התרמת התחדשות פוליפ שלמה מן Aboral Physa של שושנת ים הכוכבת

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bossert, P., Thomsen, G. H. Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis. J. Vis. Exp. (119), e54626, doi:10.3791/54626 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

צורבים, ובאופן ספציפי הידרה, היו הבעלים החיים הראשונים הראו להתחדש מבנים שניזוקו או נקטעים, ואכן מחקרים כאלה לטעון השיקו חקירה ביולוגית מודרנית דרך העבודה של Trembley לפני יותר 250 שנה. נכון להיום המחקר של התחדשות חלה התעוררות מחודשת הן באמצעות "קלאסיים" אורגניזמים רגנרטיבית, כגון הידרה, planaria ו Urodeles, כמו גם קשת הרחבת מינים פורש טווח של metazoa, מן ספוגים באמצעות יונקים. מלבד העניין המהותי שלה כתופעה ביולוגית, הבנה כיצד התחדשות עובדת במגוון מינים תרצינה להודיע ​​לנו על האם תהליכי התחדשות לשתף תכונות משותפות ו / או מינים או בהקשר ספציפי מנגנונים תאיים ומולקולריים. כלנית הים כוכבנית, vectensis Nematostella, הוא אורגניזם מודל המתעוררים להתחדשות. כמו ההידרה, Nematostella הוא חבר של המערכה העתיקה, הצורבים, אבל בתוך tהוא בכיתה anthozoa, clade אחותו אל הידרתים כי הוא אבולוציונית יותר הבסיס. לכן היבטים של התחדשות Nematostella יהיו מעניינים להשוות לעומת עם אלה של ההידרה צורב אחרים. במאמר זה, אנו מציגים שיטה לחצות, להתבונן ולסווג התחדשות של סוף aboral של המבוגר Nematostella, אשר נקרא physa. Physa עובר ביקוע טבעי כאמצעי רבייה מינית, ואו ביקוע טבעי או קטיעה ידנית של physa מפעילה מחדש צמיחה הרפורמציה של מורפולוגיות מורכבות. כאן יש לנו קודיפיקציה שינויים מורפולוגיים פשוטים אלה בתוך מערכת Staging התחדשות Nematostella (להלן NRSS). אנו משתמשים NRSS כדי לבחון את ההשפעה של chloroquine, מעכב פונקציה ליזוזומלית שחוסמת autophagy. התוצאות מראות כי התחדשות של מבנים פוליפ, ובמיוחד mesenteries, הוא לא נורמלי כאשר autophagy מעוכבת.

Introduction

התצפית של התחדשות ב הידרה יחיד הייתה האירוע המכונן כניסתו של ביולוגיה כמו 1,2 מדע ניסויי. ההתחדשות נשארת תופעה של משיכה רחבה באופן יוצא דופן כדי ביולוג ולהניח אדם כאחד. פוטנציאל ביולוגים התפתחותיים, קלינאים, מדענים ביו מהנדסים רקמות להבין ולהתגבר על המגבלות על התחדשות אדם עושה ביולוגית התחדשות יותר מעניין מהותי.

עכשיו, עם השימוש של טכנולוגיות מתפתחות כגון הגנום רצף רווח והפסד של כלי פונקציה, השדה צפוי ניסה להפריד מנגנון שיקום וכדי בסופו של דבר להבין כיצד שונה מינים יכול להתחדש בעוד שאחרים לא יכולים. מידת האחידות בתגובות מולקולריות, תאית מורפולוגיים נותרה הובהרה, אך עד כה נראה כי התגובות הבסיסיות בקרב בעלי חיים שיכולים להתחדש דומות יותר מאשר יצטרך Imagi היהנד רק לפני עשור 3.

צורב בפרט הם קלילים על התחדשות כמעט כל חלקי גופם בתוך קשת רחבה של גיוון מורפולוגיים. מתוך פוליפ מים הבודד הטרי, הדרתי יחד עם הפוליפים הימיים הזעירים לבנות שוניות אלמוגים עצומות, אל בסיפונופורים הקולוניאלי המורכב, כגון Man-O-המלחמה הפורטוגזית, התחדשות היא לעתים קרובות במצב של רבייה, בנוסף מנגנון תיקון או רפורמה חלקי גוף פגומים או אבד כתוצאה מפגיעה וטריפה. אם המינים השונים של צורבים להשתמש מנגנונים דומים או שונים להתחדשות היא שאלה מעניינת ביסודו 4-6.

אנחנו, ואחרים כבר בפיתוח anthozoan, Nematostella vectensis כמודל התחדשות 7-17. אנחנו לאחרונה פתחנו מערכת אחסון זמנית לתיאור התחדשות של גוף כולו מחתיכה אחידה מורפולוגית של רקמות נחצתה מן aboraסוף l של הפוליפ 10. בעוד פוליף Nematostella יכולים להתחדש כאשר נחצו ברמה כזו או אחרת, בחרנו לחתוך מבוגרים לעבר עמדת aboral באזור הפשוט ביותר מורפולוגית, את physa, בין שאר כי זה קרוב המטוס הרגיל של ביקוע מיני טבעי 18, וגם בגלל זה תצפית היתרים בניתוחים מולקולריים לאופן שבו גוף כולו מחדש מן הרכיבים מורפולוגיים הפשוטים.

מערכת staging התחדשות Nematostella (NRSS) מספקת מערכת פשוטה יחסי של מבחני ביצועים מורפולוגיים שיכול לשמש להבקיע את ההתקדמות של כל היבט של התחדשות ידי physa קטוע, בתנאי תרבות נורמלים או ניסיוני מוטרד מצבים כגון טיפולי מולקולה קטנים, מניפולציה גנטית , או שינוי סביבתי. כצפוי, NRSS הופכת אמצה כמו פיגום מורפולוגיים שעליו האירועים התאיים ומולקולריים של התחדשות יכולים להיות הופנה10.

לבסוף השיטה של חיתוך שלנו מייצרת הזמנות כמה חור שנפערו גודל גדול יותר לנקב סיכת נקודה בשימוש במחקר שנערך לאחרונה 17, עדיין הוא לרפא את הפצעים סביב 6 שעות. תיעוד השלב חזותי מעצר והמובחן של סגירת פצע צריכה להציע גישות ניסיוניות להסביר את העצמאות לכאורה של הגודל של פצע ואת הזמן שנדרש כדי לסגור. לפיכך, הבנה ויזואלית עמוקה יותר של תהליך קטיעת aboral, המסופקת על ידי פרוטוקול זה, תסייע חקירות נוספות לתוך מערכת התחדשות המודל הזה ולהרחיב את היישום של מערכת קביעת שלב זו באמצעות Nematostella vectensis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מיזוג 1. של בעלי חיים עבור טמפרטורה, תזונה מחזור אור / חושך

  1. השג מבוגרי vectensis Nematostella מאחד מעבדות Nematostella הרבות ברחבי העולם, או ספק ללא כוונת רווח (לוח 1)
  2. לשמור Nematostella בטמפרטורה קבועה (בדרך כלל בין 18 ו -21 מעלות צלזיוס) בחושך, ב "1 / 3x" מים לים מלאכותיים (ASW) במליחות של 12 חלקים לאלף (ppt). לשמור על תרבויות במנות תרבות זכוכית פשוטה סודה-סיד, בדרך כלל 250 מ"ל או 1.5 ליטר קיבולת 11.
    הערה: תנאי התרבות פשוטים אלה משמשים בדרך כלל בין מעבדות ללמוד Nematostella, אך טיפול תרבות יכול גם להיות אוטומטי 19.
  3. Feed הארטמיה Nematostella טרי בקעו Nauplii 2 - 4x בשבוע. ציסטות הארטמיה האץ במלוא העוצמה (36 ppt) או 1 / 3x ASW על 30 מעלות צלזיוס, בצלחת זכוכית מלבני רדוד 20 או בכל מספר של בקנה מידה קטנה, מדגרות ארטמיה מסחריות או תוצרת בית. אם באינקובטור אינו זמין, שרימפס יבקעו ב RT אבל לעשות זאת לאט יותר.
    הערה: זה בדרך כלל דורש יותר מ -24 שעות להשלמה.
  4. חלף מי תרבות כלנית לפחות פעם בשבוע. לבריאות המבוגרת הטובה ביותר, נקי (ללא סבון) תרבות קערות פעם בשבוע של פרשות ריר מצטברות, אשר מעיילת הקערה יכולים מלכודת מזון שלא נאכל ופסולת, לסבך את החיות.

בחירה 2. והרפיה של בעלי חי אוויר התזונתי

  1. גודל בהתאמה בחר פוליפים של באותו אורך כ (3 - 5 ס"מ, כאשר באופן טבעי רגוע) ומניחים אותם בקערה מופרד המושבה במשך שלושה ימים לפני קטיעה.
    הערה: מספר בעלי החיים שנבחרו לחיתוך ייקבע על ידי הניסוי מתנהל, כמובן, אבל באופן כללי אנו ממליצים לפחות חמישה בעלי חיים לכל נקודות לדוגמא עם שש משוכפלים. כָּך,בניסוי טיפוסי מינימום של 30 חיות יהיה שנבחר מראש. באופן כללי, זה חכם כדי לבחור יותר מהמספר המזערי (30) מאז קטיעות כי הם לא סדירים (ראו להלן) יכול מאוחר יותר להשפיע ניקוד.
  2. מוציאים את המאפה של חיות שנבחרו מהחממה אל האור בחדר לפחות שעה אחת לפני קטיעה.
    הערה: זמן חשיפה לחדר אור תנודות של טיפול צפוי לגרום החיות להתכווץ, ולכן הם צריכים להיות מותאמים או "רגועים" על ידי דגירה על ספסל המעבדה. בעלי חיים יהפכו עקשן לגעת וחשיפה לאור ובשלב כי ניתן להעביר על ידי pipetting עדין.
  3. אופציונלי: להרדים את החיות על ידי הוספת 7.5% MgCl 2 (ב 1 / 3x ASW). בעדינות להוסיף את הפתרון MgCl 2 לקערה עם טפטפת פלסטיק 5 מ"ל סטנדרטי.
    הערה: למרות חיות תהפוך בסופו של דבר מורגל אל האור מניפולציה פיזית, זה יכול להיות יתרון להרדים בעלי חיים על מנת לקיים או "לתקן" tהוא נרגע מדינה אחרי שהם הפכו 16,21,22 מוארכים.
  4. השתמש משעמם רחב פיפטה פלסטיק (> 0.5 ס"מ) להעביר (ב 1 / 3x ASW) חמישה בעלי חיים מבריכת צורך לקטוע, לתוך החלק התחתון של צלחת חיתוך זכוכית סטרילית של בקוטר 100 מ"מ המכיל 12 ASW ppt. מניחים את צלחת על הבמה של סטראו עם הגדלה משתנה בין 10 - 40X.
    הערה: אם בעלי החיים לא הורדמו ורגוע לחיתוך, הם עדיין יכולים להגיב למגע ואת התאורה סטריאוסקופ ובכך עשוי להזדקק כמה דקות להיות רגוע שוב.

3. קטיעה

  1. באמצעות אזמל סטרילי, לקטוע את physa aboral מכל פוליפ, במטרה להשיג קטע physa כי הוא כ כל עוד זה הוא רחב המכיל לא לפדר.
    הערה: האתר לחתוך האידיאלי הוא פשוט aboral אל הסיום לפדר. על המטוס של חיתוך ישנו מעבר מ לפדר ראוי l הדקאינס מתאים לכל אחד החדרת mesenterial (ראה איור 1, חיצים). עדר לפדר הוא קריטי משום שהיא מייצרת ריר שעשוי להקל 'חיבור' החור 17,30.
    1. מניחים את להב סכין המנתחים במגע עם החיה באתר הרצוי של קטיעה. בצע פעולה זו על העצמאית (חופשי), או על ידי בעדינות לתפוס את הגוף של החיה עם # 5 מלקחיים (בסגנון דומון או דומה).
    2. חותכים דרך הרקמה על ידי מינוף הלהב המעוקל של אזמל בתנועה 'נדנדה' על פני הגוף.
      הערה: רקמת צריך לנתק בצורה נקייה כמו סכין המנתחים הוא התנדנד ולשחרר את החלק הרצוי physa מן התורם. עם זאת, אם חתיכה קטנה של רקמה עדיין מתחברת לגוף physa, לחתוך אותו עם סכין המנתחים. אל תנסה להפריד בין החלקים מחוברים על ידי משיכת, מכיוון שהדבר עלול לגרום נזק physa.
  2. הסר כל פוליפ 'תורם' נקטע מהצלחת ולהחזיר אותו SEPAקערה שיעור שכותרתו "קטועי גפיים ונקווה '; לתארך את הקערה ולהחזיר אותו לתרבות מניות.
    הערה: פוליפים קטומים ירפא את הפצע aboral תוך יום ואז יכול להיות מוזן באופן נורמלי. הם להתחדש physa נורמלי מחפש בתוך שבועות ובנקודה את physa ניתן נקטעו שוב אם ירצה בכך.
  3. שוטפים את physa נכרת שנותרו בצלחת חיתוך ב ASW 12 ppt, ולאחר מכן להעביר כל physa אל באר סטרילי נפרד בצלחת תרבית תאים רב גם כי יש כבר 10 מ"ל של ASW 12 ppt בכל טוב.
    הערה: בדוגמא זו נעשתה שימוש צלחת שש היטב, עם כל מחזיק גם 10 מיליליטר של מי ים וחמש נכרת physa. במי ים בכלל צריך לכסות את physa מספיק כדי למנוע חשיפה לאוויר בשל תנועת טיפול אידוי פוטנציאלי. הצלחת או הבארות צריכה מכסה.
  4. חזור על שלבים 3.1 - 3.3 לאסוף לפחות 5 physa בכל טוב מאופק עבור כל טיפול ניסיוני.
  5. דגירה physa בטמפרטורה אשר provIDE קצב ההתחדשות הטוב ביותר לקראת חקירתם ניסיוני המתוכננת. מניח את הצלחת המכילה את physa לתוך חממה מוסדרת טמפרטורה, בטמפרטורה קבועה נקבעה על ידי השיעור של התחדשות הרצויה.
    ההערה: physa יהיה לחדש רקמות חסרות ויוצרי פוליפ מלא כאשר מודגרות בטמפרטורות שבין 15 ו -27 מעלות צלזיוס. שיעור ההתחדשות תלוי בטמפרטורה למעט שני השלבים הראשונים. היום הממוצע להגעת שלב 4 עבור כל בטמפרטורות הוא 7 ד לאחר גזירה זו גם עולה בקנה אחד עם התחדשות ב 21 מעלות צלזיוס. בשעה 27 ° C, שלב 4 הוא הגיע כ -3 ימים קודם לכן ב -15 ° C, שלב 4 מתעכב בכ -3 D לעומת התחדשות ב 21 ° C (ראה גם הפניה 10).

4. הערכת התחדשות עם מערכת האחסון הזמני התחדשות Nematostella (NRSS)

  1. ציון את physa באמצעות מיקרוסקופ סטריאו-מתחם עם magnific משתנהation (10 - 80x). ציון את physa טרי חתוך Nematostella כמו שלב 0 ולהמשיך הבקיע באותו זמן כל קטיעה פוסט יום (DPA) באמצעות NRSS 10.
    הערה: קריטריוני staging מפתח ופרטים להפנות הפנית 10.
    1. ציון physa כמו שלב 0 (פצע פתוח) אם physa טרי חתוך מופיע כגוש cup- בצורת דמוי בלון רפוי, עם אתר פצע פתוח צפוי גלוי.
      הערה: שולי הפצע עלולים גם להישאר ביחד מלכתחילה, אבל הרקמה עדיין תכווץ וחוסר נוקשות. שולי הפצע הפתוח אפשר לראות עוברים התכווצות רדיאלי כמו מרפא הפצע.
    2. ציון physa כמו שלב 1 (פצע נסגר) אם פצע הקטיעה מופיע סגור.
      הערה: מיקום הפצע יתאים הקוטב אוראלי בעתיד. המשטח החיצוני סביב הקוטב האוראלי בעתיד עשוי להתחיל להציג קשתות מובהקות מתאימות הוספות mesenterial שבבסיס רדיאלית הסימטרי endodermal.
    3. ph ציוןYSA כמו שלב 2 (קשתות רדיאלי) אם פני השטח של המוט האוראלי מופיע מנופחים, חושף שמונה קשתות עלה מסודרות בתוך תבנית סימטרית רדיאלית והופרדו חריצים. שימו לב קטן, blebs hemispherical בשיא של הקשתות. הם יהיו על גבוה כמו רחב, חולף סביר, ובתחילה מורכבים על ידי שכבת תאי ectodermal יחידה.
      הערה: במקרים מסוימים blebs דו שכבתי עשוי לייצב. הערה: בשלב זה או אחר טיולי שכבת ריר עשויה להופיע כדי לתמצת את physa (איור 2) ב 'נדן' קרומי. חומר encapsulating זה צריך להסיר כדי להקל ניקוד.
    4. ציון physa כמו השלב 3 (Tentacle) אם הניצנים של הזרועות המכילות שכבות רקמת endodermal ו ectodermal נוצרים ביציבות בסוף הפה של לפחות קשתות רדיאלי כמה.
      הערה: הזרועות ארוכות יותר מאשר הם רחבים הם מינימאלי ניע. Physa מציגה את הגדילה, אך אינפלציה משתנית כך יסודות לפדר עלולים להפוך מולible המשתרעת החדרת mesenterial לתוך חלל הגוף (coelenteron).
    5. ציון physa כמו שלב 4 (לינארית Mesenteries) אם physa מכיל שמונה mesenteries ברורים, גלויים שמרחיבים לתוך coelenteron מ הוספות בקיר הגוף, עם אורכים אוראליים aboral כי הם יותר מפי שתיים הרוחב רדיאלי שלהם נמדד ממקום שבו הם מופיעים להתחבר אל הלוע בקצה aboral שלה (enterostome).
      הערה: ארבעה או פחות יש mesenteries "קפלים" קצוות חינם פנימיים. הלוע גלוי. למעלה משמונה זרועות גלויות, ניע ולפעמים הם מתכווצים לתוך הגוף.
    6. ציון physa כמו שלב 5 (Mesenteries קפלים בעיקר) אם physa יש יותר מארבע mesenteries עם קפול, ואת קפול הוא יותר מלא ומתפתל מאשר בשלב 4. חיה יש כמעט "רגיל" המראה מבוגר, אבל אין גלוי תאי אשכים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ההתקדמות של אירועים מורפולוגיים במהלך רגנרציה ב physa הכרות מוצג באיור 1 א ', הכולל נופים נציג physa בכל שלב NRSS. האתר לחתוך physa הטיפוסי מותווה על המבוגר (ראשי החץ). הצילומים איור 1A להראות התחדשות מתקדמת של מבנים אוראלי הגוף מפני physa טרי ביקע פוליפ נוצר באופן מלא. איור 1B, C להראות את הסדר של המחיצה הפנימית, mesenteries, בשלב 4 ושלב 5, בהתאמה. שימו לב כמה mesenteries בשלב 4 יחסר "קפול", אבל כדי להעפיל כשלב 5 הרוב חייב פתח קפלים. 1D איור מראה physa אפוף קרום של רירי אשר ניתן להסירו עם מלקחיים (איור 1E). בעוד בדרך כלל לא מזיק התחדשות (אלא אם כן זה בלתי סביר מלכודות החיה), הקרום יכול לעכב הבקיע את physa ולעשותing מניפולציות ניסיון, כגון קיבוע מיקרוסקופיה, מדגם או קציר לניתוח מולקולרי / ביוכימיים. זה מוסר הכי טוב אחרי שלב 1, או מאוחר יותר, אם זה רפורמות.

איור 2 מראה כיצד מערכת staging יכול לשמש כדי להבקיע את תוצאות ניסוי כדי להעריך את ההשפעות של עיכוב autophagy. Physa נחתך שטופל chloroquine ב 10, 50 ו -100 מיקרומטר, או physa היה מטופלים (שולט). Chloroquine מעכב פונקציות ליזוזומלית, אשר נדרשים עבור autophagy. הקריטריונים NRSS שימשו את התוצאה עבור physa במהלך התחדשות ותוצאות היו זממו באיור 2E. תמונות שליטת נציג (איור 2 א) ו physa מטופלי chloroquine (איור 2 B - D) נעשו כאשר שולט הגיעו לשלב חיות 5. chloroquine מטופלים לא התקדם מעבר לשלב 4, והם בדרך כלל הציגו regenera לפדר שלםtion (קפול החסרה ביותר), גודל זרוע קצר, ובמקרים מסוימים אורכים גוף קצר.

איור 1
איור 1. תכונות ההתחדשות. (א) דוגמאות physa התחדשות מבנים אוראליים וגוף מבוים פי NRSS. לוח שכותרתו למבוגרים מציג תכונות של חיה בוגרת עם זרועות (t) לוע (ph), mesenteries (מ ') והוספות לפדר (מייל). חצים לבנים להראות היכן באזור קפלים של מעבר mesenteries יותר להחדרה לפדר, רכס של endoderm האריכה עד למסוף aboral. אזור זה מהווה את physa. חצים צהובים להראות physa חציית אתר אידיאלי. לוח 0 מראה חמש דקות physa אחרי החצייה, ופאנל 0 'הוא גרסה מוגדלת של אחד מאותם physa, עם פצע פתוח במרכז, המגדיר שלב 0 שלNRSS. לוח 1 מציג physa עם הפצע סגור עכשיו, הגדרת שלב 1. לוח 2 מראה physa עם קשתות רדיאלי הרים סביב הקוטב האוראלי, עם רקמות מנופחות להלן, המקביל לשלב 2 (לוחות 2 - 0 מצפה לכם נוף של הסוף האוראלי). לוח 3 מציג ניצני זרוע המתעוררים בקוטב האוראלי (פונה ימינה) של physa מאורך הניפוח, עכשיו בשלב 3. אלמנטים לפדר בסיסית הערה גלויות הלוע נוצר האזור הכהה בסוף האוראלי. לוח 4 מציג את הופעתה של זרועות נכונות, כמו גם חולפת 'blebs' בקוטב האוראלי, mesenteries לינארית 4. שלב הגדרת גלויי physa המנופח. המסה העגולה הגדולה הגלויה בתוך פוליפ היא ממקור לא ידוע ו תגורש דרך הפה. לוח 5 מציג כמעט התחדשות מלאה מאופיינת יותר מארבע mesenteries קפלים, ph נוצר באופן מלאarynx ושמונה או יותר משושים, המגדיר אותו שלב 5. (B, C) נופים Aboral של physa הפרט להמחיש את הסדר ומורפולוגיה biradial של mesenteries. לפי השקפה זו, קפלי mesenteries נראה שיש בליטה מידווי רקמות (חץ ירוק). Physa שלב 4 יש ארבעה או פחות mesenteries קפלים, וכן physa בשלב 5 יש יותר מארבעה (C). Mesenteries עם או בלי קפול מסומנים על ידי ראשי חץ ירוק או צהוב, בהתאמה. ראש חץ שחור ב (ג) מצביע על לפדר קפלים כי האריך רדיאלית. (D, E) הסרת נדן רירי מן physa מתואר. החצים הלבנים מצביעים על נדן רירי סביב physa (ד) כי יש להסיר כמו (E) לפני בקיע התחדשות. לפעמים רקמות שיורית (חיצים צהובים) עלולות להילכד בתוך הנדן, וזה גם צריך להיות מוסר. כוכבית מציינת קטבים אוראליים, שבו סימןed. ברי גודל אדומים הם 0.5 מ"מ בכל הלוחות למעט A5 (1.0 מ"מ). B לוחות ו- C של איור זו שונו והודפסו מחדש באישור ההפניה 10. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. השפעת chloroquine על התחדשות. כדי להדגים יישום של NRSS, בדקנו את ההשפעות של chloroquine, מעכב autophagy. Physa נקטעו ולצרף אותה מיד 1 / 3x ASW המכיל 0.1% DMSO (שליטה) או chloroquine ב 10, 50, 100 מיקרומטר. Physa דורגו ב -24 במרווחים h באמצעות NRSS. (א) תמונות סיום נציג נלקחים בקרות כשהגיעו לשלב 5. - D) נציג תמונות של physa chloroquine שטופל כי הגיעו "רמה רגנרטיבית" של chloroquine שלב 4. שנגרמו ליקויים דומים התחדשות בכל המינונים שנבדקו. הבעיה הבולטת ביותר הייתה חוסר התחדשות מלאה mesenteries ומחושים. מורפולוגיה הגוף חריגה (למשל, עושה להטוטים) עוד צוין מדי פעם (C). נוכחות (לבן החץ) וחוסר (חץ שחור) של קפלים בתוך physa chloroquine שטופלו מוצג D (זרועות ייסוגו חלקית). (ה) נתוני staging לכל physa זממו כפונקציה של זמן (ב 23 ° C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. סיכוםתכונות עיקריות של שלבי NRSS. דיאגרמה זו מציגה את השינויים המורפולוגיים המפתח שמגדירים כל שלב NRSS. כיוון של תנועות מסומנים על ידי חצים ותכונות אדומים על ידי ראשי חץ ירוקים. שלב 0 מתארת פצע פתוח רק לאחר החיתוך (א), ו- T). קצות הפצע לעבור התכווצות רדיאלי סגירה לכיוון המרכז (B). שלב 1 מאופיין סגירה מלאה של הפצע (C) והעלאת רמת הקשתות בין רכסים אוראלי הפונה (ד); במרכז המשטח האוראלי (ראש החץ) הוא מדוכא. שלב 2 יש מתקמרת בולטת של המשטח האוראלי (ראש החץ, E); physa מתחיל להאריך ולהיות צר (F) עם ניצנים זרוע ו blebs גלוי על השיא של קשתות (ראשי חץ). שלב 3 יש ניצני זרוע יציבים (ראש חץ, G) ואת לוע ההתחדשות ניתן לראות צפיפות בקוטב האוראלי (גוש כתום, ראש חץ ב H (אני) כי צריך להיות לפחות פעמיים כל עוד מגובהן בצומת של הלוע (אני). ארבעה או פחות mesenteries ניתן קפלים בקצה הפנימי שלהם - נימת mesenterial (J, J '). שלב 5 מאופיין יותר מארבע mesenteries קפלים (K), אשר ניתן להעריך על ידי מיטב צופה מסוף aboral (K '). Re-הדפסה באישור הפניה 10. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שימוש Nematostella כמודל של ריפוי פצעים והתחדשות אהיה יותר ויותר פופולרי. לכן, חשוב להיות מסוגל לדמיין את דפוסי מורפולוגיים של פרוטוקול מסוים לפני ניתוחים תאיים ומולקולריים יעילים ניתן להקצות והשווה. Nematostella יש רמה גבוהה של "גמישות" משובים, יכולת לבצע רפורמה כמעט כל מבנה חסר נקטע בכל מקום, בשלבים שלאחר planula חיים. לפיכך, חוקרים שונים בחנו התחדשות נובעי קטיעה או פציעה באזורים שונים של פוליפים, בגילים שונים וגדלים 7-18.

מערכת staging המתואר כאן עוקבת אחר הטרנספורמציה של קטע אחיד מורפולוגית של physa, קטוע מסוף aboral של מבוגר, אל פוליפ לנוער מלא אנטומית חסר רקמת רבייה בלבד (אנחנו לא נקבענו עדיין כאשר הקטינים מחדש אלה הופכים מיניים מature). גישה זו בוחנת התחדשות מתוך גֶמֶד פשוט של רקמה לאחד מורכבות מקסימלית קרובות. כולל חמישה physa כמו גודל קבוצה מומלץ מינימום לנרמל עבור השתנות פרט פוטנציאליות שאירית. כמובן, מספר זה יכול להיות מותאם כדי להתאים את מטרות הניסוי בפרט אבל הפרוטוקול NRSS מאפשר 2 מ"ל של מדיום לכל physa לשלול "אפקט נפח" פוטנציאל כזה אשר דווחה להשפיע התחדשות ב 23 ההידרה.

בניגוד לגישות אחרות ללמוד התחדשות Nematostella השתמשו גוף באמצע נחצה מבוגרים או בסוף הפה, או פוליפים בשלב 4-זרוע לנוער נחצה-הגוף באמצע 7,11-18. שני מחקרים בחנו התחדשות physa ששוחרר על ידי ביקוע טבעי 16,18, והגישות באמצעות physa נקטעה צמחו לאחרונה עם 8,9 NRSS. כל גישות מגוונות אלה יש יתרונות משלו והוא יכול לענות על שאלות שמייחד regenerative תהליכים המתרחשים תחת משטרי קטיעה או פציעה שונות, ובקרב בעלי חיים מזדקנים בצורה שונה. פרוטוקול NRSS בקטיעת physa בקיע, שמוצג במחקר הנוכחי, מייצר מערכת אחידה יחסית של physa ללימוד שיטתי ונמנע וריאציה בגודל physa, רכב רקמות, והתקדמות הבאה של ההתחדשות נצפתה עם ביקוע רוחבי טבעי 18,24. למרות קטיעת physa הקביל במידה מה המצב הטבעי של רבייה מינית ב Nematostella, הבדלים מולקולריים כבר ציינו בין ההתחדשות שמתקבלת כתוצאה מביקוע וקטיעות טבעיים אמצע גוף או על physa 16,18,24. אם physa מיוצר על ידי השיטה של ​​קטיעה מתוארת כאן או להראות ביקוע טבעי הבדלים כאלה עדיין לא נקבע.

ישנן כמה בעיות שאינן קריטיים להצלחה עם קטיעת הגידול, וטכניקות ניקוד מתוארות כאן. פוליפים שנבחרו עבור קטיעה שוld להישמר באותה הטמפרטורה, מתאים עבור גודל physa, היסטוריה תזונתית ואם גיל אפשרי (אם כי האחרון לא נבדק באופן שיטתי כדי לקבוע אם קיימת גיל-השפעה על וריאצית התקדמות שלב). קבלת פצע פתוח עם אזמל סטרילי חד בעל להב מעוקל חשוב לתצפיות מורפולוגיים של ריפוי פצעים בין שלב 0 ושלב 1. כאשר physa הוא מנופחת ואת הלהב המעוקל של האזמל הוא התנדנד על הרקמות המבוגרות, הוא קטוע בתנועה אחת וניתן להעביר במהירות לטיפול גם מחיתוך צלחת. קטיעות הכוללות לפדר או כי הם התוצאה של מניפולציה גופנית מקיפה אמורה להיות מושלכות.

עיסוק הזמני physa מטופל כדי לקבל תחושה של שונות אישית של האוכלוסייה הנבדקת. וריאציה בין physa הפרט היא לפחות בשלבים המוקדמים. לדוגמה, כל physa נמצאים שלב 0 ב 0 DPA. באותו אופן כל physa להגיע שלב1 בתיאום 1 DPA. הופעתו של שלב 2 עשויה להיות קשה יותר עבור הצופה להבחין כי "אינפלציה" היא מצב יחסי מושגת, עם זאת, על ידי 2 DPA עם וריאציה מעט. הופעתו של התקדמות סימני זרועות נאמנת לשלב 3. זרועות ההתחדשות עשויות להיות מוסתרות על ידי הופעתו של "גולם" קרומי כי מעכב להדמיה של ניצן הזרוע מתחת. אם הכיסוי קרומי לא הוסר בעבר, זה צריך להיעשות כך עכשיו. הסרת הקרום עם פינצטה הקנס הטו תשחרר את physa ההתחדשות. ההבחנה בין שלב 4 ו -5 הוא מספר mesenteries קפלים. שלב 4 יש ארבעה או פחות mesenteries קפלים, ושלב 5 יש חמישה כדי שמונה mesenteries קפלים. בעוד קפול ניתן לצפות בתצוגה לרוחב, את המספר המדויק של mesenteries קפלים הוא ציין טוב יותר עם נוף aboral.

אתגר אחד בלימוד התחדשות מבוגר Nematostella מתוך PHYsa גֶמֶד, ואכן עם רקמות לחתוך מאתרי קטיעה אחרים, הוא הבהירות המגוונת של רקמות חיות. הנורה של physa ברור יחסית מבוגר ללא פגע, אבל זה הופך להיות די אטום בשל התכווצות הרקמה לאחר קטיעה. בהירות חוזרת בהדרגה (שלב 2) פעם נסגר הפצע (שלב 1) ואת החיה מתחילה להתנפח, אבל גם אז באזור סביב אתר הפצע שבו רקמות ומבנים הן מחדשים באופן פעיל שרידים מטושטשים במקצת על ידי רקמות צפופות (במיוחד שלב 3). לאינפלציה עלתה כלל מלווה שלב 4 ו קיבוע 5. ואחריו הבהרה אופטית קרוב לוודאי לפתור מה קורה בסוף הפה, אבל יותר אינפורמטיבי עשויים להיות כתבים חיים, מהונדסים רקמות ספציפיות שיכול להיות פיקוח על קרינה ובקלות יותר מדמיינים 15, 25-30.

Physa נקטעה כמובן לא יכול להאכיל מאז היא חסרת זרועות, פה mesenteries (אשר נמל בלוטות עיכול), ובכך requiהתחדשות טבעת של מבנים בגוף חסרים כדי להיות מושלמת על ידי הנעת עתודות מזין ממקורות שאינם מזון. Physa עלול להשיג זאת היא על ידי autophagy, שבו הציטופלסמה, אברונים מרכיבים תאיים אחרים הנבלעים intracellularly ועובדו על מנגנון ליזוזום תלוי כדי לייצר אנרגיה ותרכובות עבור תהליכים האנאבוליים 31-33. אנו מוצאים כי טיפול physa עם המעכב ליזוזום, chloroquine, גורם התחדשות תקינה של mesenteries ומחושים, ומורפולוגיה גוף כללית, המציין כי autophagy נדרש להתחדשות רגילה של מבנים אוראליים וגוף. Autophagy המווסת גזע התא פונקציות 34-36, והיא ממלאת תפקידים חיוניים התחדשות הידרה, planaria, ו דג הזברה 37-41. דרוש ניתוח נוסף כדי להבין כיצד autophagy משפיע התחדשות Nematostella ברמות תאית ומולקולרית, אבל הניסוי לעבור הראשון שלנו מראה את התועלת של השימוש ע"נSS כשיטה הקרנה מהירה עבור מולקולות קטנות, עלולים להשפיע על התחדשות.

התהליכים הגנטיים, מולקולריים תאיים המווסתים התחדשות Nematostella הם רק בשלב ראשוני של הבנה, אבל המודל המתהווה הזה להתחדשות יש רפרטואר גדל והולך של כלים לניתוח ביטוי גנומי גן. עם הגנום המוער שלה, שפע של סמנים גנטיים אזוריים ספציפי רקמות, ושיטות חזקות transgenesis, mutagenesis, היסטולוגיה במיקרוסקופ, Nematostella מבטיח לחשוף את המנגנונים שולט anthozoan התחדשות צורבת ולחשוף אם תהליכי המשובים שלה דומים או ייחודיים בין צורבים ו metazoans בכללי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי תאי גזע ניו יורק למדע (NYSTEM C028107) מענק GHT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nematostella vectensis, adults Marine Biological Lab (MBL) non-profit supplier
Glass Culture Dish, 250 mL Carolina Biological Supply 741004 250 mL
Glass Culture Dish, 1,500 mL Carolina Biological Supply 741006 1,500 mL
Polyethylene transfer pipette, 5 mL USA Scientific  1022-2500 narrow bore, graduated
Polyethylene transfer pipet, tapered Samco 202-205 cut off 1 inch of tip to make wide bore
Disposable Scalpel Feather Safety Razor Co. Ltd no. 10 blade should be curved
#5 Dumont Fine point tweezers Roboz RS5045 alternative suppliers available
Pyrex Petri dish, 100 mm diameter Corning 3160 can substitute other glass Petri plates
Sterile 6-well plate Corning Falcon  353046 or similar from other manufacturer
Sterile 12-well plate Nunc  150628 or similar from other manufacturer
Sterile 24-well plate Cellstar, Greiner bio-one 662-160 or similar from other manufacturer
Brine shrimp hathery kit San Francisco Bay; drsfostersmith.com CD-154005 option for growing brine shrimp
pyrex baking dish common in grocery stores option for growing brine shrimp
artificial seawater mix 50 gal or more  Instant Ocean; drsfoster-smith.com CD-116528 others brands may suffice
Plastic tub for stock ASW preparation various common 25 gallon plastic trash can OK
Polypropylene Carboy Carolina Biological Supply 716391 For working stock of ASW @ 12 ppt
Beaker, Graduated, 4,000 mL PhytoTechnology Laboratories B199 For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt
Stereomicroscope and light source various  with continuous 1 - 40X magnification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lenhoff, S. G., Lenhoff, H. M. Hydra and the Birth of Experimental Biology: Abraham Trembley's Memoirs Concerning the Natural History of a Type of Freshwater Polyp with Arms Shaped like Horns. The Boxwood Press. (1986).
  2. Trembley, A. Mémoires pour servir à l'histoire d'un genre de polypes d'eau douce, à bras en forme de cornes. Jean & Herman Verbeek. (1744).
  3. Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11, (10), 710-722 (2010).
  4. Galliot, B. Hydra, a fruitful model system for 270 years. Int J Dev Biol. 56, (6-8), 411-423 (2012).
  5. Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: are there unifying principles? Dev Genes Evol. 233, (1-2), 53-66 (2013).
  6. Holstein, T. W., Hobmayer, E., Technau, U. Cnidarians: an evolutionarily conserved model system for regeneration? Dev Dyn. 226, (2), 257-267 (2003).
  7. Amiel, A. R., et al. Characterization of Morphological and Cellular Events Underlying Oral Regeneration in the Sea Anemone, Nematostella vectensis. Int J Mol Sci. 16, (12), 28449-28471 (2015).
  8. Warren, C. R., et al. Evolution of the perlecan/HSPG2 gene and its activation in regenerating Nematostella vectensis. PLoS One. 10, (4), e0124578 (2015).
  9. Gong, Q., et al. Integrins of the starlet sea anemone Nematostella vectensis. Biol Bull. 227, (3), 211-220 (2014).
  10. Bossert, P. E., Dunn, M. P., Thomsen, G. H. A staging system for the regeneration of a polyp from the aboral physa of the anthozoan Cnidarian Nematostella vectensis. Dev Dyn. 242, (11), 1320-1331 (2013).
  11. Stefanik, D. J., Friedman, L. E., Finnerty, J. R. Collecting, rearing, spawning and inducing regeneration of the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nat Protoc. 8, (5), 916-923 (2013).
  12. Tucker, R. P., et al. A thrombospondin in the anthozoan Nematostella vectensis is associated with the nervous system and upregulated during regeneration. Biol Open. 2, (2), 217-226 (2013).
  13. Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Dev Biol. 12, (2012).
  14. Trevino, M., Stefanik, D. J., Rodriguez, R., Harmon, S., Burton, P. M. Induction of canonical Wnt signaling by alsterpaullone is sufficient for oral tissue fate during regeneration and embryogenesis in Nematostella vectensis. Dev Dyn. 240, (12), 2673-2679 (2011).
  15. Renfer, E., Amon-Hassenzahl, A., Steinmetz, P. R., Technau, U. A muscle-specific transgenic reporter line of the sea anemone, Nematostella vectensis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (1), 104-108 (2010).
  16. Burton, P. M., Finnerty, J. R. Conserved and novel gene expression between regeneration and asexual fission in Nematostella vectensis. Dev Genes Evol. 219, (2), 79-87 (2009).
  17. DuBuc, T. Q., Traylor-Knowles, N., Martindale, M. Q. Initiating a regenerative response; cellular and molecular features of wound healing in the cnidarian Nematostella vectensis. BMC Biol. 12, (2014).
  18. Hand, C., Uhlinger, K. R. Asexual reproduction by transverse fission and some anomalies in the sea anemone Nematostella vectensis. Invert Biol. 114, 9-18 (1995).
  19. Fritzenwanker, J. H., Technau, U. Induction of gametogenesis in the basal cnidarian Nematostella vectensis(Anthozoa). Dev Genes Evol. 212, (2), 99-103 (2002).
  20. Magie, C., Bossert, P., Aramli, L., Thomsen, G. Science's super star: The starlet sea anemone is an ideal tool for student inquiry. The Science Teacher. 83, (3), 33-40 (2016).
  21. Genikhovich, G., Technau, U. In situ hybridization of starlet sea anemone (Nematostella vectensis) embryos, larvae, and polyps. Cold Spring Harb Protoc. (9), (2009).
  22. Magie, C. R., Pang, K., Martindale, M. Q. Genomic inventory and expression of Sox and Fox genes in the cnidarian Nematostella vectensis. Dev Genes Evol. 215, (12), 618-630 (2005).
  23. Chera, S., Kaloulis, K., Galliot, B. The cAMP response element binding protein (CREB) as an integrative HUB selector in metazoans: clues from the hydra model system. Biosystems. 87, (2-3), 191-203 (2007).
  24. Reitzel, A. M., Burton, P. M., Krone, C., Finnerty, J. R. Comparison of developmental trajectories in the starlet sea anemone Nematostella vectensis: embryogenesis, regeneration, and two forms of asexual fission. Invertebr Biol. 126, 99-112 (2007).
  25. Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nat Commun. 5, 5486 (2014).
  26. Jahnel, S. M., Walzl, M., Technau, U. Development and epithelial organisation of muscle cells in the sea anemone Nematostella vectensis. Front Zool. 11, 44 (2014).
  27. Kelava, I., Rentzsch, F., Technau, U. Evolution of eumetazoan nervous systems: insights from cnidarians. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 370, (1684), (2015).
  28. Nakanishi, N., Renfer, E., Technau, U., Rentzsch, F. Nervous systems of the sea anemone Nematostella vectensis are generated by ectoderm and endoderm and shaped by distinct mechanisms. Development. 139, (2), 347-357 (2012).
  29. Richards, G. S., Rentzsch, F. Transgenic analysis of a SoxB gene reveals neural progenitor cells in the cnidarian Nematostella vectensis. Development. 141, (24), 4681-4689 (2014).
  30. DuBuc, T. Q., et al. In vivo imaging of Nematostella vectensis embryogenesis and late development using fluorescent probes. BMC Cell Biol. 15, (2014).
  31. Kaur, J., Debnath, J. Autophagy at the crossroads of catabolism and anabolism. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, (8), 461-472 (2015).
  32. Carroll, B., Korolchuk, V. I., Sarkar, S. Amino acids and autophagy: cross-talk and co-operation to control cellular homeostasis. Amino Acids. 47, (10), 2065-2088 (2015).
  33. Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol. 221, (1), 3-12 (2010).
  34. Rodolfo, C., Di Bartolomeo, S., Cecconi, F. Autophagy in stem and progenitor cells. Cell Mol Life Sci. 73, (3), 475-496 (2016).
  35. Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9, (6), 830-849 (2013).
  36. Phadwal, K., Watson, A. S., Simon, A. K. Tightrope act: autophagy in stem cell renewal, differentiation, proliferation, and aging. Cell Mol Life Sci. 70, (1), 89-103 (2013).
  37. Varga, M., Fodor, E., Vellai, T. Autophagy in zebrafish. Methods. 75, 172-180 (2015).
  38. Varga, M., et al. Autophagy is required for zebrafish caudal fin regeneration. Cell Death Differ. 21, (4), 547-556 (2014).
  39. Gonzalez-Estevez, C., Salo, E. Autophagy and apoptosis in planarians. Apoptosis. 15, (3), 279-292 (2010).
  40. Buzgariu, W., Chera, S., Galliot, B. Methods to investigate autophagy during starvation and regeneration in hydra. Methods Enzymol. 451, 409-437 (2008).
  41. Tettamanti, G., et al. Autophagy in invertebrates: insights into development, regeneration and body remodeling. Curr Pharm Des. 14, (2), 116-125 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics