknikker har allerede tilladt udviklingen af ​​stammer af flere insekter arter, der kan anvendes til skadedyrsbekæmpelse programmer, der sigter både på udryddelse eller udskiftning af vilde bestand wed insekter med modificerede biologiske funktioner. I denne protokol, beskriver vi en optimeret metode til medfly embryo mikroinjektion med enten plasmid DNA eller dsRNA.

Tilgængeligheden af ​​veletablerede og omkostningseffektiv halvtørt larve medium for medfly opdræt, samt den omfattende molekylær information opnået gennem årene af forskere studerer kønsbestemmelse og cellularization proces i denne art, i høj grad lette etableringen af ​​en pålidelig embryo mikroinjektion protokol. Især har opdræt protokol blevet optimeret til at sikre maksimal frugtbarhed og vitalitet af embryonerne. Dette er vigtigt for at maksimere sandsynligheden for at opnå levedygtige voksne med det mindste antal injicerede embryoner mulige. Forskellige protokoller er tilgængelige for medfly opdræt, såsom gulerod-baserede larvestadiet fødevarer, som vi beskriver at opdrætte den injicerede larver. Men denne metode er dyrere og dens fremstilling er mere tidskrævende endandre medier, der anvendes til rutinemæssig opdræt.

En vigtig barriere for brugen af ​​mikroinjektion er den ikke-specifikke skader forårsaget af den mekaniske manipulation af embryonerne. Dette omfatter flere variabler påvirker overlevelsen af embryoner, såsom piercing af embryoet membraner med malerpenslen anvendes til orientere embryonerne, de injicerede mængder, injektionsstedet og puffer, og den type nål, der anvendes 50. Nogle af disse parametre er blevet optimeret, såsom de injicerede mængder og bufferen. I tilfælde af nåle, kan de også produceres in-house under anvendelse af en aftrækker, og dette kræver en optimering trin til at bestemme den ideelle protokol.

Blandt de store ulemper i mikroinjektion procedure er også dechorionation: selv om dette trin er afgørende for at gøre æggene nemmere at handleren (dvs. mindre glat) og for at lette injektion, kan langvarig udsættelse for blegemiddel stærkt påvirke embryonale vitalitet. for denne grund protokollen vi beskriver her rapporterer anvendelsen af ​​et meget kort dechorionation tid (5 sek), der er etableret som et godt kompromis mellem fjernelse af chorion og overlevelsesraten.

De protokoller, der anvendes til bag den efterfølgende livsfase er også relevante. Larver udklækket af injicerede embryoner skal fjernes fra olien så hurtigt som muligt. Olie er faktisk vigtigt at forhindre udtørring af embryonet, men kan være skadelige for larverne. Den anvendte metode til at fjerne larver, tidsforbruget i olien, og den type fødevarer, der anvendes er alle vigtige variabler, der skal tages i betragtning, da de kan kompromittere den endelige overlevelsesrate.

Når screening voksen og larver, kan immobiliseringsorganet metoder også være kritisk. Medfly voksne kan immobiliseres ved hjælp af enten is eller CO 2, men langvarig eksponering kan være skadelig for voksne overlevelse. Som et alternativ til embryo mikroinjektion, har oral levering vist sig atvære en mindre invasive og potentielt høj kapacitet metode til at udføre RNAi analyser. Det kan være særlig effektiv i arter, som ikke kan underkastes en mikroinjektion, samt for RNAi-medieret skadedyrsbekæmpelse i feltpopulationer.

I dette papir, er to tilfælde blevet rapporteret som eksempler på de mulige anvendelser af protokollen beskrevet: første, den vellykkede transformation gennem transposase-medieret gen indsættelse af medfly genom, som førte til etableringen af ​​flere stammer med fluorescerende testikler. Anvendelse af en lignende procedure mikroinjektion, er det også muligt at injicere dsRNA, med virkningerne af knockdown er synligt Til den voksne stadium.

Etableringen af ​​en pålidelig mikroinjektion protokol for de Medfly embryoner åbnede vejen til at overveje genetisk modificerede stammer som et redskab til at kontrollere fluer i naturen, som alternative eller supplerende strategier til klassiske tilgange, herunder sterile InsectTeknik. Endelig kan de seneste fremskridt i teknologien til automatiseret mikroinjektion i zebra fisk embryoner potentielt bidrage til udviklingen af high throughput fremføringsmidler med vigtig betydning for at skabe transgene stammer af medfly og andre relevante skadedyr 51.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 x injection Buffer 0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5 mM KCl
Construct Plasmid
Helper Plasmid
dsRNA Phenol-Chloroform purified
Standard Larval food 1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer's yeast, 1 kg soft wheat bran
Carrot Larval Food 2.5 g agar, 4 g sodium benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1 L
Adult Food yeast extract and sugar (1:10)
Microscope slides Sigma-Aldrich Z692247
Injection needles  Eppendorf 5242956000
Microloaders Eppendorf 5242956003
Double slided tape
Whatman Black circle paper Sigma-Aldrich Z695505
Bleach Diluite 1:2 before use
Paintbrush (000)
Micromanipulator Narishige MN-153
Microinjector Eppendorf Femtojet
Adult cages
Chlorotrifluoroethylene oil Sigma-Aldrich H8898
Ceratitis capitata The strain used is ISPRA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Diamantidis, A. D., Carey, J. R., Nakas, C. T., Papadopoulos, N. T. Population-specific demography and invasion potential in medfly. Ecol. Evol. 1, 479-488 (2011).
  2. Augustinos, A. A., et al. Exploitation of the Medfly Gut Microbiota for the Enhancement of Sterile Insect Technique: Use of Enterobacter sp. in Larval Diet-Based Probiotic Applications. PLoS ONE. 10, e0136459 (2015).
  3. Liquido, N., Shinoda, L., Cunningham, R. Host plants of Mediterranean fruit fly: an annotated World review. Ann Entomol Soc Am. 77, 1-52 (1991).
  4. Szyniszewska, A. M., Tatem, A. J. Global assessment of seasonal potential distribution of Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). PLoS ONE. 9, e111582 (2014).
  5. Malacrida, A. R., et al. Globalization and fruitfly invasion and expansion: the medfly paradigm. Genetica. 131, 1-9 (2007).
  6. Dyck, V. A., Hendrichs, J., Robinson, A. S. Sterile Insect Technique: Principles and practice in Area-wide Integrated Pest Management. Springer. (2005).
  7. Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
  8. i5k Genome Sequencing Initiative for Insects and Other Arthropods. Available from: http://arthropodgenomes.org/wiki/i5K (2016).
  9. Handler, A. Medfly Genome Annotation Groups. Available from: https://www.hgsc.bcm.edu/arthropods/medfly-genome-annotation-groups (2016).
  10. Pane, A., Salvemini, M., Delli Bovi, P., Polito, C., Saccone, G. The transformer gene in Ceratitis capitata provides a genetic basis for selecting and remembering the sexual fate. Development. 129, 3715-3725 (2002).
  11. Loukeris, T. G., Livadaras, I., Arcà, B., Zabalou, S., Savakis, C. Gene transfer into the medfly, Ceratitis capitata, with a Drosophila hydei transposable element. Science. 270, 2002-2005 (1995).
  12. Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
  13. Hoy, M. Insect Molecular Genetics. An Introduction to Principles and Applications. 3rd edn, Academic Press. (2013).
  14. Christophides, G. K., Livadaras, I., Savakis, C., Komitopoulou, K. Two medfly promoters that have originated by recent gene duplication drive distinct sex, tissue and temporal expression patterns. Genetics. 156, 173-182 (2000).
  15. Handler, A. M., McCombs, S. D., Fraser, M. J., Saul, S. H. The lepidopteran transposon vector, piggyback, mediates germ-line transformation in the Mediterranean fruit fly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 7520-7525 (1998).
  16. Handler, A. M., Harrell, R. A. 2nd Transformation of the Caribbean fruit fly, Anastrepha suspensa, with a piggyBac vector marked with polyubiquitin-regulated GFP. Insect Biochem Mol Biol. 31, 199-205 (2001).
  17. Koukidou, M., et al. Germ line transformation of the olive fly Bactrocera oleae using a versatile transgenesis marker. Insect Mol Biol. 15, 95-103 (2006).
  18. Condon, K. C., et al. Germ-line transformation of the Mexican fruit fly. Insect Mol Biol. 16, 573-580 (2007).
  19. Raphael, K. A., et al. Germ-line transformation of the Queensland fruit fly, Bactrocera tryoni, using a piggyBac vector in the presence of endogenous piggyBac elements. Genetica. 139, 91-97 (2011).
  20. Meza, J. S., Nirmala, X., Zimowska, G. J., Zepeda-Cisneros, C. S., Handler, A. M. Development of transgenic strains for the biological control of the Mexican fruit fly, Anastrepha ludens. Genetica. 139, 53-62 (2011).
  21. Schetelig, M. F., Handler, A. M. Strategy for enhanced transgenic strain development for embryonic conditional lethality in Anastrepha suspensa. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9348-9353 (2012).
  22. Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
  23. Allen, M. L., O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. Stable, germ-line transformation of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 38, 701-710 (2001).
  24. Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem Mol Biol. 32, 1211-1220 (2002).
  25. Nolan, T., Bower, T. M., Brown, A. E., Crisanti, A., Catteruccia, F. piggyBac-mediated germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi using the red fluorescent protein dsRED as a selectable marker. J Biol Chem. 277, 8759-8762 (2002).
  26. Rodrigues, F. G., Oliveira, S. B., Rocha, B. C., Moreira, L. A. Germline transformation of Aedes fluviatilis (Diptera:Culicidae) with the piggyBac transposable element. Mem Inst Oswaldo Cruz. 101, 755-757 (2006).
  27. Terenius, O., Juhn, J., James, A. A. Injection of An. stephensi embryos to generate malaria-resistant mosquitoes. J Vis Exp. e216 (2007).
  28. Jasinskiene, N., Juhn, J., James, A. A. Microinjection of A. aegypti embryos to obtain transgenic mosquitoes. J Vis Exp. e219 (2007).
  29. Concha, C., et al. Efficient germ-line transformation of the economically important pest species Lucilia cuprina and Lucilia sericata (Diptera, Calliphoridae). Insect Biochem Mol Biol. 41, 70-75 (2011).
  30. Takken, W., Scott, T. W. Ecological Aspects for Application of Genetically Modified Mosquitoes. Springer. Netherlands. (2003).
  31. Handler, A. M., James, A. A. An Introduction to the History and Methodology of Insect Gene Transfer. Insect transgenesis: methods and applications. CRC Press. 3-26 (2000).
  32. Handler, A. M. A current perspective on insect gene transformation. Insect Biochem Mol Biol. 31, 111-128 (2001).
  33. Gong, P., et al. A dominant lethal genetic system for autocidal control of the Mediterranean fruitfly. Nat. Biotechnol. 23, 453-456 (2005).
  34. Scolari, F., et al. Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae). N Biotechnol. 25, 76-84 (2008).
  35. Schetelig, M. F., et al. Site-specific recombination for the modification of transgenic strains of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18171-18176 (2009).
  36. Schetelig, M. F., Caceres, C., Zacharopoulou, A., Franz, G., Wimmer, E. A. Conditional embryonic lethality to improve the sterile insect technique in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). BMC Biol. 7, 4 (2009).
  37. Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochem Mol Biol. 43, 1-8 (2013).
  38. Lacroix, R., et al. Open field release of genetically engineered sterile male Aedes aegypti in Malaysia. PLoS ONE. 7, e42771 (2012).
  39. Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 30, 828-830 (2012).
  40. Leftwich, P. T., et al. Genetic elimination of field-cage populations of Mediterranean fruit flies. Proc. Biol. Sci. 281, (2014).
  41. Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, E6736-E6743 (2015).
  42. Economopoulos, A. P., Judt, S. Artificial Rearing of the Mediterranean Fruit Fly (Diptera: Tephritidae): Size of Oviposition Holes. J. Econ. Entomol. 82, 668-674 (1989).
  43. Thailayil, J., Magnusson, K., Godfray, H. C., Crisanti, A., Catteruccia, F. Spermless males elicit large-scale female responses to mating in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 13677-13681 (2011).
  44. Gilbert, L. Insect Development. Morphogenesis, Molting and Metamorphosis. Academic Press. (2009).
  45. Schetelig, M. F., Horn, C., Handler, A. M., Wimmer, E. A. Area-Wide control of insect pests. From research to field implementation. Vreysen, M. J., Robinson, A., Hendrichs, J. Springer. 85-93 (2007).
  46. Gabrieli, P., et al. Sex and the single embryo: early development in the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Dev Biol. 10, 12 (2010).
  47. Tazuke, S. I., et al. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
  48. Gabrieli, P., Marois, E., Catteruccia, F. Transgenic insects: techniques and applications. Benedict, M. Q. CABI. 188-207 (2014).
  49. Scolari, F., et al. How functional genomics will impact fruit fly pest control: the example of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Genet. 15, Suppl 15 2. S11 (2014).
  50. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
  51. Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats