High-throughput robotizzata Assisted Isolamento di sensibile alla temperatura letale Mutants in

Genetics
 

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Breker, M., Lieberman, K., Tulin, F., Cross, F. R. High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii. J. Vis. Exp. (118), e54831, doi:10.3791/54831 (2016).

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Abstract

Introduction

La caratterizzazione fenotipica delle collezioni mutante sistematiche di organismi modello è un approccio collaudato per sezionare la complessità cellulare. Il aploide unicellulare verde alghe Chlamydomonas reinhardtii ha una serie gene impianto simile, ma è discostato dalle piante terrestri prima molteplici duplicazioni del genoma nel lignaggio impianto terreno 2. In linea di principio, la mancanza di una duplicazione genica e un ciclo di vita principalmente aploidi facilita notevolmente la perdita-di-funzione di approcci genetici. Tuttavia, distruzione mirata di geni di interesse è quasi impossibile a causa della mancanza di efficace integrazione genomica omologa. Una libreria interruzione inserzionale casuale è in fase di costruzione, in combinazione con l'identificazione del sito perturbato, finora ottenendo un insieme Arrayed di 1.935 interruzioni mappati in rappresentanza di 1.562 geni 3. Tuttavia, questo approccio (previsto in generale per produrre mutazioni nulli) non è applicabile ai geni essenziali. Sensibili alla temperatura (TS) mutazioni possono essere recovered in geni essenziali, e metodi recenti consentono efficace individuazione del gene mutato e la lesione causale. L'analisi fenotipica ad alta temperatura quindi fornisce informazioni immediate sulla funzione del gene mutato. Abbiamo riportato sul isolamento e la caratterizzazione di mutazioni letali ts in ~ 70 geni essenziali in Chlamydomonas, concentrandosi in particolare sui geni coinvolti nella progressione del ciclo cellulare e controllare 1,4.

Ts schermi letali sono stati un pilastro di analisi genetica nei microrganismi per decenni 5,6. In linea di principio, una caratteristica desiderabile è di avvicinarsi "saturazione", nel senso che tutti i geni capaci di mutare TS letalità sono identificati da almeno un mutante, consentendo un'analisi completa. Tuttavia, in pratica, diversi fattori limitano l'approccio alla saturazione. Innanzitutto, mentre quasi tutti i geni possono essere mutati alla perdita di attività ad alta temperatura, l'efficacia del recupero di tali mutanti varia su almenoun ordine di grandezza 7,8. Pertanto, uno schermo a caso inizia a raccogliere successi ricorrenti in "frequent flyer" molto tempo prima che la saturazione si avvicina. In secondo luogo, mentre ts mutazioni generalmente producono una riduzione della funzione, essi non possono essere veri null a temperatura restrittiva (e viceversa, spesso non sono completamente funzionali ad una temperatura permissiva). Questo problema può essere affrontato in una certa misura, confrontando più alleli; se tutti condividono un fenotipo comune, questo è più probabile che riflettano il risultato di semplice inattivazione del gene. Alleli multipli sono anche molto utili per l'identificazione molecolare definitiva della lesione causale 1. Tuttavia, il problema "frequent flyer", significa che più alleli nei geni raramente colpite possono essere difficili da recuperare.

Per queste ragioni, abbiamo sviluppato una maggiore oleodotto per isolare e caratterizzare fenotipicamente ts mutanti. Abbiamo raccolto più di 3.000 ts mutanti finora, including circa 200 nuove mutazioni del ciclo cellulare candidato. Analisi fenotipica e molecolare di questa collezione, che già comprende probabilmente mutazioni nella maggior parte o tutti i percorsi cellulari essenziali, dovrebbe fornire nuove intuizioni e ipotesi in biologia cellulare vegetale. È importante sottolineare che questo tubazione può essere applicato a qualsiasi microrganismo che cresce su agar costruire efficientemente ts raccolte mutanti.

Una nota sulle attrezzature: due robot sono molto importanti per l'efficienza in questa procedura (un selettore di colonia e una combinazione replica placcatore / ciliegia raccoglitrice). Pickers in genere hanno perni metallici. colonie raccolte vengono tenuti in aria su questi perni per un certo periodo (secondi a minuti, a seconda del modello). Chlamydomonas muore in circa 20 secondi su un perno di metallo in aria. Questo limita la scelta del modello per l'organismo. questioni precisione. Il nostro selettore colonia è ragionevolmente accurata; tuttavia, è in qualche modo violento nella sua azione e ha qualche possibilità di contaminazione incrociata spray a base. Non viene utilizzato ad altaER rispetto al 384 densità (4,5 millimetri di centro-centro distanza); a questa densità, la precisione è tutto accettabile. La raccolta robot placcatura replica / ciliegia (diversi accessori utilizzati per queste applicazioni) è molto più lento a raccolta, ma è sufficientemente accurato per la densità di 1.536 (6.144 è una sfida, anche per questo robot molto accurata, abbiamo valutato questa densità, ma non eletti usarlo per le sue varie difficoltà). Il robot non funziona bene se le piastre vengono caricate in modo non uniforme, ecc. E 'importante individuare controllare per essere sicuri che le cose giuste stanno accadendo; Naturalmente, il robot esecuzione automatica e in generale tutti andrà bene se i primi piatti erano corretti.

Protocol

1. mutagenesi UV

  1. Preparare un lotto di 100 - 200 piastre di agar rettangolari con Tris-acetato-fosfato (TAP) di media 9,10. Preparare questi piatti un paio di giorni in anticipo e tenerli in panchina ad asciugare al fine di garantire un rapido assorbimento delle cellule sospese nei passaggi successivi.
  2. Cultura Chlamydomonas cellule fino a 0,2-,5 densità ottica (OD 750; ~ 2 giorni) in 100 ml di TAP liquido sotto la luce, a 25 ° C e agitazione a 100 rpm.
    NOTA: mutagenesi UV viene eseguita in modo indipendente in due background genetico: Mat- Hygro r (conferisce resistenza alla Hygromycin B) e Mat + Paro r (conferisce resistenza alla Paromomicina). scelta antibiotico è arbitraria, a condizione che i due tipi di accoppiamento hanno resistenze farmacologiche complementari.
  3. Controllare un campione di ciascuna delle culture al microscopio per garantire che le cellule sono vitali, sani (nuoto e intatto), e senza contaminazione.
    NOTA: culture Overgrown "crash" eperdere vitalità, che appare come "fantasmi" nella microscopia a contrasto di fase. Non tenere culture shaker andare una volta raggiunta la saturazione. Il fenomeno "fantasma" è facilmente individuabile nella fase 1.3.
  4. Diluire la cultura a 0.003 OD 750. Avvolgere la bottiglia con un foglio di alluminio per garantire la densità omogenea, come il ceppo è mobili e nuota direzionalmente in risposta alla luce.
    1. Regolare la densità della sospensione sulla base della dose UV previsto, in modo che la contabilità per l'uccisione delle cellule, 200 - 600 colonie superstiti formeranno sulle piastre (Figura 1). Vedere la Tabella 1 per le informazioni su tempi di esposizione ai raggi UV.
  5. Attaccare una cassetta piccolo tubo che si inserisce un dosatore ed eseguire una serie di lavaggi per la sterilizzazione, secondo le istruzioni del produttore, per prevenire la contaminazione.
  6. Utilizzando un dosatore 8 x 12, dispensare 4 x 96 gocce di 2 microlitri ciascuno su piastre rettangolari (Figura 1
  7. Per garantire molto anche singola dispersione cellulare, utilizzare lastre secche, come detto sopra, e rapidamente coprire le piastre per evitare che le cellule dal nuoto in risposta alla luce. Mantenere il livello di piastre coperto e al buio fino a quando viene assorbito tutto il liquido.
  • Posizionare le piastre sotto una lampada UV germicida (30 watt tubo UV germicida) per periodi di tempo determinati empiricamente per dare una resa ottimale di mutanti TS tra i sopravvissuti. Qui, utilizzare tempi di 0,5 - 1,5 minuti ad una distanza di 40 - 50 cm al risultato nel 90 - 99,9% abbattimento. I sopravvissuti contengono 100 - 1.000 mutazioni puntiformi indotte dai raggi UV, di cui ~ sequenze codificanti 10 Variazione%.
    1. Al fine di garantire la massima potenza di irradiazione UV senza ritorno a causa di DNA dipendente dalla luce riparare 11,12, il lavoro al buio a questo passaggio e subito imballare lapiastre in una scatola buia dopo l'irradiazione.
  • Conservare le piastre al buio per 8 - 24 ore a temperatura ambiente.
  • Posizionare le piastre in un incubatore a 21 ° con illuminazione di formare colonie. la formazione di colonie prende ~ 10 giorni. Assicurarsi di avvolgere le piastre con i sacchetti di plastica e aggiungere carta assorbente all'interno di cancellare fino condensa liquida. Evaporazione e condensazione cicli altrimenti in grado di fornire percorsi di film liquidi per i contaminanti di entrare nei piatti.
  • Caricare le piastre in pile pertinenti come fonti di raccolta colonia robotica (Figura 2). Scegliere colonie per 384-array su piastre rettangolari, e farle crescere a 21 ° C con illuminazione (~ 1 settimana).
  • Condensare il 384-array in un 1.536-array (4: 1) usando un robot replica-placcatura (Figura 3) e consentono le piastre di crescere per ~ 3 giorni in C incubatore 21 °.
  • Replicare i 1.536-array a due piatti ciascuno e mettere uno in C incubatore 21 ° (permissivatemperatura) e l'altro in un 33 ° C incubatore (temperatura restrittivo). Dopo 24 ore, replicare le piastre a 33 ° C ad una nuova serie di piastre pre-riscaldato, e metterli in C incubatore 33 °.
    NOTA: La ragione di questo è che la placcatura secondaria ts mutanti letali può in alcuni casi accumulano sostanziale biomassa, anche se le cellule vengono arrestati nel primo ciclo cellulare dopo la placcatura. La replica secondaria elimina questo segnale e aumenta notevolmente la sensibilità.
  • Fotografare i piatti con una macchina fotografica digitale dopo 3 giorni di crescita a 33 ° C e 5 giorni di crescita a 21 ° C. Tenere le piastre in un telaio fisso. Usare una "griglia-plate" contrassegnato con nove indicatori di allineamento che è stata fotografata insieme alle piastre di coltura (Figura 4). piastre di coltura fotografia come alternata accoppiati 33 ° C (21/33) le immagini a 21 ° C e.
    NOTA: diversi tempi di incubazione consentono di compensare la crescita in quanto il tipo selvaggio cresce in modo significativoveloce a 33 ° C che a 21 ° C.
  • 2. Identificazione dei candidati Mutant ts: Prima schermata

    1. Elaborare le immagini 21/33 piatto abbinato a un software di analisi Matlab immagine personalizzata per eliminare lo sfondo e di segmentare le immagini in un 1.536-array. Il programma determina la biomassa rilevato (intensità totale pixel) in ciascuna posizione (figura 5).
      NOTA: Il software (fornito nel SI insieme alle istruzioni) utilizzeranno l'immagine della griglia a lamelle per determinare le posizioni di celle (singole voci) in un 1.536-array presso l'allineamento di ingrandimento e piastra utilizzata e calcolare l'intensità totale di pixel in ogni cella . Questi valori per ogni mutante vengono poi confrontate con parametri regolabili per determinare la crescita desiderata a 21 ° C rispetto a una ts + standard e il grado di temperatura sensibilità, definita come: S (Mut 33) / S (WT 33) / S (Mut 21) / S (WT 21), dove S è il segnale (in pixeltensity dopo sottrazione del fondo), Mut è un mutante individuale, e "WT" è una colonia non sensibile alla temperatura scelta a caso (ceppo mutagenizzato che aveva ts + fenotipo). Crescita a 21 ° C è definita come S (Mut 21) / S (WT 21). In questa prima schermata, si applicano i criteri di selezione rilassato (permettendo relativamente bassa crescita a 21 ° C e un grado relativamente basso di sensibilità alla temperatura) per mantenere la falsa basso tasso negativo.
    2. Caricare la lista delle colonie selezionate generati dal software come un file di istruzioni per la singola colonia raccogliendo robotica (tipicamente in un 384-array). Preparare i piatti origine e di destinazione secondo le istruzioni robotica e raccogliere le colonie a matrice (Figura 6).
      NOTA: raccoglitrici convenzionali richiedono un file di istruzioni in un formato, come ad esempio .csv, .txt o .xls. Tutti i raccoglitori avranno la capacità di essere di file-driven; diversi formati richiederanno la modifica minore del codice MATLAB (codice sorgente fornito). Posizionare le piastre di destinazione nella cartella C incubatore 21 ° per ~ 5 giorni di tempo per crescere un piatto stock.

    3. Identificazione ts Mutanti: secondo schermo

    1. Ripetere il passaggio da 2.1 a ripetere il test colonie raccolte. Tipicamente 30 - 50% delle colonie sarà ripetere il test ts come chiari letali, per un rendimento del 2% - 5% ts letali rispetto a colonie sopravvissute iniziali mutagenesi UV.
    2. Ripetere il passaggio 2.2 per la raccolta delle ts letali due volte schermati, ma con un file di istruzioni modificato progettato per colonie matrice in blocchi di 100 colonie su piastre rettangolari a 384 densità. Questo è per un comodo esame microscopico nel passaggio successivo. Il formato del file di istruzioni è specificato in fase di esecuzione dal codice MATLAB.
    3. Assicurati di includere diverse colonie WT come controllo e posizionare le piastre a 21 ° C per ~ 5 giorni.

    4. Determinazione fenotipo iniziale

    1. Replicare le piastre 100 blocchi schierati al punto 3.2 e metterli in C incu 21 °Bator per ~ 2 giorni per ottenere colonie di recente crescita.
    2. Replicare la nuova copia delle piastre 100-blocco (4.1) a tre copie. Inserire una copia in C incubatore 21 ° e uno in C incubatore 33 ° come controlli.
    3. Posizionare la terza copia ( "screening piastre") in una configurazione robotica, e individuare le colonie con lunghe spine toccato con acqua sterilizzata.
      NOTA: le cellule Chlamydomonas appuntato agar robot tendono a terra inizialmente come una macchia piuttosto densa delle cellule, con poche singole celle disponibili per l'ispezione al microscopio. Per ottimizzare le colonie di ispezione microscopica, individuare le cellule inizialmente trasferiti con una goccia d'acqua (volume di acqua trasferita dai perni lunghi robotici è ~ 100 nl). Ciò provoca dispersione delle cellule in un piccolo raggio (~ 1 mm) intorno al centro pinning iniziale, con molte singole cellule isolate.
    4. Prendere microfotografie di una regione di ogni spot delle piastre di screening al tempo 0 (mentre ancora single, cellule indivise) (Figura 7) e posizionare le piastre a 33 ° C per l'incubazione. Determinare la posizione dell'immagine tramite il controllo manuale di fase di un microscopio tetrade dissezione modificata impostato per dare fermate al 4,5 mm spaziatura da centro a centro di una matrice di 384 densità.
    5. Rimuovere le piastre di screening del C incubatore 33 ° e prendere microfotografie, come al punto 4.4, a diversi intervalli di tempo (10 ore, 20 ore, 48 ore). Assicurarsi che il palco, il portatarga, e il controller stadio sono precisamente calibrato per ottenere immagini delle stesse cellule in ogni punto del tempo. Eseguire acquisizione microfotografia rapida (~ 10 min).
    6. Utilizzare la seconda copia C incubatore 33 ° per verificare il fenotipo ts e per assicurarsi che le fluttuazioni di temperatura durante l'acquisizione dell'immagine hanno effetto importante sul ts fenotipo.
      1. Analizzare le immagini microscopiche e selezionare per i mutanti in base ai criteri desiderati (Figura 8). Spot the set selezionato finale di una piastra di agar-96 schierati. Assicurarsi che ogniPiastra contiene mutanti dello stesso tipo di accoppiamento e resistenza ai farmaci.
      2. Per ciascuna piastra, inserire le ultime due colonne positivo (query mutazione) e un controllo negativo (WT) per il dosaggio complementazione.

    5. complementazione e Linkage sperimentazione di nuovi mutanti di "frequent flyer"

    1. Trasferire grandi quantità di colonie disposti a medio-gameti induzione esente da azoto 10 a 96 pozzetti (densità di ogni colonia dovrebbe essere di circa 0,2 OD). Incubare le piastre sotto la luce (13-20 W mercurio lampadine) per ~ 5 ore per consentire gametogenesi.
      NOTA: Questo passaggio può essere condotta sia con una configurazione robotica replicare o manualmente con un semplice dispositivo di placcatura.
    2. Sospendere query con i tipi di accoppiamento opposti che ospitano le cassette di resistenza alternativi in tubi con media dei gameti-induzione esente da azoto 10 per gametogenesi.
    3. Mescolare i campioni in una piastra segnale in un accoppiamento mixtVolume ure di 20 microlitri (Figura 9). A seguito di ~ 10 minuti sotto la luce, il punto 5 ml di ogni ben due volte: una volta su un piatto TAP per il test di collegamento e una volta su TAP + 5 micron Paro + 9 micron Hygro per il test complementazione.
    4. Incubare le piastre di collegamento nel 21 ° C incubatore per una notte, e poi avvolgerli in carta stagnola. Tenerli al buio per 5 giorni per permettere la formazione zygospore.
    5. Incubare le piastre complementazione-prova per circa 10 giorni alla luce a 21 ° C.
      NOTA: Gli importi della droga sono tarati per consentire la sopravvivenza di diploidi doppiamente eterozigoti, ma sono ancora abbastanza per eliminare i aploidi di accoppiamento. Tali importi sono stati calibrati per integrazioni cassetta di resistenza standard utilizzati in questo specifico progetto; con nuove integrazioni, le dosi devono essere ricalibrati. La maggior parte della biomassa è verificato per essere diploidi mediante citometria di flusso (figura 9), anche se un livello variabile di aploidi (probabilmente da meiosi e la crescita di doppiamente resistentesegreganti) è di solito osservato pure.
    6. Replicare le piastre di complementazione-test in due copie per l'identificazione fenotipo TS. Mettere una copia a 21 ° C e una copia a 33 ° C per ~ 5 giorni.
    7. Colonie di prova per il fenotipo TS, come descritto nella sezione 2.1 (Figura 5). Le colonie che non sono integrando con la query probabilmente rappresentano alleli dello stesso gene, come le query (diploidi etero-alleliche per le mutazioni nello stesso gene).
    8. Per il test di collegamento, seguendo passo 5.4, spostare le piastre di nuovo alla luce per consentire la meiosi e conseguenza di segreganti aploidi per ~ 7 giorni.
    9. Replicare le piastre di test di collegamento a TAP + 10 micron Paro e 10 micron Hygro di selezionare per progenie doppio-resistenti (previsti al 25% della progenie aploide, dal momento che le cassette non sono collegate) e incubare a 21 ° C per una settimana.
      NOTA: Aumentare il dosaggio del farmaco per aploidi doppiamente resistenti.
    10. colonie di prova per il fenotipo TS, come hon punto 2.1.
      NOTA: è previsto un fenotipo TS (e osservato) per mutanti nello stesso gruppo di complementazione come la query. Inoltre, un fenotipo TS nel saggio linkage per un mutante che integra la query, può riflettere stretto collegamento tra l'interrogazione e la nuova mutazione. Mutanti che completano le query testati sono probabili nuovi geni che entreranno cantiere per l'identificazione bioinformatica della lesione causale, e in ultima analisi, per ulteriori analisi fenotipica.

    Representative Results

    Mostriamo una pipeline accelerato per isolare ts mutanti in Chlamydomonas. Le cellule vengono dispensate su piastre di agar, e poco dopo convalida pratica al microscopio per la densità di cella singola, piastre sono UV irradiati (Figura 1). Colonie irradiati tipici sono identificati e raccolti in un formato schierati dopo 10 giorni di crescita a temperatura permissiva (Figura 2). Le piastre risultanti nel formato 384 vengono miscelati in un 1.536-array (Figura 3). Da questi primi passi di raccolta colonie irradiati, abbiamo schierato ~ 200.000 colonie finora. La densità della sospensione viene regolato sulla base della dose UV progettato in modo che, rappresentando la morte, 200 - 600 colonie superstiti formeranno sulle piastre. Tre volte UV esposizione (1,5 min, 1 min, e 0,5 min) e tre densità sono stati testati conseguenza (Tabella 1). Empiricamente, il tempo di esposizione 1.5 min prodotto la maggior parte delle ts- mutanti (~ 50%); Tuttavia, finora, 1 min ceduto maggior parte dei candidati del ciclo cellulare. Pertanto, i futuri colpi di mutagenesi UV sono stati fatti con solo 1 min. Una preoccupazione importante è la spruzzatura durante la raccolta iniziale e la contaminazione incrociata (soprattutto nei formati ad alta densità). Ciò può comportare la duplicazione e l'ulteriore fenotipizzazione dello stesso mutante due volte. Per ridurre al minimo la probabilità di uno scenario del genere, aver cura di raccogliere le colonie alla dimensione ottimale, e fare in modo che le colonie adiacenti non vengono raccolte nel saggio iniziale.

    Successivamente, due sequenziali saggi fenotipo TS (Figura 5) sono stati eseguiti, e circa 3.000 TS-mutanti sono stati isolati e caratterizzati fenotipicamente mediante microscopia time-lapse (Figura 8). A causa della messa a fuoco biologica nello studio del ciclo cellulare di interesse per fenotipi che soddisfano determinati criteri, non siamo interessati a raccogliere più di due alleli in ogni target gene. Pertanto, abbiamo effettuato complementazione e test di collegamento con i geni già caratterizzati con più di due alleli (query) contro i candidati di recente raccolti per rimuovere i geni altamente ricorrenti dalla tubazione a valle (Figura 9).

    Figura 1
    Figura 1: uniforme diffusione delle cellule Unmutagenized e UV mutagenesi. (a) 384 x 2 gocce microlitri vengono dispensate su una piastra di agar usando un dispensatore di reagente. (b) le piastre casuali sono testati sotto il microscopio per verificare la densità a cella singola e sono UV irradiati con un'esposizione 1-min. Barra di scala = 50 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    figura 2 Figura 2. Le colonie UV-mutagenizzato scelto per i 384-array. (a) le singole cellule UV-irradiati sono coltivate per circa 10 giorni in colonie visibili. Barra di scala = 2 cm. (b) programma di analisi delle immagini riconosce colonie separabili in base a determinati parametri e robot li array in 384 piatti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 3
    Figura 3. La fusione al 1.536-array. Quattro piastre 384 formato sono fusi in un unico 1.536 piastra; una volta cresciuto, vengono replicati nuovamente per verificare il fenotipo TS. Clicca qui per visualizzare ungrande versione di questa figura.

    Figura 4
    Figura 4. Imaging per la quantificazione. (a) Le piastre sono tenute in un telaio sotto un documento photography supporto in modo che tutte le piastre in serie vengono fotografati con un ingrandimento identici e posizionamento. (b) La prima immagine è di una micropiastra 1536 pozzetti con i puntini rossi posti agli angoli e punti medi. Questa "grid-plate" image definisce la posizione della matrice. (c) Esempio di un 1.536-array dopo l'incubazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 5
    Figura 5. L'identificazione del fenotipo TS da SemiImage Analysis automatizzata. le immagini delle lastre vengono analizzati dal software MATLAB personalizzato (fornito nel SI). L'immagine è segmentata automaticamente in matrici di celle (96, 384, o 1.536), e il segnale in ogni cella è quantificata. Crescita a 21 ° C è segnata in blu, e la crescita a 33 ° C è segnato in giallo. Le colonie che mostrano una crescita significativamente superiore a 21 ° C rispetto a 33 ° C (standardizzati per ts +) sono selezionati e contrassegnati in quadrati neri con un punto verde. Queste scelte possono essere modificati manualmente. Le selezioni finali sono trasferiti in un file utilizzato dal robot colonia-picking. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 6
    Figura 6. Picking Robotic del primo turno ts candidati letale. La ciliegia-Picking robot segue le istruzioni da un file generato come descritto al punto 2.1 per scegliere i candidati per un nuovo array. Il pannello superiore illustra il caricamento di uno spillo sterilizzato. Il pannello inferiore mostra la raccolta precisa da una certa colonia nella piastra di origine. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 7
    Figura 7. Screening Time-lapse per l'ordinamento iniziale di ts Lethal fenotipi. I cloni che hanno superato due turni del protocollo di screening di figura 5 vengono replicate in piastre a una densità cellulare tale che le singole cellule possono essere risolti microscopicamente. Un microscopio dissezione tetrad modificato viene utilizzato per identificare le posizioni in cui vengono prese microfotografie dopo 0 ore, 10 ore e 20 incubazioni hr un t 33 ° C. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 8
    Figura 8: I mutanti del ciclo cellulare Chlamydomonas identificati da Time-lapse Microscopia. (a) Illustrazione del ciclo cellulare unico Chlamydomonas descrive la lunga fase G1 caratterizzato da una crescita cellulare, seguito da cicli di SM di fissione, che finiscono con la schiusa delle cellule figlie appena nati. (b) le immagini al microscopio mostrano le cellule WT durante il ciclo cellulare e l'identificazione dei tipici mutanti del ciclo cellulare che non riescono a completare la mitosi. Barra di scala = 50 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 9
    Figura 9: complementazione e Linkage Test. (a) Una query antibiotico resistenti (ad esempio, Hygro) con un gene mutato ripetuto frequentemente è attraversata in una piastra a 96 pozzetti con una serie di mutanti del tipo di accoppiamento opposta che ospitano una seconda cassetta antibiotico resistenza (ad esempio, Paro). piastre di complementazione producono un'elevata frazione di diploidi come indicato dalla colorazione acido nucleico e analisi in citofluorimetria (pannello in basso a sinistra in a). (b) La miscela di accoppiamento viene testato sia per complementazione in diploidi e per linkage in progenie doppio resistente meiotica. Il controllo positivo è query stessa nel tipo di accoppiamento opposta, e, come previsto, mostra il fenotipo TS a 33 ° C, mentre il controllo negativo è WT e mostra il ts + fenotipo. Le colonie cerchiate non mostrano complementazione con la query e sono quindi nalleli TS ew per il gene della query. Questi sono generalmente esclusi da ulteriore caratterizzazione, dal momento che solo "frequent flyer" sono nel set di test di complementazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    <td rowspan = "2"> 0.5 '
    Tempo OD Colonie raccolti (#) fenotipo TS I candidati del ciclo cellulare
    1.5 ' 0,012 6000 (Avg = ~ 200) 200 (3,3%) 7 (3,5%)
    1 ' 0.003 11.000 131 (1.19%) 15 (11,4%)
    (Avg = ~ 360)
    6E-04 9000 40 (0,45%) 1 (2,5%)
    (Avg = ~ 300)

    Tabella 1: Calibrazione di irradiazione Times massimizzare la resa del ciclo cellulare candidati mutanti. Tre volte di irradiazione sono stati testati (30 piastre ciascuno) con i corrispondenti valori di densità ottica per garantire numeri di colonie superstiti (200 - 600).

    Discussion

    La pipeline qui descritta per l'isolamento ad alto rendimento di mutanti letali ts assicura che presumibilmente tutti i percorsi cellulari essenziali del genoma Chlamydomonas sono rappresentati. Le due fasi più critiche per la raccolta efficiente dei potenziali geni del ciclo cellulare e per l'eliminazione delle ripetitive alleli "frequent flyer" sono: 1) la definizione coerente di caratteristiche fenotipiche arresto per cicli cellulari incompleti e 2) il saggio di complementazione in parallelo contro il già identificati interrogare i geni per ingrandire la collezione con quelli di nuova isolati.

    Quando sincronizzati dai cicli luce-buio, Chlamydomonas cresce fotosinteticamente durante le ore diurne e aumenta di dimensioni delle cellule> 10x senza alcuna replicazione del DNA o cella divisione 13. Circa coincidente con l'inizio della notte, cellule poi sottoposti a molteplici cicli di alternanza replicazione del DNA, mitosi, e la divisione cellulare (Figura 8). Questo schem normativoe fornisce una distinzione naturale tra geni necessari principalmente per la crescita cellulare e l'integrità e geni richiesti specificamente per il ciclo di divisione cellulare. Abbiamo scoperto che i punti di tempo 10-hr e 20-HR sono molto informativo per un fenotipica di massima iniziale di taglio 1. Le ampie classi di mutanti letali ts che riconosciamo attualmente, sulla base di queste immagini (vedere SI in Tulin e Croce, 2014) 1, sono: Notch, Popcorn, rotonda, piccolo, medio, lisi presto, e multiple-ciclo (Figura 8 ).

    Le tre categorie più importanti ci concentriamo su sono Notch, popcorn, e Round. Le e fenotipi "Notch" "popcorn" sono stati mostrati in precedenza per presentare le caratteristiche della maggior parte delle lesioni delle cellule ciclo-specifici (ad esempio, mitotico ciclina-dipendente chinasi, macchinari replicazione del DNA, e topoisomerasi II) 1. La comparsa di una (Notch) o multipla (popcorn) i piani apparenti di divisione cellulare incipiente ma soccombente è una comoda MorpholIndicatore ogical dell'iniziazione ciclo cellulare. Questi mutanti in genere mostrano difetti di crescita poco o niente, con aumenti di volume delle cellule simili a WT al contrassegno di 10 ore. I fenotipi Notch e popcorn sono evidenti a 10 ore e sono completamente sviluppati (frequentemente associata con lisi cellulare) per 20 ore. cellule "giro" si sviluppano in modo simile a WT, ma con una produzione molto ridotta di apparenti i piani di divisione incipienti, ottenendo così grandi, cellule rotonde arrestati. Precedente mutanti in questa categoria sono caduti in componenti dei anafase-promuovere complessi 14 o in geni necessari per la funzione dei microtubuli (tubulina cofattori-pieghevole, complesso anello gamma-tubulina) 1. In tempi più recenti, queste cellule mostrano spesso pronunciato la lisi cellulare.

    "Small" e le cellule "medio" crescono sia trascurabile (Small) o significativamente inferiore a WT (Medium). Molti di questi mutanti identificati fino ad oggi hanno lesioni nei geni le cui annotazioni suggeriscono ruoli nella cellula di baseI processi di crescita (r traduzione o biogenesi della membrana). La principale discriminazione microscopica tra il Medio e rotonda si basa sulla quantità di crescita a 10 ore (rotonda: come WT; Media: ridotto). Perché le piccole e medie categorie sono abbastanza grandi e probabilmente riflettono lesioni in una vasta gamma di percorsi cellulari, non stiamo cercando di saturare queste categorie; tuttavia, noi vogliamo molecolarmente individuare i rappresentanti della classe per capire fenotipi di perdita di percorsi diversi. Due categorie non studiate sono: 1) l'early-lisi mutanti che perdono l'integrità (perdita di colore verde, perdita di refractility) dal marchio 10-ore, con poche prove di crescita delle cellule prima e 2) i cicli multipli. Le cellule proliferano in modo simile a WT 10 e 20 ore, anche se mostrano una totale incapacità di svolgere la proliferazione di più lungo periodo.

    Noi siamo per lo più caratterizzando "notch", "pop-corn" e "rotondo" e escludono le piccole e medie cellule rotonde, cosìcome mutanti che perde che poche divisioni cellulari completi. Questo è principalmente per garantire che le caratteristiche cellulari di base, come la crescita e l'integrità della membrana, sono funzionali e arricchire la probabilità di geni divisione legate. Questo approccio è risultato essere empiricamente efficiente; tuttavia, è possibile che un gene del ciclo cellulare è pleiotropico e ha ruoli aggiuntivi precedenza in G1, prima divisione attuale. Tali casi, che ci aspettiamo di essere rare, sono mancati. Più in generale, il nostro obiettivo per l'arresto omogenea, che in alta probabilità è dovuta a una mutazione causativa che è una proteina completamente disfunzionale. Tuttavia, per la stessa ragione come appena descritto, ci possono essere molti punti di arresto e quindi, una certa flessibilità è consigliabile nella scelta dei candidati.

    Al fine di arricchire la collezione con nuovi geni identificati, i candidati prescelti sono analizzati per complementazione. Abbiamo bisogno di TS nel controllo positivo (query di query mutazione) e TS + nel controllo negativo (query contro WT). Nuovi mutanti nello stesso gruppo complementazione come la query sono TS. L'appartenenza allo stesso gruppo di complementazione riflette quasi invariabilmente una lesione molecolare nello stesso gene (questo è stato il caso per ogni tale gene abbiamo testato). Pertanto, per "frequent flyers", questo criterio è di esclusione per un'ulteriore caratterizzazione. Mutanti che non erano allo stesso gruppi di complementazione, come le query testati sono candidati per nuovi geni e sono ulteriormente caratterizzate da bioinformatica e strumenti sperimentali. recupero altamente variabile di TS alleli in gruppi di complementazione è un fenomeno che ben noto è, variabilità è notevolmente maggiore di rumore di Poisson, a causa della grande variabilità intrinseca della mutabilità di TS tra i diversi geni. Cause potrebbero includere le differenze thermolability intrinseche; dimensioni diverse proteine; la presenza di una proteina come monomero rispetto come un grande, stabilizzato complesso; e punti caldi mutageni. Questo è quasi un nuisa puronce. Tuttavia, quello risultante esito favorevole è che la lista "frequent flyer" non è lungo (con pochi obiettivi che occupano la maggior parte della lista), in modo che il test di complementazione alta intensità di lavoro non è un'impresa enorme fino alle fasi successive del progetto.

    Come un approccio complementare, abbiamo effettuato un test di collegamento. In questo saggio, progenie doppi resistenti sono selezionati e testati per il fenotipo TS. Un fenotipo TS è previsto (e osservato) per mutanti nello stesso gruppo complementazione come la query o per le mutazioni strettamente collegate. Per ciascuno dei geni testati, una progenie WT dovrebbe apparire (ts + fenotipo) in una certa probabilità a seconda della distanza genetica. Stimiamo che ci sono circa 100 zygospores per ogni accoppiamento in questi punti. Ipotizzando 100% di efficienza meiotica, questo si tradurrà in circa 100 progenie doppio farmaco-resistente dai cassetti resistenza ai farmaci non collegati (25% della progenie meiotica, quattro per la meiosi, a causa di Meredità endelian). Questo sarebbe anche il caso di TS mutazioni, dove il 25% delle progenie sarà doppio mutante, e il 25% sarà WT se la query e di test mutazioni sono scollegati. Pertanto, fuori della progenie doppio-farmaco-resistente, il 25% sarà WT (circa 25 celle). Questo è il caso per le mutazioni completamente non collegati; tuttavia, moderata linkage (entro ~ 20 cm, circa 2 MB o 2% del genoma 115) sarà fortemente ridurre o eliminare la ts + segnale. Nel caso del collegamento della mutazione testato per la cassetta antibiotico, ts + aploidi che sono double-farmaco-resistenti sono presenti in quantità molto basse. Questo manifesta come apparente mancata ricombinarsi con tutti i mutanti testati, nonostante integrare tutti i mutanti testati, un risultato aberrante che viene facilmente rilevato; in tali casi, backcrossing risolverà il problema.

    Sia da conoscenze pregresse e dalle analisi di sequenza, ci aspettiamo che i geni del ciclo cellulare nel Chlamydomonas a circa 500 geni 2, anche se mov, ma probabilmente non tutti, sono essenziali. Valuteremo la necessità di round di mutagenesi aggiuntivi come più mutanti sono raccolti e il livello di aumenti di saturazione.

    Questa procedura è progettato unicamente per lo studio dei processi biologici essenziali ei geni e le proteine ​​che li realizzano. Altre metodologie per generare esistono perturbazioni in geni essenziali (ad esempio, la trasformazione di alleli mutagenizzate in modo casuale 16, alleli condizionalmente trascritte 17, o alleli hypomorphic 18). Tuttavia, tutti richiedono la ricombinazione omologa, che è fortemente soppressa nel vegetativo Chlamydomonas. Il cluster, regolarmente intervallate breve ripetizione palindromo (CRISPR) / Sistema Cas9 è stata stabilita come un potente strumento per la modifica del gene 19; tuttavia, è ancora da lavorare in modo efficiente in Chlamydomonas 20. Criticamente, tutti questi metodi richiedono la conoscenza preventiva del bersaglio. Questa è una restrizione gravese si vuole avere la possibilità di imparare qualcosa di nuovo! Il nostro approccio sarà resa mutazioni identificano geni essenziali, indipendentemente alcuna conoscenza preliminare. Pertanto, allo stato attuale livello di tecnologia, l'isolamento di ts mutazioni casuali seguiti da l'identificazione del gene dal sequenziamento profondo può essere il metodo più efficace per ottenere una rapida entrata in biologia cellulare microbica nel superkingdom impianto.

    L'identificazione di mutazioni causative (tra i 100 ~ codifica-sequenza che cambia mutazioni in ogni clone) è oltre la portata di questo articolo. Sequenziamento profondo delle piscine segreganti, prelevare 1 è efficace, ma ad alta intensità di manodopera. Una strategia piscina combinatoria per la determinazione di tutti mutazioni in un gran numero di ceppi, dopo il sequenziamento di un piccolo numero di piscine, è molto costi e lavoro efficace. Una nuova strategia per il sequenziamento combinatoria segreganti gonfiato è in fase di sviluppo che permetterà l'identificazione di mutazioni causative in decine di mutanti simultaneously in un unico passaggio di sequenziamento (in preparazione). Queste efficienze sono molto importanti per consentire la fase di identificazione del gene fondamentale per tenere il passo con il molto rapido accumulo di mutanti che viene reso possibile dal procedure descritte qui.

    Disclosures

    Gli autori dichiarano non interessi finanziari rilevanti.

    Acknowledgments

    Ringraziamo i membri del laboratorio croce per la consulenza e la discussione utile. Questo lavoro è stato sostenuto da PHS 5RO1-GM078153 e un premio Junior Fellow dal Simons Fondazione per Michal Breker.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Equipment:
    Hudson RapidPick colony picker Hudson Robotics
    MultiDrop Combi Reagent Dispenser Thermo Scientific 5840300
    Small tube metal tip cassette Thermo Scientific 24073295
    Singer RotoR replica-plating robot Singer Instruments Very essential for the process. For lower scale screenings you can use an in-house manual tool
    Singer single-colony picking attachment (‘Stinger’) Singer Instruments Can be picked manually, however for large scales it is nearly impossible
    Name Company Catalog Number Comments
    Materials:
    SYTOX Green Nucleic Acid Stain ThermoFisher Scientific S7020

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    References

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