À haut débit robotisé Isolation assistée sensible à la température létale Mutants en

Genetics
 

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Breker, M., Lieberman, K., Tulin, F., Cross, F. R. High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii. J. Vis. Exp. (118), e54831, doi:10.3791/54831 (2016).

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Abstract

Introduction

La caractérisation phénotypique des collections de mutants systématiques des organismes modèles est une approche éprouvée pour disséquer la complexité cellulaire. La haploïde verte unicellulaire Chlamydomonas reinhardtii algues a un ensemble de gènes de plantes comme, mais il a divergé de plantes terrestres avant plusieurs duplications du génome de la lignée végétale des terres 2. En principe, le manque de duplication de gènes et un cycle de vie principalement haploïde facilite grandement les approches génétiques de perte de fonction. Cependant, la perturbation ciblée de gènes d'intérêt est presque impossible en raison de l'absence d'intégration génomique homologue efficace. Une bibliothèque de perturbation insertionnelle aléatoire est en cours de construction, combinée à l' identification du site perturbé, ce qui donne à ce jour un ensemble de 1.935 Arrayed perturbations mappés représentant 1.562 gènes 3. Cependant, cette approche (prévue en général pour produire des mutations nulles) ne sont pas applicables aux gènes essentiels. (Ts) mutations peuvent être recovere sensible à la températured dans les gènes essentiels et des méthodes récentes permettent l'identification efficace du gène muté et la lésion pathogène. L'analyse phénotypique à haute température fournit ensuite des informations immédiates sur la fonction du gène muté. Nous avons signalé sur l'isolement et la caractérisation de mutations létales ts dans ~ 70 gènes essentiels dans Chlamydomonas, en se concentrant en particulier sur les gènes impliqués dans la progression du cycle cellulaire et de contrôler 1,4.

Ts écrans mortels ont été un pilier de l' analyse génétique des micro - organismes pendant des décennies 5,6. En principe, une caractéristique souhaitable est d'aborder la «saturation», ce qui signifie que tous les gènes capables de muter à ts létalité sont identifiés par au moins un mutant, ce qui permet une analyse complète. Cependant, dans la pratique, plusieurs facteurs limitent l'approche de la saturation. Premièrement, alors que presque tous les gènes peuvent être mutées pour une perte d'activité à haute température, l'efficacité de la récupération de ces mutants varie sur au moinsun ordre de grandeur 7,8. Par conséquent, un écran aléatoire commence à ramasser résultats récurrents dans les «voyageurs fréquents» bien avant que la saturation est approché. Deuxièmement, alors que ts mutations aboutissent généralement à une réduction de la fonction, ils peuvent ne pas être de vrais nulls à une température restrictive (et inversement, ne sont souvent pas entièrement fonctionnel à une température permissive). Ce problème peut être traitée dans une certaine mesure en comparant les allèles multiples; s'ils partagent tous un phénotype commun, ce qui est plus susceptible de refléter le résultat d'une simple inactivation du gène. Allèles multiples sont également très utiles pour l' identification moléculaire définitive de la lésion responsable 1. Cependant, le "voyageur fréquent" problème signifie que plusieurs allèles des gènes rarement touchés peuvent être difficiles à récupérer.

Pour ces raisons, nous avons développé un pipeline amélioré pour isoler et caractériser les phénotypique ts mutants. Nous avons recueilli plus de 3000 mutants ts jusqu'à présent, including environ 200 nouvelles mutations du cycle cellulaire candidate. L'analyse moléculaire et phénotypique de cette collection, qui comprend déjà probablement des mutations dans la plupart ou toutes les voies cellulaires essentiels, devrait fournir de nouvelles perspectives et des hypothèses de la biologie des cellules végétales. Surtout, cette canalisation peut être appliqué à tout microorganisme qui se développe sur de la gélose pour construire efficacement les collections de mutants ts.

Une note sur le matériel: deux robots sont très importants pour l'efficacité de cette procédure (un sélecteur de colonie et une combinaison réplique plater / cherry picker). Pickers ont généralement des broches métalliques. colonies Picked sont maintenues dans l'air sur ces broches pour une certaine période (secondes à quelques minutes, en fonction du modèle). Chlamydomonas meurt à environ 20 secondes sur une broche métallique dans l'air. Cela limite le choix du modèle de l'organisme. questions de précision. Notre colonie picker est raisonnablement précise; cependant, il est un peu violent dans son action et a une certaine possibilité de contamination croisée à base de pulvérisation. Il ne sert pas à hauteer que la 384 densité (4,5 mm espacement centre-centre); à cette densité, la précision est tout à fait acceptable. Le robot de repiquage des répliques / cerise (différents accessoires utilisés pour ces applications) est beaucoup plus lente à la cueillette, mais il est assez précis pour la densité 1.536 (6144 est un défi, même pour ce robot très précis, nous avons évalué cette densité, mais choisi de ne pas de l'utiliser en raison de ses diverses difficultés). Le robot ne fonctionne pas bien si les plaques sont chargées de façon inégale, etc. Il est important de repérer vérifier pour être sûr que les bonnes choses se produisent; bien sûr, le robot va fonctionner sans surveillance et en général, tout ira bien si les premières plaques étaient correctes.

Protocol

1. UV mutagenèse

  1. Préparer un lot de 100 - 200 plaques d' agar rectangulaires avec Tris-Acétate-Phosphate (TAP) moyenne 9,10. Préparer ces plaques quelques jours avant et de les garder sur le banc à sécher pour assurer une absorption rapide des cellules en suspension dans les prochaines étapes.
  2. Culture Chlamydomonas cellules jusqu'à 0,2 à 0,5 densité optique (DO 750; ~ 2 jours) dans 100 ml de liquide TAP sous la lumière, à 25 ° C et en agitant à 100 rpm.
    REMARQUE: la mutagénèse UV est effectuée de manière indépendante dans les deux fonds génétiques: Mat- r Hygro (confère la résistance à l' hygromycine B) + Mat Paro r (résistance à la paromomycine confère). Le choix d'antibiotique est arbitraire, à condition que les deux types d'accouplement ont des résistances médicamenteuses complémentaires.
  3. Vérifier un échantillon de chacune des cultures sous le microscope pour veiller à ce que les cellules sont viables, en bonne santé (natation et intact), et sans contamination.
    NOTE: cultures Overgrown "crash" etperdre leur viabilité, apparaissant comme des «fantômes» en microscopie à contraste de phase. Ne gardez pas les cultures secoueurs aller une fois qu'ils atteignent la saturation. Le «fantôme» phénomène est facilement détectable à l'étape 1.3.
  4. Diluer la culture à DO 750 0,003. Envelopper la bouteille avec du papier d'aluminium pour assurer une densité homogène, que la souche est motile et nage directionnellement en réponse à la lumière.
    1. Réglez la densité de la suspension en fonction de la dose d'UV prévue, de sorte que la comptabilité pour la destruction de cellules, 200 - 600 colonies de survivants se forment sur les plaques (figure 1). Voir le tableau 1 pour obtenir des informations sur les temps d'exposition aux UV.
  5. Fixer une cassette de petit tube qui correspond à un distributeur de liquide et d'effectuer une série de lavages pour la stérilisation, conformément aux instructions du fabricant, pour éviter toute contamination.
  6. L' utilisation d' un distributeur de liquide de 8 x 12, 4 x 96 distribuer des gouttes de 2 pl chacune sur des plaques rectangulaires (figure 1
  7. Pour assurer la dispersion des cellules très simple même, utiliser des plaques sèches, comme mentionné ci-dessus, et rapidement couvrir les plaques pour empêcher les cellules de la natation en réponse à la lumière. Maintenir le niveau des plaques couvertes et dans l'obscurité jusqu'à ce que tout le liquide soit absorbé.
  • Placer les plaques sous une lampe UV germicide (30 watts tube UV germicide) pendant des périodes de temps déterminées de manière empirique pour obtenir un rendement optimal de mutants TS- parmi les survivants. Ici, les durées de 0,5 à 1,5 minutes à une distance de 40 - 50 cm à entraîner 90 à 99,9% de destruction. Survivants contiennent 100 - 1000 mutations ponctuelles induites par les UV, dont ~ 10% de changement des séquences codantes.
    1. Afin d'assurer une puissance maximale de l' irradiation UV avec aucune réversion due à l' ADN dépendant de la lumière réparer 11,12, le travail dans l'obscurité à cette étape et immédiatement emballer leplaques dans une boîte noire après l'irradiation.
  • Garder les assiettes dans l'obscurité pendant 8-24 heures à la température ambiante.
  • Placer les plaques dans un incubateur à 21 ° avec l'illumination pour former des colonies. La formation de colonies prend ~ 10 jours. Assurez-vous d'envelopper les plaques avec des sacs en plastique et ajouter du papier absorbant à l'intérieur pour éponger la condensation liquide. cycles d'évaporation et de condensation autrement peuvent fournir des voies de films liquides pour les contaminants de pénétrer dans les plaques.
  • Chargez les plaques dans les piles concernées en tant que sources pour la cueillette des colonies robotique (Figure 2). Prélever des colonies pour 384-réseaux sur des plaques rectangulaires, et les cultiver à 21 ° C avec éclairage (~ 1 semaine).
  • Condenser les 384 tableaux dans un 1536-réseaux (4: 1) en utilisant un robot réplique-placage (figure 3), et de permettre aux plaques de se développer pendant environ 3 jours à 21 ° C incubateur.
  • Répliquer les 1.536-réseaux à deux plaques chacune et placer un dans le 21 ° C incubateur (permissivetempérature) et l'autre dans un incubateur à 33 ° C (température restrictive). Après 24 h, reproduire les plaques à 33 ° C à une nouvelle série de plaques préchauffées, et les placer dans les 33 ° C incubateur.
    NOTE: La raison de ce placage secondaire est que ts mutants létaux peuvent dans certains cas accumulent la biomasse importante, même si les cellules sont arrêtées au cours du premier cycle cellulaire après placage. La réplique secondaire élimine ce signal et augmente considérablement la sensibilité.
  • Photographier les plaques avec un appareil photo numérique suivant 3 jours de croissance à 33 ° C et 5 jours de croissance à 21 ° C. Tenez les plaques dans un cadre fixe. Utilisez une "grille-plaque" marquée avec neuf indicateurs d'alignement qui est photographié avec les plaques de culture (figure 4). Photographie des plaques de culture comme alternative appariés 21 ° 33 ° C (21/33) images C et.
    NOTE: Les différents temps d'incubation sont utilisés pour égaliser la croissance depuis le type sauvage augmente de manière significativeplus rapidement à 33 ° C qu'à 21 ° C.
  • 2. Identification des candidats mutants ts: Premier écran

    1. Traiter les paires 21/33 images de la plaque avec un Matlab logiciel d'analyse d'image personnalisée pour éliminer l'arrière-plan et de segmenter les images dans un 1536 tableau. Le programme détermine la biomasse détectée (intensité de pixels au total) dans chaque position (figure 5).
      REMARQUE: Le logiciel (fourni dans le SI avec les instructions) utiliseront l'image grille-plaque afin de déterminer les emplacements des cellules (entrées individuelles) dans un 1536-array à l'alignement d'agrandissement et de la plaque utilisée et calculer l'intensité de pixels au total dans chaque cellule . Ces valeurs pour chaque mutant sont ensuite comparés aux paramètres réglables pour déterminer la croissance requise à 21 ° C par rapport à un ts + standard et le degré de sensibilité à la température, définies comme suit: S (Mut 33) / S (WT 33) / S (Mut 21) / S (WT 21), où S est le signal (pixeltensity après soustraction de fond), Mut est un mutant individuel, et "WT" est une colonie non-sensibles à la température choisie au hasard (souche mutagénisé qui avait ts + phénotype). Croissance à 21 ° C est défini comme S (Mut 21) / S (WT 21). Dans ce premier écran, appliquer des critères de sélection détendue (permettant une croissance relativement faible à 21 ° C et un degré de sensibilité à la température relativement faible) pour maintenir le faux négatif faible taux.
    2. Charger la liste des colonies sélectionnées générées par le logiciel comme un fichier d'instructions pour la seule colonie de la cueillette robotique (généralement dans un 384-array). Préparer les plaques de source et cible selon les instructions de la robotique et de choisir des colonies à matrice (figure 6).
      NOTE: pickers classiques nécessitent un fichier d'instructions dans un format, comme .csv, .txt, ou .xls. Tous les cueilleurs auront la capacité d'être entraînée fichier; différents formats nécessiteront des modifications mineures du code MATLAB (code source fourni). Placez les plaques cibles dans le 21 ° C incubateur pour ~ 5 jours pour pousser une plaque de stock.

    3. Identification ts Mutants: Deuxième écran

    1. Répétez l'étape 2.1 à retester colonies cueillies. Typiquement 30 - 50% des colonies va retester ts comme claires létaux, pour un rendement de 2% - 5% ts létaux par rapport aux colonies initiales survivants mutagenèse UV.
    2. Répétez l'étape 2.2 pour la cueillette des ts létaux deux fois dépistés, mais avec un fichier d'instruction modifié conçu pour les colonies de tableau en blocs de 100 colonies sur des plaques rectangulaires à 384 densité. Ceci est pour l'examen microscopique pratique dans l'étape suivante. Le format de fichier d'instruction est spécifié lors de l'exécution par le code MATLAB.
    3. Assurez-vous d'inclure plusieurs colonies WT comme un contrôle et placer les plaques à 21 ° C pendant ~ 5 jours.

    4. Détermination phénotypique initiale

    1. Répliquer les plaques de 100 blocs disposés à l'étape 3.2 et les placer dans le 21 ° C incubator pour ~ 2 jours pour obtenir des colonies fraîchement croissance.
    2. Répliquer la nouvelle copie des plaques de 100 blocs (4.1) à trois exemplaires. Placer une copie dans l'incubateur à 21 ° C et une dans la couveuse 33 ° C en tant que témoins.
    3. Placez la troisième copie ( "screening plaques") dans une configuration robotique, et repérer les colonies avec de longues tiges touchées avec de l'eau stérilisée.
      NOTE: les cellules de Chlamydomonas épinglées agar robotically ont tendance à atterrir d'abord comme une tache assez dense de cellules, avec quelques cellules individuelles disponibles pour l'inspection microscopique. Afin d'optimiser les colonies pour l'inspection microscopique, repérer les cellules transférées initialement avec une goutte d'eau (le volume d'eau transféré par les longues broches robotiques est de ~ 100 nl). Il en résulte une dispersion des cellules dans un petit rayon (~ 1 mm) autour du centre de piégeage initial, avec de nombreuses cellules uniques isolées.
    4. Prendre photomicrographies d'une région de chaque tache des plaques de blindage au temps 0 (tout seul, des cellules non divisées) (La figure 7) et de placer les plaques à 33 ° C pendant l' incubation. Déterminer l'emplacement de l'image par la commande de l'étape manuelle d'un microscope tétrade de dissection modifié prévu pour donner des arrêts au 4,5 mm espacement d'un réseau de 384 densité de centre à centre.
    5. Retirez les plaques de blindage de la 33 ° C incubateur et prendre des photomicrographies, comme à l'étape 4.4, à des points de temps variables (10 h, 20 h, 48 h). Assurez-vous que la scène, le support de plaque, et le contrôleur de scène sont précisément calibrés pour obtenir des images des mêmes cellules dans chaque point de temps. Effectuer l'acquisition de microphotographie rapide (~ 10 min).
    6. Utilisez la deuxième copie dans le 33 ° C incubateur pour vérifier le phénotype ts et de faire en sorte que les variations de température au cours de l'acquisition d'image n'a aucun effet majeur sur ts phénotype.
      1. Analyser les images microscopiques et sélectionner des mutants sur la base des critères souhaités (figure 8). Repérez l'ensemble sélectionné finale dans une plaque de gélose 96 revêtu. Assurez-vous que chaquela plaque contient des mutants du même type d'accouplement et une résistance aux médicaments.
      2. Pour chaque plaque, incorporer les deux dernières colonnes, une (requête de mutation) positif et un négatif (WT) de contrôle pour le dosage de complémentation.

    5. Test de complémentation et liaison des Nouveaux Mutants à "Frequent Flyers"

    1. Transfert de grandes quantités de colonies disposées à moyen gamète-induction exempt d' azote 10 dans microplaques de 96 puits (densité de chaque colonie devrait être d' environ 0,2 OD). Incuber les plaques sous lumière (13-20 W mercure des ampoules) pour ~ 5 h pour permettre la gamétogenèse.
      REMARQUE: Cette étape peut être réalisée soit avec une installation robotique réplication ou manuellement à l'aide d'un dispositif de placage simple.
    2. Suspendre les requêtes avec des mating types opposés hébergeant les cassettes de résistance alternatives dans des tubes avec le milieu d'induction gamète exempt d' azote 10 pour la gamétogenèse.
    3. Mélanger les échantillons dans une plaque cible dans un conjugué mixtele volume ure de 20 ul (figure 9). Après ~ 10 min sous la lumière, comptant 5 pi de chaque puits deux fois: une fois sur une plaque de TAP pour les essais de liaison et une fois sur TAP + 5 uM Paro + 9 uM Hygro pour les tests de complémentation.
    4. Incuber les plaques de liaison dans le 21 ° C incubateur pendant une nuit, puis les envelopper dans du papier. Gardez-les dans l'obscurité pendant 5 jours pour permettre la formation de zygospore.
    5. Incuber les plaques complémentation-test pour ~ 10 jours à la lumière à 21 ° C.
      REMARQUE: Les quantités de médicaments sont calibrés pour permettre la survie des diploïdes doublement hétérozygotes, mais ils sont encore assez pour éliminer les haploïdes d'accouplement. Ces montants ont été calibrés pour des intégrations de cassettes de résistance standards utilisés dans ce projet spécifique; avec de nouvelles intégrations, les doses doivent être recalibrés. La plupart de la biomasse est vérifié pour être diploïdes par cytométrie de flux (Figure 9), même si un niveau variable de haploïdes (probablement de la méiose et la croissance de doublement résistantségrégants) est habituellement observée aussi bien.
    6. Répliquer les plaques de complémentation-test en deux exemplaires pour l'identification du phénotype ts-. Placez une copie à 21 ° C et une copie à 33 ° C pendant ~ 5 jours.
    7. Colonies d'essai pour le phénotype ts-, tel que décrit dans la section 2.1 (Figure 5). Les colonies qui ne sont pas complémente avec la requête sont susceptibles de représenter des alleles du même gène que la requête (hétéro diploïdes de mutations alléliques dans le même gène).
    8. Pour les tests de liaison, après l'étape 5.4, déplacer les plaques arrière à la lumière pour permettre la méiose et excroissance de ségrégants haploïdes pendant ~ 7 jours.
    9. Répliquer plaques d'essai de liaison à TAP + 10 uM Paro et 10 uM Hygro pour sélectionner des descendances doubles résistant (prédites à 25% de la descendance haploïde, étant donné que les cassettes sont dissociées) et incuber à 21 ° C pendant une semaine.
      NOTE: Augmenter la dose de médicament pour haploïdes doublement résistantes.
    10. colonies de test pour le phénotype ts-, comme in étape 2.1.
      NOTE: Un phénotype ts- est prévu (et observé) des mutants dans le même groupe de complémentation que la requête. En outre, un phénotype ts- dans le dosage de liaison pour un mutant qui complète la requête, peut refléter lien étroit entre la requête et la nouvelle mutation. Mutants qui complètent les requêtes testées sont de nouveaux gènes susceptibles qui entreront dans le pipeline pour l'identification bioinformatique de la lésion responsable, et, finalement, pour une analyse phénotypique.

    Representative Results

    Nous montrons un pipeline accéléré pour isoler des mutants ts dans Chlamydomonas. Les cellules sont distribuées sur des plaques d' agar - agar, et peu de temps après validation rapide sous le microscope pour la densité de cellules isolées, les plaques sont UV irradiée (Figure 1). Colonies irradiées typiques sont identifiés et repris dans un format rangé après 10 jours de croissance à une température permissive (Figure 2). Les plaques résultantes au format 384 sont fusionnés à un 1.536-matrice (figure 3). A partir de ces premières étapes de collecte des colonies irradiées, nous avons rangé ~ 200.000 colonies jusqu'à présent. La densité de la suspension est ajustée en fonction de la dose d'UV prévue de telle sorte que, soit la mort, 200 - 600 colonies de survivants se forment sur les plaques. Trois fois UV d'exposition (1,5 min, 1 min et 0,5 min) et trois densités ont été testées en conséquence ( voir le tableau 1). Empiriquement, le temps d'exposition de 1,5 minutes a abouti à la plupart des ts- des mutants (~ 50%); Cependant, de loin, 1 min a abouti à la plupart des candidats du cycle cellulaire. Par conséquent, les futurs cycles de mutagenèse UV ont été réalisées avec 1 min seulement. Une préoccupation importante est les éclaboussures lors de la cueillette initiale et la contamination croisée (en particulier dans les formats de haute densité). Cela peut entraîner deux fois dans le double emploi et plus phénotypage du même mutant. Pour réduire au minimum la probabilité d'un tel scénario, prendre soin de recueillir des colonies à la taille optimale, et assurez-vous que les colonies adjacentes ne sont pas pris dans l'essai initial.

    Ensuite, deux séquentielles TS- tests phénotypiques (figure 5) ont été réalisées, et près de 3000 ts- mutants ont été isolés et phénotypique caractérisés par microscopie time-lapse (Figure 8). En raison de la mise au point biologique dans l'étude du cycle cellulaire d'intérêt dans les phénotypes qui répondent à certains critères, nous ne sommes pas intéressés par la collecte de plus de deux allèles dans chaque cible gene. Par conséquent, nous avons effectué complémentation et les tests de liaison avec des gènes déjà caractérisés avec plus de deux allèles (requête) contre les candidats nouvellement collectés pour éliminer les gènes fortement récurrents de la canalisation aval (figure 9).

    Figure 1
    Figure 1: répartition uniforme des cellules non mutée et mutagenèse UV. (a) 2 x 384 ul de gouttes sont distribuées sur une plaque de gélose en utilisant un distributeur de réactif. (b) des plaques au hasard sont testés sous le microscope pour vérifier la densité de cellules isolées et sont UV irradiés avec une exposition de 1 min. Barre d'échelle = 50 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 2 Figure 2. Colonies mutagénisé-UV choisi pour les 384 tableaux. (a) des cellules individuelles irradiées-UV sont cultivées pour ~ 10 jours dans des colonies visibles. Barre d'échelle = 2 cm. (b) un programme d'analyse d'image reconnaît colonies séparables selon certains paramètres et les robotically dans 384 revêt ainsi des plaques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 3
    Figure 3. Fusion du 1536-array. Quatre plaques 384 format sont fusionnées pour une 1536-plaque; une fois cultivées, ils sont répliqués de nouveau pour tester le phénotype ts. S'il vous plaît cliquer ici pour voir uneune plus grande version de ce chiffre.

    Figure 4
    Figure 4. Imaging pour Quantification. (a) Les plaques sont maintenues dans un cadre sous un stand document de la photographie de telle sorte que toutes les plaques dans une série sont photographiées à un grossissement et un positionnement identique. (b) La première image est celle d'une plaque de microtitrage 1536 puits avec des points rouges placés aux coins et au milieu. Cette «grille-plaque" image définit la position de la matrice. (c) Exemple d'un 1536-array après incubation. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 5
    Figure 5. Identification du phénotype ts- par Semi-automated Analyse d'image. images de plaques sont analysées par le logiciel MATLAB personnalisé (fourni dans le SI). L'image est automatiquement segmentés en matrices de cellules (96, 384 ou 1.536), et le signal dans chaque cellule est quantifié. La croissance à 21 ° C est marqué en bleu, et la croissance à 33 ° C est marquée en jaune. Les colonies présentant une croissance significativement supérieure à 21 ° C contre 33 ° C (standardisé à ts +) sont sélectionnées et marquées carrés noirs avec un point vert. Ces choix peuvent être modifiés manuellement. Les sélections finales sont transférées vers un fichier utilisé par le robot de colonie-cueillette. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 6
    Figure 6. Picking Robotic des candidats Lethal de première ronde. La cerise-PickiRobot ng suit les instructions à partir d'un fichier généré comme décrit à l'étape 2.1 de choisir des candidats pour un nouveau tableau. Le panneau supérieur montre le chargement d'une broche stérilisée. Le panneau inférieur montre la cueillette précise à partir d'une certaine colonie dans la plaque source. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 7
    Figure 7. Time-lapse Dépistage de tri initial de ts des phénotypes létaux. Les clones qui ont passé deux tours du protocole de criblage représenté sur la figure 5 sont répliquées sur des plaques à une densité de cellules telles que les cellules individuelles peuvent être réglées au microscope. Une dissection microscope tetrad modifié est utilisé pour identifier les positions auxquelles microphotographies sont prises après 0 h, 10 h et 20 h incubations une t 33 ° C. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 8
    Figure 8: Les Mutants du cycle cellulaire Chlamydomonas identifiés par Time-Lapse Microscopy. (a) Illustration du cycle cellulaire unique , Chlamydomonas décrit la longue phase G1 caractérisée par une croissance cellulaire, suivi par des cycles de SM de fission, qui finissent avec l'éclosion des cellules filles nouveau - nés. (b) montrent des images au microscope des cellules WT au cours du cycle cellulaire et l'identification des mutants typiques du cycle cellulaire qui ne terminent pas la mitose. Barre d'échelle = 50 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figure 9
    Figure 9: complémentation de liaison et d' essai. (a) Un résistant (par exemple, Hygro) requête antibiotique avec un gène muté fréquemment répété est traversé dans une plaque de 96 puits avec un ensemble de mutants du type de conjugaison opposé qui abritent une deuxième cassette de résistance aux antibiotiques (par exemple, Paro). plaques de complémentation rendement élevé fraction de diploïdes comme indiqué par la coloration d'acide nucléique et une analyse en cytométrie de flux (panneau inférieur gauche en a). (b) Le mélange d'accouplement est testée à la fois pour la complémentation en diploïdes et pour la liaison dans la descendance double résistant à la méiose. Le contrôle positif est la requête elle-même dans le type de conjugaison opposé, et, comme prévu, montre le phénotype ts- à 33 ° C, alors que le contrôle négatif est WT et montre le ts + phénotype. Les colonies encerclées montrent aucune complémentation avec la requête et sont donc nallèles TS- ew pour le gène de la requête. Ceux-ci sont généralement exclus de caractérisation plus poussée, puisque seuls les «voyageurs fréquents» sont dans l'ensemble de test de complémentation. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    <td rowspan = "2"> 0,5 '
    Temps OD Colonies cueillies (#) phénotype TS- Candidats cycle cellulaire
    1.5 ' 0,012 6000 (Moy = ~ 200) 200 (3,3%) 7 (3,5%)
    1' 0,003 11.000 131 (1,19%) 15 (11,4%)
    (Moy = ~ 360)
    6E-04 9000 40 (0,45%) 1 (2,5%)
    (Moy = ~ 300)

    Tableau 1: Calibration du Irradiation Times pour maximiser le rendement du cycle cellulaire candidats Mutant. Trois fois d'irradiation ont été testées (30 plaques chacune) avec DO correspondant à assurer survivants le nombre de colonies (200 - 600).

    Discussion

    Le pipeline décrit ici pour un rendement élevé isolement des mutants létaux ts assure que vraisemblablement toutes les voies cellulaires essentiels du génome de Chlamydomonas sont représentés. Les deux étapes les plus critiques pour la collecte efficace des gènes potentiels du cycle cellulaire et pour l'élimination des allèles «frequent flyer» répétitifs sont: 1) la définition cohérente des caractéristiques phénotypiques arrêt pour les cycles cellulaires incomplètes et 2) le dosage de complémentation parallèle contre déjà identifié interroger les gènes pour agrandir la collection avec ceux nouvellement isolés.

    Lorsque synchronisés par des cycles lumière-obscurité, Chlamydomonas pousse photosynthétiquement pendant les heures de lumière du jour et l' augmentation de la taille des cellules> 10x sans réplication de l' ADN ou la division cellulaire 13. Qui coïncide approximativement avec le début de la nuit, les cellules sont ensuite soumises à des cycles multiples de replication de l' ADN en alternance, la mitose et la division cellulaire (Figure 8). Cette schem réglementairee fournit une distinction entre les gènes naturels principalement nécessaires à la croissance cellulaire et l'intégrité et les gènes nécessaires en particulier pour le cycle de la division cellulaire. Nous avons constaté que les points de temps de 10 h et 20 h sont très instructifs pour une phénotypique rugueuse initiale coupé 1. Les grandes classes de mutants létaux ts que nous reconnaissons actuellement, à partir de ces images (voir SI en Tulin et Cross, 2014) 1, sont: Notch, Popcorn, rond, petit, moyen, lyse précoce, et plusieurs cycles (Figure 8 ).

    Les trois catégories les plus pertinentes, nous nous concentrons sur sont Notch, Popcorn et ronde. Les "Notch" et phénotypes "popcorn" ont été présentés précédemment pour être caractéristique de la plupart des lésions du cycle cellulaire spécifiques (par exemple, mitotique kinases cycline-dépendantes, les machines de réplication de l' ADN, et la topoisomérase II) 1. L'apparition d'un (Notch) ou multiple (Popcorn) Les plans apparents de la division cellulaire naissante mais qui succombe est une pratique MORPHOLIndicateur ogique de l'initiation du cycle cellulaire. Ces mutants présentent généralement peu ou pas de défauts de croissance, avec une augmentation du volume cellulaire similaire à WT à la marque de 10 h. Les Notch et Popcorn phénotypes sont évidents à 10 h et sont entièrement développés (souvent associée à la lyse des cellules) de 20 h. cellules "ronds" se développent de manière similaire à WT, mais avec une production très réduite des plans de division naissantes apparentes, donnant ainsi de grandes cellules, rondes arrêtées. Mutants précédents dans cette catégorie sont tombés dans les composants des complexes 14 ou dans les gènes de anaphase-promotion nécessaires à la fonction des microtubules (cofacteurs tubuline-pliage, complexe bague gamma-tubuline) 1. Parfois plus tard, ces cellules présentent souvent la lyse cellulaire prononcée.

    "Small" et les cellules "Medium" poussent soit négligeable (Small) ou beaucoup moins que WT (Medium). Beaucoup de ces mutants identifiés à ce jour ont des lésions dans les gènes dont les annotations suggèrent des rôles dans cellula baseprocessus de croissance de r (traduction ou biogenèse membranaire). La principale discrimination microscopique entre moyenne et ronde repose sur le montant de la croissance à 10 h (ronde: comme WT; moyen: réduit). Parce que les catégories petites et moyennes sont assez grandes et reflètent probablement des lésions dans une grande variété de voies cellulaires, nous ne tentons pas de saturer ces catégories; cependant, nous ne voulons Moléculairement identifier les représentants de la classe à comprendre phénotypes de perte dans diverses voies. Deux catégories non étudiées sont: 1) le début de la lyse des mutants qui perdent l'intégrité (perte de la couleur verte, la perte de réfringence) par la marque de 10 h, avec peu de preuves de la croissance cellulaire avant et 2) les multiples cycles. Les cellules prolifèrent de manière similaire à WT à 10 et 20 h, bien qu'ils présentent une incapacité totale à mener à bien la prolifération à long terme.

    Nous sommes la plupart du temps caractérisons "cran", "pop-corn" et "rond" et exclut les petites et moyennes cellules rondes, ainsicomme mutants qui fuient que quelques divisions complètes de cellules. Ceci est principalement à assurer que les caractéristiques cellulaires de base, tels que la croissance et de l'intégrité de la membrane, sont fonctionnels et enrichir la probabilité pour les gènes liés à la division. Cette approche est jugée empiriquement efficace; cependant, il peut être qu'un gène du cycle cellulaire est pléiotrope et a d'autres rôles plus tôt dans G1, avant la division réelle. Ces cas, qui nous nous attendons à être rares, sont manqués. Plus généralement, nous visons l'arrestation homogène, qui probabilité élevée est due à une mutation causale qui est une protéine complètement dysfonctionnel. Cependant, pour la même raison que nous venons de décrire, il peut y avoir plusieurs points d'arrêt et, par conséquent, une certaine flexibilité est souhaitable dans le choix des candidats.

    Afin d'enrichir la collection avec des gènes nouvellement identifiés, les candidats retenus sont testés pour la complémentation. Nous exigeons ts- dans le contrôle positif (requête contre la mutation de requête) et ts + dans le contrôle négatif (Query contre WT). Nouveaux mutants dans le même groupe de complémentation que la requête sont ts-. L'appartenance à un même groupe de complémentation reflète presque invariablement une lésion moléculaire dans le même gène (cela a été le cas pour chacun de ces gènes, nous avons testé). Par conséquent, pour «voyageurs fréquents», ce critère est d'exclusion pour une caractérisation plus poussée. Mutants qui ne sont pas les mêmes groupes de complémentation que les requêtes testées sont des candidats pour de nouveaux gènes et sont en outre caractérisés par la bioinformatique et des outils expérimentaux. récupération très variable de TS- allèles dans différents groupes de complémentation est un phénomène qui est bien connu, la variabilité est nettement supérieure à bruit Poisson, en raison de la grande variabilité intrinsèque de la mutabilité à TS- entre gènes différents. Les causes peuvent inclure les différences de thermolabilité intrinsèques; différentes tailles de protéines; la présence d'une protéine en tant que monomère par rapport à un grand complexe stabilisé; et les points chauds mutagène. Ceci est presque un nuisa purnce. Cependant, un résultat favorable résultant est que la liste "frequent flyer" est pas long (avec seulement quelques cibles occupant la majeure partie de la liste), de sorte que le test de complémentation main-d'œuvre est pas une entreprise de grande envergure jusqu'à ce que les étapes ultérieures du projet.

    Comme une approche complémentaire, nous avons effectué un test de liaison. Dans cet essai, les descendances doubles résistant sont sélectionnés et testés pour le phénotype ts. Un phénotype ts- est prévu (et observé) des mutants dans le même groupe de complémentation que la requête ou de mutations étroitement liés. Pour chacun des gènes testés, une descendance WT devrait apparaître (ts + phénotype) dans une certaine probabilité en fonction de la distance génétique. Nous estimons qu'il ya environ 100 zygospores pour chaque accouplement dans ces taches. En supposant que 100% d'efficacité de la méiose, cela se traduira par la descendance d'environ 100 double résistant aux médicaments à partir des cassettes non chaînées de résistance aux médicaments (25% de la descendance de la méiose, quatre par méiose, en raison de Mhéritage endelian). Ce serait également le cas pour TS- mutations, où 25% des descendances sera double mutant, et 25% sera WT si la requête et de test des mutations sont dissociées. Par conséquent, sur la descendance résistante double drogue, 25% sera WT (environ 25 cellules). Tel est le cas pour les mutations complètement non liés; Cependant, la liaison modérée (moins ~ 20 cm, environ 2 Mb, soit 2% du génome 115) va fortement réduire ou éliminer les ts + signaux. Dans le cas du couplage de la mutation testée à la cassette antibiotique, ts + haploïdes qui sont résistants à deux médicaments sont présentes en très faibles quantités. Cela se manifeste comme un échec apparent pour recombiner avec tous les mutants testés, en dépit de compléter tous les mutants testés, un résultat aberrant qui est facilement noté; dans de tels cas, rétrocroisement va résoudre le problème.

    Les deux de la connaissance préalable et de l' analyse de séquence, nous nous attendons à des gènes du cycle cellulaire dans le Chlamydomonas d'être autour de 500 gènes 2, bien que most, mais probablement pas tous, sont essentiels. Nous allons évaluer la nécessité pour les tours de mutagenèse supplémentaires plus mutants sont collectés et le niveau de saturation augmente.

    Cette procédure est conçue uniquement pour l'étude des processus biologiques essentiels et les gènes et les protéines qui les effectuent. D' autres méthodes existent pour générer des perturbations dans les gènes essentiels (par exemple, la transformation des allèles mutagénisées au hasard 16, allèles conditionnellement transcrits 17, ou allèles hypomorphic 18). Cependant, ils nécessitent tous la recombinaison homologue, qui est fortement réprimée dans végétative Chlamydomonas. Le cluster, régulièrement intercalées courte répétition palindromique (CRISPR) / système cas9 a été créé comme un outil puissant pour la modification génétique 19; cependant, il est encore à travailler efficacement dans Chlamydomonas 20. Critique, toutes ces méthodes nécessitent une connaissance préalable de la cible. Ceci est une restriction sévèresi l'on veut avoir la possibilité d'apprendre quelque chose de nouveau! Notre approche donnera des mutations d'identification des gènes essentiels, indépendamment de toute connaissance préalable. Par conséquent, au niveau actuel de la technologie, l'isolement des mutations ts aléatoires suivis par l'identification des gènes par séquençage en profondeur peut être la méthode la plus efficace pour obtenir une rapide entrée en biologie cellulaire microbienne dans le superkingdom des plantes.

    Identification des mutations causales (parmi ~ 100 de codage de la séquence de changement des mutations dans chaque clone) est au-delà de la portée de cet article. Séquençage profond des pools de ségrégants regroupés 1 est efficace , mais de main-d'œuvre. Une stratégie de pool combinatoire pour la détermination de toutes les mutations dans un grand nombre de souches, après le séquençage d'un petit nombre de piscines, est très rentable et efficace du travail. Une nouvelle stratégie pour le séquençage combinatoire de ségrégants regroupés est en cours de développement qui permettra l'identification des mutations responsables dans des dizaines de mutants SIMultaneously en un seul passage de séquençage (en préparation). Ces gains d'efficacité sont très importants pour permettre à l'étape de l'identification des gènes critiques pour suivre le rythme de l'accumulation très rapide de mutants qui est rendu possible par les procédures décrites ici.

    Disclosures

    Les auteurs déclarent aucun intérêt financier significatif.

    Acknowledgments

    Nous remercions les membres du laboratoire de la Croix pour obtenir des conseils et des discussions utiles. Ce travail a été soutenu par PHS 5RO1-GM078153 et par un prix junior Fellow de la Fondation Simons à Michal Breker.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Equipment:
    Hudson RapidPick colony picker Hudson Robotics
    MultiDrop Combi Reagent Dispenser Thermo Scientific 5840300
    Small tube metal tip cassette Thermo Scientific 24073295
    Singer RotoR replica-plating robot Singer Instruments Very essential for the process. For lower scale screenings you can use an in-house manual tool
    Singer single-colony picking attachment (‘Stinger’) Singer Instruments Can be picked manually, however for large scales it is nearly impossible
    Name Company Catalog Number Comments
    Materials:
    SYTOX Green Nucleic Acid Stain ThermoFisher Scientific S7020

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    References

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